proteomıcs

PROTEOMICS
Yirminci yüzyılda bilimsel
keşiflerin baş döndürücü
ilerleyişi günlük
yaşamlarımıza da önemli
etkiler yaptı
Endüstrileşmiş ülkelerde
görülen hayat beklentisi
ve yaşam kalitesindeki
artış tıp ve biyolojik
biimlerdeki keşiflerle
bağlantılıdır
Yirminci yüzyılın başında,tıp ve biyoloji
makroskopik fenomenleri anlamayı
amaçlayan tanımlayıcı bilimlerdi
Yüzyılın bitişiyle birlikte, bu bilimler
yaşamlarımızdaki biyolojik süreçlerde
etkileri daha çok anlaşılan mikroskopik ve
nanoskopik dünyalara giriş yaptılar
Yeni binyılın doğuşu genomik bilginin de
çok fazla birikmesiyle birlikte, karmaşık
çokgenli hastalıkların ve sistem
biyolojisinin anlaşılması için yeni bir
paradigmayı gündeme getirmiştir.
Yüzyılın son çeyreğinde bazı bilim
adamlarının DNA sekans dizisinin
çıkarılabileceğini öngörmesiyle yeni bir
çağ başladı.
Teknolojinin gelişmesi ve yeni araçların
keşfiyle genom çalışmaları büyük bir hız
kazandı.
Özellikle, büyük genomların daha uygun
sürelerde sekanslamasını yapabilmek için
araç ve gereçler geliştirildi(Dovichi,1997).
Bu araç ve gereçler, biyolojiyi ve
hastalıkları daha iyi anlamamızı
sağlayacak kapsamlı yaklaşımların
iskeletini oluşturmamızı sağladı
Daha da önemlisi biyolojik süreçlerin
sadece genomik sekanslamayla
çözülemeyeceği çok kısa bir sürede
anlaşıldı
Daha sonra bakışlar RNA ekspresyon
seviyelerine çevrildi.
Ribonükleik asitin ekspresyon seviyelerinin
kantitatif analizlerinin hızlı bir şekilde
yapılmasını sağlayacak olan bir dizi araç
kullanıma sokulmuştur.
DNA/RNA array teknolojisinin ve gen
ekspresyonunun seri analizi (SAGE) nin
ortaya çıkışı RNA altbirimlerinin ve
tamamının kantitatif ekspresyon
profillerinin elde edilmesini
kolaylaştırmıştır.
Bu teknikler kullanılarak farklı RNA
ekspresyon profilleri elde edilebileceği gibi,
hücreler farklı bir durumdayken ya da farklı
hücreler karşılaştırılırken genlerin up ya da
down regüle edildikleri tespit edilebilir.
RNA çalışmalarıyla inanılmaz büyüklükte
bilgi ortaya çıkarılmıştır.
Bununla birlikte, RNA ekspresyonunun tek
başına gen işlevlerini ve biyolojik
prosesleri açıklamakta yetersiz olduğu
ortaya çıktı
RNA ekspresyonunun protein seviyesinde
meydana gelen değişikliklerle zayıf bir
doğrusal ilişkiye sahip olduğu farklı
çalışma grupları tarafından elde edilen
kanıtlarla ortaya konurken
Maya genomu üzerinde yeni yapılmış
geniş ölçekli bir çalışma DNA chip
sonuçları ve protein ekpresyonları
arasında zayıf bir ilişki bulunduğunu
açıkça göstermiştir.
Bu çalışmada,bir genle bağlantılı olan
protein sevitesinde önemli derecedeki
değişim, RNA ekspresyon seviyesinde bir
değişim olmadan gen-altucundaki (downstream) regülasyon mekanizmalarıyla
gerçekleştirilebileceği bulunmuştur.
Protein çalışmaları, kısmen proteinin
yapısını kesin ve kolay bir şekilde
tanımlayacak olan metodların
eksikliğinden dolayı her zaman küçük
ölçeklerde yapılmıştır
2 boyutlu jel elektroforezi tipik olarak
proteomik çalışmalarında profil çıkartmak
için kullanılır, ve bu yöntemin en önemli
işlevi farklı koşullarda ifade edilen
proteinlerin farklı gösterimleridir
Halihazırda kullanılan protein ekstraksiyon
protokolleri tüm biyolojik örneklerin
hepsine uygulanamamaktadır, ve
ekstrakte edilmiş olan proteomdaki
proteinin gösterilebilmesi anlamında da
sınırlılıkları vardır
Hidrofobik proteinler kolaylıkla ekstrakte
edilemez ve 2D jel üzerinde gösterilemez
Bir proteomda beklenen proteinlerin
önemli bir miktarı hidrofobiktir
2D elektroforezi ve kütle spektrometresi ile
tanımlanan proteinlerden elde edilen bilgi
önemli miktarda hidrofobik proteinin eksik
olduğunu göstermektedir.
Son yıllarda, Rabillout ve grubunun önemli
çabaları hidrofobik proteinlerin tekrar
eldesi (geri kazanımı) için kullanılabilecek
geliştirilmiş kimyasallar ve protokoller
sağlamıştır
Buna rağmen, proteomik çalışmalarında
hidrofobik proteinlerin ekstraksiyonu halen
önemli bir hedeftir.
Proteom çalışmalarında özellikle her biri
kendi proteomuna sahip, farklı safhalarda
bulunan birçok farklı hücreden oluşan
dokularla çalışıldığında problemler ortaya
çıkmaktadır.
Doku parçalarının lize edilmesi sonucunda
bir proteom çorbası meydana gelir.
Bu sorunu bertaraf etmek için hücre
kültürüyle çalışılmaya başlanmıştır.
Bitki, hayvan ve klinik örneklerden de
proteomik çalışmları yapılmıştır.
Dokulardan elde edilen hücrelerin
fraksiyonlara ayrılması proteomun
karmaşıklığını azaltır.
Belli hücre tiplerine özgü immobilize
antibadiler kullanılarak, proteomik
çalışmaları için hücre populasyonlarını
ayıracak immünomagnetik teknikler
keşfedilmiştir.
İki boyutlu Jel Elektroforeziyle
Protein Ayrıştırılması
Proteomların bazıları, diğerleri binlerce
protein taşırken , birkaç yüz ya da daha az
protein taşıyan göreceli olarak daha küçük
proteomlardır.
Proteomics çalışmalarında, 2D jel
elektroforezinde en sık yapılan şey, birinci
boyutta proteinleri pI larına göre daha
sonra da ikinci boyutta MA’larına göre
ayırmaktır
Açıkçası, pI ve MA bazında ayırmanın
kombinasyonu yapıldığında doğru bir
ayırım vermekte ve bu durum 2D jel
elektroforezinin eşsiz çözme(ayırma)
gücünü yansıtmaktadır.
Her ne kadar 2D elektroforez sistemi güçlü
bir ayrıştırma tekniği olsa da, başlangıçta
oldukça kullanışsızdı
80’lerin ortalarında immobilize pH
gradiyenti (IPG strip) ortaya konarak bu
teknik ticari olarak kullanılabilir hale geldi
1980’lerin ortalarında, amfolit özellikteki
akrilamid monomerleriyle akrilamidin
düşük çapraz bağlarla kopolimerlerize
edilmesiyle pH gradiyentinin stabilize ve
immobilize olabileceği görülmüştür
Uygun bir IPG şerit elde edildiğinde,
protein ekstraktı ve yükleme tamponu
karışımı bu şeride yüklenir
Şerit boyunca küçük bir elektrik akımının
verilmesi proteinlerin IPG şeride
transferini artırır
Şerit tam olarak yüklendiğinde, daha
büyük bir alanı IPG şeridi boyunca
uygulanır
Pozitif yüklenen proteinler katoda doğru
hareket ederler ve pI’larına ulaşana kadar
artan pH’la karşılaşırlar
Negatif yüklenen proteinler ise anoda
doğru hareket ederler ve pI’larına ulaşana
kadar azalan pH’a maruz kalırlar
Her bir protein kendilerine ait pI’larında
odaklanırlar.
İki-Boyutlu Jel Elektroforeziyle
Ayrılmış Proteinlerin Tespiti
Jel elektroforeziyle ayrıştırılmış proteinleri
görüntülemek için yıllar boyu farklı
metodlar geliştirilmiştir.
Her ne kadar farklı kimyasallar kullanılsa
da, kullanılan metod ya birinci boyuttan
sonra proteinlerin etiketlenmesini ya da
ikinci boyuttan sonra proteinlerin
etiketlenmesini içerir
2D jel elektroforezinden önce
gerçekleştirilen protein önetiketlenmesi
sıklıkla büyüme ortamına radyoizotopik
olarak etiketlenmiş amino asitlerin
eklenmesiyle gerçekleştirilir
Proteinlerin önetiketlenmesinde kullanılan
başka bir yaklaşım nötral kvalent bağlanan
floresan boyalar kullanılmasıdır
Bu boyalar 2D jel elektroforeziinden önce
proteinlere kovalent olarak bağlanır
Yüklü olmadıklarından dolayı, boyalar
proteinlerin izoelektrik noktalarını minimal
bozmaları avantajını taşırlar
Bununla birlikte, bu yaklaşımın duyarlılığı
absorpsiyonun zayıflığından dolayı kötü
etkilenmektedir
Yeni elde edilmiş floresan boyalar 2D jel
elektroforeziyle ayrılmış proteinler için
nanogram seviyesinde hassasiyet
kazandırmıştır
Bu yaklaşımın dezavantajı ise bir floresan
tespit sisteminin ve her bir protein
lekesinin daha ileri prosesleri için
otomatize edilmiş bir leke toplayıcıya
gerek duyulmasıdır
Proteinlerin seperasyon sonrası tespiti,2D-jelde
ayrılmış proteinlerin görüntülenmesinde en çok
tercih edilen yoldur
Özellikle, kullanımlarının kolaylığı ve
duyarlılıklarından dolayı koloidal komasi boyama
ve gümüş boyama tercih edilen metodlardır
Koloidal komasi boyama genellikle 25 ila 50 ng
civarında proteinlerin tespitini sağlarken, gümüş
boyama 5ng seviyesindeki proteinlerin tespitine
izin verir.