FİZİKSEL HARİTALAMA
advertisement
FİZİKSEL HARİTALAMA Niçin yüksek çözünürlüklü fiziksel hatitalara ihtiyaç duyulur? Alışılmış insan genetik haritaları, DNA’daki özgü genlerin izole edilmesinde yeteri kadar detaylı olmadığından fiziksel haritalar gereklidir. Fiziksel haritalar aynı zamanda, büyük çaplı DNA sekanslama projeleri için gerçek substrat olarak, DNA örneklerine hizmet verebilmek için gereklidir. Genetik linkaj haritalama, düzenlenmiş markırların bir sırasını sağlar. Deneysel organizmalarda bu sıra hemen hemen yoğun olabilir. İnsanlarda, çok sayıda dölün üretilmesi ve yetişmesinin kontrolü yetersiz olduğundan sınırlıdır. İnsan genetik haritalama çabalarından ortaya çıkan durum şüphelidir. Çünkü mayotik rekombinasyon olaylarının dağılımı düzensizdir. Sitogenetik hiritalama, bu zamana kadar , düşük çözünürlükteydi, şimdi gelişiyor. Eğer otomatikte daha basit olsayda, diğerlerinin yerini alan iyi bir metod olurdu. Bazı organizmalarda, sitogenetikler insandakinden daha güçlüdür. Örneğin, Drosophila’da politen kromozomlar, dikkate değer bir güç ve kolaylık sağlar. Büyük yayılma ve yüksek çözünürlükte politen kromozomları görüntüleme, 50 kb’da olan bantların görünmesine izin verir. Bu, insan metafaz FİSH’nin en iyisinden 20 kez daha kararlıdır. Dahası, metafaz politen kromozomlarda, çok sayıda DNA kopyaları mikro ayrılma ve klonlamada insandakinden daha etkilidir. Radyasyon hibritleme, prensipte markırlar arasındaki mesafelerin ölçümü için doğru bir yol önerir. Bununla beraber, uygulamada radyasyon hibrit haritalarında bağlı uzaklıklar bozulmuş görülür. Radyasyon hibritlerini yalnızca kullanmak, tam bir doğru harita ya da DNA ürünlerinin subklonunun ve karekterizasyonunun yüksek çözünürlükte üretilmesi henüz kesin değildir. Bunun yerine, şuan ki diğer metodlar, fiziksel haritalamada, 3 önemli amaç içermilidir: 1. Bir kromozomun ya da genomun, DNA’sının tümünün düzenlenmiş sıranı sağlamalıdır. 2. DNA markırlarının yoğun sıra içinde doğru mesafelerini sağlamalıdır. 3. Kromozom ya da genomun direk DNA sekansından, DNA örneklerinin bir sırasını sağlamalıdır. Çoğu araştımacıların bu alandaki gayretleri özellikle kromozomlar ya da kromozom bölgeleri üzerine odaklaşır. Probların ve klonların izolasyonunun probleminde, bunların herbirinin düzenlenmesinde ve sonuçta bitmiş haritalar üretilmesinde genellikle farklı metodlar getirilir. Genom çalışmalarında, temel olarak 2 çeşit fiziksel haritalar kullanılıyor ; restriksiyon haritalar ve düzenlenmiş klon bankaları ya da düzenlenmiş kütüphaneler. RESTRİKSİYON HARİTALAR Bir kromozomdan retriksiyon enzimlerle kesilerek oluşturulabilen DNA fragmentlerinin düzenlenmiş sırasını içerir. DNA fragmentinin uzunluğu olarak bilinen harita boyunca olan uzaklıklar ölçülebilir. Pratikte şu anda kullanılan metodlarla elektroforesiz ile ölçülür. Bir ideal restriksiyon haritalamada herbir DNA fragmenti, diğer haritalardaki markırlara bağlanır. Bunun gelişigüzel seçilen problar ile yapılıp yapılmadığı dikkat edilirse, bu probların herbir DNA fragmenti içinde yerleşimi genellikle bilinmez. DNA fragmentlerinin sonlarına cevap veren problar daha yararlıdır, çünkü onların restriksiyon harita üzerindeki pozisyonu tam olarak bilinir. Orijinal olarak problar sekanslanmış DNA segmentleri içerirler. Bununla beraber PCR sayesinde sekanslanmış DNA segmentlerinin kullanımı kolaylaştırıldı. Restriksiyon haritalamanın en büyük avantajı, referans noktalar arasındaki sıranın tam uzunluğunun bilinmesidir. Diğer bir avantajı ise restriksiyon haritalamanın bir top-down tekniği kullanarak bitirilmesidir. Üçüncü avantajı klonlanmış DNA’lardan çok genomik DNA fragmentleri ile çalışıyor olmasıdır. Deneyimler, restriksiyon haritaların doğru ve kesin şekilde kısa zaman periyotunda yapılabildiğini gösterdi. Top- down haritalamada bir kromozom uygun bölgelere ve düzenlenmiş bölgelere kesilir. Genellikle bir kromozom, ilgilenilen materyalde bir hibrit hücre seçimi ile seçilir. Tipik bir restriksiyon haritalamada, bazı önceden varolan genetik harita bilgileri, fiziksel haritalamanın oluşması için bir iskelet olarak kullanılabilir. Alternatif olarak ilgilenilen kromozom, sitogenetik metotlar ya da düşük çözünürlüklü FİSH ile bölgelere ayrılabilir. Büyük DNA fragmentleri, restriksiyon enzimlerle çok seyrek tanıma bölgeleri ile kesilerek üretilir. Fragmentler büyüklüğe göre ayrılır ve genetik olarak ya da sitogenetik olarak haritalanmış DNA probları ile hibridasyonu sayesinde bölgeler seçilir. Bu noktadaki sonuca makrorestriksiyon haritası denir. Fragmentler ortalama 1Mb boyutunda olabilir. Bu basit bir genom için 25 fragment düzenlenmiş olacağı anlamına gelir . bu insan genomu için 3600 fragment demektir. Fragmentler özgü kromozomlar içinde sınıflandırılmadıkça, bu düşünülemiyecek bir iştir. Eğer iyi bir harita isteniyorsa, düzenlenmiş fragmentler alınarak ya da daha sıklıkla restriksiyon nükleazlarla kesilerek, parçalara ayırarak oluşturulabilinir. Restriksiyon haritalamanın en büyük dezavantajı, mümkün metodlar ile sekanslanmış ya da dağıtılabilinmiş ölümsüz formları ve elverişli DNA’yı üretmemesidir. Küçük bir genom için, çoğu makrorestriksiyon fragmentleri PFG fraksiyonu ile ayrılıp, çoğaltılabilir. DÜZENLENMİŞ KÜTÜPHANELER Çoğu genomik kütüphaneler, ilgili restriksiyon enzimlerle kısmi kesim ile yapılır. Fragmentlerin boyutunun seçimi , DNA insertlerin tek sırasını sağlar ve sonra istenilen büyüklük oranı için uygun bir vektör içine klonlanır. Klonlanmış fragmentler DNA parçalarının hemen hemen rastgele sıralanmasıdır. Kütüphane içinde, verilmiş bir küçük DNA bölgesi, bir çok farklı klonda olabilecektir. Çünkü klonlar, genom üzerinde katlanmış bölgeleri içerir. Bu overlapların belirlenmesi çeşitli fingerprinting metodları ile mümkündür. Çalışmalarda, kütüphaneler genellikle, genomun tüm bilgilerini hemen hemen bir kerede örnekleme yapmak için 5 ile 10 kata kadar sıralıdır. Bu geniş kütüphanelerin amacı, bir bitişik kalıpta genomu örten minimum sıradaki klonları düzenlemek ve yerleştirmektir. Bu sıraya tiling path denir. Klon kütüphaneleri genellikle botom-up olarak düzenlenmiştir. Burada özgü klonlar başlangıç olarak kütüphaneden rastgele seçilir. Genellikle kütüphane, örneklerin bir düzeni gibi, herbir klonlar mikrotiter plateler üzerinde bir sırada tek yerleşime sahiptir.böylelikle iki farklı klonların tesadüfi karışma şansları önemsenmemiş olur. Klon, hibridasyon ile, restriksiyon haritalama ile ya da DNA sekanslaması ile fingerprintlenir. Sonuçta klonların, bazı ya da aynı fingerprint paternlerinin hepsini paylaşanlar görülür. Bunlar açıkça üst üste çakışırlar, üst üste çakışan sıralar içinde yerleşirler ve contigs adını alırlar. Bu yaklaşımın çoğu avantajları vardır. DNA’nın , klonlar olarak kullanıldığından beri, ölümsüz örneklerin haritası yapıldı. Küçük klonlama kullanıldığı zaman, haritalar genellikle yüksek çözünürlüklüdür ve bazı fingerprintleme formları, her bir klonun hakkında yararlı bilgi sağlar. Top-down ya da bottom-up haritalama ile yapılmış olan klonların ve örneklerin sayısı korkutabilir. Bu sayı aynı zamanda çözünürlük isteği ile belirlenir. Problar üzerinde bazı perspektifler elde etmek için, 150 Mb bir kromozom haritası düşünün. Bu oran yaklaşık bir insan kromozomu boyutundadır. İnsan kromozomlarının fiziksel haritalarını oluşturmak için var olan metodların uygun sırası ile 50kb ile 1Mb çözünürlüklere izin verilir. Bir harita çözünürlük isteği, bottom-up da klon çeşitlerinin kullanımı ile belirlenecektir. İlk üç klon tipleri, her hücrede çok sayıda kopyası yetişebilir. Bu büyük ölçüde, DNA hazırlama, hibridasyon ve diğer analitik prosüdürlerle basitleşir. Son iki klon tipleri, genellikle her bir ev sahibi hücre için tekli kopya olarak kullanılır. Böylece ayrı ayrı çalışmak zor ama onların büyük insert boyutları, düşük çözünürlüklü haritallamatı daha hızlı ve etkili yapar. RESTRİKSİYON NÜKLEAZ GENETİK KESİMLERİ Yararlı kütüphaneler ve genetik restriksiyon haritalarının üretilmesi için istenilen büyüklükte DNA fragmentlerinin oluşumu kritiktir. Bir genom için her bir 4 bazın eşitçe olduğu yer göserilir, büyüklük n’in özgü alanının oluşma ihtimali 4-n’dir, böylece ortalama fragment uzunluğu enzim tarafından oluşturulan, 4n olabilecektir. 4 ya da 6 baz bölgeleri ile enzimler, küçük insert kütüphanelerinin kısmi kesiminin oluşturulması için uygundur. 10 bazlık bölgeli enzimler düşük çözünürlüklü makro restriksiyon haritalama için tercih edilir. Ama bir çok enzim bilinmiyor. Büyük insert klonları için 8 bazlı enzimler uygun olabilir. HTF ADALARI Not I enzim kesim bölgelerinin frekansı üzerinde etkiye sahip metillenmiş CpG’nin özel dağılımı, memeli genomlarında istatiksel düzensizlikleri yansıtır. Bu, daha düşük spesifik restriksiyon enzim olan Hpa II ile genomik kesimler oluşturulduğu zaman ilk olarak bulundu. Tipik olarak, bu enzimde oluşan kesim CCGG sekansını tanır. Denemelerde, 2 fazlı dağılma bulunur. Hpa II, DNA metilasyonu ile inhibe olur. CmCGG sekansını kesemez. Şekildeki gibi genom, metilasyonun olmadığı bölgede bölünür ve CpG‘lerin metillendiği yerlerde bölünür. Büyük fragmentin Hpa II kesiminden oluştuğu umulur. Küçük fragmentler umulmamıştır. Onlara Hpa II tiny fragments (HTFs) denildi. Bunları içren bölgeler de HTF island diye adlandırıldı. HTF adaları, genlerin yanında yerleşime eğilimlidir, genellikle genlerin 5’ kenarındadır. G+C çok zengindir. HTF adalarında CpG sekansları metillenmemiştir. Eğer buralarda metillenme yoksa, mutasyon ile CpG’nin ileri kaybı olmamalı ve böylece bu sekans sıklığı G+C içeriğini yansıtmalıdır. Not I kesim bölgelerinin %90’ından çoğu HTF adalarında yerleşmiştir. RESTRİKSİYON FRAGMENTLERİN DÜZENLENMESİ Her biri genetik olarak haritalanmış ya da sitogetik olarak haritalanmış DNA markırları, radio işaretli olabilir ve belirlemede hibridasyon probu olarak kullanılır. Büyük DNA fragmentlerine cevap olarak belirleyen ve üzerine oturan hibridasyon probları olarak kullanılır. Makrorestriksiyon haritalama tasarımları oluşturmak için şunları yapmalıyız: 1. 2. 3. 4. 5. Büyük restriksiyon fragmentleri üzerine özgül yerleşmeyen problar isole edilmeli DNA, daha büyük fragment oluşturmak için daha düşük frekanslarla kesilmeli İsole edilen problar ilgilenilen fragmentlere cevap vermelidir Komşu fragmentler şüpheli olmayacak şekilde tanımlanmalı Şansla oluşturulan bazı küçük fragmentler gözardı edilmemelidir. DNA FRAGMENTLERİNİN BELİRLENMESİ Bazı enzimler ile oluşan restriksiyon kesim paternleri PFG ile analizi edilmelidir.PFG ile 3 ya da 4 farklı pulse zamanları ile küçük parçaları ayırmada genellikle gereklidir. 30 saniye pulse 0-200 kb, 60 saniye pulse 200-1000 kb, 10000 saniye 1-3 Mb, 3600 saniye ya da ikinci PFG bunlardan daha büyük fragment oluşturur. DNA fragmentleri, PFG’nin etidium bromide ile boyanmasıyla görünür halde olbilir. İnsan genomu gibi komplex genomlardan kromozom restrksiyon haritası geliştirmek için, bir hibrit hücre içinde başlamak en iyisidir. BÜYÜK DNA FRAGMENTLERİ ÜRETİMİ Daha önce restriksiyon enzimlerinin DNA metilasyonu tarafından inhibe edildiğinden bahsedilmişti. Bunun sağladığı avantajlardan biri restriksiyon enzimlerinin özgüllüğünün artmasıdır ki bu metillenme ile gerçekleşir. Metilasyon ayrıca bir metilaz kullanılarak kısmi kesimlerin daha üst seviyeye geçmesi için genel bir yol olarak kullanılabilir. Metilaz tüm kesim bölgelerinin hepsini tanır ancak reaksiyonun sonuca gitmesine izin vermez. Burada sonuca taşınacak olan metilasyon reaksiyonları ile ilgileniyoruz. Aşağıda DNA gösterilmiş. Bu, siyah harfler ile gösterilen G-C çiftleri tarafında Not I bölgesi içerir. Aşağı yukarı tüm Not I bölgelerinin çeyreği 5’ ucunda ekstra bir C’ye sahip olacaktır. İlave edilen çeyrek 3’ ucunda ekstra bir G’ye sahip olacaktır. Bu ekstra çökelti Fnu D II metilaz için tanıma bölgesi üretir. Fnu D II metilaz CGCG’yi mCGCG’ye çeviren bir enzimdir. Bazı metilasyonlar Not I kesim bölgeleri içerisindedir. Metilasyon ile Not I kesimlerinin tamamının yaklaşık yarısı inaktif olabilir ve bu enzim tarafından çift ortalama fragment büyüklükleri üretir. BAĞLANTI KLONLARI Bu ve bundan sonraki bölümlerde birkaç methot tartışacağız. Bu methotlar diğer haritalama bilgileri girmeden restriksiyon fragmentlerinin sırasının saptanmasına izin veren yöntemlerdir. Bir çok açıdan, diğerlerine göre kat kat sağlıklı olan bu yöntemlerde özgül klonlar kullanılır ki bunlara bağlantı klonları denir. Bu klonlar aynı nadir kesim bölgeleri içerir ki bu bölgeler haritalama yapmak için , örneklerden makrorestriksiyon fragmentleri üretimi için kullanılmaktadır. Bu klonlar bir nadir kesim bölgesine sahiptir. Onlar 2 komşu büyük DNA fragmentlerinin üstüne çakışmalıdır. Nadir kesim bölgesi bağlantı klonunun bir kenarına yakın olmadıkça, bölgenin ötesinde kalan tek kopya materyal hibridleme için etkili olamaz. Bu olasılığı kaldırmak için, birden fazla bağlantı klonu kurarak çalışmak yararlı olur. Bu klonlar nadir kesim bölgesini yandan kuşatan farklı DNA dağılımlarına sahiptir. EcoR I ve Hind III gibi farklı restriksiyon nükleazları ile yapılmış kütüphaneleri kullanışlı bir yoldur. Eğer tam bir bağlantı kütüphanesi elde edilebilir ise, bunlar kullanılarak restriksiyon fragmentlerin tam sıralanışı üretilebilir. Bağlantı klonlar 2 farklı çeşit restriksiyon nükleaz kesimleri arasında etkili köprü vazifesi yaparlar.
