biyoteknoloji ders notu
advertisement
MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI BİYOTEKNOLOJİ DERS NOTLARI Biyoteknoloji, genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan manipülasyonlarla yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler elde etmektir. Biyoteknolojinin kullanım alanları her gün biraz daha önem kazanmaktadır. Kendi içinde sınıflandırılacak olursa mikrobik biyoteknoloji, tarımsal biyoteknoloji, hayvan biyoteknolojisi, adli biyoteknoloji ve tıbbi biyoteknoloji gibi birçok alanda biyoteknoloji kullanılmaktadır. Biyoteknolojinin gelişiminde en önemi adımlar restriksiyon enzimlerinin saptanması ile atılmaya başlanmıştır. Restriksiyon endonukleazlar; dışarıdan hücrelere giren yabancı DNA dizilimlerinin*, bakterideki özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak, mutasyonlar meydana getirmesini engelleyen, böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla görevli enzimlerdir. Bu enzimler, dışarıdan gelecek olan genetik materyalleri ayrıştırma işlemlerini rastgele yapmamakta, kısa DNA dizilerini özgül olarak tanıyıp, bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesim işlemini gerçekleştirmektedirler. Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler ve her enzimin keseceği bölge de bilinmektedir. İşte bu spesifik olarak kesme yetenekleri sayesinde bilim insanları birçok genetik materyal üzerinde işlem yapma, onları istedikleri yerden kesip yerine başka özellikler yerleştirm hareketliliğine kavuşmuşlardır. Nukleik asit (DNA/RNA) çoğaltma yöntemleri Biyoteknoloji tanımlanmasında alanındaki da hız, gelişmeler spesifite gibi sayesinde birçok infeksiyöz avantaja sahip ajanların yöntemler geliştirilmeye başlanmıştır. Böylece klasik yöntemlerle tanısında sorunlarla karşılaşılan hastalıkların tanısında hızlı ve spesifik sonuçlar almak mümkün olmaya başlanmıştır. Buna bağlı olarak infeksiyöz hastalıklardan korunma ve kontrolde daha etkili sonuçlar almak ve aynı zamanda ulusal kapsamda epidemiyolojik analizlerde de bulunmak mümkün olmuştur. Nükleik asit çoğaltma ve saptama yöntemleri temelde iki farklı prensip üzerinde 1 oluşturulmuştur; nükleik asit prob hibridizasyon yöntemleri ve nükleik asit amplifikasyon yöntemleri. POLYMERASE CHAIN REACTION (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU-PCR) PCR ilk kez 1983 yılında uygulamaya konulmuş bir test olmasına rağmen günümüze kadar oldukça geliştirilmiş olup, araştırmaların yanı sıra infeksiyonların tanısından genetik hastalıkların tanısı ve adli tıbba, ekolojiden gıda kontrolüne kadar uzanan bir yelpazede rutin amaçlarla da kullanılmaktadır. Özellikle çok zor ya da uzun sürede üreyen ve kültürü yapılamayan mikroorganizmaların tanısında tercih edilen bir yöntemdir. PCR istenilen DNA gen bölgelerinin (hedef-target) in-vitro olarak bir tüp içinde çoğaltılması ve elde edilen bu ürünlerin gözle görülebilir hale getirilerek saptanmasıdır. Bu sayede çok az miktardaki hedef DNA çoğaltılarak saptanabilmektedir. Çalışma presibi: Hedef genetik materyallerin (DNA/RNA*) spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile enzimatik olarak sayısal çoğaltılması prensibi ile çalışan PCR üç aşama bulunmaktadır. Bunlar; denatürasyon, bağlanma/hibridizasyon (annealing) ve sentez (uzama)’dır ve bu üç basamak bir döngüyü/siklusu oluşturur. Denatürasyon: DNA’ nın iki polinükleotid iplikçiğini bir arada tutan hidrojen bağlarının, yüksek ısı kullanarak, eriterek tek iplikçikli moleküller oluşturulduğu aşamadır. uygulanarak Bu reaksiyon 30 saniye süreyle 90-96º C ısı gerçekleştirilir. Ayrıca birçok PCR çalışmasında, özellikle denatürasyonu zor olan kalıp DNA’lar için 94-96 C’ de 3-5 dakika süre ile bir ön denatürasyon işlemi uygulanması önerilmektedir. Bağlanma/hibridizasyon: Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır. Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup, bağlanma her zaman DNA polimeraz enziminin çalışma prensibine uygun olarak 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşmektedir. Bu basamak için gerekli olan ısı genellikle primerlerin erime ısısına göre ayarlanmaktadır. 2 Sentez: Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’ yönde uzatıldığı aşamadır. Sentez işlemi 65-72º C de 1-2 dakika sürede gerçekleştirilmektedir. Yukarıda açıklanan üç basamaktan oluşan bir siklus sonunda örnekteki mevcut DNA miktarı iki katuna çıkmış olacaktır ve bu döngü yaklaşık 30 defa tekrarlandığında hedef DNA nın milyarlarca kopyası elde edilebilmiş olacaktır. PCR reaksiyon karışımı: İdeal bir amplifikasyon için gerekenler şu şekildedir; Hedef DNA sekansları İki tür spesifik oligonukleotid primerleri Termostabil DNA polimeraz Nükleotidler (Dört tür dNTP) Tampon çözelti, Magnezyum Primerler: Amplifiye edilmek istenen bölgeyi belirleyen oligonükleotidlerdir. İstenilen bölgeye spesifik olarak dizayn edilmelidirler. Genellikle 18-30 nükleotidten oluşmuşlardır. Nükleotidler (dNTPler): Reaksiyon karışımındaki konsantrasyonları 20200 µM olmalıdır ve çoğunlukla her dört nükleotit de eşit oranda katılmalıdır. Hedef DNA: Varlığı aranan, çoğaltılmak istenen hedef DNA sekansları, kan, serum, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm saç teli ve hatta mumya gibi inceleme örneklerinden ayrıştırılarak ve saflaştırılarak karışıma eklenirler. DNA polimeraz: 5 u/µl enzim ilavesi genellikle tavsiye edilir. Tampon çözelti: Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için tavsiye edilen tampon çözeltide 10-50 mM Tris-HCl ve 50mM KCl gerekir. Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween olması 20 gibi deterjanlar da DNA polimeraz enziminin stabilitesi için katılabilir. MgCl2: Reaksiyon karışımında 0.5-2.5 mM MgCl2 olması istenir. Enzim aktivitesine, primerlerin bağlanmasına ve DNA nın erime ısılarına etki ederler. PCR sonuçlarının belirlenmesi: Bu yöntemler arasında en basit ve yaygın olanı elektroforez yöntemidir. Çoğaltılan PCR ürünleri (amplikon) agaroz ya da poli-akrilamid jele, bilinen işaret DNA lar (DNA marker; DNA ladder) ve kontrol 3 PCR ürünleri ile birlikte yüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar. Oluşan DNA bantları ethidium bromür ile boyanarak ve U.V. ışığı kullanılarak incelenir. Farklı PCR çeşitleri: Nested PCR: Bu yöntemle birbirini takip eden iki PCR yapılır. İlk PCR sonucunda elde edilen ürünler, ikinci PCR’da hedef DNA olarak kullanılır. Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR): Hedef molekül DNA değil RNA ise; bu iki aşamalı PCR yöntemi uygulanır. İlk basamakta RNA’ dan cDNA sentezinin (geri transkripsiyon) gerçekleşir. İkinci basamakta da bu komlementer DNA nın satandart PCR yoluyla çoğaltılması gerçekleşir. Multiplex (Çoklu) PCR: Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin), birden fazla primer çifti kullanarak aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılmasını sağlayan PCR çeşididir. Real Time PCR: Elektroforez aşaması yoktur, amplifikasyon ürünleri kullanılan problar sayesinde eş zamanlı olarak bilgisayar ekranında gözlemlenir. Yukarıda açıklananların dışında tek iplikçikli DNA nın amplifikasyonunu mümkün kılan Asimetrik PCR; çok düşük miktardaki hedef DNA nın amplifiye edilmesini sağlayan Booster PCR; rastgele DNA dizilerinden teşekkül eden primerlerin kullanılmasına dayalı RAPD-PCR; lam üzerindeki doku parçalarından hedef DNA’ nın PCR ile çoğaltılmasını sağlayan in- situ PCR gibi farklı PCR çeşitleri de kullanılmaktadır. PCR’ın avantajları ve dezavantajları Avantajları: Hızlı, seçilen primerlere bağlı olarak spesifik bir yöntemdir. Etkenin vücutta çok az sayıda bulunduğu durumlarda da duyarlı sonuçlar alınabilen PCR protokolleri geliştirilmiştir. Kültürü zor ve uzun olan bakteriyel infeksiyonların tanısında kolaylık ve hız sağlamaktadır. Özellikle bakteriyel infeksiyonlarda incelenen materyalin eski ya da kontamine olması durumlarından daha az etkilenmektedir (viral hastalıklarda virusların daha hızlı denatüre oldukları unutulmamalı). Personel hatalarını ve insan gücünü minimuma indirger. Dezavantajları: İlk kurulumu açısından pahalıdır, ancak temel ekipmanları tamamlandıktan sonra günümüzde firmalar arası rekabat sayesinde sarf malzemeler açısında maliyetin çok fazla olması sorunu fazla kalmamıştır. Çalışma 4 esnasında en küçük DNA kontaminasyonu, yanlış sonuçların oluşmasına neden olabilir. Sonuçların yorumlanmasında deneyimli personele gereksinim vardır. MOLEKÜLER TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt tipleri görülebilmektedir ve bu durum özellikle hastalıklardan korunma ve tedavisinde önemli olmaktadır. Aynı şekilde ulusal ve uluslar arası bazda epidemiyolojik verilerin oluşturulmasında da önemlidir. Bu alt tipleri saptamak için birçok yöntem vardır; serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme, morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme ve moleküler tiplendirme. Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin başlıca kullanım amaçları aşağıdaki gibi sıralanabilir; • Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi, • Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi, • Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi, • Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi, • Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması, • Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol yöntemlerinin değerlendirilmesi. Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için sahip olması gereken bazı özellikler vardır. Hiçbir test bu özelliklerin hepsini kapsamamaktadır ancak bir yöntem seçilirken araştırmanın amacına uygun olan ve aşağıdaki kriterlerden olabildiğince çoğuna sahip olan testlerin seçimine özen gösterilir. Bu özellikle şu şekildedir; • Tiplendirebilirlik özelliğine sahip olmalı, • Ayrım gücünün yüksek olması, • Tekrarlanabilir ve her seferinde aynı sonuçları verecek şekilde stabiliteye sahip olmalı, • Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi uygun olmalı 5 • Kullanım spektrumu geniş olmalı • Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması • Sonuçların laboratuvarlar arasında paylaşılabilir olması Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler Klon: Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla organizmadır. Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar: Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen izolatlardır. Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar): Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan izolatlardır. Salgın suşu: Aynı türün hem epidemiyolojik (zaman, yer, ortak kaynak) hem de genetik olarak ilişkili, aynı genetik profile sahip izolatlarıdır. Endemik suş: Belli bir popülasyonda, infekte bireylerden sıklıkla izole edilen, tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen izolatlardır. Yakın ilişkili izolatlar: Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Olası ilişkili izolatlar: Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak yakın ilişkili değildir. İlişkisiz izolatlar: Salgın suşundan üç genetik olay bakımından farklı olan izolatlar 6 PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde en eski yöntemlerden biridir ve günümüzde bazı bakteriler için hala altın standart olarak görlmektedir. Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük DNA moleküller,i büyüklükleri fark etmeksizin aynı hızla aynı miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir. Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir. PFGE yöntemi de bu prensipte çalışan bir tekniktir. Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar blokları içerisinde yapılır. Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir. Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunan çıplak DNA molekülleri, uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile kesilir, özel elektroforez işlemi başlatılır. Oluşan bantlar bilgisayar programları aracılığı değerlendirilir. Yöntemin ayrım gücü çok yüksektir ancak zaman alıcı (yaklaşık 4-5 gün) ve kompleks bir yöntemdir ve laboratuvarlar arasında standardizasyon problemi de bulunmaktadır. Nükleik Asit Blotlama ve Hibridizasyon Yöntemleri Blotlama yöntemlerinin prensibi, elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan proteinlerin veya nükleik asitlerin bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesidir. Southern Blotlama E.M. Southern adlı bilim adamı tarafından 1975 yılında geliştirilmiştir. Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan membran blotlama ve görüntüleme tekniğidir. Kısaca aşamaları sırasıyla aşağıdaki şekildedir: 1- DNA izolasyonu: Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir. 7 2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim: Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyonu ve RE’ lar birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA segmentleri oluşur. 3- Elektroforez: Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir ortamda, jel içerisinde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar oluştururlar. 4- Membrana transfer:Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlara aktarılma aşamasıdır. 5- Denatürasyon ve Fikzasyon: Membran üzerine transfer edilen DNA bantları 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir; çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli hale gelir. Bunu takiben naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikze edilmesi (yapışması) sağlanır. 6- Hibridizasyon: Üç temel adımda gerçekleşir; a- prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek için, blotlanması tamamlanan membranın bloklandığı aşama; b- hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama c- hibridize olmayan probların yıkanması ve görüntülenme aşaması. 7-Sonuçların gözle görülmesi: Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyama yöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir. Northern Blotlama J.Alwine ve G. Stark tarafından 1979 yılında, herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi amacıla geliştirilmiş bir yöntemdir. Aşamaları; 1-RNA nın izolasyonu, 2-Elektroforez, 3-Membrana aktarma, 4-Blotting, 5-RNA’ nın saptanmasıdır. Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA’ ları saptamada yararlanılır. 8 Dot/Slot Blotlama DNA/RNA’nın elektroforez yapılmadan membrana damlatılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi prensibi ile geliştirilen bir blotlama yöntemidir. Aşamaları şu şekildedir: 1-Klinik materyalden DNA izolasyonu, 2- İki ya da beş katlı seri dilüsyon yapılması ve her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma, 3-Denatürasyon ve fikzasyon, 4-Hibridizasyon, 5-Otoradiografi ile görüntüleme. Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemlidir, genellikle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir. In situ Hibridizasyon Yöntemin prensibi, doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesidir. Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme imkanı sağlar. 5 temel adımda gerçekleşir; 1-Dokuların işlenmesi (fikze edilme ve kesilme), 2-Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi, 3-Hibridizasyon, 4-Yıkama, 5-Görüntüleme. 9
