at tür tayđn real tıme pcr kđtđ

AT TÜR TAYĐN REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPRT-A
GĐRĐŞ
DNA ĐZOLASYONU
At Tür Tayin Real-Time PCR Kiti, işlenmiş et ürünleri içerisinde at materyalinin
Hayvan mitokondrial DNA’sının izolasyonu, spin kolon yöntemine dayalı herhangi
bulunup bulunmadığını tespit eder.
bir Kandan Genomik DNA Đzolasyon kiti ile yapılabilmektedir. Bu tip kitlerde
solüsyon isimleri farklı olsa da genelde prensipleri aynıdır. Özetle;
KĐT PRENSĐBĐ
•
50-100 mg örnekten (Et veya işlenmiş gıda) temiz bir tüpe alınıp üzerine
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
300 µl Lizis buffer ve 25 µl enzim konularak enzimin aktivasyon
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
sıcaklığında 30 dk inkübe edilir.
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
•
Đnkübasyondan sonra tüpler 13.000 rpm’de 2 dk santrifüj edilip, berrak
•
Bu tüp içerisine kitin protokolünde belirtildiği miktarda alkol eklenip oluşan
kısım temiz bir tüpe aktarılır.
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
karışım spin kolona aktarılır ve belirtilen hızda ve sürede santrifüj edilir.
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
•
Sonraki aşamalar da kitin protokolünde belirtildiği şekilde yapılarak yıkama
ve elüsyon işlemi tamamlanır.
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
Kitimiz, MN NucleoSpin®Blood ve Axygen Blood Genomic DNA izolasyon kitine
edilmektedir.
göre optimize edilmiştir.
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
Kit, PCR için gerekli tüm bileşenleri içerisinde bulundurur. At türüne spesifik
TEST PROSEDÜRÜ
primer ve problar yardımı ile örneğin içeriği tespit edilir.
•
Kit ayrıca internal
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20 µl master miks ve 0,3
µl Hot Start Taq DNA Polimeraz konulur. Sonra 5 µl (~10-100 ng)
kontrol içeriği ile PCR reaksiyonunuzun çalışmasını da kontrol etmektedir.
örnek DNA ‘sı ilave edilir.
KĐT ĐÇERĐĞĐ
•
•
•
•
Bileşen
At Master Miks
Pozitif Kontrol DNA
Negatif Kontrol DNA (*)
Hot Start Taq DNA Polymerase
20 Test
430 µl
20 µl
20 µl
10 µl
(*) Negatif kontrol DNA’lar ilgili türlerin çapraz reaksiyon gösterebileceği
türlerden seçilmiştir (Örn: At için negatif kontrol eşek DNA’ sı, vb.). Böylece
sistemin çapraz reaksiyon kontrolünü de yapabilirsiniz.
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır.
•
Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz
miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan karışımdan 20 µl
tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları konulmalıdır.
PCR PROGRAMI
SAKLAMA KOŞULLARI
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
kadar kullanılabilir.
•
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
35 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile, türe ait pikleri ise FAM
boyası ile analiz edilmelidir.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
Đnternal kontrol, tüm kuyularda pik vermeli ve CT değeri 24 ≤ X ≤ 28
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
aralığında olmalıdır. Pik alamadığınız durumlar için “olası problemler” bölümüne
•
Test’te inhibitör varlığı ,
bakabilirsiniz.
söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Böyle durumlarda çalışma tekrar edilmeli eğer aynı problem devam ediyorsa
yeniden DNA izolasyonu yapılmalıdır.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
[email protected].
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
Türe ait pikler için de FAM boyasında analiz yapmanız gerekmektedir. Bu boyada
görmeniz gereken CT değer aralığı ise 12 ≤ X ≤ 28 dir.
sözkonusu tür için “negatif” yorumunu yapabilirsiniz.
Eğer pik yoksa
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012