Mutasyon ve polimorfizm tarama metodları Kaynak

Polimorfizm/Mutasyon
tarama teknikleri
Yrd. Doç. Dr. Bengi ÇINAR KUL
Not:
Polimorfizm bireyin
herhangi bir gen açısından
en az 2 alleli olması
durumudur (A yada a gibi)
Bir popülasyonda aynı
gen için çok farklı
alleller olabilir
(multipleallelizm)
Polimorfizmin yararları
• Pedigrinin saptanması,soy testi, babalığın
belirlenmesi
• Polimorfik genlerden verim ve hastalıklara
dayanıklık ile ilgili işaret gen olarak yararlanılması.
• Tek yumurta ikizliğinin belirlenmesi (özellikle
sığırlarda önemli)
• Irkların kökenlerinin belirlenmesi, popülasyon
genetiği ve hayvan ıslahı çalışmaları.
• Polimorfizmin temelinde ne vardır?
•
-
Nasıl bir mutasyon olmalıdır?
Sessiz
Nötral
Missense
Fonksiyon kaybı veya artışı
Bazı Mutasyon Tarama Teknikleri
1. Direkt Mutasyon Tarama Yöntemleri
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Kesim parçası uzunluk polimorfizmi
• ASA (Allele Specific Amplification)
• DNA Dizi Analizi
• SNP mikroarray
2. İndirekt Mutasyon Tarama Yöntemleri
• SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
• DHPLC (Denaturing High Performance Liquid
Chromatography)
• Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (High Resolution
Melting – HRM)
PCR
Polymerase Chain Reaction
Polimeraz Zincir Reaksiyonu: DNA’nın belirli
bir bölgesinin tüp içinde çoğaltılması işlemi…
Bu teknik ile DNA molekülünde istenilen bir parçanın
milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını yapmak
mümkündür. Mutasyon tarama tekniklerinin
birçoğu PCR temellidir.
Replikasyonun laboratuar
ortamında taklit edilmesidir.
• Çift sarmal DNA açılır
• DNA polimeraz enzimi yeni ve
komplementer iplikçiği üretir.
PCR’ın aşamaları
Sıcaklık ve zaman yönünden 3 farklı aşamanın arka
arkaya tekrarlanmasına dayanmaktadır.
1- DENATÜRASYON
2- PRİMER BAĞLANMASI
3- UZAMA
DÖNGÜ
1- DENATÜRASYON
Çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklık altında (93-96⁰C)
çözülerek tek zincir hale geçmesidir. Hidrojen bağlarının
kırılmasıyla olmaktadır.
2- PRİMER BAĞLANMASI
Hedef bölgeye komplementer primerin tek iplik DNA’da
ilgili bölgeye bağlanmasıdır (54-64⁰C).
3- UZAMA
• DNA polimeraz enzimi, primerlerin ucuna kalıp DNA’ya
eşlenik bazlar (dNTP) ekleyerek yeni DNA iplikçiğini uzatır.
(70-72⁰C)
PCR Reaksiyonu için gerekenler:
• Kalıp DNA
• Primerler
• Sıcaklığa dirençli polymerase
– DNA Polymerase
Thermus aquaticus
• dNTP
– (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• Tampon çözelti + Mg++
• Thermocyler (ısı döngü cihazı)
• Animasyon
(http://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E)
PCR ürünlerinin görüntülenmesi
Agaroz Jel elektroforez
• DNA ya da PCR ürünü agaroz jeldeki
kuyucuklara yüklenir.
• DNA (–) yüklüdür ve (+) yüklü
elektroda doğru hareket eder.
• DNA’nın büyüklüğünü ölçmek için
DNA ladder (size marker) kullanılır.
Agaroz jel elektroforezi görüntülenmesi genellikle Etidyum bromide ile
yapılır. EB, DNA ile kompleks bir bağ kurarak UV ışık altında parıldamasını
sağlar.
PCR- RFLP
PCR’ın ardından restriksiyon enzimlerinin
kullanılmasıyla mutasyon taranmasıdır.
Restriksiyon enzimleri, DNA’da özgün dizileri tanır ve o
noktadaki fosfodiester bağını keserler.
Örneğin EcoRI enzimi GAATTC dizisini tanır ve G ile A
bazları arasından fosfodiester bağlarını kırar.
Restriksiyon enzimleri bakterilerin kendilerini koruma
silahlarıdır.
PCR işlemi ardından EcoRI enzimi ile kesildiğinde;
daha küçük iki band oluşuyorsa homozigot normal,
PCR ürünü kesilmeden kalıyorsa homozigot mutant,
3 band görülüyorsa (normal ve mutanttan kaynaklanan) heterozigot bir
bireydir denilebilir.
DNA dizi analizi
DNA’nın nukleotid dizisinin saptanmasıdır.
Eski olmakla beraber en sık kullanılan yöntem Sanger
sekanslamadır.
Bu teknik, normal dNTP´lerin (3 '-hidroksilli (OH-) yanı
sıra 3'-hidroksil (OH-) grubu olmayan
dideoksiribonükleozit trifosfatların (ddNTP) ve DNA
Polimeraz enziminin yardımıyla DNA moleküllerinin
5’3’ yönünde uzatılmasına dayanır.
• DNA’nın yapısı…
Bir nükleotidin 5' ucunda bulunan fosfat grubuna başka bir
nükleotidin 3' hidroksil grubu bağlanırsa fosfodiester bağı oluşur.
DNA’nın sentez yönü bu yüzden 5’ 3'
Reaksiyon sırasında DNA polimeraz tarafından
sentezlenen PCR ürününe herhangi bir ddNTP´nin
katılması ile 3´ pozisyonunda serbest hidroksil grubu
olmadığından yeni bir baz eklenemez ve sentez devam
etmez.
Bunun sonucu olarak da serbest Hidroksil grubu olmayan
A,G,T ve C bazlarına bağlı olarak değişen boylarda PCR
ürünleri oluşmaktadır
Veteriner hekimlikte PCR’ın başlıca
kullanım alanları
• Kalıtsal hastalıkların genlerinin araştırılması,
populasyondaki bireylerin taranması
• Verimle ilgili genlerin populasyonda taranması
• Moleküler ıslah
• Prenatal tanı
• Irkların ve türlerin tarihsel gelişiminin aydınlatılması
• Evrim çalışmaları ve antik DNA çalışmaları
• Adli çalışmalar (tür belirleme, ebeveyn belirleme)
• Hastalık etkenlerinin (viral, bakteriyal vs.) tür tayini
• Aşı üretimi
• Gıda katkılarının belirlenmesi
• GDO üretimi ve gıdalarda GDO varlığının belirlenmesi………..