SANRAL DOGMA REPLİKASYON
advertisement
11.10.2012 SANRAL DOGMA Doç.Dr.Erdal BALCAN 1 Doç.Dr.Erdal BALCAN 2 Memeli hücre döngüsü REPLİKASYON DNA sentezi ve histon sentezi DNA sentezi için hızlı gelişim S fazı G0 G1 fazı Hücreler sessiz G2 fazı M fazı Gelişim ve hücre bölünmesi için hazırlık Mitoz Doç.Dr.Erdal BALCAN 3 Doç.Dr.Erdal BALCAN 4 1 11.10.2012 G1 S G2 M DNA sentezi replikasyon için hücrenin hazırlanması Kromatin kondansasyonu mitoz sitokinez Çekirdek zarı parçalanması Hasarlı DNA tamiri Sentriol sentezi DNA REPLİKASYONUNUN BİYOKİMYASAL TEMELİ DNA sentezi için iki anahtar substrat gereklidir: 1.Deoksinukleosid trifosfatlar (dGTP, dCTP, dATP, dTTP): nukleosid trifosfatlar deoksiribozun 5’ ’ hidroksil grubuna bağlı üç fosforil grubundan meydana gelir. En içteki fosforil grubu alfa fosfat, diğerleri beta ve gama fosfat olarak isimlendirilir 2. Primer-kalıp eşleşmesi: primer, kalıbın komplementeridir. Doç.Dr.Erdal BALCAN 5 Doç.Dr.Erdal BALCAN 6 DNA replikasyonu sırasında polimeraz enzimleri dışında 20’ ’den fazla enzim ve protein rol alır. Tümüne DNA replikaz sistemi ya da replizom adı verilir DNA replikasyonu: – Başlangıç- replikasyon bir orijinden başlar • Replikasyon orijin(leri)nin belirlenmesi • Çift sarmal yapının tek iplikli DNA’ ’ya denatürasyonu • Replikasyon çatalı oluşumu Doç.Dr.Erdal BALCAN 7 – Uzama- yeni DNA dizileri DNA polimeraz ile çoğaltılır – Sonlandırma- replikasyon prokaryotlarda ve ökaryotlarda farklıDoç.Dr.Erdal sonlanır. BALCAN 8 2 11.10.2012 DNA replikasyonu kesintilidir. pol III yeni sentezlenen dizinin sadece 3’ ucuna nukleotid ekler. DNA dizileri birbirine göre anti-paraleldir. Prokaryot kromozomunda halkasal DNA bulunur. Replikasyon, replikasyon orijini adı verilen bir bölgeden başlar ve kromozomun her iki yönüne doğru ilerler. Zincir uzaması öncü dizide (leading (leading strand) strand) devamlı (replikasyon çatalı ile aynı yönde) Geciken dizide (lagging (lagging strand) strand) kesintili Doç.Dr.Erdal BALCAN 9 Doç.Dr.Erdal BALCAN 10 REPLİKASYON ÇATALINDAKİ PROTEİN KOMPLEKSLERİ 1. DNA primaz DNA primaz DnaB (helikaz) 2. DNA Helikaz 3. ssDNA bağlayan proteinler (Single Stranded DNA Binding Proteins) ile birlikte 5’ ’-3’ ’ yönünde kısa polinukleotid (RNA öncüsü) sentezini 4. Sliding Clamp gerçekleştirir 5. Clamp Loader ve 3’ ’ ucu DNA polimeraz 6. DNA polimeraz için uygun hale getirerek 7. DNA Ligaz 8. DNA Topoizomeraz durur. Doç.Dr.Erdal BALCAN 11 Doç.Dr.Erdal BALCAN 12 3 11.10.2012 Hem öncü (leading) hem de geciken (lagging) dizi DNA sentezi için primaz enzimine gereksinim duyarken bu enzimin iki dizi arasındaki fonksiyonu birbirinden farklıdır. Her bir öncü (leading) dizi sadece tek bir RNA öncüsüne gereksinim duyar. Geciken dizinin kesintili sentezinde binlerce Okazaki fragmanları ve ilişkili RNA öncülerine gereksinim vardır. mRNA, rRNA ya da tRNA da rol alan RNA polimerazların tersine, primaz yeni RNA öncüsünü sentezini başlatmak için spesifik DNA dizilerine gereksinim duymaz. Bunun yerine, primaz, DNA helikaz gibi bir başka DNA replikasyon proteini ile ilişkiye girdiği zaman aktive olur. (primozom= primozom= primaz + helikaz) Primaz aktive olduğunda, sıraya bakmaksızın RNA öncülerini sentezler. Doç.Dr.Erdal BALCAN 13 PriA, primazın DNA’ya bağlanmasına yardımcı primozom proteini. Primozom, 7 farklı proteinden oluşur: DnaG, primaz, DnaB helikaz, DnaC helikaz asistan, DnaT, PriA, Pri B, ve PriC. Doç.Dr.Erdal BALCAN Molecular Biology Understanding the Genetic Revolution, 2005 14 DNA helikazdan sonra oluşturulan ssDNA , DNA sentezinde kalıp olarak kullanılıncaya kadar baz eşleşmesinden uzak durmalıdır. Ayrılmış dizileri stabilize etmek için single-stranded DNA binding proteinler (SSB’ ’ler) buralar bağlanırlar. Bir SSB’ ’nin bağlanması bir diğer SSB bağlanmasını beraberinde getirir. Buna kooperatif bağlanma denir ve bu bağlanma ssDNA ile SSB’ ’lerin etkileşimini büyük ölçüde stabilize eder. ATP ssDNA bağlı bir helikaza bağlandığında ssDNA üzerinde belirli polaritede hareket Doç.Dr.Erdal BALCAN ederek sarmalı açar. 15 Doç.Dr.Erdal BALCAN 16 4 11.10.2012 Tüm polimerazlarda geniş bir yarık ve 3 bölgeden oluşan sağ el yapısı yer alır: Avuçiçi: katalitik bölge, proofreading Parmaklar: kalıbın pozisyonunun ayarlanması Başparmak: replikasyonun sürdürülmesi, oluşan DNA’ ’ya tutunmak Replike olan DNA , DNA Sliding DNA clamp DNA polimeraz ile ilişkili olarak yeni replike olmuş DNA’ ’yı kuşatarak “processivity” düzeyini arttırır. processivity : DNA polimerazlar tarafından BALCAN eklenen Doç.Dr.Erdal nukleotidlerin ortalama sayısını veren17 bir ölçüdür. DNA POLİMERAZ PRİMER:KALIBI TUTAN BİR ELE BENZER DNA polimeraz deoksinukleosid trifosfatların katılımını katalizleyen tek bir aktif bölgeye sahiptir. Diziye gelen nukleotidlerin A:T ya da G:C baz çifti oluşturmasını denetler. Doç.Dr.Erdal BALCAN 19 polimerazın avuç içi bölgesi ile ilişkilidir. Aktif bölgede, kalıbın tek sarmal bölgesinin ilk bazı çift sarmal DNA için uygun pozisyon Doç.Dr.Erdal BALCAN alır. 18 DNA replikasyonunun doğruluğu: 1.Komplementer baz çiftinin doğruluğu 2.“ “proofreading ” (hata okumadüzeltme) mekanizmaları 3.Dizi aracılığı ile hata tamiri 1. Komplementer Baz Çiftinin Doğruluğu: Doğru nukleotid, polimeraza doğru olmayan nukleotidden daha fazla ilgi gösterir. Çünkü sadece doğru nukleotid kalıpla doğru baz Doç.Dr.Erdal BALCAN 20 çifti oluşturur. 5 11.10.2012 2. Proofreading (hata okuma-düzeltme) mekanizmaları-Ekzonukleolitik Düzeltme (exonucleolytic proofreading): DNA polimerazın yeni nukleotid eklemesi için primer dizinin 3’ ’ OH ucuna gereksinim vardır. DNA polimeraz, 3’ ’ OH ucunda yanlış (uygunsuz-mismatched) primer barındıran DNA dizilerine nukleotid ekleyemez. DNA polimeraz, farklı katalitik bir bölgesi ile 3’ ’5’ ’ yönünde ekzonukleaz aktivitesi oluşturarak DNA replikasyonunun doğruluğu: 1.Komplementer baz çiftinin doğruluğu 2.“ “proofreading ” (hata okumadüzeltme) mekanizmaları 3.Dizi aracılığı ile hata tamiri Katalitik aktivitesine ek olarak avuç içi bölgesi, eklenen nukleotidlerin doğru baz çifti oluşturmasını kontrol eder (proofreading). Bu bölge yeni sentezlenen DNA’ ’nın küçük oluğundaki baz çiftleri ile yoğun hidrojen bağı köprüleri oluşturur. Bu kontaklar baza-spesifik değildir, ancak sadece doğru baz eşleşmesi sırasında oluşurlar. Bu bölgede yanlış eşleşmiş bir DNA, katalizi ciddi biçimde yavaşlatır. (primerin uç kısmındaki uygunsuz dizileri keserek) Yavaşlamış kataliz ve yeni sentezlenen DNA’ ’ya afinitenin azalması düzenleme yapar. Bu düzenleme DNA sentezini başlatacak uygun 3’ ’uca kadarDoç.Dr.Erdal sürer.BALCAN AVUÇ İÇİ_PROOFREADING polimerazın aktif sitesinden primer:kalıp çiftinin uzaklaşmasına ve 21 DNA sentezinde düzeltme uygun olmayan nukleotidlerin uzaklaştılması nukleazlar tarafından gerçekleştirilir. Bu tip nukleazlar. Bu ekzonukleazlar DNA’ ’yı 3’ ’ucundan hidrolize ederler. (a) Uygun olmayan nukleotid DNA’ ’ ya polimeraz ile eklendiğinde, DNA sentezinin hızı azalır ve DNA polimerazın primerin 3’ ’ OH bölgesine ilgisi azalır. (b) Yanlış eşleme (mismatch) gerçekleştiğinde primerin 3’ ’ ucu düzeltme için ekzonukleaz aktif bölgesine ilgisi artar. (c) Yanlış eşleşen nukleotid uzaklaştırıldığında DNA polimeraz aktivitesi için uygun dizi oluşturulur ve DNA sentezi devam eder. Cell 92; 296, fig 1, 1998 Elsevier Yanlış eşleşme primer:kalıp çiftinin polimerazın aktif sitesinden uzaklaşmasına ve Doç.Dr.Erdal BALCAN 23 polimerazda proofreading nukleaz aktif bölgeye bağlanmasına neden olur. Doç.Dr.Erdal BALCAN 22 polimerazda proofreading nukleaz aktif bölgeye bağlanmasına neden Replikasyon çatalı oluşurken, kromozom rotasyonuna bağlı olarak süperkatlanmalar negatif ya da pozitif yönde olabilir. DNA replikasyonu sırasında bu tür süperkatlanmaların oluşması DNA topoizomerazlar adı verilen bir grup enzim tarafından önlenmektedir. süperkatlanmalar oluşturan, süperkatlanmaları çözen veya her ikisini de yapan bu enzimlerin 2 türü var vardır. Tip I DNA topoizomerazlar: DNA molekülünün bir zincirini geçici olarak koparan ve diğer zinciri oluşan boşluktan geçirdikten sonra kopuk uçları tekrar birleştiren bu enzimlerin hem nükleaz (zincir koparan) hem de ligaz (zincir bağlayan) aktiviteleri vardır. Tip II DNA topoizomerazlar: DNA çift heliksine sıkıca bağlanarak her iki zincirde geçici kırıklar oluştururlar. Sonra sarmalı ters yönde döndürerek döngü sayısının azalmasını sağlarlar. En sonunda kopuk uçları tekrar birleştirerek hem negatif hem de pozitif sarmalların birikimini önler. Doç.Dr.Erdal BALCAN 24 6 11.10.2012 Bir RNA öncüsü bir ucunda uygun bir 3’ ’ ucu içerdiği için DNA polimeraz bu uçtan Okazaki fragmanlarını oluşturmak üzere diziyi uzatır. Her bir Okazaki fragmanının sentezi, bu DNA polimerazın bir önceki fragmanın 5’ ’ ucuna bağlı RNA primerine diziyi eklemesine kadar devam eder. TRANSKRĐPSĐYON Primaz tarafından yeni RNA öncüsü sentezi Eski RNA öncüsü silinir ve DNA ile doldurulur Laggingdizi kalıp DNA polimeraz yeni Okazaki fragmanı oluşturmak için yeni RNA öncüsüne bağlanır. Aradaki boşluk DNA ligaz tarafından doldurulur DNA polimeraz DNA fragmanını sonlandırır Doç.Dr.Erdal BALCAN 25 TRANSKRĐPSĐYON Genetik bilgiyi taşıyan DNA molekülünün DĐZĐLER BĐRBĐRĐNDEN AYRILIR hücresel faaliyetlerin Kalıp dizi (nongerçekleşmesi için gerekli codingantisense dizi) bilgiyi RNA’ya aktarma işlevi. coding-sense dizi RNA DĐZĐSĐ YAPILIR Kalıp DNA dizisi (noncoding ya da anti-sense dizi): mRNA’nın komplementeri olan DNA dizisi. Coding dizi (sense dizi): yeni sentezlenen RNA’ya özdeş olan DNA dizisi. Doç.Dr.Erdal BALCAN 27 Genetik bilgiyi taşıyan DNA molekülünün hücresel faaliyetlerin gerçekleşmesi için gerekli bilgiyi RNA’ya aktarma işlevi. Doç.Dr.Erdal BALCAN 26 TRANSKRĐPSĐYON TERMĐNOLOJĐ Sistron (cistron): bir polipeptid kodlayan bir yapısal gen ya da DNA (ya da RNA) segmenti. Günümüzde sistron ve yapısal gen ifadeleri proteine dönüşmeyen RNA’ları (rRNA, tRNA, snRNA, v.b.) kodlayan DNA dizileri için de kullanılmaktadır. Monosistronik RNA: tek bir protein kodlayan mRNA (ökaryotlarda). Polisistronik RNA: bakterilerde operon olarak bilinen ilişkili gen kümeleri genom üzerinde ardışık olarak yerleşmiştir. Bu kümeler birlikte transkribe olarak tek bir mRNA oluştururlar. Bu nedenle bir bakteri mRNA’sı genellikle birbiri ile ilişkili çeşitli proteinleri (örneğin metabolik bir yolun ardışık adımlarını katalizleyen ilişkili enzimleri) Doç.Dr.Erdal BALCAN 28 kodlayabilir. 7 11.10.2012 SĐSTRONĐK-POLĐSĐSTRONĐK mRNA PROKARYOT ÖKARYOT DNA promotor yapısal gen DNA promotor yapısal genler OPERON TRANSKRĐPSĐYON Bakteriyal mRNA molekülünün yapısı. 5 ’ gereksinim Polisistronik mRNA Monosistronik mRNA duyan ökaryotik ribozomların cap yapısına tersine prokaryotik ribozomlar prokaryotik mRNA molekülünün farklı bölgelerinde bulunan özel ribozom bağlama bölgelerine (Shine-Dalgarno) dizilerine gereksinim duyarlar. Bakterilerdeki bu ribozom bağlama özelliği tek bir mRNA molekülünden farklı tip protein oluşturmasına Doç.Dr.Erdal BALCAN 29 olanak sağlar. Doç.Dr.Erdal BALCAN 30 Figure 6-73 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) TERMĐNOLOJĐ TERMĐNOLOJĐ Open Reading Frame-Açık Okuma Çerçevesi (ORF): OPERON: Birbiri ile benzer işlev gören ürünleri sentezleyen DNA ya da RNA’da bir protein kodlayabilen baz dizisi. Stop kodon içermez. Her ORF ucu bir stop kodonla sonlanır. genlerin Kalıp DNA dizisi (non-coding ya da anti-sense dizi): mRNA’nın komplementeri olan DNA dizisi. Coding dizi (sense dizi): yeni sentezlenen RNA’ya özdeş olan DNA dizisi. (operatör, promotor…) içerir. (ilişkili gen kümeleri) oluşturduğu kümelerdir (örn. Aynı metabolik yol üzerindeki enzimler). Yapısal genleri ve kontrol elementlerini YAPISAL GENLER: Enzimlerin birincil yapısını şifrelemek ile görevli olan enzimlerdir. OPERATÖR: komşu genin transkripsiyonunu kontrol eden kısa DNA bölgesi. Coding; sense dizi PROMOTOR: Kalıp;Non-coding; antisense dizi RNA transkripti Doç.Dr.Erdal BALCAN RNA polimerazın bağlanarak transkripsiyonu başlattığı DNA dizisi. Bir genin transkripsiyonunu kolaylaştıran DNA bölgesi. Promotorlar düzenleyecekleri genlerin yakınında yer 31 alırlar. Doç.Dr.Erdal BALCAN 32 8 11.10.2012 TERMĐNOLOJĐ Upstream bölge UPSTREAM ELEMENT: Promotor bölgenin ön kısmında yer alan Promotor DNA bölge. Downstream bölge -35 Gen +1 -10 3 ’ ve 5 ’ UTR (Untranslated-Lider) BÖLGE: mRNA ’ nın kodlama yapan bölgelerinin her iki tarafında yer alan translasyona girmeyen bölgeler. Transkripsiyon Başlangıç 5’ ’ cap 5’ ’ UTR Poly A sinyal Kodlama Bölgesi Start Kodon 3’ ’ UTR Poly (A) kuyruk Stop Kodon Doç.Dr.Erdal BALCAN 33 +1 bölge: DNA’ ’ dan RNA’ ’ ya ilk transkribe olan baz -10 bölgesi: Bakteriyel promotorda transkripsiyon başlangıcından 10 baz geride bulunan ve RNA polimeraz tarafından tanınan bölge. -35 bölgesi: Bakteriyel promotorda transkripsiyon başlangıcından 35 baz geride bulunan ve RNA polimeraz tarafından tanınan bölge. Başlangıç ve bitiş bölgeler Transkript başlangıcı Transkript sonu Doç.Dr.Erdal BALCAN 34 Kimyasal ve enzimatik olarak transkripsiyon, DNA replikasyonuna çok benzer Her iki yolda da DNA kalıbına uygun nukleik asit sentezi yapılır. Bazı farklılıklar bulunmaktadır: 1. Transkripsiyonda yeni dizi deoksiribonukleotidden değil ribonukleotidden oluşur. 2.Transkripsiyonda replikasyona göre çok küçük bir molekül üretilir. Doç.Dr.Erdal BALCAN 35 3.Transkripsiyonda DNA’ ’ nın sadece bir ipliği kullanılır.36 Doç.Dr.Erdal BALCAN 9 11.10.2012 TRANSKRİPSİYON: REPLİKASYON 1.BAŞLANGIÇ 2.UZAMA 3.SONLANMA TRANSKRİPSİYON -Tüm DNA kopyalanır - DNA’ ’ - Her iki iplik kalıp olarak kısmı kopyalanır kullanılır. - Tek iplik kalıp olarak -Öncüye gereksinim var kullanılır. - Oluşan yeni dizi -Öncüye gereksinim yok deoksiribonukleotid - Oluşan yeni dizi -Kopyanın işlenmesi söz ribonukleotid Transkripsi yonun başlaması nın belirli bir uzama konusu değil Bağlanma (kapalı kompleks) -Kopyanın işlenmesi gerekir Doç.Dr.Erdal BALCAN 37 Promotor kaynaşması (açık kompleks) Doç.Dr.Erdal BALCAN 38 UZAMA: BAŞLANGIÇ: RNA polimeraz yaklaşık 10 bazlık bir RNA sentezledikten sonra, uzama fazına geçer. Bu geçiş polimerazda yapısal bir değişiklik Bir başlatıcı (promoter) olarak DNA dizisi (bir çok başlatıcı faktör ile birlikte) RNA polimeraza bağlanır. Promoter-polimeraz kompleksi oluşturur ve kalıbı daha sıkı tutar. Uzama, nukleotidlerin fosfodiester bağı ile birbirlerine bağlanması şeklinde devam eder. yapısal bir değişikliğe uğrar. Replikasyon başlangıcında olduğu gibi DNA transkripsiyon noktasında açılır ve (DNA replikasyonunda olduğu gibi) transkripsiyon 5’ ’-3’ ’ yönünde başlar. Sentez 5’ ’-3’ ’ yönündedir. Uzama sırasında, bu enzim DNA’ ’yı önce açar sonra birleştirir. Hareket ettikçe büyüyen RNA’ ’yı kalıptan uzaklaştırır. Proofreading fonksiyonu vardır. Replikasyondan farklı olarak, sadece bir DNA dizisi kalıp olarak E. coli’ ’de sentez hızı yaklaşık 50 nukelotid/sn’ ’dir kullanılır. Doç.Dr.Erdal BALCAN 39 Doç.Dr.Erdal BALCAN 40 10 11.10.2012 SONLANMA: Polimeraz geni transkribe ettikten sonra durur ve RNA ürününü salar. Bazı hücrelerde sonlanmayı tetikleyen mekanizmalar iyi belirlenmiştir. Bir çoğunda ise bilinmemektedir. Bakterilerde iki tür sonlanma bulunur: 1.Rho (ρ ρ) faktöründen bağımsız (independent-intrinsic) 2.Rho (ρ ρ) faktörünün gerekli olduğu (dependent) Doç.Dr.Erdal BALCAN 41 Doç.Dr.Erdal BALCAN RNA’ ’ daki GC bazları kendi 1.Rho-independent (intrinsic): aralarında eşleşerek saç tokası Prokaryotlarda RNA’ ’nın uzaması, RNA polimerazın sonlandırma formunu oluşturur. dizisine rastlamasına kadar devam eder. Bu yapı RNA polimeraz için DNA’ ’da en yaygın sonlandırma dizileri AT-zengin dizileri takip eden fiziksel bir stres yaratır ve transkripsiyon durur. bir GC-zengin dizinin olduğu bölgelerdir. RNA’ ’ daki saç tokası formunu Böyle dizileri içeren bir DNA bölgesinden sentezlenen RNA’ ’daki GC 4 ya da daha fazla urasil bazı izler. bazları kendi aralarında eşleşerek saç tokası formunu oluşturur. RNA’ ’ daki urasil bazları ile Bu yapı RNA polimeraz için fiziksel bir stres yaratır ve transkripsiyon kalıp DNA’ ’ daki Adeninlerin karşılıklı gelmesi ile oluşan zayıf durur. etkileşim RNA’ ’ nın DNA’ ’ dan RNA’ ’daki saç tokası formunu 4 ya da daha fazla urasil bazı izler. kopmasına neden olur. RNA’ ’daki urasil bazları ile kalıp DNA’ ’daki Adeninlerin karşılıklı Doç.Dr.Erdal BALCAN gelmesi ile oluşan zayıf etkileşim RNA’ ’nın DNA’ ’dan kopmasına 43 42 Doç.Dr.Erdal BALCAN 44 11 11.10.2012 2.Rho-dependent: Ancak bütün sonlandırma bölgeler saç tokası oluşturmayabilir. Bu durumda özel bir sonlandırma proteini olan rho (ρ ρ) devreye girer. Bu protein, uzayan RNA zincirine bağlanarak transkripsiyonun durmasına neden olur. Bu protein aynı zamanda ATPaz aktivitesine sahiptir: bir transkripte bağlandığında RNA’ ’yı kalıptan ve RNA polimerazdan zorla kopartır. Doç.Dr.Erdal BALCAN 45 Doç.Dr.Erdal BALCAN 46 Doç.Dr.Erdal BALCAN 47 Doç.Dr.Erdal BALCAN 48 12 11.10.2012 ÖKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON Ökaryot ve prokaryot transkripsiyon mekanizmaları birbirine benzerdir. Ökaryotta çekirdekte gerçekleşen transkripsiyon daha komplikedir. Ökaryotlarda farklı RNA’ ’ların sentezi farklı RNA polimerazlar tarafından gerçekleşir. Bakterilerde sadece bir başlatıcı faktöre (σ σ) gereksinim varken ökaryotlarda transkripsiyonun promotor-spesifik olarak başlaması için farklı başlangıç faktörleri devreye girer. Bunlara genel transkripsiyon faktörleri (GTF) denir. Transkripsiyon faktörleri TFII (Transcription Factor for RNA Doç.Dr.Erdal BALCAN 49 Doç.Dr.Erdal BALCAN polymerase II) genel ismine sahiptir (TFIIA, TFIIB, TFIID…). 50 Enhancer: proteinlere (trans-acting faktörler ve transkripsiyon faktörlerine) bağlanarak Ökaryotlarda Transkripsiyonun Farkları transkripsiyon düzeyini arttıran kısa DNA dizileri. • Ökaryotlarda transkripsiyon çekirdekte, translasyon sitoplazmada birbirinden tamamen ayrılmış olarak gerçekleşir. Insulator: Enhancerlerin uygun olmayan genleri aktive etmesine engel olan DNA elementleridir. Enhancer ile promotor arasındaki “iletişimi” bloke eder. • Transkripsiyon başlamasının regülasyonu için özgül DNA dizileri ve protein faktörlerin etkileşimi daha komplekstir. • Promotorlara ek olarak genin 5’ kontrol bölgesinin dışında genin içinde ve 3’ aşağı bölgesinde de yer alabilen enhensır diziler bulunur. • Sentezlenen ilk RNA kopyası, olgun ökaryotik mRNA ya dönüşmek için bir dizi işlenme basamağından geçer. Doç.Dr.Erdal BALCAN Trans-acting faktörler – gen ifadesini kontrol etmek için cis-acting dizilere (elementlere)bağlanan proteinler. 51 Cis-acting elementler – bir genin yakınında bulunan ve gen ekspresyonu için gerekli DNA dizileri (promotor, enhancer ve silencerleri içerir). Silencer: Transkripsiyon faktörlerine Trans-regulatör elementler: transkripsiyon bağlanarak transkripsiyonu baskılayan kodlayan DNA dizileri Doç.Dr.Erdalfaktörlerini BALCAN 52 DNA dizileri 13 11.10.2012 GENEL KAVRAMLAR DNA’nın bükülmesi, transkripsiyon faktörlerinin enhancerlere bağlanmasını ve transkripsiyonu başlatıcı kompleksinin etkileşim halinde olmasını sağlar. Enhancere bağlanarak bir genin transkripsiyonunu sağlayan transkripsiyon faktörüne Aktivatör denir. Aktivatörler, enhancere bağalanarak promotor ile RNA polimeraz arasındaki bağlantıyı ve transkripsiyon başlangıç kompleksinin oluşumunu kolaylaştıran proteinlerdir Doç.Dr.Erdal BALCAN 53 Doç.Dr.Erdal BALCAN Robert Tjian, "Molecular Machines thatControl Genes,"Scientific American. 54 RNA POL II’ ’ nin transkripsiyonu başlatmasında cis-element dizileri yardımcıdır. BAŞLAMA: En önemli cis-element: Goldberg-Hogness ya da TATA kutusudur. Ökaryotlarda transkripsiyonun başlama bölgelerinde Bir çok RNA polimeraz promotoru, transkripsiyonun başlama noktasının yaklaşık prokaryotlara benzer biçimde özel baz dizilimleri içeren 25 baz çifti solunda (upstream) konsensus dizisi TATAAA olan ve TATA kutusu olarak adlandırılan bir bölgeye sahiptir. bölgeler vardır: Ökaryotik promotorlarda sık rastlanan diğer bir bölge, -80 ya da -70 baz çifti solda yer alan CAAT kutusudur 1. -30 bölgesinde bulunan TATA kutusu (Goldberg-Hogness Promotor bölgesinde yer alan diğer bir cis-element, GGGCGG konsensus dizisine sahip ve -110 bölgesinde yer alan GC kutusudur. kutusu) CAAT ve GC kutuları transkripsiyon faktörlerini kendilerine bağlarlar ve 2. -80 bölgesinde bulunan CAAT kutusu transkripsiyonu güçlendirici etkileri vardır. 3. -110 bölgesinde yer alan GC kutusu Doç.Dr.Erdal BALCAN 55 Doç.Dr.Erdal BALCAN Upstream elementler 56 14 11.10.2012 Upstream elementler RNA Pol II’ ’nin bağlanma etkinliğini arttırırlar Doç.Dr.Erdal BALCAN 57 Transkripsiyonun başlamasındaki ilk olay TFIID protein kompleksindeki bir polipeptidin [TBP (TATA binding protein)] TATA kutusuna bağlanmasıdır. TBP DNA’ya bağlandığı zaman TATA kutusunun biçimini bozar. Oluşan TBP-DNA kompleksi diğer genel transkripsiyon faktörlerinin ve polimerazın bu bölgeye gelmesine neden olur. In vitro da bu proteinler promotorda TFIIA, TFIIB ve RNA polimeraz II ile kompleks oluşturmuş TFIIF şeklinde bağlanır. Bu bağlanmanın ardından TFIIE , TFIIH ve TFIIJ bağlanır. Bu kompleks en az 40 polipeptid içerir ve TRANSKRİPSİYON BAŞLAMA KOMPLEKSİ olarak adlandırılır. TFIIH ATP hidroliz enerjisini kullanarak iki DNA zincirini transkripsiyonun başlama noktasından ayırır. Aynı zamanda RNA pol II’yi fosforile eder ve bu fosforliasyonla bazı TF’leri polimeraz üzerinde oturdukları yerden kalkarlar çünkü fosforilasyonla pol biçim değişikliği gerçekleştirir. Üzerindeki fazlalıklardan (TFleri) kurtulan Doç.Dr.Erdal BALCAN 59 RNA pol senteze başlar. 1. TFIID’ ’nin yapısındaki TBP DNA’ya küçük oluktan bağlanır. 2. Daha sonra sırasıyla, TFIIA, TFIIB ve RNAPII ile kompleks oluşturmuş TFIIF bağlanır. Bu noktada, RNAPII transkripsiyonu başlatabilir ancak, promotor bölgeden ayrılamaz. Doç.Dr.Erdal BALCAN 58 Doç.Dr.Erdal BALCAN 60 15 11.10.2012 RNAPII’nin promotordan ayrılması ve RNA’yı uzatması için TFIIE, TFIIH ve TFIIJ’ ’ye gereksinim vardır. TFIIH, hareket etmeden önce RNAPII ‘nın karboksi terminal kuyruğunu (CTD) fosforiller (Ser Transkripsiyon sırasında RNA pol II’ninCTD’inin fosforilasyonu enzimin DNA boyunca ilerlemesine ve transkripsiyonun ve Thr grupları fosforillenir). gerçekleşmesine olanak sağlar. CTD’ ’nin fosforilasyonu sadece enzimin transkripsiyon faktörlerinden kurtulmasına olanak sağlamaz, aynı zamanda transkripsiyonunun uzamasını ve uzayan RNA’ ’nın işlenmesine olanak sağlayacak bazı proteinlerin bağlanmasına olanak sağlar. Bu proteinlerden bazıları RNA CTD, her birinin içinde 3 serin amino asidi içeren 7 amino asitlik (Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser) tekrarlar içerir (C. elegans’ta 45, insanlarda ve Drosophila’daDoç.Dr.Erdal BALCAN 61 52) . TRANSKRİPSİYONUN SONLANDIRILMASI TORPEDO MODEL TORPEDO MODEL 5’ ’-3’ ’ ekzonukleaz aktivitesine sahip bir RNaz-torpil- (mayalarda Rat1, insanda hXm2) poli(A) bölgesine girerek oluşan RNA’ ’yı kırar ve RNA polimerazın DNA’ ’dan ayrılmasını sağlar. ALLOSTERİK MODEL RNA polimeraz elongasyon evresinde aktif formdadır. Poli (A) bölgesini geçtikten sonra yapısal bir değişiklik ya da kovalent bir modifikasyonla düşük aktiviteli bir forma dönüşür ve kademeli olarak ortadan kalkar. Doç.Dr.Erdal BALCAN Doç.Dr.Erdal BALCAN polimerazın kuyruğundan yeni sentezlenmiş RNA’ya “atlayarak”62 RNA işlenmesinde rol alır. 63 Doç.Dr.Erdal BALCAN 64 16 11.10.2012 mRNA dilini protein diline çevirmek için gerekli 4 önemli bileşen: mRNA’lar 4 bazlı alfabe ile yazılı tRNA’lar kodu 20 amino asitlik alfabe ile yazılı koda Aminoaçil-tRNA sentetaz çevirirler Ribozom translasyon Doç.Dr.Erdal BALCAN 65 Prokaryotlardaki Ribozom Bağlanma Bölgesi Doç.Dr.Erdal BALCAN 66 Ökaryotlardaki Ribozom Bağlanma Bölgesi Translasyonun başlaması için ribozomun mRNA’yı yakalaması gerekir. Bir ribozomla bağlanmayı kolaylaştırmak için prokaryotlarda mRNA moleküllerinin açık okuma çerçeveleri (open reading frame-ORF) başlangıç kodonunun upstreamında (5’ kısımda) özel bir dizi içerirler. Bu diziye Ribozom bağlanma bölgesi (ya da ShineDalgarno dizisi) adı verilir. Başlangıç kodonunun 5’ kısmında bulunan bu bölge 16S ribozomal RNA’ ’nın 3’ ucundaki bir diziye komplementerdir. Ribozom bağlanma bölgesi bu RNA bileşeni ile baz eşleşmesi oluşturur ve ribozomu (açık okuma çerçevesinin) başlangıcında yerleşmesine olanak sağlar. • Ökaryotik mRNA 5’ cap yapısı ile ribozomu tanır. • Ribozom 5’-AUG-3’ başlangıç kodonunu buluncaya kadar mRNA üzerinde 5’-3’ yönde diziyi tarar. Shine-Dalgarno dizisi: AGGAGG Ribozom bağlanma b. Doç.Dr.Erdal BALCAN 67 Doç.Dr.Erdal BALCAN 68 17 11.10.2012 AMĐNO ASĐTLERĐN tRNA’ tRNA’ya BAĞLANMASI tRNA “yüklenmesi” Amino asit bağlamamış tRNA’ tRNA’ya “yüksüz yüksüz” ” denir. tRNA’ ’ ya amino asit yüklemesi iki Her bir tRNA için spesifik bir enzim (aminoaçil tRNA sentetaz) adımda gerçekleşir: amino asiti tRNA’ tRNA’ya bağlar. 1. Amino asit ATP ile etkileşerek tRNA’ tRNA ’ya amino asit yüklemesi iki adımda gerçekleşir: aminoaçil-AMP’ ’yi (aminoaçil- 1. Amino asit ATP ile etkileşerek aminoaçilaminoaçil-AMP AMP’ ’yi (aminoaçil(aminoaçil- adenilat) oluşturur. adenilat) oluşturur. 2. Aminoaçil grubu tRNA’ ’ nın 3’ ’- 2. Aminoaçil grubu tRNA’ tRNA’nın 3’ 3’-ucuna eklenir ucuna eklenir. Amino asit + ATP aminoaçil-AMP Amino asit + ATP aminoaçil aminoaçil--AMP +Ppi +Ppi Aminoaçil--AMP + tRNA aminoaçil Aminoaçil aminoaçil--tRNA +AMP Aminoaçil-AMP + tRNA aminoaçil- Amino--açil tRNA sentetaz oldukça spesifiktir. Amino tRNA +AMP Doç.Dr.Erdal BALCAN 69 Doç.Dr.Erdal BALCAN 70 RİBOZOM DÖNGÜSÜ Aktif protein sentezi yapılmazken iki ribozom alt ünitesi ayrı ayrı bulunur. Alt üniteler protein sentezi olacağı zaman mRNA üzerinde (özellikle 5’ uca yakın bölgede) bir araya gelirler. Bu nedenle protein sentezi 5’ uçtan başlar. mRNA ribozomlara çekilir, kodonlar ribozomun içine girer. mRNA, tRNA’yı kullanarak amino asit dizisine dönüşür. Stop kodona gelince iki alt ünite birbirinden ayrılır. PROTEİN SENTEZİNİN BASAMAKLARI Doç.Dr.Erdal BALCAN 71 Doç.Dr.Erdal BALCAN 72 18 11.10.2012 tRNA bağlanma bölgeleri Büyük ribozomal alt ünite küçük ribozomal alt ünite mRNA bağlanma bölgesi Doç.Dr.Erdal BALCAN Figure 6-64 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) P: peptidil site (ilk tRNA’nın bağlandığı bölge) A: amino açil site (2. tRNA’nın bağlandığı bölge) 73 E: çıkış bölgesi Figure 6-66 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Adım 2: polipeptid zincirinin karboksil ucu P bölgesindeki tRNA’dan salınır ve A bölgesindeki tRNA’ya bağlı bulunan amino asidin serbest amino grubuna bağlanır (peptid bağı oluşumu). Bu reaksiyon peptidil transferaz tarafından katalizlenir. Adım 1: sonraki amino asidi taşıyan tRNA , mRNA ile baz eşleniği oluşturarak ribozomal A bölgesine bağlanır. Bu durumda P bölgesi ve A bölgesi iki komşu tRNA içerir. Adım 2: polipeptid zincirinin karboksil ucu P bölgesindeki tRNA’dan salınır ve A bölgesindeki tRNA’ya bağlı bulunan amino asidin serbest amino grubuna bağlanır (peptid bağı oluşumu). Bu reaksiyon peptidil transferaz tarafından katalizlenir. Doç.Dr.Erdal BALCAN Protein sentezi başladığında amino asitlerin uzayan polipeptid zincirine eklenmesi 4 adımda gerçekleşir: 1.tRNA bağlanması 2.Peptid bağı oluşumu 3.Büyük alt ünitenin yer değiştirmesi 4.Küçük alt ünitenin yer değiştirmesi Doç.Dr.Erdal BALCAN 74 Adım 3: büyük alt ünite küçük alt üniteya bağlı hareket eder. Böylece iki tRNA’nın akseptör stemleri E- ve Pbölgesine geçer. 75 Figure 6-66 (part 1 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Doç.Dr.Erdal BALCAN Figure 6-66 (part 2 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 76 19 11.10.2012 Adım 3: büyük alt ünite küçük alt üniteya bağlı hareket eder. Böylece iki tRNA’nın akseptör stemleri E- ve Pbölgesine geçer. Adım 4: Küçük alt ünite hareket eder böylece ribozom yeni aminoaçiltRNA almaya hazır hale gelir. Adım 4: Küçük alt ünite hareket eder böylece ribozom yeni aminoaçiltRNA almaya hazır hale gelir. Adım 1 yeni aminoaçiltRNA gelmesiyle tekrar edilir. Doç.Dr.Erdal BALCAN Figure 6-66 (part 3 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 77 Doç.Dr.Erdal BALCAN 78 Figure 6-66 (part 4 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) GEN Ekzon İntron Ekzon İntron Ekzon İntron İntron Ekzon Promotor TRANSKRİPSİYON Ekzon RNA işlenmesi İntron Ekzon İntron Ekzon İntron Kuyruk Sinyali Ekzon İntron İŞLENME CAP YAPISININ TAKILMASI, KUYRUK EKLENMESİ, İNTRONLARIN UZAKLAŞTIRILMASI şapka PoliA kuyruk Ekzon Ekzon Ekzon Ekzon AAAAAAAAAA TRANSLASYON Doç.Dr.Erdal BALCAN 79 Doç.Dr.Erdal BALCAN 80 20 11.10.2012 1 2 3 kaynaklar 1. Molecular Biology of the Cell Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 5th ed. 2008 2. Lehninger Principles of Biochemistry. Nelson DL, Cox MM, 4th ed. W. H. Freeman ed 2004 3. Molecular Biology of the Gene. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R 5th ed. 2004 1. 5’ ’ uca capping (şapka yapısının takılması) 2. 3’ ’ uca Poli A kuyruğunun takılması 3. Splicing Mekanizması Doç.Dr.Erdal BALCAN 81 Doç.Dr.Erdal BALCAN 82 21
