Mutasyon Saptama Yöntemleri

Tüberküloz Tanısında
Moleküler Yöntemler
Prof. Dr. TANIL KOCAGÖZ
Nükleik Asit Çoğaltma ile Enfeksiyon
Etkenlerinin Saptanması
Örnekteki
hücreler
DNA
eldesi
DNA
çoğaltma
Ürün
saptama
Polimeraz Zincirleme Tepkimesi
(Polymerase Chain Reaction –PCR-)
Hedef Bölge
Karry Mullis
Kalıp DNA
95°C zincirlerin ayrılması
50-70°C
primerlerin birleşmesi
72°C DNA yapımı
Ürünler
Elektroforez
İzlenebilir Elektroforez
ORTE
Mikobakteri Türlerinin Saptanması
PZT Restriksiyon Enzim İncelemesi
• hsp65 gen bölgesi PZT ile çoğaltılıp, BstEII and HaeIII
enzimleri ile kesilir
• Restriksiyon biçemleri özel molekül ağırlık standartları ile
karşılaştırılır
(Myker B and Myker H. Köksalan & Kocagöz)
ORTE ve Tibo Gel ile hsp65 PRA
“Line Probe Assay”
•
•
•
•
INNO-LiPA Mycobacteria (Innogenetics, Ghent, Belgium)
16S-23S rRNA “spacer region”; Biyotinli primerler ile PCR
Tersine hibridizasyon; streptavidine-alkalen fosfataz
M. tuberculosis, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae, M.
avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, and M. chelonae
Moleküler Epidemiyoloji
•
•
•
•
•
Kaynak olgunun belirlenmesi
M. tuberculosis bulaş yollarının izlenmesi
Relaps veya reenfeksiyonun ayrımı
Laboratuvarda çapraz bulaşın saptanması
Tüberkülozun yerel ve küresel yayılımının
izlenmesi
IS6110 RFLP
Spoligotyping
• Çok değişkenlik gösteren doğrudan tekrar
bölgesinin PZT ile çoğaltılıp incelenmesi
İzlenebilir PZT
Floresans Rezonans Enerji Transferi
(FRET) Propları
M. tuberculosis’te ilaç direnci
Rifampisin
rpoB’de nokta mütasyonlar
İzoniyazid
(İNH)
katG, inhA ve ahpC’de nokta
mütasyonlar
Etambütol
embB’de nokta mütasyonlar
Streptomisin
rpsL ve rrs’de nokta mütasyonlar
Pirazinamid
pncA’da nokta mütasyonlar
Rifampisin Direncinin
izlenebilir PZT ile belirlenmesi
Fluorescence (-dF/dT)
Red640 ile işaretli FRET
Propları ile erime eğrileri
Temperature
Fluorescence (-dF/dT)
Red705 ile işaretli FRET
Propları ile erime eğrileri
Temperature
DNA saflaştırma
PZT çoğaltma
karışımı
hazırlama
İzlenebilir PZT
Olanakları kısıtlı laboratuvarlar
Uganda
Hindistan
Gene Xpert

M. tuberculosis ve
Rifampisin direnci
Test Hazırlama
Sürüntü çubuğu elüsyon sıvısına konup tutacak kısmı kırılır
Kapak kapatılıp vorteksle çalkalanır.
Kartuşun örnek kısmına dökülür.
Aygıta konup test işlemi başlatılır.
C
A
D
-3’
-5’
5’3’-
B
Molecular
Beacon
Target
Hybrid
E
Zincir Ayırma Çoğaltma
Strand Displacement Amplification (SDA)
Transkripsiyona Dayalı Çoğaltma
Transcription Mediated Amplification (TMA)
VerePLEX – DNA saflaştırma yok – MTB, TDM –
INH, Rifampisin direnci
Hydra 1K- İzlenebilir PZT – Erime Tepesi incelemesi
GenePOC – İzlenebilir PZT – Tanı ve INH, Rifampin direnci
Alere Q – DNA saflaştırma - İzlenebilir PZT – İlaç direnci
İlmiğe Bağlı Çoğaltma
“Loop Mediated Amplification” (LAMP)
Çoğaltma için 6 bölgeye özgül 4 adet primer
kullanılır
 Özgüllüğü çok yüksektir
 Sabit sıcaklıkta çoğaltma yapılır, sıcaklık
döngüsü gerektirmez
 Çoğalma floresans veya bulanıklık ile
izlenebilir
 RNA’dan başlanarak çoğaltma yapılabilir

Decomics
Santrifüj gerektirmediği için dünyada laboratuvar olanakları en kısıtlı yörelerde dahi
kullanılabilir. Örnek işleme süresini 45 dakikadan 23 dakikaya indirmektedir.
Örnek kaba konur
Emici boncuklar eklenir
Karıştırılır
Karıştırılır
5 dakika beklenir
10 dakika beklenir
Boncuk paketi açılır
Nötralizasyon
3 dakika sonra hazır
sıvısı eklenir olan örnekten ekim yapılır
TK Besiyeri
Kullanıma hazır – Kültür – Duyarlılık Testi
TK
Mikobakteri
Kontaminasyo
n
Teşekkürler