NKUBAP.00.10.AR.12.03
advertisement
İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER…………………………………………………………………………………i ŞEKİLLER LİSTESİ…………………………………………………………………………..ii TABLOLAR LİSTESİ………………………………………………………………………...iii ÖZET…………………………………………………………………………………………..v ABSTARCT……………………………………………………………..……………………vi 1.GİRİŞ ...................................................................................................................................... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ve KURAMSAL TEMELLER ........................................................ 2 2.1 Kanserin Moleküler Özellikleri ........................................................................................ 2 2.2. Kanser Biyomarkerleri ve Otoantikorlar ......................................................................... 3 2.3. Otoantikor Üretimi .......................................................................................................... 4 2.4. Heat Shock Protein 70 (HSP70) ...................................................................................... 5 3. MATERYAL ve YÖNTEM ................................................................................................. 10 3.1. Materyal ......................................................................................................................... 10 3.2. Elektrokimyasal Ölçümler ............................................................................................. 10 3.3. İmmobilizasyon Süreci .................................................................................................. 10 3.3.1. ITO Elektrotların Ölçüme Hazırlanması ................................................................. 10 3.3.2. Anti-HSP70’ in ITO Elektrot Yüzeye Kovalent Olarak Bağlanması…………….10 3.3.3 HSP70’ in ITO Elektrot Yüzeye Kovalent Olarak Bağlanması ............................... 12 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA .................................................................... 13 4.1. İmmobilizasyon Basamakları ........................................................................................ 13 4.2. Optimizasyon Basamakları ........................................................................................... 13 4.2.1. Anti-HSP70 Konsantrasyonunun Belirlenmesi ...................................................... 13 4.2.2 AntiHSP70 İnkubasyon Süresinin Belirlenmesi ...................................................... 14 4.2.5 Tekrarlanabilirlik ..................................................................................................... 15 4.2.6. Single Frequency Ölçümleri ................................................................................... 17 4.2.7. ITO Temelli AntiHSP70 Biyosensörün SEM Görüntüleri ..................................... 17 4.2.7. Depo Ölçümleri ....................................................................................................... 18 5. SONUÇ ve ÖNERİLER ....................................................................................................... 19 KAYNAKLAR ......................................................................................................................... 20 i Şekil Listesi Şekil2.1İmpedans’ın potansiyel(zaman) ve akım(zaman) büyüklüklerine bağımlı matematiksel gösterimi .............................................................................................................. 8 Şekil 2.2 Bir elektrolitle kontakt halindeki elektroda ilişkin Randles eşdeğer devre modeli .... 9 Şekil 1.1 Altın nanopartikülle kaplanan ITO elektrotun EIS ölçümü…………………...……11 Şekil 3.2 anti HSP70in immobilizasyon adımlarına ait CV ve EIS spektrumu ...................... 11 Şekil 4.1 Farklı anti HSP70 konsantrasyonları ile hazırlanan ITO-AuNP temelli biyosensörün immobilizasyon kalibrasyon grafikleri ................................................................................... 14 Şekil 4.2 Optimize edilmiş antiHSP70 konsantrasyonuna (1 µg/mL) ait EIS spektrumu….14 Şekil 4.3 anti HSP-70nin farklı sürelerle inkübe edilmesiyle hazırlanan ITO temelli biyosensörün immobilizasyon kalibrasyon grafikleri .............................................................. 15 Şekil 4.4 Optimize edilmiş antiHSP inkübasyon süresine (75 dakika) ait EIS spektrumu .... 15 Şekil 4.5 Tasarlanan ITO AuNP temelli biyosensörün optimum şartlarına ait EIS spektrumları ………………………………………………………………………………………………...16 Şekil4.6 Optimal şartlardaki ITO-AuNP temelli biyosensörün kalibrasyon grafiği ………………………………………………………………………………………….……..16 Şekil4.7 antiHSP70 temelli biyosensöre HSP70 bağlanmasının gerçek zamanlı ve tek frekansta yapılan single frequency ölçümü …………….……………………………………17 Şekil4.8 ITO elektrot yüzeyi SEM görüntüleri……………………………………………….18 ii Tablo Listesi Tablo 2.1.Biyoelektrokimyasal sistemleri tanımlamakta çok sıklıkla kullanılan impedans elemanlarının tanımlanmaları, frekans bağımlılıkları ve faz kaymaları………………….…..8 Tablo 4.1. Tekrarlanabilirlik ve R² değerleri…………………………………….…………….16 iii Bu çalışma, Bu tez NKUBAP tarafından NKUBAP.00.10.AR.13.09 numaralı proje ile desteklenmiştir. iv Özet Isı şok proteinleri (HSP) metabolizmanın çeşitli inflamasyon durumlarında miktarı hızlıca artan markerlarındandır. Bu protein ailesinin çeşitli türleri mevcut olmakla birlikte, serumdaki konsantrasyonu çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bu noktadan yola çıkılarak, bu çalışmada HSP-70 in erken tanısına yönelik tek kullanımlık ITO elektrotlarla yeni ve hassas bir biyosensör sistemi geliştirilmiştir. ITO yüzeyinin iletkenliği altın nanopartiküllerle sağlanırken, kendi kendine oluşan tek tabakalar (SAMs) için sisteamin kullanılmıştır. Biyosensörün geliştirilmesi aşamasında her bir adım optimize edilmiş ve döngüsel voltametri ve elektrokimyasal impedans spektroskopisiyle ölçümleri alınmıştır. Antikor-antijen bağlanmasının sabit frekansta takip edilmesini sağlayan “krono-impedans” tekniği de çalışmamızda uygulanmıştır. Tasarlanan yeni biyosensör sisteminin tekrar üretilebilirliği ve tekrarlanabilirlik değerlerinin iyi olduğu görülmüştür. Biyosensörün raf ömrü ve gerçek serumda uygulanabilirliği de çalışmanın çıktıları arasındadır. v ABSTRACT Heat shock proteins (HSPs) are important molecular signatures in the cellular stress response. HSP70 could be a potentional biomarker because its overexpression in serum is associated with many cancers. In the present work, we described a novel immunsensor constructed on a gold nanoparticles-modified ITO disposable electrode. Anti-HSP70 was immobilized through covalent with Cysteamine which formed a self-assembled monolayer on gold electrodes. Cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) techniques were employed to characterize the immobilization process and to detect. The chrono-impedance technique to real time monitor the interaction between HSP70 and anti-HSP70 is also implemented. . To demonstrate the feasibility of the biosensor in practical analysis, the real serum samples were experienced. vi 1.GİRİŞ Son yıllarda serum biyomarkerler, kanser teşhisi için oldukça revaçtadırlar. (Leslie ve Downes, 2004). Bunlardan serum otoantikorlar, tümör alakalı antijenlere (TAAs) karşı spesifiktirler. Melanom hastalarının serumlarından alınan örneklerinden yola çıkarak tanımlanan antijenlerin ilk seralojik tanımlanmasından beri (Robert ve ark. 2000) kanserli hastalarda (TAAs) ve otoantikor sayısında büyük bir artış söz konusudur (Gallie ve Phillips, 1984). Kanserin erken evrede tanısı, hastanın hayatını kurtarmada ve hastalığın seyrinin başarılı bir şekilde takip edilmesinde kritik öneme sahiptir; dolayısıyla kanserin erken tanısı için spesifik ve hassas yöntemlere ihtiyaç vardır. Kanda, idrarda ve diğer vücut sıvılarındaki biyomarkerlerın analizi hastalığın belirlenmesinde uygulanan metotlardandır. Çoklu marker profilleri (varlıkları ve konsantrasyon seviyeleri) hastalığın başlangıç tanısında elzemdir. Bu metotlar, klinikçilere (doktorlara) başarılı bir tedavi yöntemine karar verme ve hastaların hayatta kalma oranını arttırma hususunda destek olabilmektedir. Hali hazırda var olan kanserin seyrini izleme yöntemleri ağırlıklı olarak boyama ve mikroskopiyi kullanarak hücre morfolojisine dayanan geleneksel yöntemlerdir. Bunlar, biyopsi alıp akabinde dokuyu hücre fiksasyonu kullanarak inceleyen ve böylelikle kanserli hücreyi tayin edip tanımlama yaklaşımları sunan invazif tekniklerdir. Fakat bu testler, kanserin başlangıç aşamasında pek faydalı olamamakta ve ilerleyen süreçte tekrarlanmayı zorunlu kılabilmektedir (Soper ve ark. 2006). Kanser, genetik ve çevresel olmak üzere bir çok faktörden etkilenmektedir, çevresel faktörlere karsinojenik kimyasallar, radyasyon ve bakteriyal (örneğin mide kanserinde) veya viral infeksiyonların (örneğin servikal kanser) da dâhil olduğu mikrobiyal sebepleri dahil etmek mümkündür. Kanserin bu denli çeşitli sebeplere bağlı olarak ortaya çıkması, klinik testleri de oldukça karmaşıklaştırır. Kanserle ilintili 200den fazla hastalık vardır ve bunlar vücudun çeşitli bölgelerini etkilemektedir. Kanser, normal hücre sinyal yolaklarını bozmak suretiyle tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonuna ve onkogenlerin aktivasyonuna yol açar. Bu multifaktöriyel değişiklikler (genetik ve epigenetik) normal memeli hücrelerine kıyasla daha yüksek büyüme kapasitesi göstererek kanser hücrelerin biçimlenmesine ve hastalığın başlangıcına sebep olabilir. Fakat tanı sürecinde tek bir gen değişmeden kalmaz ve farklı lokasyonlarda (organlarda) tümör yolakları değişebilir (Guavardana ve Diamandis,2007). Tüm bu değişiklikler, özgül bir kanserin tanısında özgül bir değişkeni veya markerı seçmeyi güçleştirmektedir. Bu yüzden, bir dizi biyobelirteç, hastalığın tanısında potansiyel olarak analiz edilmektedir. Kanser testleri için bir biyosensör geliştirmek, kanser biyolojisinin temel elemanlarını ve karmaşasını bir miktar da olsa anlamakla mümkündür. Kanser, anahtar genlerin DNA sekanslarının modifikasyonu veya değişiminin sebep olduğu genetik bir hastalıktır. Bu değişimler, gende veya protein ekspresyonunda bir değişim veya da tümör hücresinin protein kompozisyonundaki bir değişimi ifade etmektedir. DNAdaki değişim birikmeye başladıkça, hücre davranışındaki düzen giderek bozulur ve kontrol mekanizmasının olmadığı kanser hücrelerinin üretilmesiyle nihayetlenir. 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ve KURAMSAL TEMELLER 2.1 Kanserin Moleküler Özellikleri Kanser, hücrelerin aşırı ve zamansız çoğalmalarına, immün sistemin gözetiminden kaçmalarına ve nihai olarak da uzaktaki dokuları da istila ederek metastazlar oluşturmalarına yol açan metabolik ve davranışsal değişiklikler geçirdikleri, çok basamaklı bir süreçtir. Bu değişiklikler hücre çoğalmasını ve ömrünü, komşu hücrelerle ilişkileri ve immün sistemden kaçma kapasitesini kontrol eden genetik programlardaki modifikasyonların birikmesiyle ortaya çıkar. Bu süreç, regülâsyonu bozulmuş, normal hücre büyümesini ve davranışını denetleyen kurallara uymadıkları için “asi” olarak nitelendirilebilecek hücrelerden oluşan bir kitlenin oluşumuna neden olur. Böylesi bir kitle uzun bir süre asemptomatik olabilir. Bununla birlikte, sonunda büyüyerek, fizyolojik işlevleri altüst edecek, kitlenin yerine ve büyüklüğüne bağlı olarak çok sayıda belirtilere ve kanser hücrelerinin organizma içinde yayılmasına yol açacaktır (Boyle ve Levin 2008). Kanserin hedeflediği genetik programlar insan genomuna dağılmış genlerde yazılıdır. İnsan DNA’sının 23 bin kadar gen içerdiği düşünülmektedir. Bu genlerin 3 bin–5 bin kadarı kanserde regülâsyonu bozulan genetik programlarda rol alan proteinleri kodlamaktadır. İşlevini kaybeden bir gen, kritik bir proteinin anormal düzeylerde üretimine (çok az ya da çok fazla), anormal bir protein üretimine ( işlev kazanmış ya da kaybetmiş), ya da bir proteinin hiç olmamasına sebep olabilir (Boyle ve Levin 2008). Çoğu kanser sadece tek bir hücreden (ya da az sayıda hücreden) doğar. Bu hücre kanserli olmak için onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerde hücrenin normal sınırının çok ötesinde çoğalmasını sağlayacak birkaç değişiklik geçirmelidir. Bu süreç “asi” hücrelerden oluşan bir klonun oluşumuna yol açar. Eğer organizma bu klonu tolere ederse ve rahatsız edilmeden kalırsa, çoğalmaya devam edebilir ve bu süreç içinde içerdiği hücreler gittikçe artan sayıda modifikasyon biriktirir. Böylesi bozulmuş bir süreçte, sadece en uygun ve en saldırgan hücreler hayatta kalacak ve daha örgütsüz olan hücrelerin yerini alacaktır. Tümörler bu şekilde zararlı hale gelirler. Bu aynı zamanda kanser tedavisinin bu denli zor olmasının da nedenidir: hastalara kanser hücrelerini etkin olarak öldüren bir ilaç verildiğinde, hayatta kalan az sayıdaki hücre, kendilerini ilaca karşı dirençli kılan değişiklikler geçirmiş olanlardır. Geride kalan bu ufak hücre grubu kanserin başlangıçtaki biçiminden daha kötü bir biçimde dönmesi için yeterli olabilir (Herceg 2007). Tümörün yayılması çoğu zaman kanser hücrelerinin anjiyogenezi, yani tümör vaskülarizasyonuna yönelik yeni, küçük kan hücrelerinin sentezini artırması ve tümöre oksijen ve besin sağlaması sonucu kolaylaşır (Boyle ve Levin 2008). DNA diziliminde mutasyon meydana geldiğinde kanser başlayabilir. Bu mutasyonlar tek bir baz değişikliği olabilir ve bu durumda bir kodonu tanımlayan 3 bazdan biri değişmiş olur ve bir proteine farklı bir proteinin eklenmesine yol açar. Bazı durumlarda, bu, söz konusu proteinin aktivitesini değiştirmek için yeterlidir. Başka DNA mutasyonları ise, çok sayıda bazı etkileyebilir ve genomdan birkaç gen içeren bir DNA parçası kopar; ya da bu DNA parçası genomda başka bir yere yerleşerek bitişik olmayan DNA parçalarının birleşmesiyle oluşan yeni genler oluşarak yeni, anormal proteinlerin sentezine yol açar. Büyüklükleri ne olursa olsun böylesi değişiklikler “genetik değişimler” ya da “mutasyonlar” olarak adlandırılır. Bu değişiklikler kanserli hücrelerin DNA dizimlinin saptanmasıyla belirlenebilir. “Kapalı” olan DNA alanları (bunlar düzeltmeye ve kopyalanmaya kapalıdır) ve açık DNA alanları (hücre bunları kopyalayabilir, okuyabilir ve RNA ile proteinleri üretmek için kullanabilir) vardır. Dolayısıyla, hücrelerin program değiştirmenin DNA mutasyonu dışındaki bir yolu, açık alanlardaki genleri kapatmak, ya da kapalı alanlardakileri açmak için genel paketlemeyi değiştirmektir. Bu gibi değişiklikler sadece DNA diziliminin saptanması ile belirlenmez. DNA’nın okunabilirliğini ve DNA’ya erişilebilirliği düzenleyen kimyasal modifikasyonların 2 da analizi gerekmektedir. Bunlar epigenetik değişiklikler olarak adlandırılmaktadır (Nowell 1976). Hücreler, içsel farklılıklarına karşın, hücre çoğalmasını ve ölümünü kontrol eden temel süreçlerin gerçekleştirilmesinde ortak planlar doğrultusunda hareket ederler. Bunun bir sonucu olarak, birçok kanserde, organın yeri ya da hastalığın nedenine bağlı olmaksızın, bazı onkogenler ve tümör baskılayıcılar değiştiği sıklıkla görülür. Bu genlerin ürünleri, hücre çoğalmasını, farklılaşmasını ve sağ kalımını kontrol etmek üzere birlikte çalışan bir öğeler ağının bir parçasıdırlar. Şekil 2.1, tüm kanserli hücrelerde değiştirilmesi gereken gen ve süreç ağının çekirdeği olarak tanımlanabilecek “kanser kutusunu” göstermektedir. Bu kanser kutusu, baslıca üç sinyal verme süreci içerir. Bunların ikisi büyümeyi artıran süreçlerdir; biri ise büyümeyi baskılayan bir mekanizmadır (Boyle ve Levin 2008). 2.2. Kanser Biyomarkerleri ve Otoantikorlar Biyomarkerler, normal, normal olmayan ya da biyolojik proseslerle gerçekleşen hücresel, biyokimyasal ya da moleküler değişikliklerdir. Bunlar, tedavi sonucu biyolojik prosesleri, patolojik prosesleri ya da farmakolojik yanıtları ölçme ve değerlendirmede kullanılmaktadırlar. Kanser araştırması ve tayininde bir biyomarker kanserin vücutta olduğunu belirtir. Biyomarker miktarları biyolojik dokuda, hücrede ya da sıvıda tayin edilebilir. Görüntüleme ücretini en aza indirebilmek ve faydayı en yüksek miktarda tutabilmek için biyomarkerler serum, üre ve tükürükte de ölçülebilmektedirler. Kanser biyomarker teknolojisi, oldukça üretken, kullanım alanları yeniliğe açık teknolojiler içeren bir alandadır. Buna karşın biyomarkerlerin keşfinden kullanılabilirliğine kadar geçen süre oldukça yavaş ve dolayısıyla bir biyomarkerin kanser teşhisinde kullanılabilirliğine kadar geçen süre oldukça uzundur. Bunun yanı sıra sınırlı sayıda biyomarker kanser tayininde kullanılabilmektedir. Bir biyomarkerin laboratuarda belirlenip klinik ortamda kanser tayininde kullanılmasına kadar geçen süre beş farklı adımdan oluşmaktadır. Bunlardan “keşif adımı” olarak da geçen ilki, potansiyel olarak uygun biyomarkerlerin belirlenmesi aşamasıdır. Bu aşamada normal hücre ile tümörlü hücrelerin protein ekspresyonları karşılaştırılarak baskılanmış ya da yok edilmiş oldukları tespit edilir. İkinci aşama “doğrulama” aşamasıdır. Bu aşamada ilk basamakta elde edilen çıplak protein alınarak diğer bir örnekten elde edilmeye çalışılır. Üçüncü aşamada dokulardan elde edilen biyomarkerlerin kanser teşhis etme kapasiteleri ölçülür. Dördüncü aşamaya gelindiğinde biyomarkerin kanseri erken teşhis edip edemediği ölçülür. Bu ölçümlerin spesifikliği ve tekrar edilebilirliği oldukça önemlidir. Ve son aşama olarak biyomarkerin insanlar üzerinde işe yarayıp yaramadığı test edilir. Tümör markerları kanserin biyokimyasal belirleyicileridir. Enzimler, hücre yüzeyi antijenleri ve hormonlar gibi sitoplâzma proteinleri kanser markerları olabilirler. Klinik uygulamalarda, marker terimi plazma, vücut sıvıları, katı tümörler, tümör hücreleri, lenf nodları ve kemik iliğinde tayin edilebilen bir molekülü tanımlamaktadır (Stearns 1998). Bazı tümör markerları sadece bir kanser tipine spesifik iken bazıları birçok kanser türünde ortaya çıkabilen moleküllerdir. Tümör hücreleri tarafından üretilen antijenler de spesifik tümör markerları arasında bulunurlar ve bu hücreler, normal hücrelerden antijenik olarak farklandırılabilirler. Tümör hücrelerinin herhangi bir proteini potansiyel bir antijen olabilir. Bu antijenler spesifik olarak diagnoz, prognozun belirlenmesi, tedavinin şekillenmesi ve izlenmesi gibi çok önemli noktalarda kullanılabilirler (Maciosek 2006). 3 2.3. Otoantikor Üretimi Kanser hücrelerinin immün takibi, antijen spesifik tümörlerin yıkımlarını tetikler (Barret ve Rawling, 2001, Bromme ve Kaleta, 2002). Tümör hücrelerinin otolog proteinleri imminogenetikteki proteinleri betimlemek için kullanılabilirler. (Gallie ve Phillips, 1984, Ross ve ark. 2004). Bu proteinler mutant olabilir, over ekspres olabilir ya da katlanmaları değişebilir. Posttranslasyonel modifikasyona uğramış TAAs (PTMs), immün sistem tarafından yabancı olarak algılanabilir (Gallie ve Phillips, 1984, Ross ve ark. 2004, Royce ve ark. 2004). PTMs varlığı, neo-epitor oluşturup ya da self-epitop oluşumunu arttırıp immün sistemi indirger. TAAs’ların imminogenetik epitopları gibi immün yanıta karşı olan yapılar otoantikor oluşumunu engeller (Rao, 2003). Ayrıca kötü bir transformasyon sırasında proteinlerin anormal olarak dizilimi, humoral yanıtı provoke edebilir. Örneğin intraselüler bir protein olan c-AMP bağlı protein kinaz (PKA), kanser hücreleri tarafından tutulur. Bu ekstraselüler PKA (ECPKA), kanserli hastaların serumlarında düzenlenir (Jedeszko ve Sloane, 2004, Joyce ve Hanahan, 2004). Ve bu da kontrol serum örneklerine kıyasla kanserli hastaların ECPKA’ ya karşı otoantikorlarını daha fazla titre eder. Diğer bir örnek ise; normalde hücre çekirdeğinde bulunması gereken siklin B1, kanserli hücrelerde sitozolde bulunmaktadır (Lah ve Kos, 1998, Iacobuzio-Donahue ve ark. 2003, Figler ve ark. 2007, Mikolajczyk ve ark. 2000). Kanserli hastalardaki bazı immün sistemlerde, sadece tümörlerde bulunan neo-antijenler bulunmasına rağmen, çoğu tümör-alakalı otoantikorlar anormal olarak ekspres olmuş selfantijenlere karşıdır (Mikolajczyk ve ark. 1997, Mikolajczyk ve ark. 2001, Peter,2001, Tomkiel ve ark. 2002). p53’ün bağışıklık sağlayıcılığı, overekspres olmasından, nokta mutasyona uğramasından ve kanser hücrelerinin sitozol ve nukleusunun birikmesinden kaynaklandığına inanılmaktadır (Loyce ve ark. 2004, Nesterova ve ark. 2006, Noon ve ark. 2004, Lofton-Day ve Mode, 2008, Belinsky ve ark. 1998, Li ve ark., 2007 31-36). Overekspres olmuş proteinler kanserli hastalarda çok fazla antijen yüklenmesine ve birincil antikor oluşumuna neden oldukları bilinir. Kanser-testis antijenler (CTAs), germ hattındaki hücrelerde bulunurlar. Çeşitli tümörlerde ekspres olmuş onkofetal proteinler iyi bilinen TAAs proteinlerindendir (Jun ve ark. 2005, Rosenfeld ve ark. 2008, Macgregor ve Squire, 2002). CTAs ya da overekspres olmuş proteinler, self-proteinlere karşı immün tolerans oluşturabilmektedirler (Sanchez-Carbayo, 2004, Rosenfeld ve ark. 2008). Birçok tümör tipinde 40’tan fazla CTA gen ailesi bulunmuştur (Tothill, 2001). Bunlar, anormal olarak ekspres olmuş ve kanserli hastalarda immün yanıtı tetikler, karsinogeneze sebep olur. Antijenlerdeki modifikasyonun humoral yanıtı nasıl tetiklediği henüz net olarak bilinmemektedir (Tothill, 2003). Varsayımlardan bir tanesinde tümörlü hücrelerdeki modifiye intraselüler proteinler ayırıldığında hücrede anormal ölümler gözlemlenmektedir (Rosenfeld,2008, Belizaire, 2003, Mosbach, 1996, Wang ve ark. 2002). Anormal tümör hücresi ölümü, anormal apoptoza yönlenir ve apoptoz yerine nekroz gibi ölümlere yönelmeler vardır (Tansil ve ark. 2005). Tümör hücresi ölümleri gibi tekrar eden döngüler modifiye intraselüler proteinlerin ısrarcı oluşumlarına neden olur. Tümör hücresi ölümü, otoimmün yanıtı terikleyen kriptik self-epitopların oluşumuna neden olur. Diğer bir hipotez ise bazı TAAs’lar lökositlerin ve bu hücrelerdeki G-protein ile eşleşmiş olmamış dendritik hücrelerin göçüne neden olmaktadır (Zhu ve ark. 2005). Dokuya özgü TAAs’ların bu kemotaktik aktiviteleri, zarar görmüş dokulardan sinyal göndererek onarılmasını sağlar. Diğer hipotezler spesifik imminogenetik modifikasyonlara dayanır. TAAs’lar çapraz bağlı yabancı antijenle yapısal benzerlik gösterir. Ve bu yapısal benzerlik sonucunda humoral yanıtlarda da benzerlikler ortaya çıkar. Isıl şok proteinlerine bağlanan TAAs, ısıl şok proteinlerin bağışıklık sistemini düzenleyici özelliklerinin sonucu olarak imminogenetik olabilirler (Zordan ve Corn, 1997, Zhang ve ark. 2004). Tümörlü hücre yüzeyine yerleşen 4 intraselüler proteinler bağışıklığı harekete geçirecek kadar anormal şekilde olabilirler. Kanda bulunan tümör alakalı peptitler potansiyel antijen görevi görebilirler. Bu peptitler tümör intraselüler proteinlerden oluşmaktadır. Villanueva ve arkadaşları tümörlerin tümör-spesifik peptitlerden oluşan tamamlayıcı degredasyon yolakları ve ex viva koagülasyonlarının ürünü olan exoproteazlar içerdiklerini ortaya çıkarmıştır. TAAs’ları ortaya çıkaran serum otoantikorlar kanser hastalarında erken teşhis ve tedavi için rol oynamaktadırlar. Ayrıca birçok kanser hastasının serumunda bulunan otoantikorlar, proliferasyon, apoptoz, sinyal iletimi, hücre döngüsü gibi olaylarla alakalı olarak anormal özellikler sergilemektedir (Barker ve Tarlov, 2000). Bu imminolojikal “raporcuların” ya da “nöbetçilerin” hücresel mekanizmaları ne kadar iyi çözülürse erken kanser teşhisi için o kadar önemli adımlar atılmış olur (Gallie ve Philips, 1984, Sanchez-Carbayo, 2004). Kanser izlenmesi, semptomlardan dolayı medikal bulguların gözlenmediği bireylere uygulanan sistematik testleri kapsamaktadır. Kanserden ölüm riski kanserin yayılımı ve fazın derecesinin artmasına paralel olarak artmaktadır. Kanser izlenmesinin amacı onu erken dönemde yani asimptomatik fazda belirlemektir. Bu aşamadaki problem çoğu kanser izleme testi kısmen yetersiz olması ve kanserler izlenme sonucu belirlenmeden önce metastaz yapmış olabilmektedirler. Kanser izleme testleri arasındaki hassasiyet farklanabilmektedir. %100 hassas bir test yöntemi izlenen populasyondaki tim kanserleri belirlemektedir. Hassasiyetliğin derecesinin hesaplanması beklenen kanser türlerinin oranına bağlıdır. Bu hesabı yaparken kanser türünün iyi belirlenmiş olması şarttır. Hassasiyet ayrıca neoplazi olmaksızın bireyler üzerinde yapılan testlerde ortaya çıkan negatif sonuçların oranıdır (Maciosek 2006). İzlenmenin avantaj ve dezavantajları çok ciddi bir şekilde tartışılmalıdır ve bu durum kanser türleri ve testlerine göre oldukça farklılık göstermektedir. Bu noktada hemen tüm kanser izleme testleri için 3 temel problem göze çarpmaktadır; gecikme zamanı, periyot ve seçim eğilimi. Bu faktörlerin tümü, bir kanserin ölümcüllüğünün azaltılmasında kullanılan bir methodun izlenmesinin etkinliğini bozmaktadır (Pinsky 2007). Bir biyomarker için en önemli iki özellik seçiciliği ve hassaslığıdır. Hassaslık, kanser hastalarının tümünü içeren bir parametredir. Seçicilik parametresi ise kanserli hastayı sağlıklı hastadan ayıran ve tüm insanları içeren bir parametredir. İdeal bir biyomarker, %100 hassaslığa ve seçiciliğe sahip olandır. Bu çalışmada HER3 (Human Epidermal Growth Factor) biyomarkeri kullanılarak hassas ve seçici bir biyosensör tasarlanması planlanmıştır. 2.4. Heat Shock Protein 70 (HSP70) Şaperonlar ya da ısı şoku proteinleri (heat-shock proteins; Hsp) ilk kez ısı şokuna maruz kalan hücrelerde tanımlanmıştır. Normal fizyolojik koşullarda, bu proteinlerin görevi; proteinlerin çökmesini önlemek, yeni sentezlenen proteinlerin üçüncül yapılarını kazanmasını sağlamak, yanlış katlanmış ve çökmüş proteinleri birbirinden ayırmak ve doğru katlanmasını sağlamak, ribozomdan görev alacağı yerlere taşımaktır. Stres koşullarında bu proteinlerin sentezi hızlanır. Hücre farklılaşmasında da önemli rol oynadıkları bilinmektedir. HSP’ler evrimsel açıdan korunmuş moleküllerdir. Gerek hücre içinde sitoplazma ve organellerde (mitokondri, endoplazmik retikulum); gerek hücre dışında görülebilirler, hatta hücre membranlarında bile gözlenebilirler. Bazı şaperonlar işlev görebilmeleri için ko-şaperonlarına ihtiyaç duyarlar. Kanserleşen hücreler sınırsız bölünme yeteneği, lokal çevrenin kullanımındaki değişiklikler, yakın veya uzak dokulara yayılma gibi özellikler kazanır. Birçok kanser hücresi yüksek dozda şaperon üretir. Kanser hücrelerinde şaperonlar, protein kinazların ve hücre büyümesi yolağındaki transkripsiyon faktörlerinin kararlı hale getirilmesinde, p53 aracılığıyla hücre döngüsünün kontrolünün etkilenmesinde, hücre dışına salınan HSP’ler ise kanser hücrelerinin çevre ve uzak dokulara yayılmasında rol oynarlar. Kanser tedavi yaklaşımlarından biri de şaperonların etkisiz hale getirilmesidir (Calderwood ve ark, 2006). 5 HSP70 bu protein ailesinin arasında stresle uyarılabilir ana proteindir. HSP70’ in fazla miktarda üretilmesi hücrede tümör oluşumuna yardımcı olur. İnsanda meme kanseri MCF-7 hücrelerinde fazla üretilmiş HSP70 G0/ G1 fazını kısaltarak hücre büyümesini hızlandırır. Bu HSP70in siklinD1’in stabilize etmesiyle ilgili olabileceği kabul edilmektedir. HSP70in azalışı ağız kanser hücreleri gibi bazı tümör hücrelerini apoptoza sürükler. Normal hücreler ise HSP70 in azalışıyla yaşama yeteneklerini yitirmezler. HSP70-2’nin tümör ilerletici aktivitelerde p53 baskılanmasında rolü vardır. Kanser ilerlemesinde HSP70ler kofaktörlerle beraber çalışabilirler (Sherman ve ark, 2007). HSP70 proteini idrar kesesi üroteliyal kanserinde, prostat kanserinde, pankreas kanserinde, meme kanserinde, endometriyal kanserde ve karaciğer kanserinde biyomarker olarak da kullanılmıştır. Biyomarkerların belirlenebilmesine yönelik yeni metodların geliştirilmesi ve yeni biyomarker gruplarının ortaya çıkarılması yeni inceleme alanlarının ortaya çıkmasını sağlamaktadır. Bu amaca yönelik olarak birçok eski teknik ve yeni geliştirilen teknikler kullanılmaya devam edilmektedir. Genom izlenmesi, genomik DNAdaki anormallikler tümör markerlarının belirlenebilmesini sağlamaktadır. Yeniden gen düzenlenmeleri, delesyonlar ve amplifikasyonlar bu tekniklerin merkezini oluşturmaktadır. RNA ekspresyonunun incelenmesi zor bir yoldur. Çünkü bu teknikte istenen RNA’nın izolasyonu gerekmektedir. Birçok teknik binlerce genin incelenmesine olanak vermektedir. Spesifik cDNA veya oligonükleotidlerin küçük miktarları katı bir destek üzerine sabitlenerek bir array düzenlenebilir. Normal ve tümör hücrelerinden gelen test RNA sı array deki komplementeriyle hibridizasyona tabi tutulur. Böylelikle RNA’nın miktarı kantitatif olarak tayin edilebilir. Bu teknik mikroarray olarak adlandırılmaktadır. RNA’nın mikroarraylerle belirlenmesi zordur. Fakat SAGE( Serial Analysis of Gene Expression) RNA ekspresyonunun çalışılmasında kullanılan kantitatif bir yöntemdir, ancak bu metodun teknik karmaşıklığı kullanımını oldukça sınırlandırmaktadır. Ters transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu da son zamanlarda kullanılan teknklerden bir tanesidir. Geri transkripsiyon ve ardından polimeraz zincir reaksiyonu RNA ekspresyonu için kullanılmaktadır. Bu teknolojiyi kullanan bir ticari klinik deney piyasaya çıkmak üzeredir. Bir diğer metod proteomik çalışmaları temel almaktadır. Geleneksel metodların çoğu bir tek proteini incelemektedir. Bunun en önemli örneği immunohistokimyadır. Ayırma teknikleri ve kütle spektrometresindeki son gelişmeler de çoklu protein örneklerinin ölçümüne olanak sağlamaktadır. Özellikle SELDI ve MALDI kütle spektrometreleri doku örneklerinden binlerce peptidin belirlenebilmesini mümkün kılmaktadır. Biyosensörlerin ilk rapor edildiği tarihten günümüze kadar geçen yaklaşık 65 yıllık süreçte, sayısız biyoreseptör, çok farklı transduser ile entegre edilerek değişik amaçlar için biyosensörler geliştirilmiştir. Bu araştırma çalışmalarına paralel olarak, ticari anlamda da biyosensör pazarı oldukça hızlı ilerleyerek, sağlık, savunma ve gıda gibi alanlarda kullanılmak üzere değişik ticari ürünler piyasaya sürülmüş ve halen kullanılmaktadır. Elektrokimyasal biyosensörler günümüzde en sık kullanılan sistemlerden bir tanesidir. Bu sistemler içinde impedans temelli olan biyosensörler ise son yıllarda çok önemli avantajlarından dolayı sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır. Elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS), kimyasal ve fiziksel özelliklerdeki değişimlere karşı çok duyarlı bir belirteç olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu teknik çeşitli kaplamalar, piller, yakıt hücreleri gibi incelemelerin analizi ve karakterizasyonlarında, elektrot kinetiği, iletken polimerler, yarı iletkenler ve sensörler ve biyosensörler gibi araştırma alanlarında çok açıklayıcı bilgiler sunar. Elektrot yüzeylerine immobilize edilen nükleik asitler, hücre ve mikroorganizmalarla geliştirilen biyosensörler, bunların karakterizasyonu ve kullanımı alanlarında da çok önemli olanaklar sunmaktadır. Elektrokimyasal impedans spektroskopisi özellikle enzimler dışında, katalitik olmayan biyomolekül etkileşimlerinin (antijen-antikor, DNA gibi) algılanmasında 6 özellikle yüzey plazmon rezonans (SPR) ve piezoelektrik esaslı yöntemlere kıyasla daha kolay uygulanabilir, ekonomik ve pratik bir seçenek sunar. Bu nedenle son yıllarda, özellikle immunolojik esaslı biyomolekül etkileşimlerini esas alan analiz amaçlarına yönelik biyosensör teknolojilerinin geliştirilmesinde algılayıcı sistem olarak elektrokimyasal impedans spektroskopisi önemli çözümler vaat etmektedir. Elektrokimyasal impedans spektroskopisi esaslı biyosensör teknolojilerinde, sistemden sinyallerin alınmasını sağlayacak ileri biyomembran oluşturma tekniklerinin geliştirilmesi, bunların karaterizasyonu ve değişimlerinin belirlenmesi de sistemin kendisi tarafından yapılabilmektedir. Bu özellik temel araştırma alanına yönelik ayrıntılı bilgi birikimine imkan vermesi açısından da çok önemlidir. Elektokimyasal impedans spektroskopisi (EIS), sistemlerin kompleks elektriksel dirençlerini, yüzey hassasiyetlerini ve miktarlarındaki değişimleri analiz etmede kullanılan çok etkili ve kullanışlı bir metottur. Metal korozyon mekanizmalarının aydınlatılmasında, membranlar boyunca yük aktarımı ve membran/çözelti ara yüzeylerinin karakterizasyonunda ve optimizasyonunda çok sıklıkla kullanılmaktadır. Son yıllarda ise biyosensörlerin hem hazırlanma aşamalarının, hem de biyomoleküllerin spesifik etkileşimlerinin izlenmesi ve kantitatif analizlerinde çok yoğun bir şekilde tercih edilmeye başlanmıştır. EIS’nin kullanımı ile ilgili ilk örnekler 1980'lerin sonunda rapor edilmiş olmasına rağmen metodun uygulamaları, enstrümantasyondaki ilerlemelere bağlı olarak son yıllarda çok fazla artış göstermiştir. Çünkü elektrokimyasal impedans spektroskopisinin kompleks parametreleri enstrümanların her türlü donanımından çok fazla etkilenebilmektedir. İmpedans teknikleri ile biyoreseptör ve onun analiti arasındaki etkileşimin belirlenmesinin yanı sıra, transduserde biyomoleküllerin immobilizasyonu boyunca meydana gelen olaylarda olduğu gibi, yüzey modifikasyonun karakterizasyonları da başarıyla gerçekleştirilebilir. Bu özellikleri ile impedans aynı zamanda, yüzey morfolojisinin görüntüleme teknikleriyle aydınlatılmasında yardımcı ve çok önemli bir araçtır. Bir sistemin impedansı genellikle küçük bir genlikli potansiyel uygulanması ve akım cevabının belirlenmesiyle tayin edilir. Bu tanımdan yola çıkarak impedans; potansiyel-zaman fonksiyonun V(t) akım-zaman I(t) fonksiyonuna bölümüdür. V0 ve I0 maksimum değere ulaştıklarında, f; frekans, t; zaman, φ potansiyel-zaman ve akım-zaman arasındaki faz kaymasıdır. Y ise kompleks iletkenlik veya admittanstır. İmpedans kompleks bir değerdir; çünkü akım sadece genlik açısından farklılık göstermekle kalmaz, potansiyel-zaman fonksiyonuyla kıyaslandığında faz kayması da gösterir. Bu yüzden değer ya |Z| ve faz kayması φ ya da reel ZR ve imgesel ZI olarak tanımlanabilir. 7 Şekil 2.1 İmpedans’ın potansiyel(zaman) ve akım(zaman) büyüklüklerine bağımlı matematiksel gösterimi Bu durum, şekil 2.1.'de gösterilmiştir. Dolayısıyla impedans ölçümlerinin sonuçları iki şekilde gösterilebilir: Bode grafiği (logf'nin fonksiyonu olarak logZ ve ) veya ZR ve ZI'nın olduğu Nyquist grafiği şeklinde. İmpedans "spektroskopisi" adı, impedansın tek bir frekanstan ziyade farklı frekansları tayin edebilme gerçeğinden türemiştir. Bu sayede bir impedans spektrumundan yüzeylerin, tabakaların veya membranların değişim ve difüzyon prosesleri ve karakterizasyonu hakkında bilgi sağlanır. Bu bilgilere ulaşmak için, impedans spektrumu genellikle eşdeğer devre kullanılarak analiz edilir. Genellikle direnç ve kapasitanstan oluşan bu devre incelenen sistemin farklı fizikokimyasal özelliklerini açıklar. Ayrıca sistem; elektrokinetik, difüzyon, partisyon gibi temel yasalardan türeyen transfer fonksiyonları temelinde de tanımlanabilir. Bu durumda bir impedans elementinin -direnç veya kapasitans- değişimi çözeltinin bileşiminin bir fonksiyonu olarak değerlendirilir. Bazı durumlarda, tüm impedansla konsantrasyondaki değişim arasında ilişki kurmak mümkündür. Elektrokimyasal impedans spektroskopisinde, elektrolit çözeltisi sistemin tek bileşeni olarak incelendiğinde, impedans davranışı açıklamak için 4 unsur kullanılır: ohmik direnç, kapasitans, sabit faz ögesi ve Warburg impedans. Bu unsurlar ve tanımlamalarının özeti tablo 2.1'de verilmiştir. Tablo 2.1. Biyoelektrokimyasal sistemleri tanımlamakta çok sıklıkla kullanılan impedans elemanlarının tanımlanmaları, frekans bağımlılıkları ve faz kaymaları 8 Eşdeğer devreler, deneysel impedans verilerini seri ve/veya paralel düzenlenmiş ideal impedans unsurlarla yaklaşık olarak belirlemek için kullanılır. Çoğu elektrokimyasal sistem bu prosedüre göre analiz edilir. Bir elektrolitle bir elektrodun temasta olduğu bir sistem Randles devresi- çözelti direnci, Rs, yük transfer direnci, Rct, çift tabaka kapasitans Cdl ve Warburg impedans, W. Şekil 2'de gösterilen Nyquist grafiğinde Rs ve Rct değerleri kolaylıkla belirlenebilir. Çift tabaka kapasitansı ise yarım dairenin maksimum yaptığı noktadaki frekanstan hesaplanabilir. Şekil 2.2 Bir elektrolitle kontakt halindeki elektroda ilişkin Randles eşdeğer devre modeli Biyolojik bir materyali karakterize etmek için (antikor gibi) elektrotlar sisteme uygulanmalı böylece elektrokimyasal hücre elde edilmelidir. AC potansiyel uygulanması ile birlikte, akım tüm sistem elemanlarını -çalışma elektrodu, biyolojik materyal, çözelti ve karşıt elektrot- dolaşmaya başlayacaktır. Ölçülen impedans, bu elemanların bireysel katkılarının bir özetidir aslında. a) Biyolojik bir materyalin impedansı ya belirli bir analitin konsantrasyonunun fonksiyonu ya da zamanın bir fonksiyonudur. Her iki durumda da her iki elektrodun impedansı, ölçülecek impedansa kıyasla küçük olmalıdır. Bu da geniş yüzey alanları kullanılarak sağlanabilir. Ayrıca, çözeltiden kaynaklanabilecek biyolojik materyalin nonspesifik bağlanmalarından kaçınılmalıdır, çünkü bu durum ara yüzey impedansı artırır. b) Çalışma elektroduna biyolojik bileşen immobilize edilir ve analitle ilişkisi tayin edilir. Bu, tipik bir biyosensör uygulamasıdır. Burada duyar elektrotun impedansı (yani biyolojik materyalle modifiye edilmiş çalışma elektrodu) aslında tüm impedansı kontrol eder. Bu yüzden, karşıt elektrodun impedansı belirgin şekilde küçük olmalıdır. Bu da duyar elektroda göre en az 10 kat daha büyük (alan) elektrot kullanılarak sağlanabilir. 9 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Deneyde kullanılan tüm reaktifler, HSP70 ve anti-HSP70 Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA)’ den alınmıştır. Tüm seyreltme işlemleri pH 7’ de 0.01M olarak hazırlanan fosfat tampon ile yapıldı. HSP70 ve antiHSP70 belli konsantrasyonlarda porsiyonlama yaparak -20ºC’ de muhafaza edilmiştir. Çalışma elektrotu olarak yüzey kullan-at ITO-PET, referans elektrot olarak KCl ile doygunlaşmış 3 M Ag/AgCl elektrot ve yardımcı elektrot olarak ise 10 cm uzunluğunda platin tel kullanılmıştır. Referans ve yardımcı elektrotlar iBAS, Warwickshire, UK firmasından, ITO-PET elektrot Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA) firmasından getirtilmiştir. Ölçümler ise döngüsel voltametri ve elektrokimyasal impedans spektroskopi yazılımı olan Echem Analyst içeren (Gamry Instruments, Warminster, USA) bir bilgisayara bağlı Gamry Potentiostate/Galvanostate, Reference 600 (Gamry Instruments, Warminster, USA) cihazında alınmıştır. 3.2. Elektrokimyasal Ölçümler ITO elektrota uygulanan bütün immobilizasyon işlemlerinin karakterizasyonunu ölçmek için döngüsel voltametriden (CV) ve elektrokimysal impedans spektrokopisinden (EIS) yararlanılmıştır. CV için potansiyel aralığı -0,5 - 1 V arasında seçilmiş olup (adım büyüklüğü: 20 mV, tarama hızı: 50 mV/s) ölçümler 0.1 M KCl içeren ve ölçüm için redoks probu sunan 5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1) çözeltisi içinde gerçekleştirilmiştir. Elektrokimyasal impedans ölçümleri ise 10 mV alternatif akımda gerçekleştirilmiştir. Ölçümde kullanılan redoks çifti, döngüsel voltametredeki ile aynıdır. İmpedans spektrumları 10.000 – 0.05 Hz aralığındadır. Anti-HSP70’ in elektrot yüzeyine bağlanması gerçekleştirildikten sonraki aşama HSP70’ in elektrot yüzeyine bağlanmasını sağlamaktır. Standart HSP70 konsantrasyon tayin aralığı 1 fg/mL ila 166 fg/mL aralığında olacak şekilde 100er µL’lik porsiyonlara daldırılmıştır. Her inkübasyon periyodundan sonra elektrot yüzeyinde fiziksel olarak absorblanmış HSP70’ i uzaklaştırmak için ultra saf su ile yıkanarak ve Fe(CN)64−/3− redoks probu içeren çözeltinin bulunduğu hücrede CV ve EIS ölçümleri alınmıştır. 3.3. İmmobilizasyon Süreci 3.3.1. ITO Elektrotların Ölçüme Hazırlanması Indiyum tin oksit (ITO-PET) elektrotların immobilizasyon aşamasından önce elektrot temizliği için 10 ar dakika süre ile sırasıyla aseton-sabun çözeltisi ve saf suda ultrasonik banyoda elektrot temizliği sağlandı. Sonrasında elektrot yüzeyinin iletkenliğini sağlamak için 200 ppm altın çözeltisi ile hazırlanan altın nanopartikülle kaplandı. 3.3.2. Anti-HSP70’ in ITO Elektrot Yüzeye Kovalent Olarak İmmobilizasyonu Yüzeyi altın nanopartikül ile kaplanarak iletken hale getirilen ITO elektrot yüzeyine kendiliğinden oluşan tabaka (SAM) oluşturmak için 60 mM (0,015 mg/2ml etanolde) hazırlanan sisteamin çözeltisinin 100 µL’sine elektrot daldırılarak gece boyu beklendi. Sonrasında elektrot yüzeyi etanol ve su ile yıkanarak CV ve EIS ölçümleri alındı. 10 A B Şekil 3.1 Altın nanopartikülle kaplanan ITO elektrotun EIS ölçümü. B: Sisteamin ile SAM oluşturulduktan sonra alınan EIS ölçümü Sisteamin ile gece boyu inkübasyon ile kendiliğinden oluşan tabakalar (SAM) sayesinde en uç kısımda –SH grupları bulunur. Bu uçların altın nanopartiküle göre iletkenlikleri daha fazladır. Bu yüzden altınnanopartikül uygulanması sonrasında elde edilen EIS ölçümüne göre daha düşük sinyallerde EIS sonuçları beklenir. CV ölçümlerinde ise bu durum, katodik anodik pik farklarının artışından takip edilebilir. Bu işlemin ardından çapraz bağlayıcı ajan olarak glutaraldehitin eklenmesi ve ardından Anti-HSP70 immobilizasyonuyla EIS spektralarında artış ve CV voltammogramlarında düşüş gözlenmektedir. Bunun sebebi, aktif uçların kapanması ve iletkenliğin azalmasıdır. İletkenliğin azalmasıyla elektron transfer direnci de artmıştır. Şekil 3.2 anti HSP70in immobilizasyon adımlarına ait CV voltamogramı ve EIS (B) spektrumu (---): ITO/sisteamin (---): ITO/sisteamin/antiHSP (-■-■-):ITO/sisteamin/antiHSP/BSA 11 3.3.3 HSP70 Biyomarkerının Tayini Artık biyomarkeri tespit etmek için biyosensör sistemi hazırlanmış olup, hazırlanan bu biyosensör 1 saat aralıklarla 5 kez farklı HSP70 konsantrasyonlarıyla inkübasyona bırakılmıştır. Her konsantrasyondaki HSP70 in ilavesinden sonra EIS ve CV ölçümleri alınmış ve böylelikle tayin takip edilmiştir. Yüzey direncinin artması EIS spektrumlarında net bir artışı beraberinde getirir. Aynı sonuç, CV piklerinde azalma olarak gözlenmiştir. 12 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1. İmmobilizasyon Basamakları Bu çalışmada çalışma elektrodu olarak kullanılan ITO-PET elektrot imobilizasyon basamakları öncesinde aseton-sabun çözeltisi-saf su ile ultrasonik temizlik yapılarak yüzeyi iletken hale getirebilmek için fiziksel olarak altın nanopartikül ile kaplanmıştır. İletken hale getirilen yüzey, SAM oluşturmak için sisteamin çözeltisinde gece boyu bırakılarak yüzeyde SH uçları oluşturulmuştur. CV ve EIS ölçümlerine bakıldığında altın nanopartikül ile iletken hale gelerek düşen EIS sinyalleri, sisteamin bağlanması sonucu iyice düşmüştür. Buna karşılık CV piklerinde gözle görülür artış gözlemlenmektedir. Bu işlemin ardından glutaraldehit ve Anti-HSP70 eklenmesiyle amino uçları bağlanmıştır. Bu da EIS ve CV ölçümlerinde bir önceki adıma göre, EIS’de artış CV’de ise bir azalış olarak görünür. Bunun sebebi, aktif uçların kapanması ve iletkenliğin azalmasıdır. İletkenliğin azalmasıyla elektron transfer direnci de artmıştır. Antikorun bağlayamadığı açık uçları kapatmak için 30 dakika süre ile BSA (Bovin Serum Albumin) kullanılmıştır. Bu aşamada da iletkenliğin biraz daha azalmasıyla BSA’nın bağlandığı, EIS ölçümünün artması ve CV ölçümünde ise biraz daha bir azalma olduğu görülmektedir. 4.2. Optimizasyon Basamakları 4.2.1. Anti-HSP70 Konsantrasyonunun Belirlenmesi Antikor eklenmesi için hazır hale getirilen elektrotlara farklı anti-HSP70 konsantrasyonlarında inkübasyon yapılmıştır. Bu konsantrasyonlar 0,25, 0,5, 1 ve 2 ve 8 µg/ml olarak belirlenmiştir. 1 saatlik inkübasyonun ardından CV ve EIS ölçümleri alınmıştır. Bloklama ajanı olarak BSA kullanılmış ve yarım saat inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra saatte bir olmak üzere her saat HSP70 eklenerek en iyi antikor konsantrasyonunun bulunması için CV ve EIS ölçümlerinin sonuçlarına bakılmıştır. 0,25, 0,5, 1, 2 ve 8 µg/ml konsantrasyonlarına ait hesaplanan R2 değerleri sırası ile 0,8108, 0,9758, 0,9578, 0,9357 ve 0,9359’dur. R2 değeri en yüksek 0,5 µg/mL’ye ait olmasına rağmen HSP70 bağlama kapasitesinin daha yüksek olması sonucunda optimum antiHSP70 konsantrasyonunun 1 µg/mL olduğuna karar verilmiştir. 13 1,20E+04 1,00E+04 ΔR (ohm) 8,00E+03 6,00E+03 4,00E+03 2,00E+03 0,00E+00 0 -2,00E+03 50 100 150 200 HSP-70 (fg/mL) Şekil 4.1 Farklı anti HSP70 konsantrasyonları ile hazırlanan ITO-AuNP temelli biyosensörün immobilizasyon kalibrasyon grafikleri (-■-■-): 0,5 µg/mL (---): 1 µg/mL , (-x-x-) : 0,25 µg/mL, (-*-*-): 2 µg/mL (---) : 8 µg/mL Şekil 4.2 Optimize edilmiş antiHSP70 konsantrasyonuna (1 µg/mL) ait EIS spektrumu 4.2.2 AntiHSP70 İnkubasyon Süresinin Belirlenmesi Yüzeyinde SAM oluşturulan elektrot yüzeyine ne kadar sürede etkili bir bağlanma olacağını anlayabilmek ve daha sonrasında antijen bağlama kapasitesinin ne kadar sürede daha fazla olacağını görmek için antiHSP70 süre optimizasyonu yapıldı. Süre olarak antiHSP70 ekledikten sonra 30, 60, 75 ve 90 dakika sonrasında CV ve EIS ölçümleri alındı ve R2 değerleri hesaplandı. 30, 60, 75 ve 90 dakikalara ait R2 değerleri sırası ile 0,2793, 0,9578, 0,9802 ve 0,7374’tür. En yüksek R2 değerine ve de sonrasında antijen bağlama miktarlarına bakılarak en uygun sürenin 75 dakika olduğuna karar verildi. Fazla bekleme süreleri sonrasında proteinin yüzeyde bozunduğu gözlemlenmiştir. Daha kısa sürede ise protein 14 yüzeye yeterli miktarda bağlanmadığı için marker eklemelerinde istenilen sonuç alınamamıştır. 1,80E+04 1,60E+04 1,40E+04 ΔR (ohm) 1,20E+04 1,00E+04 8,00E+03 6,00E+03 4,00E+03 2,00E+03 0,00E+00 0 50 100 150 200 HSP-70 (fg/mL) Şekil 4.3 anti HSP-70nin farklı sürelerle inkübe edilmesiyle hazırlanan ITO temelli biyosensörün immobilizasyon kalibrasyon grafikleri ( ---): 90 dakika (-■-■-): 30 dakika (---): 60 dakika, (x-x-) : 75 dakika Şekil 4.4 Optimize edilmiş antiHSP inkübasyon süresine (75 dakika) ait EIS spektrumu 4 4.2.5 Tekrarlanabilirlik Bütün basamakların optimizasyon koşulları sağlandıktan sonra uygun konsantrasyonlar ve zamanlarda tekrarlanabilirlik sonuçları alındı. Bu sonuçlara göre ölçümlerin korelasyon sabiti % 5,85 olarak, ortalama değer ve standart sapması 16,4 fg/mL ve ±0.96 fg/mL olarak hesaplanmıştır. Sonuçlara göre biyosensörün tekrarlanabilir bir sistem olduğu anlaşılmaktadır. Şekil 4.6’da ise optimize edilmiş ve tayin aralığı 1-166 fg/mL olan, antiHSP70 temelli HSP70 biyosensörünün kalibrasyon grafiği görülmektedir. 15 Tablo 4.1. Tekrarlanabilirlik ve R² değerleri Biyosensör R² 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 y 0,9974 0,999 0,9855 0,9917 0,9998 0,999 0,9982 0,9945 0,9778 0,9966 0,9995 0,9942 Aralık (fg/mL) 41303x + 574,41 24673x + 112,77 66093x + 481,67 101274x + 488,61 146227x + 27,956 125412x - 217 224353x + 330,64 78013x + 634,71 48068x + 694,91 70843x - 178,02 102017x + 200,15 124822x + 351,06 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 1-166 166 fg/mL 1 fg/mL Şekil 4.5 Tasarlanan ITO AuNP temelli biyosensörün optimum şartlarına ait EIS spektrumları (---): ITO/sisteamin (-■-■-): ITO/sisteamin/antiHSP70 (---): ITO/sisteamin/antiHSP70/BSA ( ---): ITO/sisteamin/antiHSP70/BSA/HSP70 18000 16000 14000 12000 y = 102,02x + 200,15 R² = 0,9995 ΔRct(Ω) 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 50 100 150 200 HSP70 konsantrasyonu (fg/mL) Şekil 4.6 Optimal şartlardaki ITO-AuNP temelli biyosensörün kalibrasyon grafiği 16 4.2.6. Single Frequency Ölçümleri HSP70 ve antiHSP70 arasındaki etkileşimin karakterizasyonu için single frequence tekniği kullanıldı. Bu teknik, zamana karşı sabit bir frekansın ölçümüne dayanmaktadır. Böylece tekrarlayan zaman dilimlerinde ve toplam zamanda impedans değişimleri kontrol edilebilmektedir. Bu amaçla 1 Hz sabit frekans ile impedans ölçümü zamanın ve faz açısının fonksiyonları olarak ölçüldü. Şekil 4.7 antiHSP70 temelli biyosensöre HSP70 bağlanmasının gerçek zamanlı ve tek frekansta yapılan single frequency ölçümü 5 4.2.7. ITO Temelli AntiHSP70 Biyosensörün SEM Görüntüleri Şekil 4.7’de biyosensör yüzeyinin SEM görüntüleri görülmektedir. A’da elektrot yüzeyinin iletken yapı kazanabilmesi için yüzeye fiziksel olarak tutunan altın nanopartiküller görülmektedir. Nanopartikül çap boyutu ölçüldüğü gibi 50 nm ila 80 nm aralığındadır. B’de ise yüzeydeki sisteamin ile oluşturulan SAM tabakası görülmektedir. C’de antiHSP70 moleküllerinin küreler şeklinde yüzeye tutunması net bir şekilde görülmektedir. D’de yüzeyde antiHSP70 moleküllerinin yanı sıra farklı olarak yüzeydeki aktif uçların kapanması için kullanılan BSA moleküllerinin yüzeye bağlanması görülmektedir. Son olarak E’de ise ITO yüzeyinde antiHSP70 molekülleri ile etkileşime giren HSP70 moleküllerini net bir biçimde gözlenmektedir. 17 Şekil4.8 ITO elektrot yüzeyi SEM görüntüleri A:Altın nanopartikül B:Sisteamin C:AntiHSP70 D:BSA E:HSP70 4.2.7. Depo Ölçümleri ITO-PET kullan-at elektrot ile hazırlanan HSP70 ölçmeye yönelik anti-HSP70 temelli biyosensörün raf ömrünü tespit etmek amacı ile 5 gün ve 15 gün bekleme sonucunda alınan ölçümler oldukça başarılıdır. SÜRE 5 gün 15 gün y 1271,1x + 1897,4 182,17x + 1265,2 18 R2 0,9981 0,974 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Küresel kanser yükü geçtiğimiz 30 yıl zarfında iki kattan daha fazla artmıştır. 2008’de 12 milyon yeni kanser vakasının teşhis edildiği, kanserden kaynaklanan 7 milyon ölümün gerçekleştiği ve kanserli 25 milyon kişinin halen hayatta olduğu tahmin edilmektedir. Dünya nüfusunun süregelen artışı ve yaşlanması kanser yükü üzerinde de büyük değişikliklere yol açacaktır. 2030’a gelindiğinde 27 milyon kanser vakası, kanserden kaynaklanan yıllık 17 milyon ölüm ve son beş yıl içinde kanser tanısı konmuş 75 milyon kişi rakamlarına ulaşılması beklenebilir. Kanser, insanlığı bu kadar tehdit eden bir hastalık olmuşken onun daha kolay teşhis edilebileceği yeni yöntemler bulmak gerekmektedir. Kanserde erken teşhis, uygulanacak tedavinin başarısı ve yaşama şansının artması bakımından hayati önem taşımaktadır. Bu sebeple hassas ve spesifik teşhis yöntemleri geliştirilmektedir. Biyomarkerlerin kan, idrar ve diğer vücut sıvılarında analizi ile geliştirilen yöntemler, kanser teşhisi için alternatif yöntemler sunmaktadırlar. Bu çeşit analizler, sağlık çalışanlarına hasta ile ilgili gerekli ilgileri zamanında sunmakta, böylece kısa sürede tedavi yöntemi belirlenebilmekte ve hastanın yaşam süresi uzamaktadır. Biyosensörler, fizikokimyasal transduser ile bütünleştirilmiş ya da alakalandırılmış moleküler tanımlama cihazıdır. Bu cihazlar point-of-care olarak sınıflandırılabilirler ve bu şekilde evde ya da klinikte kullanılabilme imkânına sahiptirler. Uygun bir biyosensör tasarlarken cihazın spesifikliğini belli bir markere olan hassaslığı belirlemektedir. Biyosensörler, kolay kullanım, ucuzluk ve çabuk sonuç verme gibi avantajlar sağlamaktadırlar. Elektokimyasal impedans spektroskopisi (EIS), sistemlerin kompleks elektriksel dirençlerini, yüzey hassasiyetlerini ve miktarlarındaki değişimleri analiz etmede kullanılan çok etkili ve kullanışlı bir metottur. Son yıllarda biyosensörlerin hem hazırlanma aşamalarının, hem de biyomoleküllerin spesifik etkileşimlerinin izlenmesi ve kantitatif analizlerinde çok yoğun bir şekilde tercih edilmeye başlanmıştır. EIS’nin kullanımı ile ilgili ilk örnekler 1980'lerin sonunda rapor edilmiş olmasına rağmen metodun uygulamaları, enstrümantasyondaki ilerlemelere bağlı olarak son yıllarda çok fazla artış göstermiştir. Çünkü elektrokimyasal impedans spektroskopisinin kompleks parametreleri enstrümanların her türlü donanımından çok fazla etkilenebilmektedir. İmpedans teknikleri ile biyoreseptör ve onun analiti arasındaki etkileşimin belirlenmesinin yanı sıra, transduserde biyomoleküllerin immobilizasyonu boyunca meydana gelen olaylarda olduğu gibi, yüzey modifikasyonun karakterizasyonları da başarıyla gerçekleştirilebilir. Bu özellikleri ile impedans aynı zamanda, yüzey morfolojisinin görüntüleme teknikleriyle aydınlatılmasında yardımcı ve çok önemli bir araçtır. Bu çalışmada, serumdaki artış miktarı birçok kanser türü için teşhis olanağı sağlayan bir otoantikor olan HSP70 tayinine yönelik antiHSP70 bazlı kullan-at biyosensör tasarlanmıştır. Bunun için öncelikle döngüsel voltametri ve elektrokimyasal impedans spektroskopisi ile imobilizasyon adımları ve HSP70’in elektrot yüzeyine bağlanması incelenmiştir. Biyosensörün başarılı sonuçlar vermesi için tüm adımlar optimize edilmiştir. Bu adımlardan antiHSP70 konsantrasyonu 1 µg/mL olarak belirlenmiştir. İkinci bir adım olarak biyosensör tayin aralığı 1-166 pg/mL olarak tespit edilmiştir. Biyosensör için önemli adımlardan biri tekrarlanabilir bir sistem olmasıdır. Farklı zamanlarda alınan ölçümler sonucunda sistemin tekrarlanabilirliği tespit edilmiştir. Ayrıca biyosensörün raf ömrü tayini için 5 ve 15 günlük beklemeler sonucu alınan sonuçlar oldukça başarılıdır. Gerçek serum örneği ile de tasarlanan biyosensörün laboratuar şartlarında gerçek serumdaki HSP70 tayinini başarıyla saptadığı görülmüştür. 19 KAYNAKLAR Barker, S.L.R., Tarlov, M.J., Canavan, H., Hickman, J.J., Locascio, L.E (2000). Analytical Chemistry, 72: 4899–4903. Barrett, A.J., Rawlings, N.D (2001). Biological Chemistry 382(5): 727–33. Belinsky, S.A., Nikula, K.J., Palmisano, W.A (1998). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95(20):11891–11896. Belizaire, A.K., Tchistiakova, L., St-Pierre, Y., Alakhov, V (2003). Biochemical and Biophysical Research Communications, 309:625–630. Boyle P, Levin B (2008). Dünya Sağlık Örgütü Uluslar arası Kanser Araştırma Kurumu Dünya Kanser Raporu, Lyon. Bromme, D. Kaleta, J (2002). Current Pharmaceutical Design 8(18):1639–58. Calderwood SK, Khaleque MA, Sawyer DB, Ciocca DR (2006). Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis, Trends Biochemical Science, 31(3):164-72. Figler, B.D., Reuther, A.M., Dhar, N (2007). Urology 70(4):711–716. Gallie, B.L., Phillips, R.A (1984). Ophthalmology 91:666–672. Gunawardana, C.G, Diamandis, E.P (2007). Cancer Letters 249:110–9. Herrera, L.J., Raja, S., Gooding, W.E., (2005) Clinical Chemistry 51(1):113–118. Hoon, D.S., Spugnardi, M., Kuo, C., Huang, S.K., Morton, D.L., Taback, B (2004). Oncogene 23(22):4014–4022. Iacobuzio-Donahue, C.A., Ashfaq, R., Maitra, A (2003). Cancer Research 63(24), 8614– 8622. Jedeszko, C., Sloane, B.F (2004). Biological Chemistry 385(11), 1017–1027. Lah, T.T., Kos, J (1998). Biological Chemistry 379(2), 125–130. Leslie, N.R., Downes, C.P (2004). Biochemical Journal 382:1–11. Li, M., Feldstein, J.T., Weinberg, R.A (2007) Nature 449(7163):682–688. Lofton-Day, C., Mode,l F., Vos, T.D (2008). Clinical Chemistry 54(2):414–423. Jordan, C.E., Corn, R.M (1997), Analytical Chemistry 69:1449–1456. Joyce, J.A., Baruch, A., Chehade, K (2004). Cancer Cell 5(5):443–453. Joyce, J.A., Hanahan, D (2004). Cell Cycle 315(12):1516–1519. Jun, L., Gad, G., Eric, A. Miska, (2005). Nature 435(7043):834–838. Macgregor, P.F., Squire, J.A., (2002) Clinical Chemistry 48:1170–1177. Mikolajczyk, S.D., Millar, L.S.,, Wang, T.J (2000). Cancer Research 60(3):756–759. Mikolajczyk, S.D., Grauer, L.S., Millar, L.S. (1997). Urology 50(5):710–714. Mikolajczyk, S.D., Marker, K.M., Millar, L.S. (2001) Cancer Res. 61(18), 6958–6963. Maciosek M, Edwards N, Coffield A (2006). Priorities among effective clinical preventive services. Am J Prev Med, 31: 90–96. Mosbach, K, Ramstrom,O. (1996) Biotechnology, 14, 65–70. Neaves P, Waddell MJ, Prentice GA (1988). A medium for the detection of Lancefield Group D cocci in skimmed milk powder by measurement of conductivity changes. Journal of Applied Bacteriology, 65: 437–448. Nesterova, M.V., Johnson, M., Cheadle, C. (2006) Cancer Res. 66(18), 8971–8974. Peter, J. (2001) Cancer Res. 61(3), 957–959. Pinsky P, Andriole G, Graha E, (2007). Prostate-specific antigen velocity and prostate cancer. Gleason grade and stage. Cancer, 109: 1689–95. Robert, V., Michel, P., Flaman, J.M., Chiron, A., Martin, C., Charbonnier, F., Paillot, B., Frebourg, T., (2000) Carcinogenesis 21, 563–565. Rosenfeld, N., Aharonov, R., Meiri, E. (2008) Nat. Biotechnol. 28(4), 462–469. Ross J.S, Fletcher J.A, Bloom K.J, Linette G.P, Stec J, Symmans W. (2004) Mol Cell Proteomics 3, 379–98. 20 Sherman M, Multhoff G, Heat shock proteins in cancer, Ann N Y Acad Sci, 1113:192-201, 2007. Soper, S.A, Brown, K. Ellington, A. Frazier, B. Garcia-Manero, G. G.V, (2006) Biosens Bioelectron, 21, 932–42. Stearns V, Yamauchi H, Hayes DF (1998). Circulating tumour markers in breast cancer: accepted utilities a novel prospect. Breast Cancer Res. Treat., 52: 239-259. Tansil, N.C, Xie, F., Xie, H., Gao, Z. (2005) Chem Commun, 8, 1064–1066. Tomkiel, J.E., Alansari, H., Tang, N. (2002) Clin Cancer Res. 8(3), 752–758. Tothill, I.E. (2001) Comput Electron Agric 30, 205–218. Tothill IE. (2003) Woodhead Publishing Limited;. ISBN: 1-85573-674-678. Wang, P.C., Gao, J., Lee, C.S., (2002) J. Chromatogr. A 942, 115–122. Zhang B, Mao QG, Zhang X, Jiang TL, Chen M, Yu F. (2004) Biosens Bioelectron 19, 711– 20. Zhu, Q., Chai, Y.Q, Yuan, R., Wang N., Li, X.L, (2005) Chem Lett, 34, 1682–1683 21
