ANTİKANSOREJEN İLAÇLARIN DNA
advertisement
Projenin Adı: ANTøKANSOREJEN øLAÇLARIN DNA BøYOSENSÖRLERøYLE KARùILAùTIRILMASI Projenin Amacı: Kemoterapi, kanser hücrelerini yok etmek için anti-kanser (sitotoksik) ilaçların kullanılmasıdır. Kemoterapi, kanser tedavisinde, tek baúına veya cerrahi iúlemle ve/veya radyoterapi ile birlikte uygulanabilir. Kemoterapi, kimyasal madde (ilaç) ve tedavi kelimelerinin birleúiminden oluúmuútur. Bu tedavide mevcut bulunan yaklaúık kırk de÷iúik ilaçtan seçilen bir veya birkaç ilaç uygulanır. Kemoterapide kullanılan ilaçlar insanlarda denenerek karar verilmektedir. Bizim geliútirdi÷imiz bu sistemle hastadan alınan küçük bir kan örne÷i içerisindeki DNA’dan ve bu DNA’nın ilaç ile etkileúimden yararlanılarak ilaç hastaya verilmeden önce ona ne tür bir etki yaptı÷ı kolayca belirlenebilecektir. Böylelikle canlı denekler veya hücre kültürleri kullanılmadan elektrokimyasal DNA biyosensörleri ile kısa sürede tayini gerçekleútirilebilecektir. Ayrıca sistemimizde elektrot yüzeyi olarak kalem ucu kullanılması di÷er yöntemlere göre yüksek hassasiyetli, küçültülebilir, taúınabilir ve tek kullanımlık modellerinin tasarlanabilmesi, ucuz ve düúük miktarda güç ve ürün gereksinimine sahip olması gibi üstünlükleri bulunmaktadır. Sistemimizin bu üstünlüklerini göstermek amacıyla günümüzde antikanserojen olarak kullanılan Kamptotesin ve Etoposid ilaçlarının DNA üzerinde ne kadar etkili olduklarını canlı denekler kullanmadan elektrokimyasal yolla DNA biyosensörleri yardımıyla tayinlerini gerçekleútirmeyi amaçlıyoruz. 1 1. GøRøù Biyosensörler, biyolojik kaynaklı bir tanıma yüzeyi ile bir fizikokimyasal çevirici sistemden oluúan analitik cihazlar olarak tanımlanmaktadır. Biyosensör sistemleri, seçici tanıma mekanizmasına sahip biyomolekül (algılama kısmı), bu biyomolekülün incelenecek maddeyle etkileúmesi sonucu oluúan fizikokimyasal sinyalleri elektronik sinyallere dönüútürebilen çevirici kısım ve elektronik kısım olmak üzere üç temel bileúenden oluúmaktadır [17]. ùekil 1: Biyosensörlerin yapısı Biyosensör sistemini oluúturan bileúenlerden en önemlisi, tayin edilecek maddeye karúı son derece seçimli fakat tersinir bir úekilde etkileúime giren, biyomolekül kısmıdır. Bu kısım sayesinde biyosensör, kendi spesifik oldu÷u hedef analiti (analiz edilecek maddeyi) tanıyarak etkileúime girer. Enzimler, mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar ve nükleik asitler sensörlerde biyomolekül olarak kullanılırlar. Bunların içinde en yaygın kullanılanlar enzimler [7], antikorlar [21, 10] ve nükleik asitlerdir [2, 13, 22, 23, 26]. Çevirici kısım, reseptörlerin biyolojik reaksiyonunu ölçülebilir fiziksel bir sinyale dönüútürürler ve biyokimyasal reaksiyonun özelli÷ine göre kullanılırlar. Çevirici kısım, elektrokimyasal, optik, elektriksel, kütle duyarlı, manyetik ve termal sisteme dayalı olabilir [20]. Biyosensörler tıp, tarım, gıda, eczacılık, çevre kirlili÷i, savunma ve birçok endüstriyel alanda çok önemli rol oynarlar [17, 19]. Günümüzde, kandaki pek çok biyolojik bileúenin tayininde, çevreyle ilgili olarak toprak, hava ve sudaki toksiklerin tayinlerinde, ilaç sanayinde, gıda endüstrisinde ve kimyasal ve biyolojik silahların algılanmasında kullanılmak üzere biyosensörler geliútirilmektedir. Biyosensörler en fazla biyomedikal sektörde uygulama imkânı bulmuúlardır. Tanıma yüzeyi olarak DNA’nın kullanıldı÷ı biyosensörlere DNA biyosensörleri adı verilir [9, 15, 18, 27]. DNA biyosensörleri, bir çevirim sistemi ile DNA’dan oluúur. DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde [14, 25] veya bu yüzeyle etkileúen maddelerin (kanserojen maddeler, ilaçlar vb.) etkileúim durumunun aydınlatılması ile 2 maddenin tespiti ve miktar tayini amaçlı çalıúmalarda kullanılabilir [3, 4, 8, 11, 12, 16, 24, 28]. Bu maddeler, DNA ile; elektrostatik olarak, DNA çift sarmal yapısının küçük ve büyük oluklarına ba÷lanarak ya da do÷al yapılı DNA’nın baz çiftleri arasına birikerek etkileúebilir [1, 6]. Bunun sonucunda da DNA’da bulunan elektroaktif bazların sinyallerinde düúüúe veya yükseliúe neden olabilirler. Bu sonuca göre de maddenin DNA ile etkileúimi hakkında yorum yapılabilir. Kullanılan klasik yöntemlere alternatif bir yöntem olarak, DNA biyosensörlerinin yüksek hassasiyetli, küçültülebilir olmaları, taúınabilir ve tek kullanımlık modellerinin tasarlanabilmesi, ucuz olmaları, düúük miktarda güç ve ürün gereksinimleri olması gibi avantajlarının olması nedeniyle günümüzde DNA biyosensörlerinin kullanımı oldukça artmıútır. DNA biyosensörleri kullanılarak DNA–ilaç etkileúimleri baúarılı bir úekilde algılanabilmektedir. Bu algılama DNA’ya ait elektroaktif bazlar olan guanin/adenin sinyali üzerinden ya da analizi yapılacak ilacın elektrokimyasal sinyali üzerinden sa÷lanabilir. Bu sinyallerdeki de÷iúimlere göre DNA–ilaç etkileúimleri hakkında yorumlar yapılabilir [5]. Çalıúmamızda, DNA tutturma yüzeyi olarak kalem ucundan yararlanılmıútır ve her bir deneme için bu kalem ucunu de÷iútirmemiz yeterli olmuútur. Kanser üzerinde etkili olan ilaçlardan, Kamptotesin ve Etoposid üzerinde araútırmalar yapılmıútır. Bu çalıúmalarda biyosensör sistemimizde gerekli olacak uygun DNA ve ilaç konsantrasyonları, uygun çözeltiler ve uygun etkileúim süreleri elde edilmiútir. øki ilaç için, oluúturdu÷umuz DNA biyosensörleriyle, DNA üzerine etkilerini, konsantrasyon ve süre bakımından karúılaútırabilmemiz mümkün olmuútur. Tüm bu optimizasyon çalıúmaları yapıldıktan sonra ilaç-DNA etkileúimi yaklaúık 15dk gibi kısa bir süre içerisinde tespit edilebilmiútir. 3 2. YÖNTEM: 2.1. Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanıúları Stok DNA Çözeltisinin Hazırlanması: Kullanılacak olan balık sperm DNA stok çözeltisi ultra saf su ile 1000 μg/mL (ppm) konsantrasyonunda hazırlandı ve -20 0C’de saklandı. Tampon çözeltisi olarak 0,05 M fosfat tampon çözeltisi (PBS), 0,50 M asetat tampon çözeltisi (ACB), 0,02 M Tris-HCl tampon çözeltisi (TBS) kullanıldı. Tampon çözeltilerinin hazırlanmasında 18 Mega-ohm’luk ultra saf su kullanılmıútır. Tamponlar hazırlık sonrasında plastik úiúelerde, buzdolabında +40C’de saklanmıútır. Hazırlanan tampon çözeltilerinin pH’larını istenilen de÷erine getirilebilmesi, hazırlanan 0,1N’lik NaOH veya 0,1N’lik HCl çözeltilerinin ve pH metre cihazını kullanımıyla gerçekleútirilmiútir. 2.2. Deney Düzene÷inin ve Elektrotların Hazırlanıúı Diferansiyel puls voltametrisi tekni÷inden yararlanılarak yapılan bu çalıúmada, potansiyostat cihazı olarak μ-AUTOLAB tip II (Eco Chemie, Hollanda) ve yazılım programı olarak GPES 4.9 kullanılmıútır. Üçlü elektrot sistemi olarak ise, kalem grafit elektrot çalıúma elektrotu, Ag/AgCl referans elektrot ve platin de karúıt elektrot olarak kullanılmıútır. Her bir elektrot sisteme metal ba÷lantılarla ba÷lanmıú ve bu üçlü elektrot sistemin daldırıldı÷ı ölçüm çözeltisinin hacmi 3 mL, ilaç ve DNA çözeltilerinin hacmi 1,5 mL olacak úekilde ayarlanmıútır. Çevirici kısım Elektronik kısım Biyomolekül Kısım ùekil 2: Biyosensörün kısımları 4 Çalıúmamızda çalıúma elektrotu olarak kullanılan, kalem grafit elektrotun (Rotring T 0,5 kalem, Tombo HB model 0.5mm uç) 6cm olan grafit uçları deneysel koúullara uygun olması açısından 3cm boyunda kesildi. Bu 3cm’nin 1,5cm’lik kısmı iúaretlenerek, 1cm’lik kısmı çözelti içine daldırılacak úekilde sisteme yerleútirildi. Her bir deneme için en az 3 kalem ucu grafit yüzeyleri oluúturularak tek kullanımlık elektrot sistemleri ile tekrarlanabilirlikler sa÷lanmıú oldu. ùekil 3: Uç kesme iúlemi 2.3. Deneysel Basamaklar ùekil 4: Deney basamakları 5 1. Elektrot yüzeyinin aktivasyonu: Hem kullanılan çözeltinin hem de kullanılacak elektrotun temiz olup olmadı÷ına karar vermek ve buna ek olarak kalem ucunda yer alabilecek her türlü bileúi÷i yükseltgenebilecekleri en son form olan karboksilik asite kadar yükseltgemek için kalem ucuna asetat tamponu içerisinde 60s +1.4V uygulanır. 2. DNA’nın yüzeye tutturulması: Bu iúlem sırasında belirli konsantrasyonda stok DNA çözeltisinden seyreltilerek hazırlanan DNA, 200s +0.5V uygulanarak daha önce aktive edilmiú olan kalem ucu elektrot yüzeyine elektrostatik olarak tutturulur. Yüzeyden tutunmayan DNA’ların uzaklaútırılması için DNA’yı hazırladı÷ımız boú tampon içerisinde yıkanır. 3. DNA-ilaç etkileúimi: Yüzeyine DNA tutturulmuú olan elektrot, belirli konsantrasyonda hazırlanmıú olan ilaç çözeltisiyle herhangi bir volt uygulamadan belirli bir süre etkileútirilir ve etkileúimden sonra ilacın hazırlandı÷ı tamponda yıkanır. 4. Ölçüm: Tüm bu etkileúim basamaklarından sonra asetat tamponu içerisinde ölçüm gerçekleútirilir. Ölçüm aralı÷ı olarak ilaçların ve DNA’nın yükseltgenme sinyalleri dikkate alınarak 0-1.2V aralı÷ında ölçüm yapılmıútır. 2.4. Uygun DNA Konsantrasyonunun Bulunması Bu çalıúmada her iki ilaç için de kullanılacak olan uygun DNA konsantrasyonunu tespit etmek amacıyla, aktivasyon basama÷ı gerçekleútirildikten sonra, DNA tutturma basama÷ında uygulanmak üzere 1000ppm (μg/ml) olan stok DNA çözeltimizden 1ppm, 5ppm, 10ppm, 15ppm ve 20ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltileri hazırlanarak +0.5V’da 200s karıúan ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. Fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkama iúlemi yapıldı ve asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 2.5. Uygun Tampon Çözeltisinin Bulunması Aktivasyon iúlem basama÷ından sonra, +0.5V’da 200s karıútırmalı olarak, 10ppm olacak úekilde asetat – fosfat – tris tamponları içerisinde ayrı ayrı hazırladı÷ımız DNA elektrot yüzeyine elektrostatik olarak tutturuldu. Daha sonra DNA tutturulan elektrot, DNA’nın hazırlandı÷ı tampon içerisinde bir kez yıkandı. Kamptotesin için 5ppm, Etoposid için 10ppm olacak úekilde asetat – fosfat – tris tamponları içerisinde ayrı ayrı ilaç çözeltileri hazırlandı. Karıúan ortamda herhangi bir volt uygulamaksızın Kamptotesin için 5dk, Etoposid için 12dk yüzeyinde DNA bulunan kalem ucu elektrotun ilaç ile etkileúimi gerçekleútirildi. ølacın hazırlandı÷ı tampon içerisinde bir kez yıkandı ve asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 6 2.6. Uygun DNA-ølaç Etkileúim Süresinin Bulunması Bu deneyde sırasıyla aktivasyon iúlemi yapıldıktan sonra, 10ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltisinin hazırlandı. +0.5V’da 200s, karıúan ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. Fosfat tampon içerisinde bir kez yıkama iúlemi gerçekleútirildi. Kamptotesin için 5ppm, Etoposid için 10ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözeltileri hazırlandı. Yüzeyine DNA tutturmuú oldu÷umuz kalem ucu elektrotlar, karıúan ortamda herhangi bir volt uygulamaksızın Kamptotesin için 3dk, 5dk ve 7dk, Etoposid için ise 3dk, 5dk, 7dk, 10dk, 12dk ve 15dk olacak úekilde ayrı ayrı ilaç ile etkileútirildi. Fosfat tampon içerisinde bir kez yıkandı ve asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 2.7. Uygun ølaç Konsantrasyonunun Bulunması Aktivasyon iúlemi gerçekleútirildikten sonra, 10ppm olacak úekilde DNA çözeltileri hazırlanarak karıúan ortamda +0.5V’da 200s elektrostatik olarak DNA tutturuldu. Daha sonra DNA tutturulan elektrot fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkandı. Kamptotesin için 1ppm, 5ppm, 10ppm ve 20ppm, Etoposid için 1ppm, 5ppm, 10ppm,15ppm ve 20ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözeltileri hazırlandı. Karıúan ortamda herhangi bir volt uygulamaksızın Kamptotesin için 5dk, Etoposid için 12dk olacak úekilde ayrı ayrı ilaç ile etkileútirildi. Fosfat tampon içerisinde bir kez yıkandı ve asetat tampon içerisinde ölçüm yapıldı. 2.8. DNA-ølaç Etkileúimi Çalıúması Kamptotesin için; Asetat tamponu içerisinde +1.4V 60 s aktivasyon iúlemi yapıldı. 10ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltisi hazırlandı. +0.5V’da 200s karıúan ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. DNA tutturulan kalem ucu elektrotu fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkandı. 5ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözeltisi hazırlandı. 7 5dk olacak úekilde DNA tutturulan kalem ucu elektrotunun ilaç ile etkileúimi gerçekleútirildi. Bir kez fosfat tampon içerisinde yıkandı. Asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. Etoposid için; Asetat tamponu içerisinde +1.4V 60 s aktivasyon iúlemi yapıldı. 10ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltisi hazırlandı. +0.5V’da 200s karıúan ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. DNA tutturulan kalem ucu elektrotu fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkandı. 10ppm olacak úekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözelti hazırlandı. 12dk olacak úekilde DNA tutturulan kalem ucu elektrotunun ilaç ile etkileúimi gerçekleútirildi. Bir kez fosfat tampon içerisinde yıkandı. Asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 8 3. SONUÇLAR: 3.1. Uygun DNA Konsantrasyonunun Bulunması Yapılan çalıúmalarda guanin sinyaline bakılarak hem Kamptotesin hem de Etoposid için uygun DNA konsantrasyonu, 10ppm’den sonra alınan guanin sinyalleri sabitlendi÷i için 10ppm olarak bulunmuútur. Grafik 1: Uygun bulunan DNA konsantrasyonu 3.2. Uygun Tampon Çözeltisinin Bulunması Her iki ilaç için de uygun tampon çözeltilerinin bulunması, DNA’nın ilaçla etkileúimden önce ve ilaçla etkileúimden sonraki sinyalleri dikkate alınarak karar verilmiútir. Buna göre ilaçla etkileúimden sonra en fazla guanin sinyalindeki düúüú her iki ilaç için de fosfat tamponunda (PBS) görülmüútür. Grafik 2: Uygun tampon çözeltisinin bulunması 9 3.3. Uygun DNA-ølaç Etkileúim Süresinin Bulunması Her iki ilaç için yapılan uygun DNA-ilaç etkileúim süre çalıúmasında ilaçla etkileúimden sonra en fazla guanin sinyalindeki düúüú dikkate alınarak Kamptotesin için 5dk, Etoposid için ise 12dk oldu÷u bulunmuútur. Buna göre Kamptotesin Etoposid’e göre daha kısa sürede DNA’ya etki etmektedir sonucunu çıkarabiliriz. Grafik 3: Kamptotesin için uygun etkileúim süresi Grafik 4: Etoposid için uygun etkileúim süresi 10 3.4. Uygun ølaç Konsantrasyonunun Bulunması Her iki ilaç için yapılan uygun ilaç konsantrasyonu çalıúmasında ilaçla etkileúimden sonra en fazla guanin sinyalindeki düúüú dikkate alınarak Kamptotesin için 5ppm, Etoposid için ise 10ppm oldu÷u bulunmuútur. Buna göre Kamptotesin Etoposid’e göre daha düúük konsantrasyonda DNA’ya etki etmektedir sonucunu çıkarabiliriz. Grafik 5: Uygun ilaç konsantrasyonunun bulunması 3.5. DNA-ølaç Etkileúimi Çalıúması Her iki ilaç için de uygun koúullar belirlendikten sonra oluúturdu÷umuz biyosensörün amacımız için uygun olup olmadı÷ını bu çalıúmayla göstermiú olduk. Buna göre her iki ilaç için de uygun konsantrasyonları ve uygun etkileúim sürelerini deneyerek DNA’daki guanin bazlarındaki düúüúleri gözlemledik. Bunun sonucunda her ne kadar farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde etki etseler de her iki ilacında DNA’ya etki ederek guanin sinyallerini düúürdü÷ünü ve her iki ilacında antikanserojen nitelikte oldu÷unu göstermiú olduk. Bizim burada gösterdi÷imiz gibi herhangi iki veya daha fazla antikanserojen özellikte oldu÷u düúünülen di÷er ilaçların da karúılaútırılmasının canlı üzerinde denemeden mümkün olaca÷ını düúünmekteyiz. Aúa÷ıda bununla ilgili sonuçlar gösterilmiútir. 11 Grafik 6: Kamptotesin için yapılan DNA-ilaç çalıúmalarındaki ilaç ve guanin sinyallerinin karúılaútırılması Grafik 7: Etoposid için yapılan DNA-ilaç çalıúmalarındaki ilaç ve guanin sinyallerinin karúılaútırılması 12 TARTIùMA VE ÖNERøLER: Bu proje kapsamında DNA-ilaç etkileúimine dayalı bir elektrokimyasal biyosensör yardımıyla antikanserojen özelli÷i bilinen iki ilaç olan Kamptotesin ve Etoposid, konsantrasyon ve etki süreleri bakımından karúılaútırıldı. Elektrot olarak kullanılan kalem grafit elektrotunun tek kullanımlık olması ve hazırlanmasının kolay olması çalıúmaya ayrı bir fayda sa÷lamıútır. Bizim geliútirdi÷imiz bu sistemle hastadan alınan küçük bir kan örne÷i içerisindeki DNA’dan ve bu DNA’nın ilaç ile etkileúimden yararlanılarak ilaç hastaya verilmeden önce ona ne tür bir etki yaptı÷ı kolayca belirlenebilecektir. Böylelikle canlı denekler veya hücre kültürleri kullanılmadan etkinli÷ini elektrokimyasal DNA biyosensörleri ile kısa sürede tayini gerçekleútirilebilecektir. Bizim çalıúmamızda da yaklaúık 15dk gibi kısa bir süre içerisinde tayin gerçekleútirilebilmiútir. Kamptotesin için uygun konsantrasyon 5 ȝg/mL, etkileúim süresi 5 dakika olarak tespit edilirken, Etoposid için uygun konsantrasyon ise 10 ȝg/mL, etkileúim süresi ise 12 dakika olarak saptanmıútır. Kamptotesin 0,88 V civarında sinyal verirken, Etoposid 0,5 V civarında yükseltgenme sinyali vermiútir. Her ne kadar farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde etki etseler de her iki ilacında DNA’ya etki ederek guanin sinyallerini düúürdü÷ünü ve her iki ilacında antikanserojen nitelikte oldu÷unu göstermiú olduk. Bizim burada gösterdi÷imiz gibi herhangi iki veya daha fazla antikanserojen özellikte oldu÷u düúünülen di÷er ilaçların da karúılaútırılmasının canlı üzerinde denemeden mümkün olaca÷ını düúünmekteyiz. Bundan sonraki aúama DNA’daki guanin bazının sinyalindeki düúmeyle hücre kültüründeki hücre ölümüyle orantılı olup olmadı÷ının hücre kültürleriyle birlikte götürülmesi olabilir. Her iki ilacın da DNA ile etkileúimlerinden elde edilen guanin yükseltgenme sinyallerindeki de÷iúiklikler ve ilaçların yükseltgenme sinyalindeki de÷iúiklikler incelendi. Bu de÷iúikliklere göre her bir ilacın DNA’ya etkisi hakkında yorum yapıldı. Kullanılan maddelerin elektrot yüzeyindeki DNA ile etkileúmesi sonrasında, DNA’nın çift sarmal yapısını bozabilece÷i veya DNA’nın guanin bazına spesifik bir ba÷lanmanın mümkün olabilece÷i ve bunun sonucunda sinyalde bir azalma gözlendi÷i úeklinde bir açıklama yapılabilir. ølaçların kendi sinyallerindeki azalma ise, yapılarında yer alan yükseltegenebilecek gruplara ait bir de÷iúikli÷e dayandırılabilir. Geliútirilen yöntemin hızlı, güvenilir ve ucuz maliyetli olması bu alanda daha çok çalıúma yapılmasına dolayısıyla DNA – ilaç etkileúimi hakkında edinilen bilgilerin daha çok geliúmesine olanak sa÷lamaktadır. DNA ile etkileúime giren maddelerin tayini, DNA hedefli ilaçların geliútirilmesinde büyük önem taúımaktadır. Çalıúmamızın baúka bir özelli÷i de antikanserojen madde tayini olmak üzere ilaç tasarımında kullanılabilecek maddelerin aydınlatılmasında önemli bir örnek teúkil etmesidir. DNA ile 13 etkileúen çeúitli maddelerin voltametrik davranıúlarının tayini, kemoterapide kullanılan DNA’ya özgül olarak ba÷lanan moleküllerin dizayn edilmesi ve DNA’ya ba÷lı hasta baúı teúhislerde kullanılan biyoteknolojik araçların geliútirilmesinde büyük bir önem taúımaktadır. Gerçekleútirilen bu çalıúma ve gelecekte planlanan çalıúmaların amacı; DNA hedefli ilaçların ya da yeni bileúiklerin DNA ile etkileúim türlerinin, elektrokimyasal olarak belirlenmesini sa÷lamak ve böylece, antikanser ilaç-DNA etkileúim mekanizmalarının hızlı ve güvenli bir úekilde tanımlanmasına alternatif olabilecek, bu sebeplerden dolayı DNA çip teknolojisine uyarlanabilecek yeni bir yöntem tasarlamaktır. Kullanılan yöntem, basit ve düúük maliyetli olup, hızlı ve seçimli úekilde yanıt verebilmektedir. Ayrıca kullanılan bu sistem yeni sentezlenecek olan antibiyotik, antiviral, antikanser ilaca dayalı ilaç çalıúmalarına katkıda bulunmak ve/veya bir ilaç hammadesinin daha duyarlı bir úekilde tayinini yapmak amacıyla, gelecekte piyasaya sürülecek DNA biyoçiplerinin teknolojisini oluúturaca÷ı ümit edilmektedir. TEùEKKÜR: Proje çalıúmalarında bizi destekleyen okul müdürümüz Yavuz KAHRAMAN’a, danıúman ö÷retmenimiz Mesut ESEN’e, laboratuvar, malzeme ve alan bilgisi bakımından her zaman yardımcı olmaya çalıúan Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ö÷retim üyelerinden Prof. Dr. Mehmet E. ùengün ÖZSÖZ’e araútırmalarımıza yapmıú oldukları katkılarından dolayı teúekkür ederiz. 14 KAYNAKÇA: 1. Blackburn, G.M., Gait,M.J. (1990). Nucleic Acids in Chemistry and Biology IRL Press, New York, Ch. 8, sayfa 297 - 332. 2. Collings, A.F., Caruso, F., (1997). Biosensors: recent advances, Reports in Progress in Physics, 60, sayfa 1397-1445. 3. Erdem, A., Kerman, K., Meriç, B., Akarca, U.S., Ozsoz, M. (1999). DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Electroanalysis, 11, sayfa 586-588. 4. Erdem, A., Kerman, K., Meriç, B., Akarca, U.S., Ozsoz, M. (2000). Novel hybridization indicator methylene blue for the electrochemical detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Anal. Chim. Acta, 422, sayfa 139-149. 5. Erdem, A., Ozsoz, M. (2002). Electrochemical DNA biosensors based on DNA- Drug interactions, Electroanalysis, 14, sayfa 965-974. 6. Graves, D. E., and Velea., L.M. (2000). Intercalative Binding of Small Molecules to Nucleic Acids. Curr. Org. Chem. 4, sayfa 915–929. 7. Gorton, L., Csöregi, E., Dominguez, E., Emneus, J., Jonsson-Petterson, G., MakroVarga, G., Persson, B., (1991). Selective detection in flow analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes, Anal. Chim. Acta, 250, sayfa 203-248. 8. Kelley, S. O., Barton, J.K. (1997). Electrochemistry of methlene blue bound to a DNAmodified electrode, Bioconjugate Chem., 8, sayfa 1997. 9. Kerman, K., Meric, B., Ozkan, D., Kara., P., Erdem, A., Ozsoz M., (2001). Electrochemical DNA biosensor for the determination of Benzo[a]pyrene – DNA adducts, Anal. Chim. Acta.,450, sayfa 45-52. 10. Killard, A.J., Smyth, M.R., Grennan, K., Micheli, L., Palleschi, G., (2000). Rapid antibody biosensor assays for environmental analysis, Biochemical Society Transactions, 28-2, sayfa 81-84. 11. Labuda, J., Buckova, M., Heilerova, L., Caniova-Ziakova, A., Brandsteterova, E., Mattusch, J., Wennrich, R. (2002). Voltammetric detection of antioxidative properties of flavanoids using electrically heated DNA modified Carbon Paste Electrode, Sensors, 2: 1-10. 12. Lukasova, E., Jelen, F. and Palecek, E. (1982). Electrochemistry of Osmium-Nucleic acid complexes: A probe for single-stranded and distorted double-stranded regions in DNA, Gen. Physiol., Biophys., 1, sayfa 53-70. 13. McGown, L.B., Joseph, M.J., Pitner,J.B.,Vonk, G.P. ve Linn, C.P., (1995). The Nucleic acid ligand: A new tool for molecular recognition, Anal. Chem., 67, sayfa 663 A- 668 A. 15 14. Meric, B., Kerman, K., Ozkan, D., Kara, P., Ozsoz, M., (2002). Indicator-free DNA biosensor based on adenine and guanine signals, Electroanalysis, 14(18), sayfa 1245-1250. 15. Mikkelsen S.R., (1996). Electrochemical Biosensor for DNA sequence Detection A Review, Electroanalysis, 8(1), sayfa 15-19. 16. Millan, K.M., Mikkelsen, S.R. (1993). Sequence-selective biosensor for DNA Based on electroactive hybridization indicators, Anal. Chem., 65, sayfa 2317- 2323. 17. Mutlu, M., (2002). Biyosensörler, Bilim ve Teknik Dergisi, Yeni Ufuklara, Temmuz 2002, sayfa 17 18. Palecek, E., (1988). New trends in electrochemical analysis of nucleic acids, Bioelectrochem. Bioenerg., 20, sayfa 179-194. 19. Rodriguez-Mozaz, S., et al., (2004). Biosensors for environmental applications:Future development trends, Pure Appl. Chem., 76 (4), sayfa 723–752. 20. Shin, J. H., Yoon, S. Y., Yoon, I.J., Choi, S.H., Lee, S.D., Nam, H., and Cha, G.S., (1998). Potantiometric Biosensors Using Immobilized Enzyme Layers Mixed With Hydrophilic Polyurethane, Sensors and Actuators B, 50, sayfa 19-26. 21. Vlatakis, G., Andersson, L.I., Müler, R. ve Mosbach, K. (1993). Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting, Nature, 361, sayfa 645–647. 22. Wang, J., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H., Farias, P.A.M., Dontha, N., (1996). DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human immunodeficiency virus, Anal. Chem., 68, sayfa 2629-2634. 23. Wang, J., Grant, D.H., Ozsoz, M., Cai, X., Tian, B., Fernandes, J.R., (1997). Adsorptive potentiometric stripping analysis of nucleic acids at mercury electrodes, Anal. Chim. Acta, 349, sayfa 77- 79. 24. Wang, J., Kawde, A.N., Erdem, A., Salazar, M. (2001). Magnetic beadbased label-free electrochemical detection of DNA hybridization, Analyst, 126, sayfa 2020-2024. 25. Wang, J., Nielsen, P., Jiang, M., Cai, X., Fernandes, J.R., Grant, D.H., Ozsoz, M., Beglieter, A., Mowat, M., (1997). Mismatch sensitive hybridization detection by peptide nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance, Anal. Chem., 69, sayfa 52005202. 26. Wang, J., Rivas, G., Cai, X., Dontha, N., Shiraishi, H., Luo, D., Valera, F. S., (1997). Sequence-spesific electrochemical biosensing of M. tuberculosis DNA, Anal. Chim. Acta, 337, sayfa 41-48. 27. Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J.R., Jiang, M., Paz, J.L.L.,Waymire, R., Nielsen, T.W., Getts, R.C., (1998). Adsorption and detection of DNA dendrimers at carbon electrodes, Electroanalysis, 10(8), sayfa 553-556. 28. Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J.R., Paz, J.L.L., Jiang, M., Waymire, R. (1998). Indicator-free electrochemical DNA hybridization biosensor, Anal. Chim. Acta, 375: 197–203. 16
