PROTEOM → [PROTEin + genOM ]

PROTEOM → [PROTEin + genOM ]
Bir organizma ya da dokunun genomu tarafından ifade edilen proteinler olarak tanımlanmaktadır.
PROTEOMİK → [ PROTEin + genOMİC ]
Kısaca proteomik şeklinde tanımlanan “Proteom Analizi” ise değişik koşullarda ekspresse edilen
proteinlerin identifikasyonlarını, yapısal özelliklerinin tanımlanmasının ve fonksiyonlarının
aydınlatılmasının kapsar. Uygulama amacına göre;
 Fonksiyonel Proteomik
 Strukturel Proteomik’ten söz edilir.
Proteom kelimesi ilk kez 1994 yılı sonuna doğru Siena’da yapılan 2D-Elektroforez toplantısında
Marc Wilkins ve çalışma grubu tarafından önerilmiştir. Literatürde 1995 yılında yer almıştır.
1975 yılında Klose, Scheele ve O’Farrell hücresel olayların 2D-Jel elektroforezi ile
açıklanabileceğini göstermişlerdir. Restriksiyon endonükleazlarının keşfi ile DNA analizi
aştırmacıların gözdesi olmuştur. İnsan genom projesinin şimdiye kadar ki sonuçları protein
analizlerinin yeniden yükselen bir değer kazandırmıştır.
Protein analizi DNA analizinden kıyaslanamayacak kadar zordur. DNA sadece dört yapı taşından
oluşurken doğal proteinler 20 farklı aminositten oluşurlar ve zincirin üç boyutlu yapısı da proteinin
fonksiyonunu çok etkiler. Ayrıca problem bu kadarla sınırlı değildir. Post-translasyonel
modifikasyonlarda protein analizine yeni bi genişlik kazandırmaktadır. Bir organizmanın bir genomu
ama birçok proteomu vardır. Organizma farklı faktörlerin etkisiyle değişik proteinleri oluşturur.
Protein Yapısal Analizinin Tarihçesi
1945’te Fred Sanger protein karakterizasyonu için ilk metodlardan birini geliştirdi.
Dinitroflorobenzeni peptid zinciri analizinde kullandı ve daha sonra insülin yapısını da aydınlatarak
kendisi ilk Nobel ödülünü aldı. Proteinlerin amino asit dizisinin aydınlatılmasında daha etkili bir
yöntem olan fenilizotiyosiyanat yöntemi ise Edman tarafından geliştirildi. Edman degradasyonu ile
birçok proteinin zincir dizisi aydınlatılmasına rağmen bu yöntem çok zaman alıcı ve uygulanması
zordur. Nükleik asit dizi analizindeki gelişmeler ve 1978 yılında DNA dizlieri yardımıyla protein
zincir dizilerinin çıkarılması çok büyük bir gelişme ve protein kimyasının bitişi olarak takdim
edilmişti. Bu gelişme protein analizinden proteom analizinden proteom analizine geçişin ilk adımı
olarak kabul edilebilir. 1989 yılından itibaren uluslararsı bilimsel toplantılarda bu geçişe ait ilk
belirtiler kendini göstermiştir.
Proteom Analizi veya Proteomik Çalışmaların Tarihsel Gelişimi
Proteomik terimi 1995 yılından önce literatürde yer almamasına rağmen moleküler biyoloji ve
genomikin gelişimi proteomik için temel oluşturmuştur. Proteom teknolojisinin kalbi sayılan iki yönlü
[2D-] jel elektroforezinin 70’li yıllarda geliştirilmesi, DNA dizi analizi ve PCR gibi modern tekniler
önemli adımlardır. Yüksek performans MALDI [ Matrix – Assisted Laser Desorption / Ionisation ] ve
ESI [ ElectroSpray Ionisation ] kütle spektrometrelerinin [ MALDI-MS ve ESI-MS ] proteinlerin ve
bunların parçalanması ile oluşan peptidlerin yüksek rezolüsyon, duyarlık ve doğruluk ile tayinine ve
ardından birkaç femtomol proteinden peptidlerin fragmentasyonuna olanak sağlamıştır.
İnsan genom projesi yanında bakteri ve hayvan genom analizleri birçok proteinin molekül kütlesi
[MW], izoelektrik noktası [PI], hidrofobisite indeksi, aminoasit dizisi ve bileşimi için veri birikimi
oluşturmuştur.
1
Genom Dizisi

GENOMİK
Transkripsiyonel Kontrol
mRNA

Translasyonel Kontrol
Primer Protein Ürünleri

PROTEOMİK
Post-Translasyonel Kontrol
Fonksiyonel Protein Ürünleri

Gen Tayini
Şekil 1. Gen Ekspresyonundan Fonksiyonel Proteine Kadar Protein Üretim Yol İzi
Genomik, gen ile başlar ve genin ürünleri (proteinler) hakkında sonuçlar çıkarır. Proteomik ise
fonksiyonel modifiye edilmiş proteinden başlar ve geri üretiminden sorumlu gene ulaşır.
FONKSİYONEL GENOMİK
PROTEOMİK
DNA İzolasyonu ve Klonlama
Protein Fraksiyonlama
Dizi Analizi
2D Jel Elektroforezi
Mutasyon
Analizi
Gen
Ekspresyonu
Protein
İdentifikasyonu
Post-Translasyonel
Modifikasyon
Şekil 2. Fonksiyonel Genomik ve Proteomik Arasındaki Benzerlik
Uygulamanın amacına göre beş tip proteomik vardır.
1. Ekspresyon Proteomik;
Hücre veya dokudan ekspresse edilen proteinleri belirleyen.
2. Yapısal Proteomik;
Proteinin üç boyutlu tayini ile ilgilenen.
3. Fonksiyonel Proteomik;
Bazı yaklaşımlarla proteinlerin fonksiyonlarını inceleyen.
4. Kemoproteomik;
Hücreler ile hangi küçük moleküllerin etkileşeceğini inceleyen bir yaklaşımdır.
5. Hücre-Haritası Proteomik;
Protein-protein etkileşimi ve proteinlerin subsellüler yerleşiminin belirlenmesini kapsar.
Proteom; DNA ve RNA analizlerinin aksine proteinlerin gerçek miktarları ve translasyon
sonrası modifikasyonları hakkında bilgi verir.
2
Örnek Hazırlığı / Ön Fraksiyonlama
Proteinlerin Ayrılması
[ 2D-Elektroforez ]
Eğitim
Protein İdentifikasyonu
[Kütle Spektrometrisi / Peptid Kütle Parmak İzi Analizleri ]
Robotik
Protein Karakterizasyonu
[ Aminoasit Dizi Analizi, PTM Belirlenmesi ]
Biyoinformatik
ÖRNEK HAZIRLIĞI
Örnek hazırlığı ve çözünürleştirme 2D-PAGE tekniğinin tüm performansını etkileyen,
tekrarlanabilir sonuçlar alınması açısından en önemli kritik adımdır. Tüm hücre ve doku
ekstraktlarında proteinlerin analizleri amacıyla,örnek hazırlanmasındaki ana problem; bunların farklı
moleküler kütle, yük, izoelektrik nokta ve çözünürlüğe sahip olmalarıdır. Ayrıca bu aşamada örnek
kompleksliğinin azaltılması da önemlidir. Bu nedenle tüm protein kategorileri için tek bir solüsyon
yoktur. Analizlenecek örneğe ve hedefe göre örnek hazırlığının optimizasyonu iyi bir ayırma için
gereklidir.
Proteinlerin solübilizasyonu; kaotropik ajanların (üre, tiyoüre vb,), indirgeyici ajanların
(dithiotreitrol, tributylphosphine vb.), deterjanların (CHAPS, CHAPSO, Triton X-100, vb.),
tamponların (Tris) ve amfolitlerin (farklı pH aralıklarında gradient oluşturucu) varlığında
gerçekleştirilir. Genelde dondurulmuş hücre ve doku örnekleri; sıvı azotta dondurularak öğütme,
sonikasyon veya homojenizasyon gibi farklı tekniklerle parçalanır. Proteinler daha sonra sonikasyon,
%1’lik DTT vb. deterjanlar, %2’lik amfolitler pH 3-10 ve 10 mM proteaz inhibitörü varlığında
çözünürleştirilir. Ancak bazı durumlarda bu standart örnek hazırlama tamponu tüm protein sınıflarının
çözünürleştirilmesinde ideal olmayabilir. Özellikle membran proteinlerinin veya diğer hidrofobik
proteinlerin hazırlanmasında farklı deterjanların ve indirgeme ajanlarının denenerek tamponda
modifikasyonlar yapılması gerekmektedir. Nükleik asitlerin örnek preparatlarında bulunması, IEF ile
proteinlerin ayrılmasında problemlere neden olabilmektedir. Örnek hazırlığı aşamasında denatüre edici
koşullarda, DNA kompleksleri ayrılarak solüsyonun vizkozitesini artırırlar. Bu ise jele protein girişini
ve göçünü yavaşlatır. Buna ilave olarak DNA proteinlere bağlanarak yapay göçlere ve şekilsiz
ayrılmalara sebebiyet verebilir. Nükleik asitlerin ortamdan uzaklaştırılmasında yaygın olarak iki
yöntem kullanılır. Bunlardan birincisi taşıyıcı amfolitlerle nükleik asitlerin kompleksleştirildikten
sonra ultrasantrifüj ile uzaklaştırılmasıdır. Diğeri ise endonükleazlarla enzimatik parçalamadır.
PROTEİN VE/VEYA PEPTİTLERİN AYRILMASI VE TANIMLANMASI
İki Yönlü Jel Elektroforezi (2D-PAGE):
İki yönlü jel elektroforezi, kompleks protein karışımlarının ayrılması ve karakterizasyonunda
kullanılan en önemli tekniklerden birisidir. 2D-Elektroforez binlerce proteinin tek adımda ayrılması
açısından önemlidir. Bu yöntem prensipte iki ayırma tekniğinin kombinasyonudur.
1. Yönde; İzoelektrik Odaklama(IEF): pH gradientinde yük bağımlı ayırma,
2. Yönde; SDS-PAGE: molekül kütlesine bağımlı bir ayırma metodu.
3
İzoelektrik Odaklama (IEF):
İzoelektrik odaklama, bir pH gradiyetinde yapılan elektroforezdir. Bunun için makromoleküller (+) ve
(-) yüklere sahip oldukları müddetçe gradient boyunca izoelektrik noktalarına rastlayan pH’ya kadar
göç ederler. İzoelektrik noktada net elektriksel yük sıfırdır. pH gradienti düşük molekül ağırlıklı
amfoterik maddelerin (amfolitler) yardımıyla oluşturulur. Eğer elektroforezde kullanılan tampon
sistemi yerine anotta kuvvetli bir asit, katotta da kuvvetli bir baz kullanılır ve aradaki jel ortamına da
gerektiği kadar amfolit solusyonu katılırsa amfolitlerin anoda yakın kısmında (+) katoda yakın kısımda
(-) net yükleri olur. Bundan dolayı elektrik verildiğinde bunlar anot ve katot tarafına itilerek merkeze
doğru hareket ederler. Bu hareketleri sırasında çevresel ortamın pH’sının kendi izoelektrik noktalarına
eşit olduğu bölgelerde hareketsiz kalırlar. Bundan dolayı, en asidik amfolitler katoda yakın olacak
şekilde izoelektrik noktalarına göre sıralanırlar. Bunun sonucu jel içinde anottan katoda doğru azalan
bir pH gradienti oluşur. Numune tatbik edilip yürütüldüğünde proteinlerin izoelektrik pH’sına geldiği
anda net olarak yüksüzleşir. Hareket etmez ve o noktada odaklanır.
İzoelektrik odaklamanın sorunları genelde kullanılan amfolitlerden kaynaklanır. Pratikte pH
gradientinin zun süre stabil kalması zordur. Bu durum zamanla protein ve gradientin katoda kaymaları
ve örnek kaybı ile sonuçlanır. Günümüzde bu sorunu çözmek için immobolize pH gradient [IPG]
jellerinin kullanımı yaygınlaştırılmıştır. Jeller ikinci yönde kullanılmayacaklarsa dengeleme
tamponların boşaltıldıktan sonra -70°C’de depolanabilirler.
Her bir teknik kendi başına 100 bileşiği ayırma kapasitesine sahipken, birleştiklerinde ayırma teorik
olarak 104 polipeptide çıkar. 2D-Elektroforez her tip hücre proteinlerinde kullanılabilir (bitki,
mikroorganizma, hayvan…) Genel olarak; bir adımda protein izolasyonu, kompleks protein
karışımlarının ayrılması, kompleksliğin derecesinin belirlenmesi (heterojenite), polimorfizm tayininde,
kalite kontrol ve protein saflığının analizi amacıyla kullanılır.
SDS PAGE ( denatüre edici page): SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino
asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri birbirinden ayırır.
Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlere de yüksek oranda (-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü
açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu
4
arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır ve jeldeki moleküller
elektrik doğrultusunda ayrılırlar. Akrilamid jel konsantrasyonu etkin ayırmayı sağlayan olgudur. SDSPAGE ikinci yönde yatay ya da dikey sistemler kullanılabilmektedir. Yatay sistemler genellikle hazır
jellerde, dikeyler ise aynı anda birçok jelin uygulanmasında tercih edilir. Jel boyutu önemlidir. Küçük
jellerde ayırım 1 nokta protein ayırımı, büyüklerde 10.000 protein ayırım yapabilmektedir. SDS-PAGE
yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon
çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.
Elektroforezde kullanılan jel boyama teknikleri:
Elektroforez işleminden sonra jelin analizi için boyama veya otoradyografi gibi yöntemlerden birisi
tercih edilir. İkinci yönün tamamlanmasını takiben ayrılan polipeptidler genelde etanol, asetik asit ve
su karışımı ile en az 1 saat ya da gece boyunca etkileştirilir. En çok kullanılan analitik yöntem
Coomasie Brillant Blue R-250 veya gümüş nitrat ile boyamadır. Coomasie Brillant Blue R-250 sadece
1.0-0.5 mg proteinlerin miktarına kadar gümüş nitrat ise 10 ng protein miktarına kadar duyarlıdır. Eğer
proteinler önceden bir radyoaktif izotop ile işaretlenmişse jelin analizi otoradyografi ile gerçekleştirilir.
Otoradyografi radyasyon yardımı ile bir radyografik film üzerinde iki veya üç boyutlu görüntü
oluşturmaktadır. Görüntü çıplak gözle görülebilir. Ancak önceden bir radyoaktif izotop ile işaretlemeyi
gerektirdiği için oldukça pahalıdır.
5
Jellerin Değerlendirilmesi:
İki yönlü elektroforez jelleri görsel veya bilgisayar yardımı ile otomatik olarak değerlendirilebilir.
Görsel değerlendirme çok açıktır ve %10’luk bir protein spot boyama yoğunluğunda farklılıklar doğru
olarak belirlenebilir. Farklı jellerdeki ilgili spotların görsel olarak bulunması otomatik taramadan daha
kolaydır. Ayrıca pahalı bilgisayar programlarına gerek duyulmaz. Ancak çok fazla protein spotunun
ayrıştırılması gerektiğinde ve çok daha büyük jeller kullanıdığında işlem güçleşmektedir. Bu durumda
otomatik değerlendirme için bilgisayar programlarına ihtiyaç duyulur. Otomatik değerlendirme ile
ilgili nokta odaklanarak 20 pencerede birden izlenmesiyle yoğunluk farklılanmalarının hesabı da
yapılabilir.
Elektroforezin Uygulamaları:
Elektroforez, proteinlerin ve enzimlerin saflığının kontrolünde, oligo nükleotitlerin analizinde,
proteinlerin moleküler ağırlıklarının tespitinde, proteinlerin izoelektrik pH’larının belirlenmesinde ve
enzimlerin preparatif eldesinde de kullanılmaktadır.
Proteom araştırmaları iki farklı bakış açısıyla yürütülür.
Klasik Proteom : İki ya da daha fazla sayıda farklandırılmış örnek grubunun 2 yönlü elektroforezle
ayrılması, farklanmaların görüntülenerek kütle spektrofotometresiyle incelenmesi söz konusudur. Basit
bir yaklaşım olup, analizlenen protein hakkında bilgi az ya da hiç olmayabilir. Çalışma için seçilen
kontrol ve örnek grubundan jelleri oluşturularak protein dağılım seviyeleri belirlenir.
Bu sayede farklılanan protein noktaları tespit edilerek incelenmeye geçilir. Buna da substraktif analiz
denir. Özellikle hastalık spesifik proteinleri tespit edilerek öncelikli teşhis amacıyla ileri aşamada ise
yeni ilaçların geliştirilmesinde farklanan protein kimliklerinden yararlanılır.
2D ELEKTROFOREZ
JELLERİN
GÖRÜNTÜLENMESİ
Jel analiz ve Nokta seçimi
JELLERİN DÖKÜMANTASYONU
Protein Noktalarının Çıkarılması
PI, MW
Protein Veri Tabanı
Tüm Veriler
MS İçin Örnek Hazırlığı
Verilerin
Karşılaştırması
MALDI-TOF
[Belirleme Safhası]
Fonksiyonel Proteom : Başlangıç biyolojik materyalinde ön fraksiyonlama sonrası her bir örneğin tek
tek analizlenip yapılarını birçok alternatif teknik kullanarak aydınlatıldığı fonksiyon ve protein
etkileşimlerinin incelendiği daha kapsamlı bir yaklaşımdır. Alternatif teknik olarak en fazla kullanılan
N terminal analizi, aminoasit kompozisyonu, antijenik özellikler, Edman Dizi analizi, kütle
spektrofotometrik teknikler, HPLC gibi.
6
N Terminal
Analizi
HASTALIK KOŞULU
KONTROL
BLOTLAMA
BLOTLAMA
Protein
Noktaları
Protein
Noktaları
Aminoasit Dizi
Analizi
Aminoasit
Kompozisyonu
Antijenik Özellikler
[Spesifik Antikorlar]
VERİ TABANLARI
PROTEİN BELİRLENMESİ
Oligonükleotid
Sentezi
Gen
Fonksiyon
Analizi
Polipeptid
Sentezi
Fonksiyon
Antikor
KÜTLE SPEKTROFOTOMETRESİ
Proteinlerin ve polipeptitlerin kütle spektrofotometrelerinde genelde peptid dizi analizleri, protein
belirlenmesi ve haritalama, moleküler kütle ve özellikle post-translasyon modifikasyonların
belirlenmesi esastır. Bu amaçla en çok kullanılan sistemler MALDI-TOF, ESI-TOF, olarak
sıralanabilir.
BİYOENFORMATİK – PROTEOM
Veri Tabanları : Protein ve DNA dizilerinin bilinmesibiyolojik sistemlerin anlaşılabilmesi açısından
büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle protein primer yapıları translasyon sonrası modifikasyonlar 2 ve
3 boyutlu yapılar ve fonksiyon hakkındaki bilgilerin ulaşılabilecek veri tabanlarında toplanmasının
büyük yarar sağlayacağı açıktır. Genetik ve protein veri tabanlarının kıyaslanması ancak yeni bilgilerin
ilgili sitelerde toplanmasıyla mümkün olabilecektir. Bu nedenle veri tabanı dizaynı, veri tabanları ve
tüm analiz sonuçlarıyla iletişim, sorgulama, arama protein yapısının ve fonksiyonun tahminine olanak
sağlayan biyoinformasyon sistemlerinin geliştirilmesi gerekmektedir.
Proteom ve Uygulamaları
7
Elektro Blotlama ve İmmün Boyama
Elektro transfer, elektroforetik olarak ayrılmış proteinlerin poliakrilamid matriksten protein
adsorplayan membran üzerine elektrik alan altında aktarılmasını sağlayan bir yöntemdir.
SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile elektroblotlamanın korolatif çalışması proteinin mikrogram
sevielerinde ileri analizlerini yapabilmek için çok uygun bir metod haline gelmiştir. Bu metodun diğer
protein izolasyon metodlarına göre önemli bazı avantajları vardır.
1. Ayırma metodu birinci ve ikinci boyutlarda yüksek çözünürlük vermektedir. Bu komplex
proteinler ve özellikle membran proteinlerinin ayrılmasında büyük bir avantaj taşır.
2. Ayrılmış proteinlerin membrana aktarılması ile uygulamada kaynaklanacak hataları en aza
indirmiş olur.
3. Az miktarda bulunan proteinlerin çalışılması imkanını verir. Tüm bu kazançların en önemli
anahtar noktası proteinlerin uygun membrana immobilizasyonudur.
Genel Akış Şeması
Proteinlerin Akrilamid jelde Odaklanması
Jelin Membran ile Etkileşimde Bulundurulması
Elektrotransfer
JElin Yüzeyine dik elektrik alan uygulanması
Proteinlerin membran üzarine hareketinin sağlanması
Proteinlerin
Blotlama verimi jelden membrana jelin transferinin başarısına ve proteinin membrana bağlanma
başarısına bağlıdır. Proteinlerin jelden membrana olan transferine ve membrana bağlanmasını
etkileyen faktörler şunlardır.
SDS Jelden Protein Transferine Etki Eden Faktörler
PARAMETRELER
Proteinler
SDS Jel
Blotlama Tamponu
Blotlama Şartları
TRANSFER GELİŞİMİ
MR
Azalır
SDS Konsantrasyonu
Akril amid Yapısı
Elektroforez sonrası iyonik gerilim
İyonik Güç
Metanol konsantrasyonu
pH
Akım / Alan
Zaman
Artar
Azalır
Artar
Azalır
Azalır
Artar
Artar
Artar
8
Proteinlerin Hidrofobik Membranlara Bağlanmasını Etkileyen Faktörler
PARAMETRELER
Proteinler
SDS Jel
Blotlama Tamponu
Blotlama Şartları
Membran Tipi
TRANSFER GELİŞİMİ
MR
Artar
SDS Konsantrasyonu
Elektroforez sonrası iyonik gerilim
İyonik Güç
Metanol konsantrasyonu
pH
Akım / Alan
Zaman
Azalır
Artar
Artar
Artar
Azalır
Azalır
-
Hidrofobik Karakter
Artar
Blotlama prosesinde ortamda bulunan SDS, elektrik alan etkisinde yüksek asidik sülfat gruplarıyla
proteinleri jel matrikste hareket ettiren temel yapıdır. Zaten blotlama için gerekli olan SDS’te
elektroforez ortamında sağlanır. Keza blotlama tamponlarına SDS ilavesi mümkün değildir. Çünkü bu
deterjanın az bir miktarı bile membrana protein protein adsorpsiyonunu engeller. Transfer tamponu
eğer benzer iyonik kuvvetle kullanıldıysa çok önemlidir. Metanol eklenmesi transfer yüzeyinde önemli
derecede artışlara neden olur. SDS protein kompleksinin dayanıklılığı metanolden etkilenir. Metanolün
artan konsantrasyonlarında bu kompleks daha kolay ayrışır. Ayrılmış SDS molekülleri anoda doğru
hareket edecek ve transfer olan protein ile membran arasında daha iyi bir etkileşim olacaktır.
Blotlamada Kullanılan Membranlar
Poliakrilamid jel proteinlerin ayrılmasında kullanılan çok iyi bir matrikstir. Ancak
karakterizasyonlarında moleküler kütlelere ve izoelektrik nokta tahminleri için bir o kadar zayıftır.
Birçok protein için jellerden elüsyon %90’ a varan kayıplarla sonuçlanabilir. Proteinlerin bir yüzeye
adsorplanmak ve buradan ileri analizlere ek yöntemler kullanılmadan geçilmesi düşüncesi ile
membranlar kullanılmaya başlanmıştır. Nitroselülozun proteinlerinin blotlanabileceği matriks olarak
çalışma alanına girmesiyle karakterizasyon için birçok yeni çalışmanın önü açılmıştır. Membranlar
taşıdıkları modifiye gruplara göre sınıflandırılmışlardır. Proteinlerin kimyasal araştırmaları akrilamid
jellerle yapılamaz. Ayrıca nitroselüloz membran üzerinde yürütülen çalışmalarda ise doğrudan
otomatik –NH2 terminal analizi ile eşdeğer değildir. Bu bağlamda 2 boyutlu elektroforez tekniği ile
protein kimyasal metodların kombinasyonu sonucu proteinlerin yüksek verimlilikte blotlanabilecei
inert membranlar geliştirilmiştir. 2 boyutlu elektroforez ile ayrılan proteinlerin polivinilidendiflorür
[PVDF] membranla blotlanması ile kompleks protein karışımı olan proteinlerin ayrılması sağlanmıştır.
Dizi analizinde problem çıkarmadan çalışan ilk membranlar pozitif yüklenmiş ya da hidrofobik yüksüz
gruplar içeren ya da PVDF ya da polipropilen [PP], gibi saf organik polimerler modifiye olmuş
membranlardır. Farklı hidrofobik membranlara ve farklı karakterdeki proteinlerin blotlanma affiniteleri
değerlendirilmiş ve blotlama mekanizması optimize edilmiştir. Son yıllarda protein aydınlatmasında
kullanılan MALDI-MS çalışmalarında elektro blotlanmış proteinler doğrudan membranlardan
analizlere gitmektedir. Bu tip çalışmalarda seçilecek olan membran çok önmeli rol oynar.
Blotlama Teknikleri
Sıkça kullanılan elektrotransfer teknikleri tank blotlama ve semi-dry blotlamadır. Bu teknikler aynı
temel prensiplere sahip olmaları yanında jeli tutacak mekanik düzenekte farklılık gösterirler.
1. Tank Blotlama [1980 lerde geliştirilmiştir.]
Tank blotlama transfer sırasında çözeltinin elektrik direnci arttığından akımda artar. Bu nedenle çok
etkili bir soğutma oluşturmak gerekir. Soğutma yeterli tamponun sirkülasyonda kaldığı durumda
9
soğutucu ile yapılır. Transfer tankları elektrodları tepede ya da yan tarafta bulunan plastik malzemeden
yapılmıştır. Sistemin kasetleri jel ile membranı etkileşimde tutar. Kasetler tank ile iletken tamponun
içinde dururlar. Tampon işlem sırasında karıştırılırsa daha verimli blotlama sağlanır.
2. Semi-Dry Blotlama
Bulut katmanları, filtre kağıtları, membran ve jelden oluşur. Katmanlar yatay olarak hazırlanır. Tank
blotlama ile karşılaştıracak olursak kaset ihtiyacı olmadığından hazırlanması kolaydır. Filtre kağıtları
tampona batırılır, anod üzerine membran ve jel düzgün bir şekilde yerleştirilir. Bu katların üzerine yine
filtre kağıtları konur ve en üstte katod şeklindeki uç kapanır. Çalışma için gerekli olan tampon miktarı
filtre kağıtlarının emdiği kadar tampon miktarıdır. Ayrıca blotlamada iyon kaynağı yine bu tamponda
emdirilmiş filtre kağıtlarıdır. Elektrot kapakları için platin kaplı grafit iletken polimerik malzemeler
kullanılmıştır. Reaksiyon süresinde sürekli bir gaz çıkışı olur. Buna sebep olan elektrokimyasal
reaksiyon,
Katot ≈ pH : 12
4H2O + 4e- → 2H2 + 4OH-
Anot ≈ pH : 2
6H2O → O2 + 4H3O + 4e-
Oluşan bu gazların genleşmesi oluşturulmuş blot katmanlarında zamanla genişlemesine neden olacak
ve elektrik gerilimini arttıracaktır. Bu istenmeyen durum blot sisteminin üzerine yaklaşık 2 kg. ağırlık
konmasıyla engellenbilir.
Blotlama Mekanizması
Blotlama işlemlerinin başında ilgilenilen proteinler jel içerisinde SDS ile yüklenmiş durumdadır.
SDS’nin negatif yükü SDS protein kompleksini anoda doğru çeker, protein hidrofobik membrana
temas eder. Bu noktada proteinin hidrofobik bağlanma bölgelerinin membran ile bağlanmasını
sağlamak için serbest olması gerekir. Protein buralardan bağlanmaya başlar ve akım devam ettikçe
SDS proteinden ayrılarak anoda doğru göçe devam eder. Protein hidrofobik etkileşimlerle membrana
bağlanmıştır. Tüm göçün sonunda ise SDS proteinden ayrılacaktır. Bu mekanizmada yüksek molekül
kütleli proteinler SDS lerini daha jeli terk etmeden kaybedebilirler. Bu noktada zamanı arttırmak etkiyi
arttırmayacaktır. Çünkü negatif yükünü kaybetmiş proteinler jelden dışarı göç edemeyeceklerdir.
Blotlama zamanını arttırmak ancak blotlama tamponuna SDS eklenmesiyle bir anlam kazanır. Ayrıca
düşük molekül kütleli proteinler yaklaşık 5 kg. daltondan küçük proteinler incelenecek olursa bu
yapılarda o kadar hızlı göç edeceklerdir ki, membrana ulaşacakları zaman içinde proteinler
SDS’lerinin bazılarından bile kurtulamayacak membran ile hiçbir etkileşime girmeden SDS
molekülleri ile beraber gidecektir.
İmmün Boyama
Membranlara immobolize edilmiş proteinler farklı amaçlar için farklı şekilde belirlenebilir. Bu boyama
teknikleri dışında immunolojik tanı tekniklerinde çok önemli uygulama alanına sahiptir. İmmün
belirleme yöntemlerinin çok çeşitli şekilleri membranlar üzerine blotlanan antijenik proteinlerin
aydınlatılmasında kullanılır. Bu farklı uygulamalarda temel prensip her zaman aynıdır.
4
S
P
3
2
1
10
Şekil. Membrana bağlı antijen tanısı
1. Blotlama materyali membranda boşalanları kaplar.
2. Spesifik antijenin spesifik antikoru ile konjugasyonu
3. Enzim konjuge-sekonder antikorunun spesifik antikora bağlanması
4. Belirteç olarak substratın reaksiyonu.
İmmün tanı için uygulanan prosedür yedi adımda gerçekleşir.
1. Membrana Transfer
2. Blotlama
3. Primer antikor İnkübasyonu
4. Yıkama
5. Konjuge sekonder antikor-ligand inkübasyonu
6. Yıkama
7. Sinyal / Renk Oluşumu
Proteinlerin Enzimatik Parçalanması ve Peptidlerin HPLC ile Ayrılması
Proteinlerin fragmanlara ayrılması çoğunlukla primer yapı tayini ve peptit haritalarının çıkarılması
amacıyla yapılmaktadır. Yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için peptidlerin hazırlanmasında
proteinlerin frakmantasyonu son derece yararlıdır. Ayrıca bu sayede proteaz dirençli bölgeler ya da
proteinlerin domainler arasındaki polipeptit zincirlerini çapraz bağlanma bölgeleri hakkında bilgi
edinebilmekte mümkündür. Frakmantasyon aynı zamanda membran proteinleirinin ---------yararlı bir tekniktir. Peptit fragmanlarının oluşturulmasında genellikle endoproteinazlar kullanılır.
Uygun enzim ya da kiyasalların seçimi parçalanmanın spesifikliğini ve verimliliğini belirlemek
açısından önemlidir. Ayrıca elde edilecek fragmanların boyutu ve sayıda ilk planlamada etkin diğer
kriterlerdir. Primer yapı analizi için birbirleriyle çakışan peptitleri elde etmek amacıyla birçok farklı
fragmantasyonun gerçekleştirilmesi önerilmektedir.
Parçalama Teknikleri
Parçalama tekniği olarak kimyasal veya enzimatik teknikler kullanılabilir. Her iki sistemde
parçalanmalar solüsyonda, jelde membrana blotlama sonrası gerçekleştirilebilir. Numune çalışma
tamponunda çözülü enzim ilave edilir ve karıştırılarak su banyosunda inkübasyona bırakılır. Tek ya da
çift yönlü jeller kullanılarak ayrılan proteinler söz konusu olduğunda birden fazla yaklaşım
uygulanabilir. Protein jellerden elektro elüsyon ile uzaklaştırılır ve peptitleri parçalama, solüsyonda
gerçekleştirilebilir. Ancak, elektro elüsyonun verimliliği zayıftır ve saf mikrogram için uygulanmaz.
Uygun verimlilik jelde ya da membrana blotlama sonrası membran parçalama işlemiyle
anılabilmektedir. Burada elde edilen protein dizi bilgileri rutin olarak birkaç pikamol düzeyinde elde
edilebilir. Eğer proteinin amino ucu blotlanmış ise enzimatik parçalanma iç dizi bilgilerine ulaşma
açısından gereklidir. Proteinin deterjanla muamele edilip proteaz enzimlerine tabi tutulması
proteinlerin iç dizi analizleri için uygun peptitlerin elde edilmesinde uygulanan bir tekniktir.
Proteaz Enzimleri
Proteinin peptitlere parçalanmasında en yaygın olarak kullanılan enzimlerin çoğu serin proteazlardır.
Bunun yanı sıra metallo ya da tiol proteazlarda kullanılır.
Tripsin : Bir serin proteazdır. Pankreasta inaktif tripsinojen olarak sentezlenir. Çok hızlı bir şekilde
amino ucundan hekza peptitin uzaklaştırılması ile aktif hale geçer. Tripsin ile parçalama arginin ve
lizin aminoasitlerinin karboksil ucunun peptit bağlarında gerçekleşir.
Kemotripsin : Bu da bir serin proteazdır. Optimum pH : 8’dir. Kemotripsin ile parçalanma lösin,
tirozin, fenilalanin triptofan, metionin ve alanında gerçekleşir.
11
Termolizin : Aktif merkezinde metal Ca2+ içerir. pH’ı 8,1 dir. Optimum sıcaklığı 50°C’dir. Termolizin
ile parçalama izolizin, valin, trionin, tirozin, fenilalanin, triptofan, lösin ve alanında gerçekleşir.
Pepsin : Asidik proteinazdır. Optimum pH : 1,8-2,2 arasındadır. Tercihen fenilalanin, metionin, lösin,
triptofan gibi hidrofob aminoasitleri amino uçlupeptit bağını hidrolizler.
Clostripain : Bir tiol proteazdır. Clostripain ile parçalama arginin karboksil ucunda gerçekleşir. Ayrıca
lizinden sonraki peptit bağlarını etkin olarak parçalayabilir.
Papain : Bir tiol proteazdır. Parçalama pH : 6 – 7 arasındadır. Arginin, lizin, glutamin, histidin, glisin
ve triozinin karboksil ucunda gerçekleşir.
Peptitlerin Ayrılması
Protein kimyasında yüksek duyarlıklı yöntemlerin geliştirilmesi, yapı analizlerinde önemli bir yer
almıştır. Bu teknoloji şimdilik iki yönde gelişmektedir.
1. Başlangıç çalışmaların küçük peptitlerde parçalandıktan sonra orta büyüklükteki polipeptitlere
uyarlanması.
2. Aminoasit analizi ve dizi analizi ile yapısal karakterizasyon için çok daha az materyalin
kullanılması.
Uzun yıllardır zıt faz sıvı kramatografisi polipeptitlerin izolasyon ve karakterizasyonunda yaygın
olarak kullanılmaktadır. Ancak kapiler elektroforez gibi alternatif kramatografik tekniklerde peptit
izolasyonunda kullanılabilmektedir.
HPLC İLE SAFLAŞTIRMA
HPLC küçük boyutlu peptitlerin kompleks karışımlarının izolasyonunda çok yararlı bir analitik
yöntemdir. Çoğunlukla zıt faz HPLC uygulanır ve küçük boyutlu peptitlerin saflaştırılmasında ve hatta
karışımın hidrofobik karakterli fragmanları içermesi durumunda dahi uyumlu bir yöntemdir. Uçucu ve
UV geçirgen HPLC tamponlarının kullanılmasının yüksek duyarlıklı ölçümlere, birbirini izleyen direkt
aminoasit analizlerine ve mikro dizi analizlerine imkan sağlaması açısından avantajlıdır.
Peptit ve Proteinlerin Dizi Analizleri
Proteom analizlerinde kısmi aminoasit dizisinin belirlenmesi proteomların tanımlanabilmesi için
zorunludur. Dizi hakkında bilgi, kütle spektrometresi ya da klasik Edman reaksiyonunda kullanıldığı
kimyasal parçalanma vasıtasıyla elde edilir. Edman parçalanması üç adımda gerçekleşir.,
1. Adım : Bağlanma
Fenilizosiyanat [PITC] polipeptitin serbest α-amino ucuna bağlanmasıdır.
2. Adım : Parçalanma
Halka oluşumu ile ilk amino asidin anilinotiyzolinon formunda ayrılmasıdır.
3. Adım : Dönüşüm
Oluşan kararsız türevin fenil tiyohidantiyon [PTH] aminoasit türevine izzomerizasyonudur.
Reaksiyon sırasında ortamdan oksijen uzaklaştırılmasına dikkat edilmelidir. Oksijen varlığında
reaktifin tiyo grubu ve ayrılan feniltiyohidantoin aminoasit türevleri kağıt ve ince tabaka
kramatografisi ile belirlenebileceği gibi çok yüksek duyarlıklı HPLC ile belirlenebilir. Polipeptitin
amino ucundan başlayarak birbiri ardına ayrılan PTH türevleri aminoasit dizisini verirler.
12
Proteinlerin ve Peptitlerin Kütle Spektrometresi
Kütle spektrometresi yüksek kütle dağılım ve doğrulukta bir analize imkan sağladığı için protein ve
peptitlerin tayininde oldukça değerlidir. Aletlerdeki son gelişmeler proteinlerin 1 ve 2 yönlü jellerden
parçalanma sonrası kütle parmak izi analizi ile belirlenmesine olanak sağlar. Tanımlama karışımdaki
bireysel peptitlerin ölçülen kütleleri ve bir proteinde bulunduğu düşünülen teorikçe türetilmiş peptit
kütleleri ile kıyaslama vasıtasıyla gerçekleştirilir. Alternatif olarak ölçümler elektro sprey iyonizasyon
[ESI] kütle aletlerinde yapılabilir. Seçilen peptit iyonlarının analizi çarpışma indüklü disosiyasyon
[CID] tek tek elde edilen peptit iyonlarının kütle spektrometresiyle MS/MS birbirinin ardına ekli iki
spektrometre ile gerçekleştirilebilir.
MALDI kütle spektrometresinde triptik-peptit karışımlarındaki farklı kütleler elde edilebilir ki bunların
her biri özel protein için karakteristiktir ve eğer protein dizi biliniyorsa protein tanımlanmasında
bulunabilir. Elektro sprey aletleri HPLC birleştirildiyse bazı peptit iyonlarından kütle parmak izi
analizi ve ilave kısmi dizi bilgileri elde edilebilir. Kullanılan aletin tipine bağlı olarak tek bir deney
boyunca aynı örneğin minimum 100 fenta mol, en yüksek ise 2 pikamollük miktarı belirlenebilir.
Doğru proteinin belirlenmesi büyük oranda aminoasid ya da gen dizisi verilerinin varlığına bağlıdır.
İleri aşamada ise spektrumların hızlı değerlendirilmesi ve veri taban aramasına imkan sağlayan uygun
biyoinformatik araçların kullanılması önemlidir.
13
14