Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA

T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
Proje Başlığı
Behçet Hastalığında Sitotoksik T lenfosit antijen -4 (CTLA-4) gen polimorfizmi
Proje Yöneticisi.
Prof Dr. Nurşen Düzgün
Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik İmmünoloji ve Romatoloji Bilim Dalı
Proje Başlangıç Tarihi
16.5.2008
Proje Bitiş Tarihi
16.2.2009
Kesin Rapor Tarihi
6 Ekim 2009
Proje No
08H3330003
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma projeleri
Ankara “2008”
I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri
Projenin Adı
Behçet Hastalığında Sitotoksik T lenfosit antijen -4 (CTLA-4) gen polimorfizmi
Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) gene polymorphism in patients with Behçet’s
disease
Özet
Behçet hastalığı (BH), her tip ve büyüklükteki kan damarını etkileyen multisistemik
inflamatuvar bir hastalıktır. Etyopatogenezi iyi bilinmemektedir. Genetik yatkınlığı olan
bireylerde mikroorganizmalara karşı immünolojik cevap bozukluğu olduğu düşünülmektedir.
Genetik çalışmalarda hastalık ile HLA-B51 antijeni arasında ilişki olduğu saptanmıştır.
Hastalık etyopatogenezine yönelik genetik çalışmalar sürdürülmektedir.
CTLA-4 antijeni, T hücre yüzeyinde aktivasyon sırasında eksprese olan bir kostimülatör
moleküldür. T hücre yüzeyindeki CD28 molekülünün aktivitesini inhibe ederek T hücre
aktivasyonunu ve sitokin salgılanmasını baskılar. Fonksiyon bozukluğu hastalıklara yol açtığı
bilinmektedir.Bu kapsamda CTLA-4 genin
exon 1 bölgesinde
49 pozisyonunda
polimorfizmi, T hücre proliferasyonun bozulmuş kontrolü ile birlikte olduğu saptanmıştır.
Romatoid artrit, Graves hastalığı ve sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi birçok otoimmün
hastalık ile CTLA-4 gen arasında ilişki gösterilmiştir. BH’da CTLA-4 gen çalışması
oldukça az sayıdadır.
Çalışmamızda CTLA-4 +49A/G gen polimorfizmi, BH’da (n=217), sağlıklı grupta (n=154)
ve klasik bir sistemik otoimmün hastalık olan SLE’lu hasta grubunda (n=111) incelenerek
BH’a bağlı venöz tromboz ve üveit varlığı ile ilişkisi araştırıldı.
Behçet hastalığı grubunda CTLA-4 +49A geni GG, GA ve AA genotiplerinin sıklığı
sırasıyla %11, % 38 ve % 51% olarak bulundu. Bu değerler sağlıklı kontrolde sırasıyla %6,
%45 ve % 49 idi (GG: 11% vs. 6% , odds ratio (OR)= 1.91 , p=0.113 ; GA: 38 % vs. 45%,
OR=0.76, p=0.206; AA:51% vs. 49%, OR=1.07, p=0.732 sırasıyla ) ve (G: 30% vs. 28%,
OR= 1.07 , p=0.6663; A: 70% vs.72%,OR=0.92,p= 0.663,sırasıyla). Hasta ve kontrol
grubunda tüm genotip ve allellerin sıklığı istatistiki olarak farklı bulunmadı. Tüm genotipler
ve alleller, Behçet hastalığına bağlı venöz tromboz olan (62/217) ve olmayanlar (155/217) ve
üveit olan (70/217) ve olmayanlar (147/217) arasında istatistiki olarak farklı bulunmadı.
Hastalıklı-kontrol grubunu oluşturan SLE’lu hastalarda CTLA-4 +49A allel ve genotip
sıklığı sağlıklı gruba göre anlamlı olarak daha yüksek sıklıkta bulundu, (sırasıyla GG: %17
vs. %6, OR =2.91, p = 0.011; GA: %49 vs. %45, OR =0.96 ,p =0.864; ve AA: %40 vs. %49,
OR = 0.70, p = 0.155, ve sırasıyla %G: 38 vs. %28,OR=1.52, p= 0.027 ; A: %61 vs. %72,
OR= 0.66, p=0.02).
Elde ettiğimiz sonuçlara göre BH’da CTLA-4 +49 gen polimorfizmi, sağlıklı gruptan
istatistiksel olarak farklı bulunmamıştır. CTLA -4 geninin 318C/T,1661A/G ve1772T/C gibi
bilinen diğer polimorfizm bölgelerinin de çalışılması daha fazla bilgi verebilir .
Title:
Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) gene polymorphism in patients with Behçet’s
disease
Summary
Behcet's disease (BD) is a multisystemic inflammatory disorder, which can affect all types
and sizes of blood vessels. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) is a costimulatory
molecule expressed on T lymphocyte after cellular activation and it acts as a competitive
inhibitor of the CD28 on T cells. Therefore, the CTLA-4 down regulates the immune response
and inhibit intracellular signaling, T-cell proliferation and IL-2 production. The G allele at
position 49 of the CTLA-4 gene in exon 1 has been found to be associated with the impaired
control of T-cell proliferation. A number of autoimmune diseases have been associated with
genetic variation at CTLA-4, such as type 1 diabetes mellitus , Graves’disease , rheumatoid
arthritis and systemic lupus erythematosus . There is limited data about the association of
BD with CTLA-4 variants. In this study we aimed to analyse the role of CTLA-4 exon-1
+49A/G polymorphism in BD susceptibility.
The distribution of the CTLA-4 +49A/G genotype and allele frequencies did not differ
between patients with BD and healthy controls (GG: 11% vs. 6% , odds ratio (OR)= 1.91 ,
p=0.113 ; GA: 38 % vs. 45%, OR=0.76, p=0.206; AA:51% vs. 49%, OR=1.07, p=0.732
respectively ) and (G: 30% vs. 28%, OR= 1.07 , p=0.663; A: 70% vs.72%,OR=0.93,p=
0.663,respectively). CTLA-4 +49 gene polymorphism was not statistically different between
BD patients with thrombosis and without thrombosis, and also patients with uveitis and
without uveitis.
Allele and genotype frequencies of CTLA-4 49 A were significantly higher in patients with
SLE as patient-control group compared with healthy controls (GG:15% vs. 6%, OR =2.91, p
= 0.011; GA: 44% vs. 45%, OR =0.96 ,p =0.864; and AA:40% vs.49%, OR = 0.70, p = 0.155,
respectively ,and G: 38% vs. 28%,OR=1.52, p= 0.0.2 ; A: 61% vs. 72%,OR=0.66,p=0.02,
respectively).
The analysis of the other known polymorphisms of the CTLA-4 genes such as,
318C/T,1661A/G and1772T/C should be also investigated to determine whether is linked to
the development of BD patients.
II. Amaç ve Kapsam
Behçet hastalığı (BH),1937 yılında dermatolog Hulusi Behçet tarafından başlıca oral ve
genital ülser, iridosiklit ve cilt lezyonları ile tanımlanan, kronik sebebi bilinmeyen bir
hastalıktır.
Eklemler, merkezi sinir sistem, gastro-intestinal kanal ve vasküler sistem de
hastalığa katılabilir. Başlıca histopatolojik bulgu vaskülit olup, her çapdaki arter ve ven
tutulabilir. Etyopatogenezde genetik yatkınlık önemli bir faktör olarak bilinmektedir.
Hastaların yaklaşık yarısında göz
tutulumu vardır.Venöz damarlarda trombotik
komplikasyonlar yaklaşık % 10-40 arasında bildirilmiştir. Behçet hastalığında göz ve ciddi
damar tutulumları prognozu kötüleştirebilir. Etyopatogeneze yönelik çalışmalar, hastalık
hakkındaki bilgileri arttıracaktır.
Anahtar Sözcükler
Behçet Hastalığı , CTLA-4 gen polimorfizmi ,tromboz, üveit
Projenin Amacı
Behçet Hastalığında genetik yatkınlığa ışık tutabilecek bulgu ve bilgiler kazanmak ve
bunların, klinikte önemli morbidite ve mortaliteye neden olan damar tutulumu ve göz
tutulumu ile ilişkisini araştırmaktır.
Projenin Önemi
Behçet Hastalığının oluşmasını etkileyen genetik faktörlerin araştırılması ile
etyopatogenezine ilişkin bilgilere katkı sağlayabilmektir.
hastalığın
III. Materyal ve Yöntem
Çalışma popülasyonu
BH tanısı için Uluslar arası Çalışma grubu tanı kriterleri (International Study Group
Diagnostic Criteria for Behçet’s Disease ) kullanılmıştır ve bu kriterleri dolduran, yaşları 1866 arasında değişen 217 hasta (125E/92K, yaş ortalaması ± SD 34±9.8) çalışmaya alındı..
Sağlıklı 154 birey (82E/72K, 20-59 yaşlar arası, ortalama yaş± SD 28±11.1) ve SLE’lu 111
hasta kontrol grubunu oluşturdu. Çalışma grubunu oluşturan popülasyon başlıca İç Anadolu
bölgesinden katılmıştır ve yazılı onam vermişlerdir.
Tablo 1. Behçet hastalığı olan 217 hastada klinik bulgular ve demografik özellikler
Yaş: ortalama±SD
34±9.8
Cins: E/K
125 E, 92 K
Oral Ulser
%57.8
Genital Ulser
%28.0
Eritema nodozum benzeri lezyon
% 18.3
Papulo-püstüler lezyon
% 38.6
Paterji testi
% 55.6
Aktif tromboz+Geçirilmiş tromboz hikayesi
% 28.5
Aktif Üveit+ Uveit hikayesi
% 32.2
Arteriyel tutulum (Anevrizma)
%3.8
Aktif Artrit
%20.2
Santral sinir sistemi tutulumu
% 3.0
Gastrointestinal sistem tutulum
% 5.8
Yöntem
Hasta ve kontrol grubunu oluşturan bireylerden periferik kan örnekleri alınarak DNA
izolasyonu önce tarif edilen metoda uygun olarak yapıldı (Miller ve ark. 1988).
Mutasyon Analizi:
DNA örneği alınmış bireylerde
CTLA-4 A/G (codon 17 Thr/Ala) exon 1’ de 49
pozisyonunda genotip tayini polimeraz zincir reaksiyonu –restriksiyon fragman polimorfizm
(PCR-RLFP) metodu ile yapıldı. DNA amplifikasyonu için önceden tanımlanan primerleri
kullanıldı. 0.2 µg genomik DNA, 1U Taq polimeraz (Fermentas), kullanarak PCR
gerçekleşti. PCR ürünleri BbvI restriksiyon enzimi ile 37°C ‘de bir gece boyunca inkübe
edildi. Parçalanan ürünler ethidium bromide ile boyanmış 2.5% agaroz jelde fotoğraflanarak
görüntülendi.
İstatistiki analiz:
Genotip dağılımı ve allel sıklığı hastalar ve kontrol grupta karşılaştırıldı. Binary logistic
regression modelleri bulguları analiz etmede kullanıldı. Sonuçlar odds ratio (OR) ve 95%
confidence intervals (95% CI). İle bildirildi Anlamlılık 0,05 olarak belirlendi. Analiz,
MINITAB® Release 15 Statistical Software, Windows programında yapıldı.
IV. Analiz ve Bulgular
Hasta grupta GG, GA ve AA genotiplerinin sıklığı sırasıyla %11, % 38 ve % 51% olarak
bulundu. Bu değerler sağlıklı kontrolde
sırasıyla %6, %45 ve % 49 idi. Tablo 2’de
görüldüğü gibi hasta ve kontrol grubunda tüm genotip ve allellerin sıklığı istatistiki olarak
anlamlı bulunmadı. Tüm genotipler ve alleler tromboz olan ve olmayan hasta grubunda ve
üveit olan ve olmayan grupta farklı bulunmadı (tablo 3 ve 4).
Sistemik lupus eritematozuslu hasta grubunda CTLA-4 +49 A allel ve genotip sıklığı sağlıklı
gruba göre anlamlı olarak daha yüksek sıklıkta bulundu (tablo 5), (sırasıyla GG: %17 vs. %6,
OR =2.91, p = 0.011; GA: %49 vs. %45, OR =0.96 ,p =0.864; ve AA: %40 vs. %49, OR =
0.70, p = 0.155, ve sırasıyla %G: 38 vs. %28,OR=1.52, p= 0.027 ; A: %61 vs. %72, OR=
0.66, p=0.02).
Behçet Hastalığında ve sağlıklı kontrol grubunda CTLA-4 A49G gen genotip
dağılımı ve allel sıklığı
Table 2:
CTLA-4 A49G
(n=217)
Genotipler
GG
GA
AA
Alleller
G
A
Sağlıklı kontrol
BH
%
(n=154)
OR
P
95% Cl
%
23
83
111
11
38
51
9
69
76
6
45
49
1.91
0.76
1.07
0.113
0.206
0.732
0.86-4.25
0.50-1.186
0.71-1.62
129
305
30
70
87
221
28
72
1.07
0.93
0.663
0.663
0.78-1.48
0.67-1.28
Behçet Hastalığında venöz tromboz olan ve olmayan hastaların CTLA-4 A49G gen
genotip dağılımı ve allel sıklığı
Table 3.
CTLA-4 A49G
Tromboz (+)
(n=62) %
Tromboz(-)
(n=155) %
OR
P
95% CI
Genotipler
GG
GA
AA
9
24
29
14
39
47
14
59
82
9
38
53
1,71
1,03
0,78
0,240
0,930
0,415
0,70
0,56
0,43
4,19
1,88
1,41
42
82
34
66
87
223
28
72
1,31
0,76
0,233
0,233
0,84
0,49
2,05
1,19
Allel sıklığı
G
A
Behçet Hastalığında üveiti olan ve olmayan hastaların CTLA-4 A49G gen genotip
dağılımı ve allel sıklığı
Table 4.
CTLA-4 A49G
Genotipler
GG
GA
AA
Allel sıklığı
G
A
Uveit (+)
(n=70) %
Uveit ( -)
(n=147) %
OR
P
95% CI
11
23
36
16
33
51
12
62
73
8
42
50
2,10
0,67
1,07
0,096
0,190
0,808
0,88 5,02
0,37 1,22
0,61 1,90
45
95
32
68
86
208
29
71
0,87
1,15
0,540
0,540
0,57 1,35
0,74 1,77
Sistemik lupus eritematozuslu hastalarda CTLA-4 A49G gen genotip dağılımı ve
allel sıklığı
Tablo5.
CTLA-4 A49G
Genotipler
GG
GA
AA
Allel sıklığı
G
A
SLE
(n=111)
%
Sağlıklı Kontrol
(n=154)
%
OR
P
95% CI
17
49
45
15
44
40
9
69
76
6
45
49
2.91
0.96
0.70
0.011
0.864
0.155
1.25 - 6.81
0.58 - 1.56
0.43 - 1.15
83
139
38
61
87
221
28
72
1.52
0.66
0.027
0.027
1.05 - 2.19
0.46 - 0.95
V. Sonuç ve Öneriler
Yaptığımız çalışmada CTLA-4 +49 A/G gen polimorfizminin Behçet hastalarında anlamlı
olmadığını gösterdik. Ayrıca göz tutulumu ve venöz tromboza yatkınlık açısından da anlamlı
gözükmemektedir. Hastalıklı-kontrol grubu olarak çalışmaya katılan klasik bir otoimmün
hastalık olan SLE hastalarında literatür bilgileri ile paralel CTLA-4 +49 A/G gen
polimorfizminin anlamlı olduğu bulunmuştur. Gelecek çalışmalarda Behçet hastalarında
CTLA-4 geninin 318C/T,1661A/G ve 1772T/C gibi diğer polimorfizmlerine odaklanmak
anlamlı sonuçlar getirebilir.
VI. Kaynaklar
1.Behçet H. (1937) Uber die rezidivirende aphtose durch ein virus verursachete geschwüre am
mund,am Auge und an den Genitalien. Derm Wochenschr 105:1152-1157
2. Emmi L, BrugnoloF, Salvati G, Marchione T. (1995) Immunopathological aspects of
Behçet’s disease Clin Exp Rheumatol 13: 687-91
3.Verity DH, Marr JE, Ohno S, Wallace GR, Standford MR (1999) Behçet’s disease, the silk
road and HLA-B51:historical and geographical perspectives. Tissue Antigens 54: 213-220
4-Boiardi L, Salvarani C, Casali B, Olivieri I, Ciancio G, Cantini F, et al. (2001) Intercellular
adhesion molecule-1 gene polymorphisms in Behcet's Disease. J Rheumatol 28(6):1283-7.
5-Salvarani C; Boiardi L; Casali B. (2004) Vascular endothelial growth factor gene
polymorphisms in Behcet's disease. J Rheumatol 31(9):1785-9.
6-Akman A, Sallakci N, Coskun M, Bacanli A, Yavuzer U, Alpsoy E, et al. (2006) TNFalpha gene 1031 T/C polymorphism in Turkish patients with Behcet's disease. Br J Dermatol.
155:350-6.
7. Walunas TL, Lenschoow DJ, Bakker JY, Linsley PS, Freeman GJ, Gren JM et al. (1994)
CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity 1:405
8.Carreno BM, Collins M. (2002) The B7 family of ligands and its receptors: new pathways
for costimulation and inhibitors of immune responses.Annu Rev Immunol 20:29-53.
9.Krummel MF, Allison JP. (1995)CD28 and CTLA-4 have opposing effects on the response
of T cells to stimulation.J Exp Med 182: 459-65
10.Lafage-Pochitaloff M, Costello R, Couez D, Simonetti J, Mannoni P, Mawas C, et al.
(1990) Human CD28 and CTLA-4 Ig superfamily genes are located on chromosome 2 at
bands q33–q34. Immunogenetics;31:198–201
11. Orozco G, Torres B, Nunez-Roldan A, Gonzales-Escribano MF, Martin J. (2004)
Cytotoxic T lymphocyte antigen –4-CT60 polymorphism in rheumatoid arthritis Tissue
Antigens 667-70.
12. Han S, Li Y, Mao Y, Xie Y (2005) Meta-analysis of the association of CTLA-4 exon-1
+49A/G polymorphism with rheumatoid arthritis. Hum Genet;118 :123-132
13. Kouki T, Sawai Y, Gardine CA, Fisfalen ME, Alegre ML, DeGroot LJ. (2000) CTLA-4
gene polymorphism at position 49 in exon 1 reduces the inhibitory function of CTLA-4 and
contributes to the pathogenesis of Graves' disease. J Immunol 165: 6606–11
14.Nistico L, Buzetti R ,Pritchard LE, Vander Auvera B, Giovannini C, Bosi E, et al. (1996)
The CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked and associated with type 1 diabetes
Belgian Diabetes Registry. Hum Mol Genet 5:1075-1080
15.Vaidya B, Imrıe H, Perros P,Young ET, Kelly WF, Carr D et al. (1999) The cytotoxic T
lymphocyte antigen-4 is a major Graves disease locus.Hum. Mol. Genet 8:1195-99
16. Harbo HF, Celius EG, Vartdal F, Spurland A. (1999)CTLA-4 promoter and exon 1
dimorphisms in multiple sclerosis. Tissue Antigens 53:106-110
17.Takeuchhi F (2003) CTLA-4 dimorphisms in Japanese systemic lupus erythematosus.
Clin Exp Rheumatol 21:527-8.
18.Sallakcı N, Bacanlı A, Coskun U, Yavuzer E, Alpsoy E, Yeğin O. (2005) CTLA-4 gene 49
A/G polymorphism in Turkish patients with Behçet’s disease.Clinical and Experimental
Dermatology 30:546-550
19.Güneşaçar R, Erken E, Bozkurt B, Özer HT, Dinkci S, Erken EG, et al. (2007) Analysis of
CD28 and CTLA-4 gene polymorphisms in Turkish patients with Behçet’s disease. Int J
Immunogenetics 34:45-49
20.Touma Z, Hamdan A, Shamseddeen W, Nasr J, Makhoul N, Zalloua PA, et al. (2008)
CTLA-4 gene variants are not associated with Behçet’s disease or its clinical
manifestations.Clin Exp Rheumatol (suppl.50);26: S132
21. Ben Dhifallah I , Braham A, Hamzaoui K, Houman MH (2009) CTLA-4 +49A/G
polymorphism is associated with Behçet's disease in a Tunisian population Tissue Antigens.
73(3):213-7.
22. International Study group for Behçet’s disease. (1990) Criteria for diagnosis of Behçet’s
disease Lancet 335:1078-80
23. Suppiah V,Alloza I, Heggarty S, Goris A, Dubois B, Carton H, et al. (2005) The
CTLA4+49A/G* G-Ct60*G haplotype is associated with susceptibility to multiple sclerosis in
Flanders J Neuroimmunol 164:
148-53
24. Frassanito MA, Damacco R,Caffario P, Damacco F . (1999) Th1 polarization of the
immune response in Behçet’s disease: a putative pathogenetic role of interleukin-12. Arthritis
Rheum 42:1967-1974
25. Musabak U, Pay S, Erdem H, Simsek I, Pekel A, Dinc A. (2006) Serum interleukin-18
levels in patients with Behcet's disease. Is its expression associated with disease activity or
clinical presentations? Rheumatol Int.; 26:545-50.
26.Oosterwegel MA, Greenwald RJ, Mandelbrot DA, Lorsbach RB, Sharpe AH (1999)
CTLA-4 and T cell activation. Curr Opin Immunol 11: 294–300
27. Hamzaoui K, Hamzaoui A, Bouajina L, Houman H. (2005) Circulation soluble CD28 in
patients with Behcet's disease: relationship to clinical manifestations. Clin Exp
Rheumatol.;23(4 Suppl 38):S49-52.
VII. Ekler
a) Mali Bilanço ve Açıklamaları
Bu çalışma için 08H3330003 no’lu BAP projesi kapsamında alımı gerçekleşen
sarf malzeme kullanılmıştır.
b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar
Proje kapsamında herhangi bir demirbaş alımı yapılmamıştır.
c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar verilmiştir.
d) Sunumlar
Çalışmamız 11-13 Haziran-2009 da Danimarka- Kopenhag’da yapılan
Avrupa Romatoloji Kongresinde (EULAR) poster olarak sunulmuştur.
e)Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler
Clinical Rheumatology Mecmuasına 6 ağustos 2009’da gönderilmiştir