6.DERS
advertisement
PROTEİNLERDEKİ AMİNO ASİT BİLEŞİMİNİN BELİRLENMESİ 1. AŞAMA: İLERİ DERCEDE SAFLAŞTIRMA 2. AŞAMA: OLİGOMERİK PROTEİNLER İÇİN: MONOMERİK PROTEİNLER İÇİN: ASİT HİDROLİZ DENATÜRASYON ve ILIMLI HİDROLİZ ile alt birimlerin ayrılması ve SAFLAŞTIRILMASI 3. AŞAMA: ASİT HİDROLİZ 24 saat, 110 oC’da 6 N HCl ile işleme sokulur. Böylece peptit bağları kopar ve amino asitler serbest kalır. DİKKAT: Bu işlem 3 amino asidi olumsuz etkiler: Triptofan Glutamin Glutamik asit + NH3 Asparagin Aspartik asit + NH3 Triptofan parçalanır Hidrolizattaki NH3 miktarından bu iki amino asidin toplamı bulunur. Triptofanı belirlemek için ayrı bir örnek NaOH ile hidrolizlenir (BAZİK HİDROLİZ). Bu işlem triptofan dışında kalan amino asitleri etkiler. 3. (4.) AŞAMA KROMATOGRAFİ (KATYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFİSİ: AMİNO ASİT ANALİZÖRÜ) İyon değiştirici reçine (-) yüklüdür. Amino asitler asit ortamda (+) oldukları için önce bu kolona bağlanırlar. Sonra yavaş yavaş pH artırılır. Amino asitler önce -COOH gruplarından bir H iyonu kaybederek nötr, sonra da(-) yüklü hale geçerek kolonu terkederler. AMİNO ASİT ANALİZÖRÜ SON AŞAMA: KANTİTATİF ANALİZ Amino asit + Ninhidrin reaktifi Mor renkli bileşikler (Prolin amino asidi ile sarı renkli bileşik) Bu maddelerin absorpladığı ışık miktarı spektral yöntemle ölçülür. Bilgisayar aracılığıyla kantitatif analiz yapılır Pikler bir kaydedicide sürekli olarak kaydedilir. Her pik bir amino aside karşılık gelir. Mor renkli bileşik Kolonu belli bir sıraya göre terkeden amino asitler elüsyon hacmi denilen (kolondan ayrılmaları için gereken tampon hacmi) bir parametreye göre farklandırılırlar. Önce standart amino asit karışımı kolondan geçirilir ve bir elüsyon profili çıkartılır. Sonra hidrolizat kolondan geçirilir ve elüsyon profili hazırlanır. Bu profil standart karışımın elüsyon profili ile karşılaştırılır. ELÜSYON PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Not: Proteinlerdeki amino asit sayısının hesap yoluyla bulunması • Proteinin molekül ağırlığı biliniyor ya da bulunabiliyorsa: Proteinin Ma A.A. Sayısı = 110 Doğada bulunan amino asitlerin ortalama molekül ağırlığı 138. Peptit bağı oluşumu ile 1 mol su ayrıldığından amino asit kalıntısının ağırlığı 138-18=120; Proteinlerde düşük molekül ağırlıklı amino asitler ağırlıkta olduğu için bu değer (1 amino asit kalıntısının ort. Ağırlığı) 110 olarak kabul edilir. PROTEİNLERDEKİ AMİNO ASİT SIRASININ BELİRLENMESİ N-terminal kalıntıların belirlenmesi SANGER YÖNTEMİ DABSİL KLORÜR KULLANIMI EDMAN YÖNTEMİ SANGER YÖNTEMİ • N-terminal amino asidin serbest amino grubu “2,4dinitrofluorobenzen” (fluorodinitrobenzen, FDNB) ile reaksiyona girer. DABSİL KLORÜR KULLANIMI • Sanger yöntemindeki FDNB yerine bu madde kullanılır. Daha koyu renkli türevler ortaya koyar, dolayısıyla duyarlılık artar. EDMAN YÖNTEMİ • N-terminal amino asit fenilizotiyosiyanat ile işleme sokulur. Böylece bu amino asidin bir feniltiohidantion türevi oluşur. • Bu yöntemde N-terminal kalıntı ayrıldıktan sonra peptit zinciri sağlam kalır. Bu zincir de işleme sokulur. Böylece 2. amino asit belirlenir. İşlem devam ettirilerek amino asit dizisi ortaya konulmuş olur. Lehninger Principles of Biochemistry, Nelson &Cox PROTEİNLERDEKİ AMİNO ASİT SIRASININ BELİRLENMESİ C-terminal kalıntıların belirlenmesi • Serbest karboksil grubunun hidroksile redüklenmesi R Bu maddenin -Amino alkol kromatografik C OH analizi gerçekleştirilir. NH2 H Spesifik enzimlerin kullanımı NH2 COOH ENZİMATİK KESİM (ör. Karboksipeptidazlarla) POLİPEPTİDİN KISA PARÇALARA AYRILMASI • Birçok polipeptit 100’den fazla amino asit içerir. Bu durumda amino asit dizisini bir uçtan başlayarak saptamak mümkün değildir. • Dolayısıyla polipeptit önce kısa peptit parçalarına ayrılır. Bu işlem 2 yolla yapılabilir: ENZİMLER ARACILIĞIYLA SELEKTİF KESİM KİMYASAL YOLLA SİYANOJEN BROMÜR Polipeptit zincirini metionin kalıntısının karbonil tarafından keser. NH2 Met COOH NH2 TRİPSİN ENZİMİ Pankreatik bir enzim olan tripsin, lizin ve arjinin kalıntılarının karbonil tarafındaki peptit bağlarının hidrolizini katalizler. COOH Lys Arg TRİPTİK PEPTİTLER KİMOTRİPSİN • Kimotripsin, fenilalanin, tirozin ve triptofan kalıntılarının karbonil tarafındaki peptit bağlarının hidrolizini katalizler. SONRA: • Kısa peptit parçaları Edman yöntemiyle analiz edilir. • Farklı kesim yöntemleriyle oluşan fragmentlerin dizi analizleri yapıldıktan sonra OVERLAP eden (ÇAKIŞAN) parçalar aracılığıyla kesin sıra saptanır. İlk kesimde oluşan fragmentler: T-U D-E-F L-M-N PQRS A-B-C O G-H-I-J-K L-M-N İkinci kesimde oluşan fragmentler: E-F-G U H-I N-O-P-Q A-B-C-D R-S-T J-K-L-M OVERLAP EDİLEREK OLUŞTURULAN DİZİ: A-B-C-D-E-F-G-H-I-J-K-L-M-N-O-P-Q-R-S-T-U Lehninger Principles of Biochemistry, Nelson &Cox Günümüzde üç boyutlu yapıların aydınlatılmasında bilgisayar kullanımı çok yaygındır.
