DNA Mikroarrayler: SNP analizleri SNP analizleri
advertisement
Hafta IX Genombilimde Mikrodizin Uygulamaları ve Biyoinformatik Analiz DNA Mikroarrayler: SNP analizleri Doç. Dr. Hilâl Özdağ DNA Mikrodizin Genomik Dizi SNP T/G 5´ 3´ SNP prob = 25 baz Perfect Match Mismatch Allel ‘A’ Perfect Match Mismatch Allel ‘B’ DNA Mikrodizin SNP C/A TAGCCATCGGTA N GTA C TCAATGATCAGCT ATCGGTAGCCAT G CAT G AGTTACTA ATCGGTAGCCAT C CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel A A ATCGGTAGCCAT T CAT G AGTTACTA ATCGGTAGCCAT A CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel B B DNA Mikrodizin -4 -2 -1 0 1 3 4 • • • • 7 Prob Çift Seti (Kuartet) SNP başına 56 olasılık Oryantasyon başına 28 Dağıtılmış yerleşim PM A MMA Düz zincir PM B MMB 5’ 3’ 3’ 5’ PM A MMA PM B MMB Ters zincir DNA Mikrodizin 1 2 3 4 5 6 7 PMA PMA PMA PMA PMA PMA PMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA PMB PMB PMB PMB PMB PMB PMB MMB MMB MMB MMB MMB MMB MMB • 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP’yi temsil etmek üzere seçilir. • Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP’nin varlığını hem düz hem de ters zincirde inceler. • Tek bir TNP’yi sorgulamak üzere toplam 40 prob kullanılmaktadır. Tek Primer Amplifikasyonu ile Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması DNA Mikrodizin 250 ng Genomik DNA Xba Xba Xba RE muamelesi Adaptörün bağlanması Tek primer ile amplifikasyon 4 PCR Reaksiyonu Fragmentasyon ve işaretleme Hibridizasyon Ve Tarama DNA Mikrodizin Mikrosatellit 10K # Marker 400 10,000 Çözünürlülük 10 cM (10 MB) 1 cM (1 MB) * # PCR Reak/örnek # PCR Primer/örnek 200 (2x multipleks) 800 Süre (400 örnek) > 8 hafta 4-6 hafta Belirteç başına DNA Deney başına DNA 40 ng 16,000 ng .025 ng 250 ng 4 1 DNA Mikrodizin Farklılıklar 100k 10K Dizin sayısı 2 1 Enzim sayısı 2: Xba1 ve HindIII 1: Xba 250 ng X2 enzim = 500 ng 250 ng PCR Amplifikasyon Boyutu 250-2000bp 250-1000bp Fragmente edilecek miktar 40ug 20ug Yüksek çözünülürlüklü tarama Rutin tarama 0.06U/uL 0.048U/uL DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2.0 Asosiyasyon çalışmaları Bağlantı Başlangıç DNA miktarı Tarama Fragmentasyon reaktifinin konsantrasyonu Algoritma ve yazılım Ana uygulama alanı Kamu TNP’ler Perlegen ve Kamu DNA Mikrodizin DNA Mikrodizin DNA Mikrodizin DNA Mikrodizin <> <> Resequencing Tiling Strategy A ATCGGTAGCCATACATGAGTTACTA T ATCGGTAGCCATTCATGAGTTACTA C ATCGGTAGCCATCCATGAGTTACTA 12 bases G ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA TAGCCATCGGTAGGTACTCAATGAT A TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT T TAGCCATCGGTATGTACTCAATGAT C TAGCCATCGGTAAGTACTCAATGAT G Resequencing Tiling Strategy TCGGTAGCCATGAATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGCATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGGATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGTATGAGTTACTAC ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA AGCCATCGGTAGATACTCAATGATG AGCCATCGGTAGCTACTCAATGATG AGCCATCGGTAGGTACTCAATGATG AGCCATCGGTAGTTACTCAATGATG Resequencing Tiling Strategy CGGTAGCCATGCATGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCCTGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCGTGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCTTGAGTTACTACA ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA GCCATCGGTACGAACTCAATGATGT GCCATCGGTACGCACTCAATGATGT GCCATCGGTACGGACTCAATGATGT GCCATCGGTACGTACTCAATGATGT Resequencing Tiling Strategy GGTAGCCATGCAAGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCACGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCAGGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCATGAGTTACTACAG ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA CCATCGGTACGTACTCAATGATGTC CCATCGGTACGTCCTCAATGATGTC CCATCGGTACGTGCTCAATGATGTC CCATCGGTACGTTCTCAATGATGTC Resequencing Tiling Strategy GTAGCCATGCATAAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATCAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATGAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATTAGTTACTACAGC ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA CATCGGTACGTAATCAATGATGTCG CATCGGTACGTACTCAATGATGTCG CATCGGTACGTAGTCAATGATGTCG CATCGGTACGTATTCAATGATGTCG Resequencing Tiling Strategy TAGCCATGCATGAGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGCGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGGGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGTGTTACTACAGCT ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA ATCGGTACGTACACAATGATGTCGA ATCGGTACGTACCCAATGATGTCGA ATCGGTACGTACGCAATGATGTCGA ATCGGTACGTATTCAATGATGTCGA A C Düz zincir G T T C G C A CustomSeq™ Resequencing Dizinleri A C G T AGCGT A C G T ACCGT • Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb. CustomSeq™ Deney Protokolü Kontrol Kalıp/Primerler Genomik DNA Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR Miktar tayini-Örneklerin Karıştırılması Fragmentasyon reaktifi Fragment Đşaret Hibridizasyon için oligo kontrolleri Hibridizasyon Veri analizi Deney Akışı Đlgilenilen genlerin belirlenmesi Genomik Genomik DNA Karıştırma ve Fragmentasyon Fragment asyon DNA fragmentleri fragmentleri PCR Ürünleri Đşaretleme Geceboyu hibridizasyon B B B B Tarama Yıkama Đstasyonu: Đstasyonu: Yıkama/Boyama B B B Sondan işaretli fragmentler Affymetrix CustomSeq™ Arrays 2.5 Days Biological Sample >chr21:29595444-29636248 gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaat tttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtc tcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgctg ggagtacaggcatgagccaccgcacccggcctgtatatcttttttaaa aggaaaagaacatatcccagaagtttccaactgagtttccctctgggt caataccagaattgggtgggggtcttcagctcacccctaaactcatca ttgataagcagaatgaatgaccatggctggtttagaca………. ~30 Kb Probe Array Wash & Stain Scan DNA Analiz Yazılımı Cihaz Kontrolü .DAT dosyasının oluşturulması GCOS .CEL dosyasının oluşturulması .CHP dosyasının oluşturulması .CHP veri karşılaştırılması GeneChip DNA Analysis Software 2.0 (GDAS)
