Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler-3

6.3.2016
Moleküler Biyolojide Kullanılan
Yöntemler-3
• DNA ile yapılacak çalışmalarda moleküler biyoloji
tekniklerinin uygulanabilmesi için öncelikle yüksek molekül
ağırlıklı DNA molekülünün saf bir şekilde elde edilmesi
gerekmektedir.
• DNA izolasyonu yöntemlerinin belirlenmesinde;
 kromozom DNA’ sı
 ve kromozom dışı DNA’ lar (plazmid ve organel DNA’ ları)
olmak üzere iki temel grup temel alınmaktadır. Kromozom ve
plazmid DNA’ larının saflaştırma sırasında birbirinden
ayrılmasında DNA’ ların moleküler yapısı oldukça önemlidir.
• Nükleik asitlerin polarlıkları oldukça yüksektir. Bu yüzden polar
solventlerde çözünebilirler, apolar solventlerde ise çökmektedirler.
• Prokaryorlarda, DNA çift zincirli, halkasal yapıdadır ve sitoplazmada
bulunmaktadır.
• Eukaryotlarda, DNA çekirdekte, mitokondride ve kloroplastlarda
bulunmaktadır.




Çekirdek DNA’sı çift zincirli ve lineer;
mitokondri DNA’ sı ise, prokaryotlardaki gibi, çift zincirli ve halkasal.
Prokaryot DNA’ larına proteinler bağlı değildir,
fakat, eukaryotların çekirdek DNA’sına histon proteinleri bağlıdır.
DNA izolasyonu ve analizi
Bu amaçla birçok yöntem geliştirilmiş ancak hepsinde temel
prensip aynıdır. DNA izolasyon yöntemlerinde dört temel
aşama bulunmaktadır:
a) Hücrelerin ve membrana bağlı yapıların parçalanarak
DNA’ nın açığa çıkarılması
b) DNA’yı hidrolize eden enzimlerin inaktive edilmesi
c) Proteinlerin DNA’dan ayrılması ve denatürasyonu
d) DNA nın solventlerle ekstraksiyonu ve çöktürme ile
konsantre edilmesi
• DNA ve RNA’ nın N- glikozidik purin
ve pirimidin bağları düşük asidik ve
bazik ortamlara dayanıklıdır.
• Bununla beraber, RNA’nın
fosfodiester bağları, 37 oC’ de 0.3 M
KOH’ de parçalanarak 2’ ve 3’
fosforibonükleotitleri oluştururlar.
• DNA’ nın primer yapısı bu koşullarda
stabildir. Seyreltik asitlerde (0.1N
TCA, HCl veya HClO4) nükleik asitler
çökmektedirler.
1
6.3.2016
Tablo 1. Çeşitli hücre ve dokulara uygulanabilecek bazı parçalama teknikleri
• Hücrenin parçalanması, DNA ve RNA izolasyonundaki
ilk ve izole edilen DNA ve RNA’ nın verim ve kalitesini
etkileyen en kritik aşamalardan biridir.
• Hücre parçalanması hızlı ve etkili olmalıdır.
• Parçalama sonunda bağ dokusu ve kemik gibi katı
dokular dışındaki dokularda gözle görülen partiküllerin
bulunmaması gerekmektedir.
• Hücre ve doku parçalanmasında en uygun metodun
seçilmesi kalite ve verimin arttırılması bakımından
oldukça önemlidir. Kullanılan organizmanın türüne göre
parçalama metodu seçilmektedir.
Teknik
Materyal tipi
Nazik
Ozmotik şok
Eritrositler
Enzim uygulaması
Bakteriler, mayalar
Deterjan uygulaması
Doku kültürü hücreleri
El homojenizatörü (veya havan)
Karaciğer vb. yumuşak dokular
Doğrama (kesme, parçalama)
Kas vb. dokular
Orta şiddette
Bıçaklı homojenizatör
Hayvansal ve bitkisel dokular
Kum, alümina vb ile ezme
Bitkisel dokular bakteriler
Sert
Fransız basınç hücresi
Bitkisel dokular, bakteriler
Ultrasonikasyon
Hücre süspansiyonları
Bilyeli mil
Hücre süspansiyonları
Manton Gaulin homojenizatörü
Hücre süspansiyonları
• İzolasyonda hem eukaryotik hem de prokaryotik hücrelerden
ayrılması gereken moleküller proteinler ve RNA’dır.
•
Fenol ve kloroform nükleik asitleri proteinlerden ayırmak amacıyla
kullanılmaktadır.
 Proteinler organik çözücüler ve deterjanlarla denatüre edilmekte;
 RNA ise RNaz ile parçalanmaktadır.
 DNaz aktivitesini inhibe etmek için EDTA kullanılır.EDTA Mg++
iyonlarıyla şelat oluşturarak ortamdan uzaklaştırır.
•
Kloroform, izoamil alkolle (izoamil alkol köpük önleyici olarak kullanılır)
birlikte kullanılmaktadır.
•
Tris buffer, ortamın pH’ sını yükseltmektedir. DNaz’ ın inaktivasyonunu
sağlamak için pH 8 ve üzerinde çalışılmalıdır. Bunlar ayrıca, ortamdan
lipid ve polisakkaritlerinde uzaklaştırılmasını sağlarlar.
•
İzopropanol DNA’ çöktürülmesinde kullanılır.
•
Ayrıca sodyum ve amonyum tuzları da DNA’ nın çöktürülmesine yardımcı
olmaktadır. DNA’ nın son olarak çöktürülüp saflaştırılması ise etanol veya
diyaliz ile yapılmaktadır. Etanol düşük bç’ne sahip DNA’ larda kullanılır.
Diyaliz ise >200 bç olan DNA’larda uygulanmaktadır.
 Proteinleri denatürasyonu , SDS (sodyum dodesil sülfat), proteinaz
K, fenol ve organik çözücüler kullanılarak sağlanır.
o SDS güçlü bir deterjandır ve proteinleri DNA’ dan ayırıp
denatüre etmektedir.
o Proteinaz K, SDS ile aktif olan ve proteinleri 65 oC’ de
parçalayan bir enzimdir.
• İzolasyon aşamalarından sonra da farklı kaynaklı ya da
farklı özellikteki DNA moleküllerinin ayrılması
(fraksiyonlandırılması) gerekmektedir.
• Genomik DNA’ yı hücre lizatından ayırmada olduğu gibi,
tek ve çift zincirli DNA moleküllerini ve plazmid DNA’ sı ile
genomik DNA’ yı birbirinden ayırmada da, kromatografik
tekniklerden yararlanılabilir.
• Bununla beraber, jel elektroforezi yöntemi daha yüksek
ayırma gücü nedeniyle nükleik asitleri ayırmada en
yaygın kullanılan yöntemdir. Bu yöntemle molekül ağırlığı
103-108 Da arasında olan DNA moleküllerini ayırmak
mümkündür.
Bakterilerden Kromozomal DNA izolasyonu
Bakteri genomundaki DNA genellikle yüksek organizasyonlu canlılardaki
kromozom tanımına analog olarak kullanılır. Bu adlandırma bakteri genom
DNA’ sını bazı bakterilerde bulunan plazmid DNA’ sından ayırt etmektedir.
Organizma : E.coli veya B.subtilus
Gerekli Malzemeler:
 Luria Bertani (LB) besiyeri, pH 7.3
 Tripton %1
 Yeast ekstrakt % 0.5
 NaCl
%1
 Tris-EDTA tamponu (TE), pH 8.0
Tris HCl pH 8.0 10 mM
EDTA pH 8.0 1mM
2
6.3.2016










SDS % 10
Lizozim
Proteinaz K
20 mg/ml
NaCl
5M
CTAB (setil trimetil amonyum bromür) / NaCl
CTAB
% 10
NaCl
0.7 M
Kloroform / izoamil alkol 24:1 (v:v)
Fenol
Fenol/kloroform/izoamil alkol 25:24:1 (v:v:v)
İzopropanol
Etanol %70
Yöntem
1) 5 ml LB besiyerine tek koloniden ekim yapılır. 150 dev/dak hızda, 37 oC’ de
bir gece boyunca çoğaltılır.
2) Bir gecelik 5 ml bakteri kültürünün 1.5 ml’ si mikrosentrifüjde (10000
dev/dak hızda 5 dak) çöktürür.
3) Üst sıvı uzaklaştırıldıktan sonra çökelti 567 l TE tamponu içerisinde
mikropipet yardımıyla çözündürülür.
4) Çözelti içerisine 30 l SDS ve 3 l proteinaz K çözeltileri eklenerek karıştırılır
ve 37oC de 1 saat bekletilir. Bu aşamada hücreler lizis olur ve tüp içindeki
sıvı saydamlaşır.
5) 100 l 5 M NaCl eklenerek karıştırılır. Daha sonra 80 l CTAB/NaCl çözeltisi
eklenir ve karıştırılıp 65 o C’ de 10 dak tutulur.
6) Üzerine eşit hacimde kloroform/izoamil alkol eklenir ve karıştırılır. 10000
dev/dak hızda 5 da sentrifüjlenir.
7) Üst faz temiz bir mikrosentrifüj tüpüne alınır ve eşit hacimde
fenol/kloroform/izoamil alkol karışımından eklenerek karıştırılır. 10000
dev/dak hızda 5 dak sentrifüjlenir.
8) Üst faz dikkatli biçimde temiz bir mikrosentrifüj tüpüne alınır ve 0.6 hacim
izopropanol eklenir. DNA çökünceye kadar karıştırılır. Bu aşamada tüp
altüst edilerek yavaş şekilde karıştırılırken DNA’ nın iplikçikler şeklinde
çökeldiği gözle görülebilir.
9) DNA, 15000 dev/dak hızda 10 dak sentrifüjlenerek çöktürülür.
10) Çökelti üzerine 50 l % 70 etanol eklenerek DNA yıkanır ve tüp hemen ters
çevrilerek alkol uzaklaştırılır.
11) Tüp ağzı açık durumda oda sıcaklığında 10-15 dak veya 60 oC’ de birkaç
dak bekletilerek alkol tamamen uçurulur.
12) Çökelti üzerine 50-100 l TE eklenir ve tüpe parmakla yavaşça vurularak
DNA çözündürülür.
• İzole edilen DNA 4 oC’ de uzun süre saklanabilir.
Bitkilerden kromozom DNA’ sı izolasyonu
Materyal: taze yaprak dokusu
Gerekli malzeme
2-ME/CTAB ekstraksiyon tamponu pH 8.0
CTAB
%2
Tris-HCl pH 8.0 10 mM
EDTA pH 8 20 mM
NaCl 1.4 M
2- Merkaptoetanol (2-ME) %2
CTAB/NaCl çözeltisi
Kloroform:izoamil alkol 24:1
CTAB çöktürme tamponu pH 8.0
CTAB
%1
Tris-HCl pH 8.0
50 mM
EDTA pH 8
10 mM
Yüksek tuz içerikli TE tamponu
Tris HCl pH 8 10mM
EDTA pH 8 0.1 mM
NaCl
1M
Etanol
%80
İzopropanol
TE tamponu pH 8
3
6.3.2016
Yöntem
6)4. aşama tekrarlanır.
1) Materyalin miktarına göre uygun hacimdeki 2-ME/CTAB ekstraksiyon
tamponu ile CTAB/NaCl çözeltisi su banyosunda 65 oC’ ye kadar ısıtılır.
2) Daha önceden –20 oC’ de soğutulmuş doku parçalayıcı alette toz haline
getirilen doku tüp veya beher içerisine alınarak tekrar –20 oC’ de
dondurulur.
7) Üst faza eşit hacimde CTAB çöktürme tamponu eklenir ve altüst edilerek
karıştırılır. Eğer çökelti görünür ise 8. aşamaya geçilir, henüz gözlenmiyorsa
65 oC’ de 30 dak beklenir.
8) 2700 dev/dak hızda, 5 dak 4 oC’ de sentrifüjleme yapılır.
3) Kullanılan materyale uygun miktarda ısıtılmış 2-ME/CTAB ekstraksiyon
tamponu eklenir ve aralıklı olarak karıştırılarak 65oC’ de 20 dak tutulur.
9) Üst sıvı uzaklaştırılır ve çökelti yüksek tuz içerikli TE tamponunda (0.5/1 ml/g
başlangıç materyali) çözündürülür.
4) Eşit hacimde kloroform/izoamil alkol (24:1) eklenir ve karıştırılır. 10.000
dev/dak hızda 4oC’ de 5 dak sentrifüjlenir.
10) DNA’ nın çökmesi için 0.6 hacim izopropanol eklenerek karıştırılır ve
10.000 dev/dak hızda, 15 dak 4 oC’ de sentrifüjlenir.
5)Üst faza 1/10 hacimde 65oC’ de ısıtılmış CTAB/NaCl çözeltisi eklenir ve altüst
edilerek karıştırılır.
11) Çökelti %80 etanol ile yıkanır ve TE içerisinde çözündürülür (0.5/1 ml/g
başlangıç materyali) ve 4 oC’ de saklanır.
Plazmit DNA sı izolasyonu
• Plazmitlerin rekombinant DNA teknolojisi
çalışmalarında vektör olarak geniş çapta
kullanılmaları plazmit izolasyon yöntemlerinin
geliştirilmesine yol açmıştır. Çeşitli izolasyon
yöntemleri arasında basit ve verimi en yüksek
olan yöntemlerden biri aşağıda verilmiştir.
• Fenol:kloroform:izoamil alkol
• 0.2 M potasyum asetat
25:24:1
• Yöntem:
• 1) E. Coli taşıdığı plazmitte bulunan
antibiyotiğe direnç geninin çeşidine göre, o
antibiyotiği yaklaşık 50 ug/ml olarak içeren 5
ml LB besiyerinde, 150 dev/dak hızda 37 C de
1 gece boyunca üretilir.
Materyal: E. Coli içinden bulunan herhangi bir plazmit
Gerekli malzemeler:
• Lizis tamponu, PH 8.0
Glukoz 50 Mm
Tris HCl 25 mm
EDTA 10 mm
• Alkali SDS çözeltisi
NaOH 0.2 N
SDS %1
5 M potasyum asetat
Etanol
TE tamponu, PH 8.0
RNaz A 20 mg/ml
2) Bir gecelik kültürdeki hücreler 7000 rpm’de 10 dak santrifüjlenerek
toplanır ve 100 ul lizis tamponunda süspansiyon haline getirilir.
3) 5 dak oda sıcaklığında bekletildikten sonra 200 ul alkali SDS çözeltisinden
eklenir ve yeniden 5 dak oda sıcaklığında tutularak hücrelerin
parçalanması ve genomik DNA’nın denatürasyonu sağlanır.
4) Parçalanmış hüücrelerden oluşan lizat üzerine 4 C’de soğutulmuş 150 ul 5M
potasyum asetat eklenerek 5 dak buz içerisinde beklenir
5) 13000 rpm’de yapılan santrifüjleme sonucu üst sıvıda kalan plazmid
fraksiyonuna 1 ml etanol eklenir.
6) 13000 rpm’de 20 dak oda sıcaklığında santrifüjlenerek plazmid DNA’sı
çöktürülür.
7) Çökelti 50 ul TE tamponunda çözündürülür ve 4 ul RNaz A eklenerek 37
C’de 1 saat bekletilir.
4
6.3.2016
Plazmitler
8) Toplam hacim TE ile 400 ul’ye tamamlanıp eşit
hacimde fenol kloroform/izoamilalkol
eklenerek alt üst edilerek karıştırıldıktan sonra
5 dak oda sıcaklığında 13000 rpm’de
santrifüjlenir.
9) Üst faz temiz bir tüpe alınarak 1 ml 0.2 M
potasyum asetat eklenir ve -20 C’de 1 saat
bekletilir.
10) 20000 rpm2de 20 dak santrifüjlenir (4 C’de)
ve 50 ul TE tamponunda çözündürülür.
Hücre içinde kromozomal DNA’dan ayrı olan halkasal yapıdaki
DNA’lardır.
Bakterilerde doğal olarak bulunur. Ökaryotlarda ise nadiren bulunur
(S. Cerevisiae).
Plazmitler bakterilerin üremesi için gerekli olan genleri taşımazlar;
buna karşılık bakteriye uygun olmayan ortam koşullarında
yaşayabilme, çeşitli toksik maddeler üretme ve metabolize
edebilme, antibiyotiklere dirençlilik ve antibiyotik sentezini
gerçekleştirebilme, patojen özellik kazandırma gibi nitelikleri
sağlayan genleri içerirler.
26
• Plazmitler konak kromozomundan bağımsız replikasyon
yaparlar.
• Kendi replikasyonları için gerekli genlerin dışında konaklarına
bazı özellikler kazandıran çeşitli genleri de taşırlar (genellikle
antibiyotik ve çeşitli metallere direnç genleri)
• plazmitlerin çoğu doğal vektörlerdir (türler arasında Yatay gen
transferi sağlar).
Plazmitlerin klonlama vektörü olarak
kullanılmalarının nedenleri:
1) Küçük olmaları DNA’nın izolasyonunu ve
manipülasyonunu kolaylaştırır.
2) Bağımsız replikasyon orijinlerinin olması
3) Çoklu kopya halinde bulunmaları, hücrede birkaç
kopya halinde bulunabilirler.
4) antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir işaretlerinin
bulunması, plazmit içeren klonların
saptanmasını ve seçilmesini kolaylaştırır
• Küçük genleri klonlamakta kullanılır (1-20 kb)
28
DNA’nın analizi
Nükleik asitlerin nanogram veya mikrogram düzeyindeki
miktarlarının belirlenmesi, moleküler biyoloji alanında çalışan
araştırıcılar için temel noktalardan biridir.
Genellikle izole edilen DNA’ların miktar tayininde absorbsiyon
temeline dayanan spektrofotometrik yöntemler kullanılır.
Nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde veya özgün
dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz enzimlerinin
etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki DNA parçalarının
saptanmasında elektroforetik yöntemler kullanılmaktadır.
1. Spektral yöntemler
Nükleotitler 260 nm dalga boyunda maksimum absorbsiyon
gösterirler
Bu nedenle 260 nm’de ölçülen absorbans değerleri (A260) oldukça
saf olarak izole edilen nükleik asitlerin ug düzeyinde
miktarlarının belirlenmesinde kullanılır.
Çift zincirli DNA molekülleri için 1 optik yoğunluk 50 ug/ml ye
karşılık gelmektedir. Buna göre çift zincirli DNA için miktar
belirlenmesinde şu formül kullanılır:
DNA (ug/ml) = A260 x sulandırma oranı x 50
5
6.3.2016
• 260 ile 280 nm dalga boylarında okunan değerler arasındaki oran nükleik
asitlerin saflığı hakkında bilgi vermektedir.
• Proteinler 280 nm’de absorbsiyon özelliği gösterirler. Bu nedenle 280 nm
de ölçülen değerdeki artış A260/A280 oranında düşmeye neden olur.
• Saflaştırılmış DNA’da A260/A280 oranı yaklaşık 1.75-1.80 in üzerinde
olmalıdır.
• 325 nm de ölçülen değer DNA çözeltisinde partikül bulunduğunu veya
ölçümde kullanılan kuvetin kirli olduğunu; 230 nm’deki değer ise nükleik
asit çözeltisi içinde peptitlerin veya fenolün bulunduğunu gösterir.
• Ölçümlerde UV geçirgen kuvartz küvetler kullanılmalı. Cam veya plastik
küvetler kullanılmaz
Elektroforetik yöntemler
• Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentlerinin (5500 baz çifti) ayırımında kullanılır.
• DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir
alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı;
 molekülün büyüklüğüne,
 yapısına,
 jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna
 ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.
• Bu jellerin ayırım gücü çok yüksek olduğundan boyutları
birbirine yakın DNA fragmentlerinin analizleri için daha
uygundur.
• Poliakrilamid jelleri hazırlamak zor ve uzun süre alır.
• Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde molekülleri birbirinden
ayırmak için kullanılır.
• Uygulanacak DNA’nın yüksek konsantrasyonda olması
gerektiğinde agaroz jel elektroforezi kullanılır.
• Destekleyici madde poliakrilamid veya agaroz olabilir
Agaroz jel elektroforezi
•
DNA’nın analizinde tüm laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan en basit
yöntemlerden bir agaroz jel elektroforezidir.
•
Yöntemin avantajı basit ve hızlı olması, ayrıca DNA fragmentlerinin birbirinden
ayrılmasını sağlamasıdır.
•
UV ışık altında floresan etki gösteren etidium bromür boyasının kullanımı ile çok
düşük konsantrasyonlarda (1-10 ng) DNA fragmentinin yerini belirlemek
mümkündür
• Agaroz kırmızı bir alg türü olan agar agar dan elde edilen doğrusal bir
polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde
karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur.
• Agaroz konsantrasyonu % 0.5-1.5 arasında değiştirilerek jelin por çapı
ayarlanabilir.
• Küçük DNA fragmentleri için yüksek , büyük DNA fragmentleri için düşük
agaroz kons. kullanılarak DNA’nın jelde uygun şekilde yürümesi sağlanabilir.
35
36
6
6.3.2016
Agaroz jel elektroforezinin yapılışı
•
•
• DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi
etidyum bromürün DNA bağları arasına
bağlanarak 300 veya 360 nm de ışığı
absorblaması sonucu florosan etki göstermesi
ile olur. Bu etki DNA konsantrasyonuna bağlı
olarak kuvvetli veya zayıf olabilir.
Agaroz
Tris-asetat (TAE) tamponu ph 8.0 (50x/l)
242 g trisma base
57.1 ml glasiyel asetik asit
100 ml 0.5 M EDTA (PH 8.0)
Tris-borat (TBE) tamponu, PH 8.0 (5x/l)
54 g trizma base
27.5 g borik asit
20 ml 0.5 M EDTA (PH 8.0)
Yükleme tamponu : bromofenol blue, BB
4 M üre
0.025 M EDTA
%60 sakkaroz
% 0.025 bromofenol blue
% ksilen
Agaroz jelin hazırlanışı
• TE tamponu, PH 8.0
10 MM tris-HCl
1 mm EDTA, PH 8.0
Etidium bromür (10 mg/ml)
1) Kullanılacak jelin büyüklüğüne göre tartılan agaroz TBE veya
TAE tampon içerisinde kaynatma yolu ile (mikrodalga veya
ateş üzerinde) çözündürülür
2) Elle tutulabilecek sıcaklığa (50-55 C) düştüğünde 0.5 ug/ml
etidium bromür ilave edilir
3) Kenarları kapatılmış cam veya özel yüzeyler üzerine, sızıntı
olmamasına dikkat edilerek dökülür.
4) Cepleri oluşturacak tarak yerleştirilerek donması beklenir.
Etidium bromür karanlıkta ve buzdolabında
saklanmalıdır
5) Tarak dikkatlice uzaklaştırılarak jel elektroforez tankına
yerleştirilir.
6) Jeldeki cebin büyüklüğüne göre izole edilen DNA
solüsyonundan alınarak BB eklenir (genellikle 1/6
hacimde).
İlk cebe daima büyüklüğü bilinen standart (marker)
yüklenir.
7) Tüm sıvı pipet yardımıyla jele yüklenir. Jelin üzerine
tampon çözeltisi eklenir. Tampon jeli kaplamlalıdır
7
6.3.2016
8) 50 V civarında akım geçirilir. Akım miktarı fragmentlerin boyutuna bağlı
olarak değiştirilebilir.
• 9) Sürenin sonunda jel UV (300 nm) ışık
altında standartlarla karşılaştırılarak
fragmentlerin boyutları belirlenir.
• Floresan etki DNA konsantrasyonuna bağlı
olarak kuvvetli veya zayıf olabilir.
• nükleik asitler jel boyunca hareket ederler.
• Nükleik asitler negatif yüklü olduğu için katottan anota doğru hareket
eder.
• Küçük moleküller büyük moleküllerden daha hızlı hareket ederler.
Etidium bromür mutajendir. Çalışırken mutlaka eldivenle çalışılmalı.
Çalışılan bölge sadece bu analiz için ayrılmalı. Analiz sonrası Etbr’ün
inaktivasyonu yapılmalı (Na hipoklorit ile)
• Böylece agaroz jel elektroforezinde DNA fragmentleri boyutlarına göre
ayrılırlar.
Restriksiyon enzimleri
DNA’nın enzimatik kesimi
• Prokaryotik hücreler DNA’yı kimyasal olarak değiştirebilen bir
veya daha fazla enzim içerirler.
• DNA’nın enzimatik kesimi restriksiyon
endonükleazları yardımıyla yapılır.
• Bu enzimlerin önemli bir sınıfı kısaca restriksiyon enzimleri
olarak bilinen restriksiyon endonükleazlardır.
• Bu sistemler prokaryotlar arasında geniş yayılımlar
göstermesine karşın ökaryotlarda çok nadir olarak bulunurlar.
• Restriksiyon enzimleri (RE) özel DNA dizilerini tanıyarak DNA’yı
keserler.
46
• RE hücre içine yabancı bir DNA girişine karşı bir savunma
mekanizması (virüslere karşı) oluştururlar
•
Hücre içine yabancı DNA girişine karşı savunma mekanizması iki bileşenden oluşur:
1 Restriksiyon endonükleazlar: Kısa ve simetik bir DNA sekansını tanırlar ve sekansın içinden
herbir ipliği spesifik bir noktadan keserler.
Dolayısıyla DNA kısa fragmentlere parçalanır.
• Hücrede önemli rol oynamalarının yanında restriksiyon
enzimleri in vitro DNA çalışmaları için de zorunludur.
2) Modifikasyon: Hücresel DNA’da aynı tanıma sekansları içindeki bir C veya A bazına metil
grubu ilave eden metilazdır.
Bu modifikasyon konak hücre DNA’sının dirençli olmasını sağlayarak endonükleazlarla
parçalanmasını önlerler.
• Bunların keşfi genetik mühendisliği alanının doğuşuna imkan
vermiştir.
• 1970’lerde DNA klonlamasının gerçekleşmesi RE’inin bulunuşu
ile olmuştur.
47
48
8
6.3.2016
3 tip RE vardır : Tip l, Tip ll, Tip lll
• Tip I ve Tip lll RE hem restriksiyon hem de metilasyon aktivitesine
sahiptirler. Her ikisi de DNA’yı tanıma bölgelerinin dışında bir yerden
keserler.
• ATP enerjisine ihtiyaçları vardır (tanıma bölgesinden kesim bölgesine
hareket etmek için).
• Tip l ve tip lll klonlamada kullanılmaz
• Moleküler biyolojide Tip II RE bu enzimler kullanılır. Tam
hedef nükleotitten kesim yaptıkları için klonlama ve
moleküler biyoloji araştırmaları için önemlidir.
Tip II RE sadece restriksiyon (kesme) aktivitesine sahiptirler. Modifikasyon
başka bir enzim tarafından gerçekleştirilir
• DNA’yı tanıma bölgesinden keserler. Bunun için ATP enerjisine ihtiyaçları
yoktur.
• Mg+2 iyonlarına ihtiyaç duyarlar
49
Tip II RE
50
RE kesim sonucunda DNA’da oluşturdukları uçların motiflerine göre iki alt
gruba ayrılırlar
• Mg+2 iyonları varlığında çift iplikli DNA üzerindeki palindromik dizileri
tanıyan ve bu diziler içindeki özel bir bölgeden kesen homodimerik
enzimlerdir.
• Yapışkan uç oluşturacak şekilde kesim yapanlar: Kesim yapılan
bölgelerde tek iplikli çıkıntılı yapı oluşmaktadır. Bunlara yapışkan uçlar
denir. Çünkü, bunlar tek iplikli kuyruklarının baz eşleşmesi ile aynı çıkıntı
uca sahip herhangi bir uca bağlanabilir.
• Tanıma bölgeleri palindromiktir ve 4-8 nükleotit uzunluktadır
Palindromik: Eğer zincirlerden biri
soldan biri sağdan okunursa aynı
diziye sahiptir ( veya ikisi de 5’-3’
veya 3’-5’ yönünde okunursa
aynıdır)
Daha sonra bu eşleşen zincirler
ligasyonla birbirlerine bağlanabilir.
Bu nedenle klonlama
çalışmalarında bu enzimler
kullanılmaktadır.
Homodimerik: Birbirine benzer iki
polipeptit alt ünitesinden
oluşmuşlardır.
51
Küt uçlu kesim yapanlar: İki zinciri de aynı
noktadan kesenler. Bunların ligasyon
etkinlikleri düşüktür.
• Klonlamada tercih edilmezler
52
• Kesim sonunda her zaman 5’ uçları fosfat
gruplarını korur.
53
54
9
6.3.2016
Bazı RE ve tanıma dizileri
• 6 bp’lik tanıma sekansı rastgele DNA dizisinde ortalama her
4096 (46) bp’de bir oluşacaktır. Bu nedenle büyük bir DNA
molekülü bu tip bir enzimle ortalama 4 kb’lık spesifik
fragmentlere kesilebilir.
• Günümüzde 600’den özel dizi tanıyan, yaklaşık 6000 RE
bilinmektedir.
• Genetik mühendisliği bakımından büyük öneme sahip
olduklarından yeni enzimler de araştırılmaktadır.
• HindIII ilk bulunan RE (1970)
• Ticari olarak yaygın bir şekilde bulunmaktadırlar.
55
56
Restriksiyon -modifikasyon sistemi
RE’lerinin isimlendirilmesi
•Pek çok RE farklı noktalardan kesim yaptığından ticari olarak karışıklığı önlemek için
enzimlerin isimlendirilmesi yapılmıştır.
•
İlk harf Bakteri cinsinin baş harfi
2. ve 3. harfler Türün adı
4. harf suşun adı:
5. rakam enzimin izole ediliş (bulunuş)sırası
•
•
•
Kısaltma
Anlam
Açıklama
E
Escherichia
cins
co
coli
tür
R
RY13
suş
I
İlk tespit edilmiş
O bakteride
tespit edilme sırası
57
Modifikasyon genleri, DNA üzerinde restriksiyon genleri ile yakın bölgede
bulunmaktadır. Bu nedenle bunlara restriksiyon modifikasyon genleri (R/M)
denilmektedir.
RE tanıdığı nükleotit dizilimlerini tanıyan metilaz enzimleri de vardır.
Metilazlar ortak tanıma dizilimlerini bir veya birkaç noktada metilasyona
uğratmaktadır (A veya C’e metil grubu eklerler).
Bu durumda, DNA metile olarak, metilaz enzimi için substrat olmaktan çıkar ve
korunmuş olur.
58
10