Toksikoloji - Trakya Üniversitesi

Toksikoloji
TOKSİK MADDELER VE
CANLILARA ETKİLERİ
BIY435
Kağnıdan Nu38 uçaklarına
1944’de Türk Hava Kurumu Uçak
Fabrikası tarafından üretilip
Damimarka’ya satılan THK-5A uçağı
• 1932’de Selahattin Alan, kendi
yaptığı MMV-I (Milli Müdafaa
Vekaleti) adlı uçağın gövdesine,
amblem olarak bir kağnı figürü
koymuş,
1936 yılında tel motorlu olan ND 36’yı, 1928
yılında ise Nu.D 38 isimli 6 kişilik çift motorlu
yolcu uçağını üretir.
Genetik toksikoloji
• Toksikolojinin bir alt dalı olan genetik toksikoloji,
organizmanın normal biyolojik işleyişi sırasında veya
kimyasal, fiziksel ve biyolojik etkenlere bağlı olarak
hücrelerin DNA moleküllerinde meydana gelen
değişiklikleri inceler.
Genotoksite
Genetik toksisite,
genotoksinlerin
kromozom ve DNA
yapısında meydana
getirdiği hasarları
kapsayan bir terimdir.
Bu hasarlar genellikle
gen mutasyonları,
kromozom anormallikleri,
DNA zincir kırıkları ve
DNA eklentileridir.
Genotoksite
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Genetik toksisite ya da genotoksisite;
çekirdek,
kromozom ve
DNA yapısında meydana gelen
DNA eklentileri,
DNA kırıkları,
gen mutasyonları,
kromozom anormallikleri,
klastojenite ve anöploidi gibi hasarları kapsayan
genel bir terimdir.
Kanserleşme mekanizması
• Kimyasal maddelerle oluşan kanser, çevresel ve
endojen faktörler arasındaki etkileşmeleri içeren
çok basamaklı kompleks bir prosestir.
• Bu mekanizmanın başlıca özelliği, somatik
hücrelerin düzenli çoğalmasını sağlayan karmaşık
kontrol sisteminin bozulmasıdır. Kimyasal
karsinojenezisin neden olduğu malign neoplazma
oluşumunda en az 3 önemli basamak bilinmektedir:
1) Başlangıç (initation);
2) Gelişme (promotion)
3) İlerleme (Progression).
Kanserleşme mekanizması
Kanserleşme mekanizması
• Kimyasal karsinojenez gelişiminde 3 dönem;
• I- Başlangıç (initation); Kimyasalın DNA’da
yaptığı değişiklik Geliştiricilerle karşılaşıncaya
kadar sessiz devre.
• II- Gelişme (promotion) Başlama evresindeki
hücre geliştirici ile çoğalır - tümör oluşumu
• III- İlerleme (Progression) İyi huylu tümörün
kötü huylu tümöre dönüşmesi .
Genotoksik Non genotik kanserojenler
• Genotoksik Karsinojenler DNA’da hasar
oluştururlar. -Primer karsinojenler -Sekonder
karsinojenler - İnorganik karsinojenler
• Epigenetik Karsinojenler Genotoksik etkileri
yoktur. -Hormon modifikasyonu İmmunsüpresör etki gibi mekanizmalar rol
oynar.
Genotoksik Karsinojenler
• Primer karsinojenler (doğrudan etkili olanlar)
– Alkilleyici ajanlar (dimetilsülfat)
–Aktif halojen bileşikleri
–Nitrözamidler
• Sekonder karsinojenler (biyoaktivasyon sonucu etkili )
–PAH’lar
–Aflatoksin B1
–Nitrozaminler
• İnorganik karsinojenler
–Kadmiyum,
–Nikel, Arsenik,
– Krom Asbest.
Kanser yapan maddeler sınıfları
•
Dünya Sağlık Örgütü’ne bağlı Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (IARC) tarafından insandaki karsinojenik
etki risklerine göre kimyasaları 5 gruba ayırmıştır:
•
Grup 1. İnsanda karsinojenik etkililer İnsanlarda kanser
oluşturduklarına ait yeterli delil bulunan etkenler.
Grup 2A. İnsanda karsinojenik etki olasılığı bulunanlar İnsandaki
karsinojenik etkileri konusunda sınırlı delil ve deney hayvanlarındaki
karsinojenik etkileri konusunda yeterli delil bulunan etkenler .
Grup 2B. İnsanda muhtemelen karsinojenik etkili olanlar İnsandaki
karsinojenik etkileri konusunda sınırlı delil ve deney hayvanlarındaki
karsinojenik etkileri konusunda yeterli delil bulunmayan etkenler.
Grup 3. İnsandaki karsinojenik etkileri yönünden sınıflandırılabilir
olmayanlar Hiçbir gruba girmeyen etkenler.
Grup 4. İnsanda karsinojenik etkisi olmayanlar İnsanda ve deney
hayvanlarında karsinojenik etkileri yönünden delil bulunmayan
etkenler.
•
•
•
•
DNA Hasarı
Mutasyona yol açan etkiler
MUTAGENLER
Mutajen, biyolojide canlı organizmaların DNA veya
RNA gibi hücresel bilgi ve yönetim zincirlerinin
moleküler yapısını değiştirerek söz konusu
organizmanın doğal olarak beklenen seviyenin çok
üzerinde mutasyona uğramasına sebep olan
fiziksel veya kimyasal etmenlerdir. Nükleer
radyasyon sonucu oluşan gama ve güneşten
yayılan UV ışınımlar en bilinen doğal
mutajenlerdendir.
Nokta mutasyon
BAZ değişimi:
•a) Silent (Sessiz) mutasyon: DNA üçlü (triplet) kodonunda bir nokta mutasyona rağmen
kodondan
•sentezlenen amino asit değişmez.
•Ör: TTA Æ TTG (Transisyonel silent mutasyon)
• lösin lösin
•b) Missense (Kayıp) Mutasyon: DNA üçlü (triplet) kodonunda bir nokta mutasyon sonrasında
kodondan
•sentezlenen aminoasit değişir.
•Ör: GCA Æ GAA (Transversiyonel missens mutasyon)
• alanin glutamik asit
•1 4 7 10 13 16 19
•ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA
• met gly ala leu leu thr stop
•6
•ATG GGA GCT CTA TTT ACC TAA
• met gly ala leu phe thr stop
•c) Nonsense Mutasyon: Üçlü (triplet) kodonda meydana gelen bir nokta mutasyon sonrasında
kodon
•STOP kodon oluşturur.
•Ör: TTA Æ TGA (Transversiyonel nonsense mutasyon)
• alanin STOP
•ATG GGA GCT CTA TTA
Nokta mutasyon
INSERTION
DELETION
Change of the
reading frame
Büyük ölçekli mutation / Kromosomal mutasyon
Fiziksel etkiye bağlı DNA hasarı
İyonize radyasyon
- suyun iyon haline gelmesi (bazları etkilemesi)
-> OH* radikaller; H2O2, O2- Bazların oksitlenmesi, dimerization ...
UV radiation
- Aromatik halkların oluşması (bazlarda )
- Baz dimerizasyonu (T=T)
İyonize enerjinin direk indirek DNA
hasarı
Kimyasallara bağlı DNA hasarı
Baz analogları
- incorporation
into DNA
during replication
(5-Br-Uracil: AT -> GC)
DNA Hasarı yapan toksik maddeler
HNO2, HSO3-,Hydroxylamine, Methoxyamine
Bazlarda Deaminazasyona yol açar.(GC -> AT)
Kimyasalla bağlı DNA hasarı
Alkylsulphates, N-nitroso-alkyles, cis-platinum
- alkylation of bases; crosslinks of dsDNA
cisplatin
cyclophosphamide
DNA Hasarı yapan toksik madeler
INTERCALATION & ADDUCT FORMATION
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) & derivatives (Nacetyl-2-aminofluorene (AAF), benzo[a]pyrene)
Mycotoxins (aflatoxins) aduct formation with DNA
(biomarkers)
Psoralen
DNA Hasarı
Genotoksik maddeler
Genotoksik madeler
Kanserleşme
Kanserleşme
Kanserleşme
• Kanser, normal büyüme ve farklılaşmayı
sağlayan mekanizmalar üzerindeki kontrolün
kaybolması nedeniyle değişime uğramış bir
hücrenin sınırsız çoğalması sonucu gelişen bir
hastalıktır.
Kanserleşme
• Hücrelerin klonal olarak çoğalması, farklılaşması,
bağımsız fakat koordineli fonksiyonlara sahip
olması, organizmanın bir bölümünden faklı bir
bölümüne taşınması, hasarlanma sonrası onarım
olması veya olmaması için gerekli bilgilerin tümü
genetik dağarcıkta bulunmaktadır.
• Fizyolojik koşullarda belli bir kontrol altında
gerçekleşen bu işlemler kanserde bozulmuştur.
Kanserleşme
• Kontrolün kaybından bu fonksiyonların düzenlenmesinde
hayati öneme sahip olan belli bir grup genin anormal
fonksiyonu sorumludur.
• Anormal gen fonksiyonu genetik hasarla ilişkili olduğundan
karsinogenezde ilk adım her zaman genetik hasardır.
• Genomun çeşitli bölgelerinde oluşan hasarların birikimi ile
bozulan kromozom yapısı yeniden düzenlenir.
• Mitoz hasarlı DNA’nın kopyalanması ile devam eder, hasarlı
genlerin ürünleri hücresel metabolizmayı değiştirir ve
sonuçta hücre değişime uğrayarak bir tümör hücresine
dönüşür.
TÜMÖR HÜCRELERİNDE GÖRÜLEN BİYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL
DEĞİŞİKLİKLER
• Tümör hücreleri normal hücrelerde bulunmayan
aşırı büyüme hızı, lokal invazyon, diferansiasyon,
anaplazi ve metastaz gibi bir takım farklı özellikler
gösterirler.
Genetik Toksisite Testleri
• Genetik Toksisite Testleri Genetik sistemler ile
genotoksisitesi test edilmek istenen maddelerin
karsinojenik ve mutajenik potansiyelleri arasında ilişki
kurulmasını sağlayan ve en yaygın olarak kullanılan
standart in vitro ve in vivo mutajenite testleri;
•
•
•
•
Ames testi,
Comet testi,
Kromozom anormallikleri (KA) testi,
Kardeş kromatit değişimi (KKD) testi ve
Mikronükleus (MN) testidir.
AMES
• Ames testi olarak da adlandırılan
Salmonella/mikrozom mutajenite testi, kimyasal
maddelerin mutajenik etkilerinin araştırılmasında
kullanılan, test parametreleri açısından en iyi
standardize edilmiş ve mutajen/karsinojen etkisi
en iyi bilinen kimyasallarla geçerliliği en fazla
kabul edilmiş bakteriyel test sistemlerinden
biridir. Ayrıca hızlı, ucuz ve uygulanabilirliğinin
kolay olması nedeniyle çok yaygın bir kullanım
alanına sahipti
AMES
AMES
• Histidin operonunun değişik bölgelerinde çeşitli
mutasyonlar içeren Salmonella typhimurium’unmutant
suşları kullanılmaktadır.
• S. typhymurium’un yapay mutasyonla oluşturulmuş
olan histidin
• sentezleme yeteneklerini kaybetmiş suşlarının,
sitokrom P-450 enzimlerini içeren memeli karaciğer
post mitokondriyal süpernatant (S9) varlığında veya
yokluğunda, test bileşeni ile muamele edildikten sonra
• ikinci bir mutasyon geçirip histidini sentezleyebilen ve
histidinden bağımsız ortamda çoğalması esasına
dayanır.
AMES
Histidinsiz ortamda üreyebilmelerine yol açan kendiliğinden geri
mutasyona uğrayan koloniler sayılarak mutajenite Belirlenmektedir.
Ortamda pozitif mutajen bir kimyasal madde varsa, geri mutasyonla
çoğalan bakteri koloni sayısı istatistiksel olarak anlamlı artmaktadır
COMET testi
• Comet tekniği, çeşitli ajanların yol açtığı DNA
tek ve çift zincir kırıklarının tespiti için
kullanılan hassas, hızlı ve güvenilir bir
yöntemdir. Tek hücre jel elektroforez (Single
cell gel electrophoresis) tekniği olarak da
adlandırılan Comet yöntemi, birçok memeli
hücresinde çeşitli ajanların indüklediği DNA
hasarı ve onarım bozukluğunun tayinini
amaçlayan çalışmalarda kullanılmaktadır
COMET testi
COMET testi
• Floresan mikroskop ile incelenen preparatlarda zarar
görmemiş DNA’lar comet (kuyruk) oluşturmazken,
hasar görmüş DNA moleküllerindeki fragmentler farklı
moleküler ağırlıklarına ve farklı elektrik yüklerine sahip
olacaklarından elektriksel alanda farklı hızlarda hareket
ederek çekirdekten dışarı doğru göç etmekte ve
kuyruklu yıldız görünümü oluşturmaktadırlar (Şekil 3).
Bu görünüm nedeniyle bu tekniğe "Comet" adı
verilmiştir. Comet testi ile DNA hasarının kantitatif
olarak saptanmasında; kuyruk momenti, kuyruktaki
DNA yüzdesi ve kuyruk uzunluğu gibi parametreler
kullanılmaktadır
COMET testi
COMET testi
Kromozom Anormallikleri (KA) Testi
• Kromozom kırıkları DNA’daki onarılmamış çift zincir kırıklarından, yeni
yapıya sahip kromozomlar ise DNA’daki zincir kırıklarının yanlış
onarılmasından kaynaklanmaktadır. Genetik materyalde oluşan bu tip
hasarlar tamir edilemediğinde ortaya çıkan yüksek KA frekansı ise,
artmış kanser riskini göstermektedir .
• KA testi, mutajenler tarafından indüklenen çeşitli yapısal ve sayısal
kromozomal anormalliklerin saptanması amacıyla sıklıkla kullanılan
standart bir yöntemdir.
• In vitro KA testi ile memeli hücre kültürlerinde, in vivo KA testi ile
genellikle kemik iliği hücrelerinde kromozom anormalliği frekansı
değerlendirilebilmektedir. Ayrıca in vivo KA testi, özellikle mutajenik
hasarın belirlenmesinde türe ve dokuya göre değişebilen
metabolizma, farmakokinetik ve DNA onarım mekanizmaları gibi
• faktörlerin değerlendirilmesine de olanak sağlamaktadır
Kromozom Anormallikleri (KA) Testi
Trizomi 21
Kromozom Anormallikleri (KA) Testi
Kardeş Kromatit Değişimi (KKD) Testi
• Kardeş Kromatit Değişimi (KKD) Testi KKD, kardeş
kromatitlerin homolog lokusları arasında DNA
replikasyon ürünlerinin simetrik değişimidir ve DNA
çift zincir kırıklarının homolog rekombinasyon
yoluyla onarılmasını göstermekedir.
• Ayrıca KKD’ler nokta mutasyonların indüksiyonu,
gen amplifikasyonu ve sitotoksisite ile yakından
ilişkilidir
Kardeş Kromatit Değişimi (KKD) Testi
Mikronükleus (MN) Testi
• MN’ler genellikle hücre siklusunu kontrol eden
genlerdeki eksiklerden, mitotik iğdeki hatalardan,
kinetokordan veya mitotik aygıtın diğer parçalarından
ve kromozomal hasarlardan kaynaklanan, hücrenin
mitoz bölünmesi sırasında ortaya çıkan, esas çekirdeğe
dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom
fragmanlarından köken alan oluşumlardır.
• MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde
oluşturduğu kromozom düzensizliklerinin ve somatik
hücrelerdeki genomik kararsızlığın indirekt göstergesi
olarak değerlendirilmektedir.
Mikronükleus (MN) Testi
Mikronükleus (MN) Testi