PCR

In vitro DNA AMPLİFİKASYONU
PCR
Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR
In vitro DNA Amplifikasyonu
1- Moleküler klonlama, DNA parçalarının, bakteri gibi basit yapılı
organizmalarda çoğaltılmasıdır.
Bu yöntemde çoğaltılacak hedef DNA,
vektör adı verilen ekstra kromozomal DNA molekülüne
(plazmid) transfer edilir.
Oluşan rekombinant plazmid ise uygun bir bakteri hücresine
sokularak bakterinin çoğaltılmasıyla in vivo olarak amplifiye
edilmiş olur
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR
2. DNA’nın çoğaltılabileceği bir teknik, 1983 de Kary Mullis
adlı bir biyokimyacının geliştirdiği Polimeraz Zincir
Reaksiyonu’dur. İlk kez başarılı in virto DNA
amplifikasyonu Saiki ve ark. Tarafından 1985 yılında
gerçekleştirildi.
Kary Mullis c1983
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html
• Amplifikasyon yöntemlerinin gelişmesinde
iki önemli nokta
– termofilik Thermus aquaticus ‘tan ısıya stabil DNA
polimeraz
– bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarının
geliştirilmesi
PCR’nun Kullanıldığı Alanlar
PCR’nin geliştirilmesi, moleküler biyoteknolojinin ve kullanım
alanının da genişlemesine yol açmıştır
•Moleküler biyoloji ve biomedikal araştırmalar
•Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalık etkenlerinin teşhisi
•Gıda, su ve yiyeceklerde bulunan mikroorganizmaların tanısı
•Genetik bozukluklar ve kanser taramaları
Prenetal tanı ve cinsiyet belirlenmesi
Gen tedavisi ve DNA aşıları
Adli tıp’da suçlu teşhisi
Antropoloji
PCR’nun Çalışma Prensibi
PCR küçük volumlar halinde hazırlanır
(0.5 ml’lik mikrofüj tüpüne, 100 ml hacminde materyal konur)
PCR
için gerekli malzemeler:
1- Hedef diziyi taşıyan kalıp DNA
(az miktarda ve ilgisiz DNA’larla kontaminasyon sorun
değildir)
2- Kalıp DNA çift iplikleri ile eşleşebilen 2 tür
oligonükleotid primeri
3- Dört tür dNTP
(15-30 bazlık ve tek iplikli)
(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
4- Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq, Vent)
Bu materyaller bir tampon çözeltisi içinde karıştırılır.
MgCl2 gereklidir.
Thermal Cycler adı verilen özel bir cihaz kullanılarak
DNA’nın amplifikasyonu gerçekleştirilir.
Bu cihaz, PCR örneğini programlanan ısı derecelerinde ve
istenilen sürelerde tutmaya yarar.
Her bir PCR döngüsü üç aşamada gerçekleştirilir.
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu (95 oC de 5 dak.)
ds DNA’ nın birkaç saniyede ısı ile ss DNA’ ya ayrılmasıdır.
(döngüye başlamadan 3-5 dk ön ısıtma yapılabilir)
2- Primerlerin bağlanması
(42-52 oC de 5 dak.)
örnek 1-2dk bu ısıda tutularak primerlerin (spesifik sentetik
oligonükleotitler) ss DNA’ daki hedef bölgelere hibridizasyonu sağlanır.
3- Polimerizasyon
(65-72 oC de 5 dak.)
polimeraz enzimi yardımı ile ss DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’ 3’
yönde uzatılmasıdır.
Her döngüde elde edilen yeni DNA’lar bir sonraki için kalıp görevi
gördüklerinden, 25-30 döngü sonunda, DNA’nın milyonlarca kopyası elde
edilir.
• Taq DNA polimeraz optimal uzama
sırasında yani 72-78 °C arasında 2000
nükleotid/dakika hızında çalışır.
Polymerase Chain Reaction
• In vitro DNA (gene) amplifikasyon tekniği
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
DNA
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
>90°
Polymerase Chain Reaction
5’
3’
40–60°
3’
5’
Polymerase Chain Reaction
5’
3’
72°
3’
5’
Polymerase Chain Reaction
5’
5’
5’
3’
3’
3’
>90°
40–60°
72°
3’
3’
3’
5’
5’
5’
Polymerase Chain Reaction
5’
3’
>90°
40–60°
72°
3’
5’
Polymerase Chain Reaction
>90°
40–60°
72°
Polymerase Chain Reaction
2n x
PCR: 3 steps
PCR’nun Avantajları

Çabuk

Duyarlı

Yüksek özgüllüğe sahip
PCR’nun Dezavantajları

Pahalı

Kros reaksiyonlar/non-spesifik DNA
amplifikasyonu  Sterilite

Yalancı pozitif/negatif değerlendirme 
Deneyimli personel
Her teknikte olduğu gibi PCR’da da optimizasyon şarttır.
Yüksek özgüllüğü ve duyarlılığına rağmen;
düşük ürün miktarı
primerlerden kaynaklanabilen non-spesifik ürün eldesi
kontaminasyon sonucu yalancı pozitif sonuçlar
gibi sorunlar yaşanabilmektedir.
İyi bir teknik kadro ve pozitif/negatif kontroller kullanılarak bu
sorunlar giderildiği taktirde PCR, biyoteknologların hayatını
kolaylaştıran bir tekniktir.
PCR ile Saptanan Bakteriyel Patojenler
•Bacillus antracis
•Corynebacterium diphtheriae
•Shigella sp
•Vibrio cholerae
•Mycobacterium avium
•Mycobacterium tuberculosis
PCR ile Saptanan Viral Patojenler
•Hepititis A,B,C,E,G
•İnsan papillomavirus
•HIV-I,II
•Influenza virus
•Rubella virus
•Herpes simplex virus
PCR ile Saptanan Fungal Patojenler
•Blastomyces dermatitis
•Histoplasma capsulatum
•Candida albicans
•Pneumocyctis carinii
PCR ile Saptanan Protozoal Patojenler
•Plasmodium falciparum
•Leishmania sp
•Toxoplasma gondii
•Trypanosoma sp.
Amplifikasyon Ürünlerinin Tespit
Edilmesi
• PCR ile amplifiye edilen DNA’yı tespit
etmenin bir yolu :
»Elektroforez
Elektroforez prensibi
Cathode
Anode
powder
+ ion
• DNA proteinler ve birçok biyomoleküller gibi
elektriksel yük taşır.
• DNA negatif yüklüdür.Bu nedenle anoda doğru
hareket eder.Yükleme katod tarafına
yapılmalıdır.
• DNA molekülleri şekilsel ve elektrik yükü
bakımından benzer olduğundan elektroforez
kriterlerine göre ayrılmaz
• DNA molekülleri büyüklüklerine göre ancak bir
jel içinde ayrılabilirler.
• DNA molekülleri genellikle agaroz ya da
poliakrilamid jel içinde elektroforez edilir.
• Jellerin içerisinde DNA moleküllerinin girip
hareket edebilecekleri porlar vardır.
• Elektroforez ile ayrılan DNA’ yı görmek için
ise etidyum bromid ile boyanır.(UV boya)
PCR - analizi
Jel-elektroforez
PCR: Viral detection
Tüm Aşamaları Özetleyecek
Olursak
Thermal Cycler
Elektroforez
3-4 hours
Ürinlerin değerlendirilmesi
(Agaroz jel)
UV translüminatör