Protein Analiz ve Saflaştırma Yöntemleri

advertisement
Protein Analiz ve Saflaştırma
Yöntemleri
Dr. Ayhan ÜNLÜ
PROTEİNİN SAFLAŞTIRILMASI
hücre ekstraktından,
proteinin izolasyonu
İzolasyon öncesi işlemler
- Hücre fraksiyonunun seçimi:
sitoplazma, mitokondri, lizozomal, mikrozomal?
- Organ tespiti:
mitokondri  kalp
lizozomal /mikrozomal fraksiyonlar  KC
Saflaştırma Şeması
Biyolojik materyal (ör: doku)
ekstraksiyon
Hücre ekstraktı
enzimatik
Hücre
kimyasal
bütünlüğünün
Fiziksel
(membran yapısının)
mekanik
bozulması
Total hücre içeriği
hücre lizatı
Saflaştırma Şeması
Çözünmeyen
hücre debrisi
(uzaklaştırılır)
Hücre lizatı
Santrifüj
Filtrasyon
süpernatan
diğer protein,
iyon,su vb,
ortamdan
uzaklaştırılması
hücresiz lizat
(nükleik asit, proteinler
küçük moleküller)
Ardışık
Saflaştırma
işlemleri
Saf Protein
Primer yapı tayini
Saflaştırma Basamakları
•Ekstraksiyon
•Proteinin saflaştırılması
Suyun uzaklaştırılması
Tuz ve küçük iyonların uzaklaştırılması
Diğer proteinlerden ayrılması
•Primer yapı tayini
Amino asitlerin cins, sayı ve sırası
Ekstraksiyon
Hücre organellerinin elde edilme safhası
İstenilen proteinin yapısını ve biyolojik
aktivitesini değiştirmemek için:
- 0-4C ortam sıcaklığı(tüm işlemler için)
- Blenderde parçalama(kıyılmış doku örneği)
- Uygun tampon (pH, iyonik güç) seçimi
ör: 0.05 M fosfat tamponu, PH 7.4
Kıyılmış doku örneği, 1/10 oranında
tamponla karıştırılır
Kimyasal Yöntemler
Deterjanlar: Triton X-100, vb
Membran yapısını bozarak
hüce içeriğinin ortama
geçmesini sağlarlar
- Pahalı
- Proteinleri denatüre edebilir
- Ortamdan hemen uzaklaştırılmalıdır
Mekanik yöntemler
Fransız Presi
Çelik bir kaba yerleştirilen
hücre süspansiyonu
üzerine uygulanan yüksek
basınçla, hücreler küçük
bir delikten geçirilir
Mekanik yöntemler
Sonikasyon
Hücre süspansiyonuna
daldırılan sonikatör,
titreşim yaparak ve
yüksek ses
dalgalarıyla hücre
bütünlüğünü bozar
ULTRASONİKATÖR
Mekanik yöntemler
Homojenizasyon
Cam homojenizatör kabında
pistonun düzenli dönüşü ya da
vuruşu ile sağlanan mekanik güçle,
hücreler piston ve cam çeper
arasında sıkıştırılır  hücre zarı
parçalanır,hücre içeriği tampona
geçer, elde edilen süspansiyon,
bütünlüğü bozulmamış bir çok
organeli içerir: HOMOJENAT
olarak adlandırılır
Saflaştırmada Kullanılan
Prensipler
Proteinler
fiziksel özellikler
büyüklük/kütle
şekil
çözünürlük
polarite
affinite, vb
saflaştırma
Saflaştırmada Kullanılan
Prensip
Yöntem
Büyüklük
kütle
santrifüj
diyaliz
ultrafiltrasyon
jel filtrasyonu kromatografisi
jel elektroforezi (SDS-PAGE)
çözünürlük
Fraksiyonel presipitasyon
Saflaştırmada Kullanılan
Prensip
Yöntem
yük
iyon exchange kromatografisi
Elektroforez ?
izoelektrik fokusing
adsorbsiyon kromatografi
polarite
Biyolojik aktivite
Bağlanma
revers faz kromatografi (HPLC)
hidrofobik etkileşim kromatografi
affinite kromatografisi
SANTRİFÜJ
Sulu karışımlar(süspansiyon/homejenat)’a
santrifüj kuvveti uygulandığında, daha
büyük ve yoğun komponentler,daha hızlı
çökerler
Düşük hızlı santrifüj:Tam hücreleri, deney
ortamından ayırır
Yüksek hızlı santrifüj: Farklı büyüklük ve
yoğunluktaki subselüler organelleri ayırır
SANTRİFÜJLEME
Santrifüjler yardımıyla yüksek hızda döndürülerek
merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin
davranışına göre ayırım sağlayan teknik
Büyüklük  differensiyel santrifüj
kütle
homojenat
mitokondri mikrozom
nükleus
hücre debrisi peroksizom
lizozom
sitozol
• Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz
bırakılarak fraksiyonlarına ayrılır
• Kütle büyüdükçe, çökmesini sağlayan santrifüj
gücü azalır
Zonal Ultrasantrifügasyon
•Yoğunluk esasına dayanır (daha hassas)
•Yoğunluk ve büyüklük olarak birbirine çok yakın
olan organeller, Differansiyel santrifüjle ayrılamaz
• Bu amaçla zonal santrifügasyon kullanılır
• Çeşitli tipleri vardır:
• Sükroz
• Histopak
Kademeli Gradient Santrifüj
numune
ultrasantrifüj
100,000 x g
24 h
sukroz
gradienti
(% 5-20) Tüpün dibi delinir
fraksiyonlar toplanır
en yoğun
en hafif
TUZ İLE ÇÖKTÜRME
• Proteinlerin su içerisindeki çözünürlükleri çok azdır.
Ortama bir miktar nötral tuz (NaCI ve (NH4)2S04 gibi)
ilave edildiğinde (düşük iyonik kuvvet) proteinlerin
yüzeyinde veya iç kısımlarında bulunan hidrofilik
grupların su ile etkileşim derecesi artar, bu durumda
proteinlerin çözünürlükleri de artar. Bu olaya salting
in denir. Protein çözeltisine çok miktarda nötral tuz
ilave edildiğinde, proteinlerin genellikle iç kısımlarında
yer alan hidrofobik gruplar etrafındaki su molekülleri
tuz iyonları tarafından uzaklaştırılır, bu durumda
hidrofobik grupların birbirleri ile olan etkileşimleri artar
ve proteinler çökerler. Bu olaya ise salting out denir.
TUZ İLE ÇÖKTÜRME
Protein çözeltisinde hidrofobik alanları büyük ve daha
fazla olan proteinler, hidrofobik alanları küçük ve daha
az olanlarınkine göre daha çabuk birbirleri ile
etkileşerek çökerler. Bu olaya proteinlerin
fraksiyonlanması denir. Bu işlem için protein
çözeltisine farklı derişimler de amonyum sülfat eklenir,
oluşan çökelti santrifüjleme ile geri elde edilir ve uygun
bir tamponda tekrar çözülür. Her çökeltide ilgili protein,
analiz yöntemleriyle aranır. Bu şekilde ilgili proteinin
bulunduğu çökelti fraksiyonu, diğer protein
fraksiyonlarından uzaklaştırılmış olur. Böylece
çöktürme işlemi ile kısmi bir saflaştırma yapılmış
olunur.
Amonyum sülfat ile Fraksiyonel Presipitasyon
% 20 (NH4)2SO4
% 40 (NH4)2SO4
santrifüj
protein
çözeltisi
hedef
protein
presipitat
Amonyum sülfat, Proteinleri
- Presipite eder (salting-out)
- Stabilitesini artırır(Kosmotropik iyon )
Büyüklük/kütle  diyaliz
Protein çözeltilerindeki tuzların uzaklaştırılmasında veya
çözelti tamponunun değiştirilmesinde çoğunlukla diyaliz
işlemi uygulanılır. Bu işlem için özel imal edilmiş, genellikle
selüloz asetattan yapılmış, gözenekli ve küçük molekülleri
geçiren ancak büyük molekülleri geçirmeyen yarı geçirgen bir
membrandan oluşan diyaliz torbası kullanılır.
Büyüklük/kütle  diyaliz
Semipermiabl
membran
homojenat
tampon
Diyaliz başı
Diyaliz sonu
Diyaliz:molekül büyüklüğüne bağlı diffüzyon
Semi-permeabl (ultramikroskobik porları bulunan)
selefon membran aracılığla filtrasyon
Proteinler, tuz, iyon ve küçük moleküllerden ayrılır
DeSALTING COLON
Bu yöntem tuzların uzaklaştırılması ve tampon
değiştirilmesinde diyalize göre daha hızlı olmasına rağmen,
küçük hacimlerde uygulama yapılması ve işlem sona erdiğinde
oldukça seyreltik bir protein çözeltisi elde edilmesi nedeniyle
dezavantajlıdır. Bu işlem için genellikle Sephadex w G25 veya
BioGel® P-6 gibi küçük gözenekli gel filtrasyon matriksleri
kullanılır.
ULTRAFİLTRASYON
Ultrafiltrasyon protein saflaştırma adımlarında çok fazla
kullanılan bir tekniktir. Ultrafiltrasyon sistemi basınç
uygulanacak özel bir üniteden, moleküllerin ayrılmasında
kullanılacak farklı gözenekli membranlardan (1.000 Da dan
300.000 Da kadar) ve basınç sağlayan aletlerden oluşmaktadır.
Ayrıca, küçük hacimlerin deriştirilmesinde ise santrifüjleme ile
filtrasyon yapan özel filtreli tüplerde kullanılabilir.
ULTRAFİLTRASYON
• Prensip olarak diyalize
homojenat
benzer (büyüklük/kütle)
• Ultrafiltrasyon tüpünün alt
kısmında yarı geçirgen bir
hücreler/
proteinler
membran bulunur
• Üstten uygulanan basınçlı
membran azot gazı ile, çözücü ve
küçük moleküller membran
dışına çıkar
Liyofilizasyon (Dondurarak Kurutma)
Isıya hassas materyallerin
kurutulma veya deriştirilmesinde
kullanılan en etkili metotlardan
biridir. Ayrıca, biyolojik
materyallerin taşınması veya
depolanması gibi durumlarda da
tercih edilmektedirler.
Liyofilizasyon, donmuş bir
materyalden bir çözücünün (su)
doğrudan vakum altında
buharlaştırma ile uzaklaştırılması
işlemiyle yapılan bir kurutma
tekniğidir.
Kromatografik Yöntemler
Kromatografi:madde karışımlarının, sabit ile mobil faz
arasında, büyüklük, şekil, taşıdıkları yük, çözünürlük, vb.
özelliklerine göre,dağılmaları,ayrılmaları
•Kolon kromatografisi:proteinlerin
depo
(tampon)
mobil faz
(tampon)
Protein
karışımı
sabit faz
(katı porlu matriks)
elüent
saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır
•Kolon, proteinleri seçici adsorblayan
bir maddeyle (katı porlu matriks)
doldurulur  SABİT FAZ
•Protein karışımı kolona tatbik edilir
•Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile
yıkanan kolon tarafından,
adsorbe edilmeyenler  önce
adsorbe edilenler  daha geç
kolondan çıkarlar
Kolon Kromatografisi
Kolon Kromatografi Tipleri
Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon
metoduna göre gruplandırılır:
•Jel filtrasyonu  büyüklük
•İyon exchange  yük
•Affinite  (bağlanma)
• Adsorbsiyon (HPLC) 
fazlar arasındaki
çözünürlük farkı
Jel Filtrasyon Kromatografi
Proteinler, molekül büyüklüğüne göre ayrılırlar
•Kolon, jel boncuklar [sephadeks (çapraz bağlanmış
dekstran)vb polisakkarid veya poliakrilamid polimer]
ile doldurulur
katı matriks
•Protein karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir
akış
Küçük proteinler,jel boncuklar
arasındaki boşluklara girer,
kolondan geç çıkarlar
cam kolon
jel boncuklar
Büyük proteinler, jel boncuklar
arasındaki boşluklara takılmaz,
kolondan önce çıkarlar
Jel Filtrasyon Kromatografi
Proteinlerin elüsyonu: en büyük
en küçük
Jel Filtrasyon Kromatografi
jel boncuk
Proteinlerin, matriksteki porlara
takılma yüzdesi, büyüklüğü ile
ters orantılıdır
Porlara takılan proteinler
daha yavaş sürüklenirler
en büyük
protein
•Avantaj: Büyük miktarda
protein karışımı saflaştırılabilir
•Dezavantaj: Yavaş ayırım
İyon exchange(değiş-tokuş) Kromatografi
Proteinler yapılarındaki asidik veya bazik amino asitlerin yan
zincirlerinde bulunan ve yüzeye doğru yer alan pozitif veya
negatif yüklü gruplar taşırlar. Pozitif yükleri histidin, lizin,
arjinin ve daha az derecede N-terminal aminlerden, negatif
yüklü grupları ise aspartik ve glutamik asit, C-terminal
karboksil grupları ve daha az derecede sistein amino
asitlerinden ileri gelir. Bir proteinin net elektrik yükü
üzerindeki negatif ve pozitif yüklü grupların bağıl sayısına
bağlı olup, pH ile değişir. Pozitif ve negatif yüklerin eşit
sayıda olduğu pH değerine izoelektrik nokta denir (pl).
Proteinlerin büyük çoğunluğu pH 5 ile 9 arasında değişen bir
pl değerine sahiptir, pl değerinin üzerinde proteinler negatif
elektrik yüküne, altında ise pozitif elektrik yüküne sahiptirler.
İyon exchange(değiş-tokuş) Kromatografi
Proteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüke göre
ayırır
pH  pI net yük pozitif
pH  pI  net yük negatif
• Protein karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki
aynı yüklü iyonlarla[ (+)(+) veya (-) (-) ile]
yer değiştirerek, kolona bağlanırlar
•Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce
çıkarlar
• Daha sonra, iyonik gücü/pH’sı farklı bir tampon
kolondan geçirilir
bağlı proteinlerin yükü
değiştirilerek elüsyonu sağlanır
İyon-Exchange Kromatografi
Katı destek olarak Reçine Seçimi.
Katı destek
selüloz
dekstran
agaroz
exchange + NaCl içeren
grup
elüsyon tamponu
DEAE
CM
sülfonat
Reçine seçimi, saflaştırılacak proteinin yüküne ve
ortam pH’sına bağlıdır
Kolonun dolgu maddesine, exchange yapacak yüklü
gruplar bağlanır
karışımdaki proteinleri bağlar
Anyon değiştirici reçine:Dietilaminoetil(DEAE)-Selüloz
Katyon değiştirici reçine: Karboksi metil(CM)- Selüloz
Sülfoksi-selüloz
Affinite Kromatografisi
Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında
kullanılır.Kolonun dolgu maddesine,
(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)
spesifik protein ile kompleks
yapabilen bir ligand bağlanır:
Tampon akışı
ligand-protein
kompleksi
Ligand bağlı
boncuk
spesifik
protein
Serbest
proteinler
diğer
proteinler
Affinite Kromatografisi
katı destek
selüloz
sepharoz
dekstran
ligand
DNA
IgG
antibody
antijen
substrat
kosubstrat
Konkavalin A
reseptor
spesifik protein
+
histon
protein A
antijen
antibody
enzim
enzim
glikoprotein
hormon
Affinite Kromatografisi
Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı
desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest
proteinler kolonu terkederler
Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz
çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe
edilir
Örnek: glukoz-protein
kompleksi
İlave
glukoz(G)
boncuk
boncuk
serbest
protein
GST-Çöktürme
Sefaroz boncukGTH (glutathione)
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi
(HPLC)
HPLC
High Pressure Liquid Chromatography
High Performance Liquid Chromatography
High Price Liquid Chromatography
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi
(HPLC)
HPLC’nin AVANTAJLARI
•
•
•
•
•
•
•
Eş zamanlı analiz
Doğruluk
Yüksek hassasiyet (ppm - ppb)
Küçük enjeksiyon hacmi (1- 1000µl)
Geniş uygulama sahası
Zor olmayan analiz koşulları
Çok iyi tekrarlanabilirlik
Yüksek performanslı sıvı
kromatografisi tekniğinin düzgün bir
şekilde uygulanabilmesi için
• Enjeksiyonun yapılabilmesi için
örnekler mutlaka sıvı olmalıdır.
• Katı örnekler ise durgun ve hareketli
faza uyumlu olan bir çözgenle
çözüldükten sonra yada ekstraksiyon
işlemi yapıldıktan sonra enjekte
edilebilmektedir.
Kolon
Kolon üretiminde yapı materyali olarak
• paslanmaz çelik
• Teflon
• cam
Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı
materyalden çok iç yüzeyine yapılan kaplamada
kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel
özelliklerinden etkilenmektedir.
Kolon
• Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış
hızı ve dolayısıyla oluşacak basınça dayanıklı olmalıdır.
• Kolon iç çapı arttıkça akış hızı ve iç doldurma hacmi
artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü ve dolayısıyla
duyarlılık azalmaktadır.
• Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm, boyları çok çeşitli
olup genellikle 30-300 mm aralığında değişmektedir.
• Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayrımı daha
iyi olmakta fakat analiz süresi uzadığı için daha fazla mobil
faz harcanmaktadır.
Dedektörler
• HPLC donanımında temel bileşenden birisi olan
dedektörler, örneğin veya hareketli fazın bazı özellikleri ile
doğru orantılı olarak bir elektriksel sinyal üretirler.
Dedektörleri “genel dedektörler” ve “seçici dedektörler”
olmak üzere ikiye ayırmak mümkündür. Kullanılan
dedektör hem örneğin hemde hareketli fazın özelliklerini
ölçüyorsa (refraktif indeks dedektörü gibi) buna genel
dedektör, eğer sadece örneğin özelliklerini ölçüyorsa (UV
dedektörleri gibi) buna seçici dedektör denilmektedir.
Seçici dedektörler, genel dedektörlerine göre yaklaşık
1000 kat daha duyarlıdır.
HPLC Sistemi Akış Diyagramı
Dedektörler
• Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS)
• Photodiode Array detector (PDA)
• Fluorescence detector (RF)
• Conductivity detector (CDD)
• Refractive Index detector (RID)
• Electrochemical detector (ECD)
• Mass detector (MS)
Ultraviyole-görünür bölge dedektörü
• Absorbans ölçen dedektörler olup
HPLC’de kullanılan dedektörlerin
yaklaşık % 80’ini
oluşturmaktadırlar. Lambert-Beer
yasası geçerlidir. Spektrum
taraması yapmak, farklı dalga
boyunda çalışmak veya dalga
boyunu zamana karşı
programlamak mümkündür.
Bu dedektörler ile sadece
Hareketli faz, UV/VIS fotometre alkenler, aromatik yapılar,
C-O, C-N, C-S bağı
ya da spektrofotometrenin
içeren bileşenlerin tayin
bulunduğu küçük bir akış
edilebilmektedir
hücresinden geçirilir.
Ultraviyole-görünür bölge dedektörü
fotodiyot array dedektör
UV/VIS dedektörler içerisinde fotodiyot
array dedektör son yıllarda yaygın olarak
kullanılmaktadır. UV/VIS dedektörden
farkı, her elementin ayrı bir dalga
boyundaki absorbansını eş zamanlı olarak
ölçebilmesidir. Bu sayede üç boyutlu
kromatogramlar almak ve istenilen her
pikin çok hızlı spektrum taramasını
görebilmek ve farklı dalga boyunda
absorbans yapan türleri ayni anda tayin
etmek olasıdır. Ayrıca istenilen dalga boyu
aralığında çalışılabilmesi bu dedektörün
sağladığı bir diğer önemli avantajdır.
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
fotodiyot array dedektör
• PDA’nın sağladığı olanaklar
– İstenilen dalga boyu aralığında çalışabilmek
– Analiz sonrası istenilen çok sayıda dalga boyunda ölçüm
yapabilmek
– Oran kromatogramı alabilmek
– istenilen her pikin spektrumunu görebilmek
– Benzerlik kıyaslaması yapabilmek
– Pikin saflığını tayin edebilmek
– D2 ve W lambayı aynı anda kullanabilmek
Fluoresans dedektörü
Organik maddelerin yaklaşık
% 15’i fluoresans oluşturma
yeteneğine sahiptir. Oluşan
fluoresans ölçülmektedir.
Kullanılan ışık kaynağı
ksenon lamba olup duyarlılığı
UV/VIS dedektöre göre
yaklaşık 103 kat fazladır.
İletkenlik dedektörü
İletkenlik ölçülür. Daha çok anyon ve katyon
analizlerinde ve iyon kromatografisinde kullanılır.
Kullanılan mobil fazın iletkenliği ne kadar düşük
olursa oluşan sinyal de o kadar düşük olmaktadır.
Refraktif indeks dedektörü
Kırılma indisi ölçülür. Sıcaklıktan etkilenir. Örnek bileşenlerinin
bulunduğu ortamda yoğunluk artacağından gelen ışık kırılarak
hücreyi terkeder. Işığın ölçülen kırılma oranından (kırılma indisi)
kantitatif tayin yapılır.
Kütle dedektörü
Hareketli iyonları kütle/yük oranlarına göre hızlı biçimde
ayırabilen bir cihazdır. İyonların çoğu tek yüklü
olduklarından, oran basitçe iyonun kütlesine eşittir. Bu
dedektörün kullanımı ile örnek bileşenlerine ait çok
özgün kromatogramlar elde edilir, dolayısıyla kalitatif
tayinlerde teşhis amaçlı kullanımlarda çok önemli bir
dedektördür.
İyon kaynağı, kütle
analizörü ve iyon
dedektör sistemi olmak
üzere başlıca üç kısımda
incelenebilir
Kütle dedektörü
Ion Max API Kaynağı: Analizi yapılcak numuneye bağlı olarak
ESI (Electrospray Ionization) veya APCI (Atmospheric Pressure
Chemical Ionization) iyonizayon teknikleri kullanılabilir. Her iki
teknikte atmosferik basınçta gerçekleşir. Genel olarak aminler,
peptidler ve proteinler gibi polar bileşikler ESI tekniği, steroidler
gibi apolar bileşikler ise APCI tekniği ile analiz edilir.
Kütle Analizörü: İyon kaynağından gelen iyolar, kütle
analizöründe değişen elektrik alana tabi tutularak m/z (kütle/yük)
oranlarına göre ayrılırlar.
MS İyon Dedektör Sistemi: MS dedektörü yüksek duyarlılığa
sahip, pozitif ve negatif iyon modlarında çalışan bir iyon dedektör
sistemidir.
HPLC tekniğinde sınırlamalar
•
•
Karmaşık örneklerde iyi çözünürlük sağlamak zor
olabilmektedir.
Aynı anda sadece bir örnek analizlenebilmektedir.
ELEKTROFOREZ
Ortam pH’sına göre, (+) ya da (-) olarak
yüklenen kolloid taneciklerin, bir elektrik
alanında, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan
anot veya katoda doğru farklı hızlarda
sürüklenmeleri
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
Proteinler, elektrik yükü, büyüklük (yük/kütle
oranı), şekil gibi özelliklerine göre ayrılırlar
Elektroforez, genellikle poliakrilamid jel
üzerinde yapılır
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
Proteinlerin saflaştırılmasında kullanılmaz !
Elektroforetik Yöntemler
• Karışım içinde bulunan protein sayısını
tespit etmek( kağıt ve jel elektroforezi)
• Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini
belirlemek( SDS-PAGE)
• Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını
tayin etmek (SDS-PAGE)
amacıyla kullanılır
POLİAKRİLAMİD JEL
Poliakrilamid Jel:Çapraz bağlı akrilamid polimeri
Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE)
protein karışımı
katot
tampon
jel
tampon
plastik kasa
anot
SDS - PAGE
SDS:Sodyum Dodesil Sülfat-anyonik deterjan
(-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve
sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid
zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır
Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül
SDS bağlanır  proteinlerin hepsi (-) yüklenir
SDS - PAGE
SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine
göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre,
birbirinden ayrılırlar
SDS’in bağlanmasıyla , doğal yapısını kaybeden
proteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip
olurlar  elektriksel alan içinde proteinlerin
hareketi sadece molekil ağırlıklarına bağlıdır
Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir
ve proteinlerin alt üniteleri birbirinden ayrılır
SDS-PAGE ÖRNEKLERİ
Molekül Ağırlığı Tayini
Standart nümune
Molekül ağ.(log)
nümune
protein
Sürüklenme hızı
İzoelektrik Fokusing
• İzozimleri ya da özellikleri çok benzeyen
proteinleri ayırmak için kullanılır
izoelektrik
• pH gradienti oluşturulan jel üzerinde fokusing
jel
elektroforez yapılarak, proteinlerin pI
değerleri tayin edilir
10
• pH gradienti:Küçük molekül ağırlıklı
organik asit ve bazları içeren bir amfolit
ya da amfolin (katyonik/anyonik polistren pH
elektrolitler) çözeltisi inkorpore edilen
jele elektrik alanı uygulanır
-
+
pH 10
pH 4
4
İzoelektrik Fokusing
• Amfolit çözeltisindeki H+ve OHiyonları, biri diğerini nötralize
ederek sürüklenirken, jel
pH gradient
üzerinde pH gradienti oluşur
• protein karışımı
İzoelektrik jele uygulanıp
elektroforez yapıldığında,
karışımdaki her protein
kendi izoelektrik
noktasına kadar jel üzerinde
sürüklenir ve durur
pI:6.5
İzoelektrik Fokusing
Kapiler Elektroforez (2D)
Western blotlama ya da imminoblotlama denilen
yöntem, bir protein karışımı içindeki belirli bir
proteini ve de büyüklüğünü saptamak için kullanılan
bir yöntemdir. Proteinin in vivo ya da in vitro
sentezlenmesinin önemi yoktur. Bununla beraber,
bu metot istenilen bir proteine karşı yönlendirilen
yüksek kalitede bir antikor kullanımına bağlıdır. Bu
antikor prob olarak kullanılarak ilgili protein bir
karışımın içinden saptanabilir. Western blot hücrede
ne kadar proteinin biriktiğini gösterebilir.
Molekül Ağırlığı Tayini
Standart nümune
Molekül ağ.(log)
nümune
protein
Sürüklenme hızı
Thank you for your attention
Download