1.GİRİŞ Günümüzde hızlı endüştrileşmeye bağlı olarak çevre
advertisement
1 1.GİRİŞ Günümüzde hızlı endüştrileşmeye bağlı olarak çevre kirliliğinin giderek artması canlıların daha fazla fiziksel ve kimyasal etmene maruz kalmasına neden olmaktadır. Fiziksel ve kimyasal etmenlerin canlılar üzerindeki zararlı etkileri araştırmacıların son derece ilgisini çekmektedir. Toksik, mutajenik, kanserojenik veya teratojenik etkili olabilen bu etmenlerin zararlarını tespit etmek ve önlemler almak gerekmektedir. Bu amaçla çeşitli testler geliştirilmiştir. 1970’ten beri dünya genelinde yaklaşık 28 milyon kg pestisit etken maddesi piyasaya sunulmuştur. Bu da 900 aktif içerik ve 50000 ticari pestisit formülasyonunu kapsamaktadır (Pan American Health Organization, 2002). Zararlıları ve otları kontrol etmek amacı ile tarımsal alanlarda pestisitlerin kullanılmasının amacı; ürün verimini arttırarak, hasatta kayıpları düşürmektir. Zirai uygulamalarla beraber pestisitlerin halk sağlığında, temizlik işlemlerinde, kağıt yapımında, boyalarda ve yüzme havuzu sularında kimyasal karışımlar olarak kullanıldığı bilinmektedir (Al-Saleh 1994). Bu bileşiklerin birçok alanda, yüksek miktarda kullanılması çevre kirliliğine yol açmaktadır. Yoğun kullanımları sonucu pestisitlerin artıklarına ve metabolitlerine içme suları ve besinlerde rastlanmıştır (Al-Saleh 1994). Bu da kimyasalların insan vücuduna girip sağlığını etkileyeceği, genetik materyalde potansiyel tehlike oluşturacağı endişesini arttırmıştır (Ribas vd 1996). Tarımda pestisitlerin yüksek miktarda kullanılması, bu bileşiklerin farklı test sistemleri ile genotoksik açıdan değerlendirilmesini gerekli kılmaktadır. Birçok araştırıcı modern tarımda bitki zararlılarını kontrol etmek amacı ile kullanılan pestisitlerin mitotik ve mayotik hücre bölünmelerini etkilediği, insanlarda, hayvanlarda ve ekonomik önemi olan bitkilerde genetik hasara neden olduğunu bildirmişlerdir (Ribas vd. 1996, Agrawal vd. 1996, Chauhan vd. 1998, Cicchetti vd. 1999, Soloneski vd. 2002, Zeljezij ve Garaj-Vrhovac 2004, D’Souza vd. 2005, Chauhan ve Gupta 2005). Saflas vd. 1987’de ve Brown vd. 1990’da yaptıkları çalışmalara göre; insanların tarımsal kimyasallarla karşı karşıya kalması ile kanser sıklığındaki artış arasında bir ilişki bulunmaktadır (Ribas vd. 1996). 2 Brown ve Wu 1977’de Triasulfuron gibi sulfonylurea grubu ilaçlarından biri olan Chlorpropamide’in in vitro V79 Çin hamster hücrelerinde KKD sayısını arttırdığını (Renner ve Münzner, 1980), Watson vd. (1976) Chlorpropamide’in insan lenfositlerinde kromozom aberasyonlarına sebep olduğunu saptamışlardır. Renner ve Münzner 1980’de Çin hamster ve farede Chlorpropamide ve tolbutamide’in KKD’leri doza bağlı olarak arttırdığını aynı zamanda Chlorpropamide’in MN oluşumunu indüklediğini, fakat KA testinde yüksek konsantrasyonlarda bile negatif sonuç gösterdiğini saptamışlardır. Nokta mutasyonlarını gösteren Ames testinde Chlorpropamide ve Tolbutamide’in mutajenik olmadığı bildirilmiştir (Renner ve Münzner, 1980). Urea grubu herbisitlerinin birçoğu genotoksisite testlerinde negatif etki göstermesine rağmen bazıları pozitif etki göstermiştir. Seiler 1978’de Fluometuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumunu indüklediğini saptamıştır (Behera ve Bhunya, 1990). Isoproturon’un in vivo KA, MN ve sperm şekli anormallikleri testlerinde konsantrasyona bağlı mutajenik etkili olduğu, Diuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumunu indüklediği (Agrawal vd. 1996), Linuron’un insan lenfosit kültüründe MN sıklığını doza bağlı arttırdığı ve klastojenik olduğu bildirilmiştir (Papapaulou vd. 2001). Fiziksel ve kimyasal maddelerin DNA üzerindeki etkilerini görmek için in vivo ve in vitro testler kullanılır (Natarajan ve Obe,1982; Carrano ve Natarajan, 1988). Genotoksik ajanların canlılar üzerindeki sitogenetik etkilerinin anlaşılması için en önemli kriterler, bir maddenin kromozom aberasyonları (KA), kardeş kromatid değişimleri (KKD) ve mikronukleus (MN) oluşturabilme özelliğidir. KA’ları insanların genotoksik ajanlara maruz kalmasından sonra ortaya çıkan önemli biyolojik sonuçlardan birisidir (Obe vd. 2002). Bonassi vd. 1995’te, Hagmar vd. 1998’de yaptıkları epidemiyolojik çalışmalara göre; periferik kan hücrelerinde yüksek KA frekansı olan insanlarda yüksek oranda kanser gelişim riski bulunmaktadır (Obe vd. 2002). Özelliği bilinmeyen kimyasal maddelerin KA’larını indükleyebilmeleri açısından test edilmesinin mutajenik/kanserojenik maddelerin stratejik açıdan taranmasında önemi olduğu bildirilmiştir (Kirkland, 1998). Latt vd. 1981’de, Littlefield vd. 1982’de, Takehisa 1982’de yaptıkları çalışmalara göre; kardeş kromatid değişimleri (KKD) testi, mutajenik kanserojenleri belirlemek üzere kabul edilen hassas bir metottur (Morimoto vd. 1985). WHO 1993’te kardeş kromatid değişimlerinin, replikasyon sırasında kardeş kromatidlerin homolog 3 lokusları arasında resiprokal (karşılıklı) DNA değiş-tokuşlarından orijinlendiğini, tüm hücrelerde kendiliğinden ve belli oranda oluşmalarına rağmen, bazı kimyasal ve fiziksel ajanların DNA’da hasar oluşturarak KKD frekansında artışa sebep olduğunu bildirmiştir (Laffon vd. 2001). MN’lar hücre bölünmesi sırasında ana nukleuslara dahil olmayan tam bir kromozom veya asentrik kromozom fragmentlerinden oluşur. Sitokinezi-blok MN yöntemi; hücrelerin kimyasal ile etkilenmesinden sonraki sadece birinci bölünmede, yeni meydana gelen hücrelerin iki nukleuslu görünümleri ile MN’ların tanınmasını (Fenech ve Morley, 1985), MN tekniği sonunda elde edilen hücrelerin sayım kolaylığı; binlerce hücrenin sayılmasını, kimyasal muamele görmüş hücreler ile kontrol hücreleri arasında küçük farklılıkların belirlenmesini sağlar. Bundan dolayı Elhajouji vd. 1995 yılı çalışmalarına göre; MN testi ile çeşitli pestisitlerin ve ilaçların genotoksisite testlerinde klastojenik ve aneugenik etkili olabilecek seviyeleri tespit edilebilmektedir (Natarajan, 2002). Pestisitlerin en büyük grubunu oluşturan herbisitler istenmeyen bitkileri yok etmek amacı ile yaygın olarak kullanılan kimyasallardır. Modern tarımda çok önemli rol oynarlar ve büyük miktarlarda kullanılırlar. Triasulfuron, yıllık veya çok senelik geniş yapraklı veya otsu zararlıların kontrolü için herbisit olarak kullanımına izin verilen sulfonylurea bileşiğidir. Triasulfuron’un düşük akut toksisite gösterdiği ve genotoksisite çalışmalarında bu herbisitin klastojenik ve mutajenik olmadığı bildirilmiştir (EPA, 1998a). Triasulfuron’un Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarını, Çin hamsterlerinde MN testinde KA’larını, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde program dışı DNA sentezini (UDS) indüklemediği saptanmıştır (EPA, 1998a). 1000 ppm konsantrasyonlarında köpek (Ciba-Giegy, 1986a), tavşan (Ciba-Giegy, 1986b) ve sıçanda (Ciba-Giegy, 1985) toksik olduğu bildirilmiş, bu maddenin insan için kanserojenik potansiyeli olduğu konusunda tamamlanmış ve belirlenmiş bir çalışmaya rastlanmamıştır. Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, fare lenfoma, Çin hamsterleri ve insan fibroblastlarında Triasulfuron’un genotoksik etkisine bakılmış olmasına rağmen, kültürü yapılan insan lenfositlerinde KA, KKD, MN indüksiyonuna etkisi üzerine bir bilgi bulunmamaktadır. Tarımda otsu zararlılarla mücadelede kullanılan Urea’lar ile yapılan toksisite çalışmalarından çelişkili sonuçlar alınmış ve literatür çalışmalarında urea grubuna ait 4 Triasulfuron herbisitinin insan lenfositlerine etkisi üzerine bilgiye rastlanmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda kültüre edilen insan periferik kan hücreleri Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile muamele edilerek, KA, KKD, MN test sistemlerinde bu bileşiğin farklı genetik hasarların meydana gelmesi üzerindeki etkisinin araştırılması ve kimyasalın genotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda; Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi ile bu konudaki bilgi eksikliği giderilmiş aynı zamanda konsantrasyona bağlı etkisi gözlenerek hangi konsantrasyonlarda toksik veya genotoksik olabileceği saptanmış olacaktır. Dolayısı ile farklı test sistemlerinde, genetik aktivite profili ortaya çıkarılarak en düşük etkili konsantrasyonları hakkında bilgi edinilmiş olacaktır. Bu bilginin besinlerde kabul edilebilir kalıntı konsantrasyonlarını ve profesyonel kullanımda tehdit sınırlarını belirlemede yararlı olabileceğini umuyoruz. 5 2. GENEL BİLGİLER Her canlı türünün kendine özgü genetik bilgisinde gen rekombinasyonundan başka sebeplerle ve ani olarak meydana gelen kalıtsal değişmelere mutasyon denir. Mutasyonlar doğada kendiliğinden meydana geldiği gibi mutagen adı verilen fiziksel ve kimyasal etkenler tarafından da meydana getirilebilirler. Mutagenler DNA molekülünde çeşitli hasarlar oluştururlar. Bu hasarlar hücrede DNA onarım mekanizmaları tarafından onarılmaya çalışılır. Meydana gelen hasarların çoğu onarılmaktadır. Bazen hücrenin ölümden kurtulabilmesi için DNA’da meydana gelen hasar mecburen yanlış olarak onarılır. Ya da onarım mekanizmalarının çalışmasını kontrol eden genlerin mutasyona uğraması ile veya beslenme, ısı ve yaş gibi çevre şartlarının etkisiyle DNA’da meydana gelen hasar onarılmadan kalabilir. Bu durumda o hücrede mutasyon, buna bağlı olarak kanser oluşumu hatta hücre ölümü meydana gelebilir. Mutasyonlar bazen canlıda üstün bir karakterin ortaya çıkmasına neden olduğu halde genellikle canlılar için dezavantaj olan özellikleri ortaya çıkarmaktadır. Canlıların DNA’larında meydana gelen hasarlar; Ames testi, in vivo memeli fare kemik iliği kromozom aberasyon testi, in vivo memeli eritrosit mikronukleus testi, in vitro memeli hücre gen mutasyon testi, bakteri kullanarak yapılan geri mutasyon testleri ile belirlenmektedir. In vitro memeli kromozom aberasyon testi, kardeş kromatid değişimleri testi ve mikronukleus testi, DNA’da meydana gelen hasarın ve genotoksik etkilerin sitogenetik açıdan araştırılmasında kullanılan test yöntemleridir. 2.1. Kromozom Aberasyonları Kromozomların sayısı ve yapısındaki değişimlere kromozom aberasyonları (KA) denir. Kromatid kırık, kromozom kırığı, fragment, disentrik kromozom, halka kromozom, kardeş kromatid birleşmesi, translokasyon, inversiyon, izokromozomlar yapısal kromozom aberasyonlarıdır. Bazı araştırıcılar tarafından KA olarak kabul 6 edilmeyen ancak yine de bir anormallik sonucu oluşan yapısal bozukluklar ise gap, spiral çözülmesi, kromozom kontraksiyonudur. İlk defa 1918 yılında de Vries Oenothera’da translokasyon tipi anormalliklerin varlığını saptayarak, kromozom yapısında değişikliklerin meydana gelebildiğini göstermiştir. Morgan 1922’de ve Bridges 1923’te Drosophila’da translokasyon ve inversiyon tipi anormalliklerin olduğunu gözlemişlerdir. Delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon gibi kararlı aberasyonların Drosophila tükrük bezi kromozomlarında ve mısır pakiten kromozomlarında kendiliğinden oluştuğu gösterilmiştir. Disentrik ve halka oluşumu gibi kararsız aberasyonların McClintock’un 1942’de mısırda yaptığı çalışmalar sonucunda, genetik materyalin kırılması, birleşmesi, köprü oluşumu sonucu meydana geldiği saptanmıştır. KA’ları organizmaların evriminde rol oynamaktadır (Natarajan, 2002). Kromozomlar sentez fazı (S fazı) sırasında replike olurlar. Replikasyon sırasında tüm DNA molekülleri açılmaktadır. Bu DNA molekülleri metafaz kromozomları ile karşılaştırıldığında veya interfaz kromatinin fibrilli yapısı ile karşılaştırıldığında çok büyüktürler. Örneğin Du Praw’ın (1970) yaptığı hesaplamalara göre insanın 1. kromozomu 7.5 cm uzunluğunda DNA molekülü içerir. Bu DNA molekülü interfazda 1350 µm fibriller yapısına paketlenir ve metafazda yaklaşık 10 µm uzunluğundadır. Dolayısı ile DNA molekülleri, hem interfaz hem de S evrelerinde çok büyük boyutları nedeni ile mutasyonlara neden olan fiziksel ve kimyasal ajanların açık hedefleridir. Oluşacak olan DNA hasarı sonucunda mikroskopta görülebilen yapısal KA’ları oluşur (Obe vd. 2002). Yapısal kromozom aberasyonları, aberasyonun kromozomun bir kromatidinde veya her iki kromatidinde görülmesine bağlı olarak iki gruba ayrılır. Eğer aberasyon tek bir kromatidde görülüyorsa buna kromatid tip, her iki kromatidinde de görülüyorsa kromozom tip aberasyon denir. Bu aberasyon tipleri mutajen uygulamasının yapıldığı hücre siklusu safhasına ve kullanılan mutajenik ajanın tipine bağlıdır. İyonize ışınlar gibi ajanlar hücre G1 safhasında iken etki ederse kromozom tip aberasyonlar meydana gelir, eğer hücre G2 safhasında iken etki ederse kromatid tip aberasyonlar ve iyonize ışınlar, S safhasında iken etki ederse her 2 tip aberasyonlar meydana gelebilir (Natarajan ve Obe, 1982). Şekil 2.1.1. ve 2.1.2.’de sırasıyla G1 ve G2 fazında yapılan ışınlama sonucu oluşan KA’ları görülmektedir (Özalpan, 2001). Şekil 2.1.1.’de görülen terminal 7 delesyon, kromozomun tek bir kolunda kırılma olması ile oluşmuştur. Kırılan parça ilk mitozda asentrik fragment şeklinde görülür. Asimetrik parça değişimi, aynı kromozomun iki kolunda kırılma olması ve kromozomun kırılan iki kolunun birbirine, kırılan iki parçanın da birbirine yapışması ile oluşur ve mitozda halka kromozom ve fragment şeklinde görülür. Şekil 2.1.1. G1 fazında yapılan ışınlamalar sonucu meydana gelebilecek kromozom tipi aberasyonlar ile bunların çeşitli yapışma olasılıkları ve S fazını izleyen mitozda saptanan görüntüleri. (Özalpan, 2001) a)Terminal delesyon, b)Aynı kromozomda simetrik parça değişikliği, c)Aynı kromozomda asimetrik parça değişikliği, d)Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişikliği, e)Farklı kromozomlar arasında asimetrik parça değişikliği. Homolog olmayan kromozomlar arasında olan karşılıklı parça değişimine translokasyon denmektedir. Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişiminde sonraki mitozda görülebilir bir değişiklik olmazken, asimetrik parça değişiminde sonraki mitozda bir disentrik kromozom ve iki asentrik fragment görülür. Şekil 2.1.2.’de G2 safhasında; ışınlama sonucu meydana gelen, kromatid aberasyonlar, terminal delesyon, izokromatid delesyon, aynı veya farklı kromozomlar arasında simetrik ve asimetrik parça değişiklikleri ve triradialler görülmektedir. 8 Şekil 2.1.2. Kromozom eşleşmesi tamamlandıktan sonra, G2 fazında yapılan ışınlamalar sonucunda meydana gelebilecek kromatid tipi aberasyonlar ile bunların çeşitli yapışma olasılıkları ve sonraki mitozda saptanan görüntüleri. (Özalpan, 2001) a)Terminal delesyon, b)İzokromatid delesyon c)Aynı kromozomda simetrik parça değişikliği, d)Aynı kromozomda asimetrik parça değişikliği, e)Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişikliği, f)Farklı kromozomlar arasında asimetrik parça değişikliği, g)Triradial aberasyon. Şekildeki terminal delesyon, sonraki mitozda terminal kromatid delesyon ve asentrik fragment şeklinde görülür. İzokromatid delesyonlar, bir kromozomun iki kardeş kromatidinde aynı hizada kırılma meydana gelmesi sonucu oluşmaktadır. Bunun sonucunda mitoz anafazında köprü ve asentrik fragment oluşabilir. Diğer bir olasılıkta ise sadece fragmentler birbirine yapışır, metafazda bir fragment şeklinde görülür. 3. 9 olasılıkta, kırılan kromozomun iki kromatidinin sadece uçları yapışır ve kırılan parçalar yapışmaz. 4. olasılıkta, hiçbir yapışmanın olmaması durumu ile karşılaşılabilir. Simetrik parça değişikliği bir kromozomun aynı kromatidinde kırılma meydana gelmesi ve kırılan parçaların karşılıklı yer değiştirmesi ile oluşur. Mitozda görülebilir bir değişiklik olmaz. Eğer kromatidlerin kırık uçları birbirine, kırılan iki asentrik parça da birbirine yapışırsa asimetrik parça değişikliği gerçekleşir. Bunu izleyen mitozda kardeş kromatidlerden birisi normal diğeri halka kromozom ile asentrik fragment şeklinde görülür. Farklı kromozomlar arasında simetrik ve asimetrik parça değişiklikleri görülmektedir. Simetrik değişiklikte, iki ayrı kromozomun birer kromatidinden kopan parçalar karşılıklı yer değiştirirler (Şekil 2.1.2. e). Mitozda görülebilir bir değişiklik olmaz. Eğer kırılan parçalar birbirlerine ve kromatidlerin de kırılan uçları birbirlerine yapışırsa (Şekil 2.1.2. f), takip eden mitozda bu durum bir disentrik kromozom ve asentrik fragment şeklinde görülür. Triradial aberasyonlar, bir kromozomun tek kromatidinde, diğer kromozomun iki kromatidinde (izokromaid) kırılma meydana gelmesi ve izokromatid kırılma sonucu meydana gelen asentrik parçaların, tek kromatid kırılması ile oluşan kırık uçlara yapışmasıyla meydana gelir. Mitozda 3 kollu bir kromozom ile izokromatid delesyon şeklinde izlenir. Bunlardan başka oluşan kromozom aberasyonlarından biri olan inversiyonlar, bir kromozomun kopan bir parçasının 180º dönüp tekrar aynı kromozoma yapışmasıyla oluşur. İzokromozomlar ise kromozomun sentromer bölgesinden kromozom tipi enine bir kopmanın olması sonucu oluşur. Her iki kromatidinin genetik bilgileri aynı olan yeni bir kromozom meydana gelir. Gap, kromozomda kromatid kalınlığına eşit ya da ondan daha dar boyanmamış (akromatik) bölgelere verilen isimdir. Kromozomdaki boyanmamış bölge kromatid kalınlığından fazla ise kromatid kırık olarak kabul edilmektedir (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995). Gaplar da kırıklarda olduğu gibi izokromatid veya kromatid gap şeklinde olabilir. Her iki kromatidde de gap varsa izokromatid gap, tek bir kromatidde gap varsa kromatid gap denir. Elektron mikroskopu çalışmalarında, gap bölgelerinde (akromatik bölgelerde) bağlantının olduğu saptanmıştır. Özellikle DNA sentezini inhibe eden bazı kimyasallar, yüksek sıklıkla gaplara neden olurlar (Natarajan ve Obe, 1982). Spiral çözülmesi, kromozomda soluk boyanan bölgelerdir. Gap’a göre daha geniş bir alanı kapsar. Kromozomların kontrole göre boylarının çok kısalması ve 10 kalınlığının artmasına kromozom kontraksiyonu denir. Bu olay kimyasal maddenin histon proteinlerine etki ettiğini göstermektedir. (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995) 2.1.1. KA testleri Mutajenik ajanlara maruz kalan insan populasyonlarını izlemek için periferik kan lenfositlerinde, KA ve MN’lar kullanılır. Hagmar vd. 1998’de insan populasyonlarında kendiliğinden oluşan KA’ları ile sonradan oluşan kanser sıklığı arasında pozitif bir ilişkinin olduğunu belirlemişlerdir (Natarajan, 2002). Boveri 1914 yılı bildirisinde; kararlı kromozomal değişiklikler ile farklı kanser tipleri arasında ilişki olduğunu ileri sürmüştür (Natarajan, 2002). Son yıllarda, kromozomları gözlemek üzere geliştirilen tekniklerle, kromozom araştırması alanında büyük gelişme gösterilmiştir. Bunlar memeli hücrelerine hipotonik muamelesi, E.M., kromozom bantlama, en son olarak FISH gibi tekniklerdir. Natarajan (2002) bundan sonra kromozom aberasyonları alanında yapılacak araştırmaların, içerdikleri mekanizmalar üzerinde odaklanacağı düşüncesindedir. 2.2. Mikronukleus (MN) Kimyasal ajanların mikronukleus oluşturması açısından değerlendirilmesi, bu kimyasalların genotoksisitelerinin tespit edilmesinde kullanılan diğer bir kriterdir. MN’lar hücrenin mitoz bölünmesi sırasında ortaya çıkan, esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom fragmentlerindan köken alan oluşumlardır. Bu durumda bu parça mikronukleus adını alır ve interfazda kolayca görülebilir. MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. MN’lar ya 11 klastojenlerin neden olduğu kromozom kırığı sonucu asentrik kromozom fragmentlerinden, ya da aneujenlerin neden olduğu sentromer bölünme hataları ve iğ ipliği fonksiyon bozukluğu sonucu anafaz sırasında geri kalan tam bir kromozomdan oluşurlar (Fenech ve Morley, 1985). Mikronukleus analizi için mutajen muamelesi görmüş hücrelere sitokalasin–B uygulanarak sitoplazma bölünmesi engellenir ve bu yolla 2 yavru nukleusun birlikte bulunduğu iki nukleuslu hücreler ve bu hücrelerin sitoplazmaları içinde yer alan mikronukleuslar değerlendirilirler. 2.2.1. MN tekniğinin gelişimi MN’lar ilk kez 1 yy kadar önce Howell tarafından eritrosit sitoplazmasında görülmüş ve bu yapılara “nukleer materyal fragmenti” denmiştir. Bunlar 1900’lü yılların başlarında Jolly terminolojisinde “intraglobuler korpuskuller” olarak tanımlanmıştır. Bu yapılar “Howell-Jolly cisimcikleri” olarak bilinir. Benzer yapılar 1937’de Brenneke tarafından fare, sıçan embriyolarında ve 1951’de Thoday tarafından Vicia faba’da da görülmüştür (Kirsch-Volders vd. 2003). Bunlara “fragment nukleuslar” veya “mikronukleuslar” denmiştir. Evans vd. 1959’da Vicia faba kök uçlarında MN’ları radyasyona maruz kalan hücrelerde gördüklerini, asentrik fragmentlerden orjinlendiklerini ve mitozun son safhasında iki yavru nukleustan ayrılarak oluştuklarını bildirmişlerdir. Vicia faba kök uçlarında nötron ve gamma ışınlarının etkisini karşılaştırdıkları çalışmada, sitogenetik hasarın belirteci olarak MN’ların kullanılabilirliğini tespit etmişlerdir (Kirsch-Volders vd. 2003). İlk kez MN test yöntemini öneren Boller ve Schmid 1970’te ve Heddle 1973’te ajanların genotoksik potansiyellerini ölçmek için kemik iliği eritrositlerinde MN’u test yöntemi olarak kullanmışlardır (Kirsch-Volders vd. 2003). Daha sonra 1980’de MacGregor vd. tarafından bu metod periferik kanda dolaşan polikromatik eritrositlerde denenmiş ve en az kemik iliği metodundaki kadar hassas olduğu gözlenmiştir. Bu metod hayvanları öldürmeden fazla sayıda örnek alınmasına olanak verdiği için daha avantajlı sayılmıştır (Almassy vd. 1987). Countryman ve Heddle 1976 yılında yaptıkları 12 çalışmada, lenfositlerde MN oluşumunu belirleyerek, kromozom hasarının meydana çıkarılmasında diğer bir uygulanabilir hücresel sistem ileri sürmüşlerdir (KirschVolders vd. 2003). Von Ledebur ve Schmid 1973’te, Högstedt ve Karlsson 1985’te geliştirdikleri modifiye metodlarla, aneuploidiye yol açan ajanlar ile klastojenleri birbirinden ayırmada, MN büyüklük farkından yararlanmışlar; klastojenlerce uyarılan MN’ların asentrik kromozom fragmentleri içeren küçük, aneujenlerce uyarılan MN’ların tam kromozomlar içerdiğini ve daha büyük ebatlı olduğunu göstermişlerdir (Demirel ve Zamani, 2002). Daha sonraları 1985 ve 1986 yıllarında Fenech ve Morley tarafından Sitokinezi-Blok (Cytokinesis-Block) Metodu geliştirilmiştir (Demirel ve Zamani, 2002). MN araştırmalarında in situ hibridizasyon (ISH) tekniği, ilk defa kromozomların sentromerini tanımlamak için Norppa vd. tarafından 1993’te uygulanmıştır (Demirel ve Zamani, 2002). Daha sonra Richard vd. 1994’te floresan in situ hibridizasyon (FISH) tekniği ile MN oluşturan kromozomların her birinin kimliğini belirleyebilecek teknolojik gelişmeler sağlamışlardır (Demirel ve Zamani, 2002). Sentromerik problu floresan in situ hibridizasyon metodu, aneuploidiyi indükleyen bileşiklerin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Papapaulou vd. 2001). 2.2.2. MN test yöntemi ve uygulama amacı MN yönteminin geliştirilmesinde en önemli adım; MN oluşumuna izin veren, bir çekirdek bölünmesini tamamlamış hücrelerin sayılmasının esas alınmasıdır (Fenech vd. 1999). Sitokinezi-blok mikronukleus metodunu geliştiren Fenech ve Morley 1986’da, hücre kültürüne mitoz sırasında sitoplazma bölünmesini durduran aktin inhibitörü cytochalasin-B (Cyt-B) ilave ederek çekirdek bölünmesini tamamlamış, ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş çift çekirdekli hücreler elde etmişlerdir (Fenech vd. 1999, Kirsch-Volders vd. 2003). İncelenen alanda kültür süresi içinde ikinci bölünmesini tamamlamış 4 çekirdekli hücrelere de rastlanmaktadır; ancak MN sayımında Heddle ve Countryman’in (1976) kriterleri kullanıldığından bu hücrelerde 13 görülen MN’lar değerlendirme dışı bırakılmaktadır (Demirel ve Zamani, 2002). Heddle ve Countryman’in (1976) kriterlerine göre: 1- MN esas nukleus ile aynı yapıda olmalıdır. 2- MN esas nukleustan küçük olmalıdır. 3- MN esas nukleustan ayrı, yuvarlak veya yaklaşık yuvarlak şekilli olmalıdır. 4- Nukleer olmayan partiküllerden farklı olarak ışığı yansıtmamalıdır. 5- MN feulgen pozitif veya diğer DNA’ya özel reaksiyonlarda pozitif reaksiyon göstermelidir. 6- MN’lar sitoplazması iyi gözlenen hücrelerde sayılmalıdır. 7- MN oluşumu doza bağlı olmalıdır (Almassy vd. 1987). Sitokinezi-blok Mikronukleus (CBMN) tekniği in vitro genotoksisite testleri, insan populasyon taramasında kolayca uygulanabilecek bir tekniktir (Fenech vd. 1999). MN tekniği, en çok çeşitli kimyasallara ve fiziksel ajanlara maruz kalmış bireylerin taranması amacı ile, bireyler arasında genetik hasarın temel seviyesini anlamak (Fenech vd. 1999) ve çeşitli ajanların klastojenik ve aneujenik potansiyellerini değerlendirmek amacı ile insan lenfositlerini de içeren farklı tip hücrelerde geniş çapta kullanılmaktadır (Fenech ve Morley, 1985). 2.2.3. MN testi avantajları MN test yöntemini sitogenetik anormallikleri belirlemede etkili bir metod yapan; farklı hücre tiplerinde in vitro şartlarda yaygın uygulanabilirliği ve sayım kolaylığıdır. Ayrıca elde edilen verilerin çok sayıda olması istatistiksel dayanağının güçlü olmasını sağlar (Fenech vd. 1999). Fenech 1997’de, Kirsch-Volders 1997’de, Eastmond ve Tucker 1989’de MN test yönteminde kinetekor veya sentromeri belirleyen metodlar kullanarak; kromozom kırığı nedenli MN ile kromozom geri kalması nedenli MN’ları birbirinden ayırmanın kolay olduğunu belirtmişlerdir (Fenech vd. 1999). İmmünokimyasal işaretleme metodları ile CBMN test yöntemi, MN oluşumundan sorumlu esas mekanizmanın anlaşılmasını sağlar. Çift iplik DNA kırıkları, asentrik 14 fragmentli MN oluşumuna ve mitotik apereydeki hata, tam kromozomlu MN oluşumuna neden olmaktadır (Kirsch-Volders vd. 2003). Kirsch-Volders vd. 1997’de, Fenech vd. 1997’de yaptıkları çalışmaların sonuçlarına göre; bu yöntem klastojenik ve aneujenik etkileri birbirinden ayırabilmekte ve Elhajouiji vd.’nin 1997 yılı çalışma sonuçlarına göre ayrıca; doz-cevap eğrisi, tam kromozom ve kromozom ayrılmaması sonuçlarına uygulanabilmektedir (Kirsch-Volders vd. 2003). Bundan dolayı in vitro MN test yöntemi bilimsel olarak yeterli ve güçlü kabul edilmektedir (Kirsch-Volders vd 2003). 2.2.4. MN ve kanser ilişkisi MN frekansı ile kanser gelişimi arasındaki direk ilişki birçok bulgu ile desteklenmektedir. Cheng vd. 1996’da, Duffaud vd. 1997’de yaptıkları çalışmalara göre; kanser hastalarında periferik lenfositlerde olduğu gibi hedef dokuda da MN frekansı artmaktadır (Fenech vd. 1999). Rudd vd. 1988’te, Rosin ve German 1985’teki bildirilerine göre; Bloom sendromu veya ataxia telangiectasia gibi hastalıklardan etkilenen bireyler, yüksek MN frekansı ve kanser riski taşımaktadırlar (Fenech vd. 1999). Sorsa vd. 1992 yılında yaptıkları araştırmaya göre; bazı ajanlar insan ve hayvanlarda MN frekansını arttırabilmekte, kanserojenite ve genotoksisite arasında bir ilişki bulunmaktadır ve bu ajanlar; iyonize radyasyon, benzen, sigaradır (Fenech vd. 1999). Fenech ve Rinaldi 1995’te, Fenech vd. 1997’de, Blount vd. 1997’de, Fenech vd. 1998’de, MN’un kandaki vitamin ve folate konsantrasyonu ile çok kuvvetli ilişkisi bulunduğunu, bunların azlığı bazı kanser tiplerinde artışa neden olduğunu bildirmişlerdir (Fenech vd. 1999). Bu bulgular açıkça MN ve kanser arasında bağ olduğunu göstermektedir. KA ile kanser sıklığı arasında anlamlı ilişki vardır. Ancak bu ilişki KKD de bulunmamıştır. MN için henüz veriler yeterli sayıda değildir (Fenech vd. 1999). 15 2.3. Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) 2.3.1. Kardeş kromatid değişim mekanizması Kimyasal ve fiziksel ajanların mutajenite ve karnserojenitesinin test edilmesinde değerlendirilen diğer kriter, kardeş kromatid değişim (KKD)’leridir. Latt vd. 1981’de KKD’lerin tek bir kromozomun iki kromatidi üzerinde homolog bölgelerdeki kırılma ve yeniden birleşme ile oluşan DNA replikasyon ürünlerinin sitolojik göstergesi olduğunu, Tucker vd. 1993’te KKD’lerin hassas genotoksik aktivite indikatörleri olarak geniş alanda kullanıldığını bildirmişlerdir (Villarini vd. 1998). KKD’ler, tek bir kromozomun iki kromatidi arasında gerçekleşen karşılıklı değişimlerdir. Bu değişimler hücre siklusunun metafaz safhası sırasında görülebilirler ve KKD’lerin meydana gelmesi için enzimatik kesim, translokasyon ve en az iki DNA heliksinin kaynaşması gerekir. Pommier vd. (1985) araştırmalarında; KKD’lerin meydana gelişinde Topoizomeraz II enziminin etkili olduğunu ileri sürmüşlerdir. Topoizomeraz II enzimi DNA’ya bağlanarak bir kompleks oluşturur. DNA’ya etki eden ajanlar bu kompleksin oluşumunu engellemektedirler. Enzim iki alt birimden oluşur (dimer). Bu dimer DNA’ya iki şekilde bağlanabilir; ya bir kovalent bağ içerir, bu bağ enzim molekülü ile DNA çift ipliğinden bir tanesinin 5’ ucu arasındadır ve bu enzim aracılığı ile DNA ipliğinden biri koparılır, ya da aynı şekilde karşılıklı kovalent bağ içerir. Bu durumda topoizomeraz II:DNA kompleksi iki DNA:protein bağı ve bir çift iplik kırığı (DSB) içerir (Şekil 2.3.1.1.). Her iki durumda da DNA’ya etki eden ajanlar tarafından topoizomeraz II:DNA kompleksi bozulur ve normal enzim fonksiyonu inhibe edilmiş olur. İleri sürülen hipotez KKD’lerin S fazına bağlı bir olay olması, yeni replike olmuş DNA ipliklerinin DNA çift iplik kırık bölgelerinde değiş tokuşu sonucu oluşmasıdır. Çünkü bu enzim yeni replike olmuş DNA ipliklerini tekrar organize ederken, DNA’da çift iplik kırıkları oluşturur ve bunları tekrar birleştirir. DNA’ya etkili ilaçlar topoizomeraz II kompleksini etkileyerek, kırılan DNA çift ipliğinin tekrar 16 birleşmesini önler. Bu kırıklar kardeş kromatidlerin değiş tokuşuna neden olur (Pommier vd. 1985). DNA replikasyonundan sonra DNA topoizomeraz II homodimerleri, yeni replike olmuş DNA ipliklerine, DNA yapısını tekrar organize etmek için bağlanırlar. DNA’ya etki eden ajanlar (intercalator); her bir DNA çift ipliği üzerinde iki DNA topoizomeraz II homodimerlerinin birbirinden ayrılmasına (moleküllerin dimerlerinin ayrılması) ve 2 homolog enzim molekülünün karşılıklı olarak değiş tokuşuna neden olabilirler (Şekil 2.3.2.). Alt üniteler karşılıklı yer değiştirmekte, buna bağlı olarak A' ve B' DNA çift iplikleri de yer değiştirmektedir. Yer değiştirmiş A' ve B' DNA çift iplikleri, sırasıyla B ve A DNA çift iplikleri ile bağlanmakta ve bunun sonucunda KKD meydana gelmektedir (Pommier vd. 1985). KKD’ler doza bağlı olarak genotoksik bileşiklere cevap verirler, ve açıkça DNA hasarı olduğunu gösterirler (Perry ve Evans, 1975). KKD tam DNA çiftsarmalı değiş tokuşunu izleyen her iki DNA ipliğinin kırılmasını içerdiğinden dolayı KKD, DNA kırılmasının sitolojik göstergesidir. Birçok çalışmada FPG tekniği kullanılarak, kimyasalların KKD’leri indüklemesi açısından değerlendirilmeleri sağlanmıştır. Klasik KA sayımına göre KKD sayımı tercih edilir. Çünkü KKD sayımı, KA sayımına göre daha kolaydır. Ayrıca KA sayımı, farklı sınıflardaki aberasyonları tanımada deneyim gerektirir ve en az 100 metafaz hücresinin sayılması gerekir. Ancak KKD belirlemede 20-25 hücre yeterli olmaktadır. Diğer taraftan şu açıktır ki bir kimyasalın mutajenitesini test etmek için KKD sayımı, KA sayımının yerini tutamaz. Direkt DNA iplik kırıklarını indükleyen ajanlar (ör: iyonize radyasyon, bleomisin ve streptonygrin), KA’larını indükledikleri oranda KKD frekansını arttırmazlar. Bu nedenle sitogenetik çalışmalarda hem KA, hem de KKD’lere bakılması, o maddenin etkinliğinin anlaşılması açısından önemlidir (Natarajan ve Obe, 1982). 17 Şekil 2.3.1.1. Memeli topoizomeraz II:DNA kompleksinin olası durumları. ●, kırık bölgelerinde topoizomeraz II ile DNA’nın 5’ terminal ucu arasında kovalent bağ (Pommier vd. 1985). Şekil 2.3.1.2. KKD’lere neden olan DNA’ya etkili ajanların etki mekanizması modeli (Pommier vd. 1985). 18 2.3.2. KKD indükleyen ajanlar Kendiliğinden oluşan KKD frekansı, hücrenin DNA içeriği ile ilişkilidir. Örneğin Uggla ve Natarajan (1982) KKD frekansının Vicia faba’da hücre başına 62 olacak kadar yüksek (DNA 54 pg/hücre) ve Drosophila melanogaster’de hücre başına 0.14 olacak kadar düşük (DNA 0.54 pg/hücre) olabildiğini bildirmişlerdir (Natarajan, 2002). KKD, S fazında meydana geldiğinden dolayı, DNA replikasyonu sırasında etkili olan ve DNA hasarı oluşturan kimyasallar KKD’leri indükler. Bu kimyasallar KA’larına göre daha düşük konsantrasyonlarda KKD’lere neden olurlar. S fazına bağlı ajanların (ör: UV ve alkilleyici ajanlar), KKD’lerinin potansiyel indükleyicileri olduğu buna karşın S fazına bağlı olmayan ajanların (ör: X-ışınları ve Bleomisin) KKD’lerin zayıf indükleyicileri oldukları saptanmıştır. KKD’lerin, nokta mutasyonları, gen amplifikasyonları ve sitotoksisiteye neden olabilecekleri bildirilmiştir (Perry and Evans, 1975). 2.4. Urea Herbisitleri Urea herbisitleri tarım alanlarında geniş yapraklı ve diğer otsu zararlıların kontrolünde kullanılırlar. Bitki kökleri tarafından alınarak hızla bitkinin üst kısımlarına iletilir ve genellikle yapraklarda gözlenen fitotoksik semptomlar oluştururlar. Herbisit sınıflandırmasında urea herbisitleri; fenylurea herbisitleri, sulfonylurea herbisitleri, thiadiazolylurea herbisitleri olmak üzere 3 sınıfa ayrılırlar. Sulfonylurea herbisitleri kendi içinde pyrimidinylsulfonylurea ve triazinylsulfonylurea herbisitleri olmak üzere 2 sınıfa daha ayrılmaktadır (Classification of herbicides, 2005). Triasulfuron, triazinylsulfonylurea sınıfına ait bir herbisittir. Hay 1990’da Sulfonylurea’ların (SU) herbisidal aktivitesinin ilk kez 1966’da fark edildiğini bildirmiştir (Cox, 1993). SU’lar herbisitlerin gelişen sınıfıdır. Bunlar ilk 19 olarak 1970’lerin ortalarında üretilmiştir. İnsanlar ve hayvanlara zararlı olmadığı için SU’lar güvenli herbisitler olarak piyasaya sunulmuştur. SU herbisitleri DuPond Crop Protection tarafından 1982’de üretilmiştir. Tarım alanlarında 100 g/ha oranında uygulanırlar. Memeli toksisitesi düşüktür ve uygulamadan sonra zararsız bileşiklere bozulur. Geniş yapraklı zararlıların, tahıl ve saf ürünlerde otların ve endüstriyel zararlıların kontrolünde kullanılmaktadır. Yaklaşık 25 SU herbisitine tarım alanlarında kullanım izni verilmiştir. 2 heterosiklik halka arasında SU köprüsü varlığı ile karakterizedirler. SU’lar kimyasal ve termal olarak kararsızdırlar. Asidik solüsyonlarda, hidrolitik kırılma ile sulfonylurea köprüsü oluşur; nötralden hafif alkali solüsyonlara doğru birçok sulfonylurea kararlılık gösterir ve bir urea hidrojen atomunu kaybederek aniyonik formda kalır. Bu bileşikler genellikle organik çözücülerde kararlıdır ve hidrokarbonlardan başka temel organik çözücülerde 1 mg/100 ml’den daha yüksek seviyelerde çözünürler (Powley, 2003). Kimyasal aktivite ile bitkileri öldürmekten ziyade, SU herbisitleri asetolaktat sentaz (ALS) enzimini inhibe ederek amino asit zincirinde temel dalların sentezini bloke ederler (lösin, izolösin, valin). Bu nedenden dolayı, bu kimyasallar SU/ALS veya nadiren ALS herbisitleri olarak refere edilirler. ALS enzimleri, hayvanlarda bulunmadığı için SU herbisit üreten firmalar onların ürünlerinin hayvanlar ve insanlar için güvenilir olduğunu iddia ederler (Flogel, 1998). Aşağıda bazı urea grubu herbisitlerinin toksikolojik ve mutajenik çalışmalarına yer verilmiştir. Tribenuron methyl (triazinylsulfonylurea) Salmonella typhimurium ve Çin hamster over (CHO) hücrelerinde in vitro gen mutasyonları negatif sonuç vermiştir. Sıçanlarda sitogenetik testler, farede MN testini içeren yapısal kromozom hasar testleri negatif sonuçlanmıştır. In vitro sıçan hepatositlerinde program dışı DNA sentez (UDS) testi negatiftir (EPA, 1989). FAO (2002), tribenuron methyl’in mutajenite profil bildirisinde; bu kimyasalın Salmonella thphimurium in vitro bakteri gen mutasyon testinde S9 metabolik aktivasyon varlığında ve yokluğunda negatif mutajenik aktivitesi olduğunu, insan lenfositleri in vitro periferik kan kültüründe S9 varlığında ve yokluğunda yapısal KA’larını indüklemediğini, CHO hücreleri in vitro memeli gen mutasyon testinde S9 20 metabolik aktivasyon varlığında ve yokluğunda CHO/HGRPT (hipoksantin guanin fosforibozil transferaz) gen mutasyonlarını indüklemediğini, sıçan primer hepatositlerinde in vitro UDS testinde negatif olduğunu, dişi ve erkek sıçanda KA için in vivo kemik iliği testinde UDS oluşturmadığını, dişi ve erkek farede in vivo kemik iliği MN testinde negatif olduğunu bildirmiştir. Triflusulfuron methyl (triazinylsulfonylurea) Ames testinde, memeli (CHO) gen mutasyonları testinde, fare kemik iliği MN testinde 5000 mg/kg’a kadar negatif sonuç vermiştir. Kültüre edilen sıçan hepatositlerinde UDS negatiftir (EPA, 1996). Ancak insan lenfositlerinde metabolik aktivasyon varlığında 1500 µg/ml den yüksek dozlar içini pozitif sonuçlar gözlenmiştir. İnsan lenfositlerinde aktivasyonsuz şartlarda KA çalışmaları yetersizdir (EPA, 2001). DPX-66037 (Triflusulfuron methyl) metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda 62.5,125,250,500,1000 µg/petri konsantrasyonlarında Salmonella typhimurium TA98,100,1535,1537,1538 suşlarında Ames testinde, 2000 µg/ml’ye kadar CHO/HGPRT gen mutasyon testinde mutajenik değildir. İnsan lenfositlerinde 50, 100, 200 µg/ml DPX 66037-59 aktivasyonsuz şartlarda, 100,200,400 µg/ml aktivasyonlu şartlarda denenmiş ve klastojenik olmadığı saptanmıştır. Sonuçlar güvenilir bulunmadığından dolayı bu test değerlendirilmeye alınmamıştır. Ayrıca insan lenfositleri sitogenetik testi ile 0.5, 1.5, 1.7, 1.85, 2.00 mg/ml DPX 66037-59 konsantrasyonları aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda denenmiş ve 1.85 mg/ml konsantrasyonda kontrolden daha düşük MI oranı tespit edilerek sitotoksik etki gözlenmiştir. Triflusulfuron methyl’in metabolik aktivasyon ile 2 mg/ml’de klastojenik olduğu tespit edilmiştir (PMRA, 1999). Metsulfuron methyl (triazinylsulfonylurea) Ames testi, memeli gen mutasyon (CHO/HGPRT) testi, UDS, in vivo kemik iliği sitogenetik testleri, in vivo fare MN testi negatif sonuç vermiştir. Methsulfuron methyl sadece 1000 mg/l’den yüksek konsantrasyonlarda CHO hücrelerinde in vitro KA’larını indüklemiştir fakat in vivo sıçan kemik iliğinde KA’larını indüklememiştir. Fare kemik iliği eritrositlerinde MN oluşumunu indüklememiştir. Metsulfuron methyl ne genotoksik ne de mutajeniktir (EPA, 1998b). 21 Donovan’ın 1984 yılında yaptığı çalışmaya göre, Salmonella typhimurium’da in vitro Ames mutajenite testinde 0-10 µg/ml konsantrasyonlarında; Fitzpatrick’in 1982’de yaptığı çalışmaya göre, CHO hücrelerinde CHO/HPRT mutajenite testinde 0-2670 mg/l konsantrasyonlarında; Vincent’in 1983’teki araştırmasına göre, sıçan primer hepatositlerinde UDS testinde 0-38 mg/l konsantrasyonlarında, Bentley’in 1990 yılında yaptığı araştırmaya göre sıçan primer hepatositlerinde UDS testinde 0-3000 µg/ml konsantrasyonlarında; Cortina’nın 1983’teki araştırma sonuçlarına göre, sıçan kemik iliğinde in vivo KA indüksiyonu testinde 0-5000 mg/kg konsantrasyonlarında; Vlachos’un 1984 yılında yaptığı çalışmaya göre, fare kemik iliğinde MN indüksiyonu testinde 0-5000 mg/kg konsantrasyonlarında negatif sonuç göstermiştir (DAR, 2004). Ancak Vlachos’un 1983’te 0-3000 mg/l Metsulfuron methyl konsantrasyonlarını CHO hücrelerinde denediği çalışmada KA testinde 1 mg/ml’nin üzerindeki konsantrasyonlarda metsulfuron methyl’in pozitif etki gösterdiğini saptamıştır (DAR, 2004). Chlorsulfuron (triazinylsulfonylurea) Chlorsulfuron in vitro mutajenitesinin çalışıldığı Ames ve CHO/HPRT testlerinde, in vitro sitogenetik testinde, in vitro DNA onarım testinde, in vitro UDS testinde negatif sonuç vererek genotoksik ve mutajenik etki göstermemiştir (EPA, 2002). Ethametsulfuron methyl (triazinylsulfonylurea) Mutajenik ve genotoksik etkilerini gözlemek amacı ile yapılan testler sonucunda ethamethsulfuron methyl genotoksik ve mutajenik değildir. Bu testler; bakterilerde Ames, CHO hücrelerinde mutajenite testleri, sıçanlarda izole edilen kemik iliği hücrelerinde KA testi, fare kemik iliğinde MN testi ve kültüre edilen sıçan karaciğer hücrelerinde DNA hasarı ölçüm testidir (EPA, 1997a). Sulfosulfuron (pyrimidinylsulfonylurea) In vitro Ames /Salmonella mutajenite testinde EPA (1997b) kullanılan 5 temel suşta negatif mutajenite olduğunu bildirmiş, Pest management Regulatory Agency metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda 1500 µg/petri dozlarında 22 sulfosulfuron’un sitotoksik olduğunu, toksik olmayan dozlarda sulfosulfuron’un mutajenik etki göstermediğini bildirmiştir (PMRA, 1998). Sulfosulfuron nokta mutasyonları için mutajenik değildir (PMRA, 1998). In vitro memeli hücresi gen mutasyon testinde CHO/HGPRT negatif sonuç vermiştir (PMRA 1998, EPA 1997b). Sulfosulfuron’un mutajenik olmadığı, nokta mutasyonlarına, çerçeve kayması mutasyonlarına ve delesyonlara neden olmadığı bildirilmiştir (PMRA, 1998). In vitro sitogenetik testinde kültüre edilen insan lenfositlerinde hem metabolik aktivasyonlu hem de aktivasyonsuz şartlarda, 100, 250, 500, 750, 1000 µg/ml konsantrasyonlarda etkisi incelenmiştir. Mitotik indekste %14,9’dan %66,7’ye kadar bir azalma gözlenmiştir. Bununla beraber KA’lu hücre sayısında veya poliploid hücre sayısında artış gözlenmemiştir. Elde edilen sonuçlara göre sulfosulfuron metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda insan lenfosit kültüründe klastojenik değildir (PMRA 1998, EPA 1997b ). Çin hamster fibroblastlarında in vitro metodunda 2000 µg/ml ve daha yüksek dozlarda, metabolik aktivasyonsuz şartlarda, kromozom yapı aberasyonlu hücre sayısında artış gözlenmiştir. Bu şartlarda klastojenik olduğu bildirilmiştir (PMRA, 1998). In vivo memeli MN testinde farelerde klastojenik olmadığı bildirilmiştir (PMRA 1998, EPA 1997b). EEC (2000), Çin hamsterlerinde in vitro şartlarda uygulanan konsantrasyonların, in vivo şartlarda sitotoksik etkisinden dolayı uygulanamayacağını, dolayısı ile in vitro ve in vivo grupların karşılaştırılmayacağını bildirmiştir. In vitro CHO/HGPRT gen mutasyon testinde, kültüre edilen memeli hücrelerinde KA testinde, insan lenfositlerinde in vitro KA testinde, farede in vivo kemik iliği MN testinde negatif sonuçlar elde edildiğinden dolayı sulfosulfuron genotoksik veya mutajenik etki göstermemektedir (EPA, 1997b). Sulfosulfuron’un akut toksisitesi düşük olduğu için genotoksik olmadığı, üreme, gelişim ve sinir sisteminde toksik olmadığından dolayı insan sağlığını tehdit etmediği kabul edilmektedir (Healy vd. 2004). Rimsulfuron DPX-E9636 (piridisulfonylurea) Piridilsulfonylurea herbisidi olan Rimsulfuron’un ticari formülasyonu DPXE9636’in in vitro sığır lenfosit kültüründe aberasyon sayısında ve aberasyonlu hücre yüzdesinde anlamlı artışa neden olduğu ve KKD’leri doza bağlı olarak anlamlı 23 indüklediği ve bu herbisidin in vitro sığır lenfosit kültüründe genotoksik olduğu bildirilmiştir (Lioi vd. 1998a). DPX-E9636’nın insan lenfosit kültüründe yapılan çalışmasında da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu kimyasalın doza bağlı olarak aberasyonlu hücre yüzdesini ve hücre başına düşen KKD sayısını arttırdığı bildirilmiş mitotik indeksi düşürdüğü tespit edilmiştir (Lioi vd. 1998b). Sulfometuron methyl (pyrimidinylsulfonylurea) DuPont (1979) (1981a) (1981b) Sulfonylurea methyl’in Salmonella’da ve CHO hücrelerinde mutajenik olmadığını, DuPont (1984) ve (1987) sıçan ve farede kanserojenik etki gözlenmediğini bildirmiştir. DuPont’a göre Sulfometuron methyl’in kanserojenik etkisi yoktur ve genetik hasar oluşturmaz (Cox, 1993). Primisulfuron methyl (pyrimidinylsulfonylurea) Primisulfuron methyl Ames mutajenite testinde Salmonella TA98 suşunda 1024 µg/petri konsantrasyonuna kadar metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda pozitif etki göstermemiştir. Çin hamsterlerinde 5000 mg/kg’a kadar MN oluşumunu indüklemediği ve toksik olmadığı gözlenmiştir. Sıçan karaciğer hücreleri (hepatositler) UDS testi 400 µg/ml’ye kadar negatif, insan lenfositleri ile UDS 1000 µg/ml’ye kadar aktivasyonsuz şartlarda negatif sonuç vermiştir (EPA, 1990). Tebuthiuron (thiadiazolylurea) Tebuthiuron’un Ames mutajenite testinde, fare MN analizi yapılarak yapısal KA testinde negatif sonuç gösterdiği, mutajenik ve kanserojenik olmadığı bildirilmiştir (EXTOXNET, 1996a) Diazolidinyl urea (imidazolidinylurea) Dimethylol urea teskstil endüstrisinde katkı maddesi olarak, diazolidinylurea (DZU) ise kozmetik alanında kullanılan urea bileşikleridir. DZU’nın Salmonella typhimurium mutajenite testinde mutajenik olmadığı (Liebert, 1990), fare kemik iliği in vivo MN testinde MN oranında artışa neden olmadığı görülmüştür. Ancak daha sonra Pfuhler ve Wolf (2002) DZU ve DMU’nun Salmonella typhimurium mutajenite testinde 24 TA98, 100, 102 suşlarında pozitif sonuç gösterdiğini saptamışlardır. Aynı araştırıcılar in vitro MN testinde de V79 Çin hamster hücrelerinde MN oluşumunu indükleyerek genotoksik etki gösterdiklerini bildirmişlerdir. Fluometuron (phenylurea) Weed Science Society of America 1994’te, fluometuron’un, Ames mutajenite testi, KA’ları için hücre kültürü testi, insan fibroblast hücreleri ve sıçan karaciğer hücrelerinde DNA onarım inhibisyon testleri gibi mutajenite ve genotoksisite testlerinde aktivite göstermediğini bildirmiştir (EXTOXNET, 1996b). EPA’nın 1988’de Fluometuron ile yaptığı bir çalışmaya göre; fareye verilen 2000 mg/kg’lık yüksek doz sonrası DNA sentezi ile etkileşim gözlendiğini saptamıştır (EXTOXNET, 1996b). Bu çalışmalara dayanarak Fluometuron’un mutajenik olmadığı görülmektedir. Weed Science Society of America 1994’te Fluometuron’un kanserojenik etkisini araştırmak amacı ile 2 yıl boyunca farelere 87 mg/kg/gün verilen çalışma sonucunda; karaciğer tümörü, lösemi, beyaz kan hücresi sayısında kontrolsüz büyüme gözlenmiştir (EXTOXNET, 1996b). Diğer bir çalışmada, National library of medicine’ın 1995’te ve EPA’nın 1988’deki bildirilerine göre; erkek farede karaciğer hücre tümörü sıklığında artış gözlenmiş, fakat dişi fare ve sıçanlarda her iki eşeyde de kanserojenik etki gözlenmemiştir (EXTOXNET, 1996b). Seiler 1978’de fare kemik iliğinde yaptığı çalışmada, fluometuron’un MN oluşumuna neden olduğunu göstermiştir (Behera ve Bhunya, 1990). Isoproturon (phenylurea) Isoproturon’un genotoksik etkilerinin in vivo KA, MN ve sperm şekli anormallikleri test yöntemleri ile araştırıldığı çalışmada bu herbisidin KA ve sperm şekli anormallikleri testlerinde doza bağlı olarak pozitif sonuç verdiği, MN testinde yüksek dozda (200 mg/kg) etkili olduğu saptanmış ve sonuçta memeli in vivo test sisteminde isoproturon’un genotoksik özelliği olduğu bildirilmiştir (Behera ve Bhunya, 1990). CHOK1 hücrelerinde SCGE testinde DNA hasarı oluşturmadığı ve anlamlı KA’larına neden olmadığı bildirilmiştir (Vigreux vd. 1998). 25 Isoproturon’un bitkiler üzerindeki sitogenetik etkileri araştırıldığında; Badr ve Elkington (1982) Isoproturon’un Allium cepa ve Hordeum vulgare’de mitotik aktiviteyi düşürdüğünü, iğ ipliği aygıtında bozulmaya sebep olduğunu, C-metafaz, kromozom sayısının ikiye katlanması, kalgın kromozomlar, multipolar anafaz ve telofaz oluşumunu arttırdığını, bu sonuçlara göre bitki test sisteminde sitotoksik ve klastojenik olduğunu, Chauhan vd. (2001) Isoproturon’un farklı konsantrasyonlarının (35-280 ppm) Allium sativum kök meristem hücrelerinde MI’i doza bağlı anlamlı olarak inhibe ettiğini, kromozom kırıkları/mitotik aberasyonlara neden olduğunu, Isoproturon’un genotoksik olduğunu, Chauhan ve Gupta (2005) Isoproturon’un Deltamethrin (insektisid) ile kombine kullanımının Allium cepa kök meristem hücrelerinde kromozom kırıkları, yapışıklık, multipolar anafaz, kromozom köprüleri, kalgın kromozomlar, kromozomların dengesiz ayrılması, iki ve çok nukleuslu hücrelere neden olduğunu, kombine muamelelerin organellerde ultrastrukturel değişimlere neden olduğunu ve bitki hücrelerinde geri dönüşümsüz hasarlar meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Diuron (phenylurea) Diuron Allium cepa kök ucu hücrelerinde hücre bölünmesini doza bağlı olarak inhibe etmiş ve kromozom kırıkları, C-metafaz, kromozom yapışıklığı, kalgın kromozomlar, multipolar düzensizlikler, anafaz köprüleri gibi çeşitli mitotik anormalliklere ve kök uçlarında morfolojik değişikliklere neden olmuştur (Chauhan vd. 1998). Daha sonra Saxena vd. (2004), Diuron’un Allium sativum kök ucu hücrelerinde sitogenetik etkilerini araştırmak üzere yaptıkları çalışmada, mitotik anormallikler ve KA’larında doza bağlı anlamlı artışın olduğunu ve Diuron ile DNA molekülü arasında muhtemel bir etkileşim olduğunu ileri sürmüşlerdir. Diuron’un insan spermatozoa hücreleri üzerinde etkisini görmek için yapılan bir başka çalışmada bu urea herbisidinin spermatozoa üzerinde yapısal ve fonksiyonel etkileri olduğu, spermatozaların canlılık ve hareket kabiliyetini azalttığı bildirilmiştir (Malpuech-Brugere vd. 2001). Diuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumuna neden olduğu (Agrawal vd. 1996), Swiss albino farelerde dominant letal test sisteminde mutajenik olduğu (Agrawal ve Mehrotra, 1997), sıçanlarda maternal toksisiteyi ve anormal fetus sıklığını arttırdığı gösterilmiştir (Khera vd. 1979). 26 Fenilurea herbisitlerinin sıçanlarda hematoksik etkilerinin araştırıldığı çalışmada Monuron, Diuron ve Fenuron ile dişi fareler muamele edilmiş; monuron ve diuron muameleli sıçanlarda dalak ağırlığında doza bağlı artış dışında, organ ağırlıklarında doza bağlı etkinin görülmediği, eritrosit morfolojisinde değişiklikler meydana geldiği, histolojik açıdan lezyonlar oluştuğu ve hemolitik anemi ve methemoglobinomeni’ye bağlı olarak dalakta pigmentasyon artışı görüldüğü, dolayısı ile dalakta toksik olduğu bildirilmiştir (Wang vd. 1993). Diuron’un albino sıçanlarda kronik muamelesi sonucu yüksek oranda mortalite ve ağırlık kaybına sebebiyet vererek sıçan karaciğerinde anlamlı histolojik değişikliklere neden olduğu hepatotoksik etkisi olduğu gözlenmiştir (Agrawal ve Kumar, 1999). Linuron (phenylurea) EPA 1988’de akut memeli toksisite çalışmalarında Linuron’un düşük aktivite gösterdiğini ve CHO hücrelerinde ve Salmonella typhimurium’da gen mutasyon testi, UDS testi ve in vivo sıçan kemik iliği gibi birçok in vitro ve in vivo yöntemde genotoksisite göstermediğini bildirmiştir (Papapaulou vd. 2001). Sıçanlarda in vivo kemik iliği kromozom çalışmasında, aberasyon frekansında artış gözlenmemiş, in vitro sıçan hepatositlerinde UDS negatif sonuç vermiştir (DPR, 1987). Atrazine ve Linuron herbisitlerinin ayrı ayrı ve kombine şekilde insan lenfositlerinde test edildiği çalışmada, bu kimyasalların ayrı ayrı verilen dozlarda çok az kromozom hasarına neden olduğu, kombine verilen dozlarda anlamlı kromozom hasarını indüklediği saptanmıştır. Aynı çalışmada faredeki etkilerini gözlemek üzere aynı şekilde verilen kimyasallar kemik iliği hücrelerinde tüm gruplarda kromozom hasarını indüklemediklerini fakat kültüre edilen dalak hücrelerinde tüm gruplarda hasar gözlendiğini bildirmişlerdir (Roloff vd. 1992). Scassellati-Sforzolini vd. (1997) in vivo şartlarda linuron’un saf bileşik ve ticari formülasyonunun genotoksisitesini araştırdıkları çalışmalarında mikronukleuslu polikromatik eritrosit sayısında artış olmadığını, bununla beraber linuron’un hepotosit canlılığını etkilediğini bildirmişlerdir. Bu sitotoksisitenin karaciğerde DNA tek iplik kırıklarına neden olduğunu ileri sürmüşlerdir. Sıçan testis hücrelerinde sitotoksik olduğunu göstermişlerdir (Scassellati-Sforzolini vd. 1997). 27 Linuron’un insan lenfosit kültüründe MN sıklığını doza bağlı olarak lineer şekilde arttırdığı ve CBPI’i düşürerek doza bağlı sitotoksik etkili olduğu, elde edilen FISH sonuçlarından klastojenik ve aneujenik kimyasal olduğu tespit edilmiştir (Papapaulou vd. 2001). Birçok SU diabet hastalarını tedavi etmek için kullanılmaktadır. Bazı SU sınıfı ilaçlar (carbutamide, chloropropamide, glibenclamide, glipentide, glipizide, tolbutamide) NIDDM (insüline bağımlı olmayan diyabet) hastalarına verilmiştir. NIDDM hastası pankreası insülin üretir fakat vücut ihtiyacını karşılamaz. Sulfonylurea ilaçları pankreası daha fazla insulin üretmek üzere düzenler, şekerin vücut hücrelerine girmesi için insuline yardım eder ve kandan atılma hızını düşürür (Flogel, 1998). Bu SU ilaçlarından olan ve hipoglisemik ajan olarak kullanılan Chlorpropamide’in in vivo sitogenetik etkili olduğu saptanmıştır. Kontrole göre anlamlı kromatid aberasyonları ve kromatid değişim aberasyonları gözlenmiştir. Kromatid değişim tipi aberasyonların fazla olması sulfonylurea’ların kromozom kırıkları oluşturma etkisini göstermektedir (Watson vd. 1976). Kromatid değişim tipi aberasyonlar kromozomların kırılması ve yeniden birleşmesi ile oluşur. Disentriklerin anlamlı artışı hücrelerin klastojenik ajana maruz kaldığını gösterir. Chlorpropamide’in DNA molekülü ile direkt reaksiyona girecek veya hasar verecek bir mekanizması olmadığından, direkt DNA üzerine etki etmesi pek olası görünmez. Kuvvetle serum proteinine bağlanarak enzim fonksiyonunu etkiler ve indirekt olarak etkisini göstermektedir (Watson vd. 1976). Renner ve Münzner (1980) çalışmalarında Brown ve Wu’nun Chlorpropamide ile muameleli in vitro Çin Hamster V79 hücrelerinde KKD sayısını arttırdığını bulmuşlardır. Çin hamster hücrelerinde ve farede Chlorpropamide ve Tolbutamide’in doza bağlı olarak KKD’lerini indüklediklerini, KA’larını neden olmadığını, sıçan ve Çin Hamster eritrositlerinde MN’ları indüklemediğini ancak farede MN oluşumuna yol açtığını bildirmişlerdir (Renner ve Münzner, 1980). Chlorpropamide ve Tolbutamide nokta mutasyonlarını gösteren Ames testinde mutajenik değildir. In vivo testler içinde KKD testi en hassas olanıdır ve Chlorpropamide ve Tolbutamide pozitif etki göstermiştir (Renner ve Münzner, 1980). 28 2.5. Triasulfuron Triasulfuron 1992’de tescil edilerek tarım alanlarında kullanım izni alınmış, buğday, arpa üretiminde geniş yapraklı otların kontrolünde kullanılan bir herbisittir (EPA, 1992). Triasulfuron akut muamele sonrası bir çok laboratuar hayvanında toksik değildir. Test edilen konsantrasyonlarda ne sıçan ve tavşanlarda teratojenik ne de farede onkogeniktir. Mutajenite testleri de negatif sonuçlar göstermiştir (PMRA, 1995). Triasulfuron düşük akut toksisite gösterir. Triasulfuron’un genotoksisitesini belirlemek amacı ile Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarını, Çin Hamsterlerinde MN testi uygulanarak KA’larını, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde düzensiz DNA sentezini indüklemesi açısından testler uygulanmış ve sonuç olarak Triasulfuron’un mutajenik, klastojenik olmadığı ve UDS’ni indüklemediği saptanmıştır (EPA, 1998a). Triasulfuron bitkiler tarafından biotransformasyona uğrar. Akuatik sistemli sularda kalıcıdır. Besin kaynaklarında akut veya kronik tehlikesi olmadığı, memeli ve kuş üremesi üzerinde riskinin düşük olduğu tahmin edilmektedir. Triasulfuron’un birçok karasal ve akuatik bitkide toksik olduğu tahmin edilmektedir. Su mercimeği ve yeşil alglerde riski çok yüksektir (PMRA, 1995). 2.5.1. Triasulfuron’un bitki metabolizması Triasulfuron toprağa uygulanan sulfonylurea herbisididir. Buğday, arpa üretiminde ilkbahar ve sonbaharda çıkış öncesi veya çıkış sonrası uygulanan tek yıllık ve iki yıllık geniş yapraklı otların kontrolünde kullanılan bir pestisittir (EPA, 1992). Bitki kök ve sürgün kısımlarından alınır. Kök ve sürgün gibi bitkinin hızlı büyüyen kısımlarına taşınması sonucunda, hücre bölünmesini inhibe eder. Çimlendikten sonra muameleli topraktaki tohumlar toprak yüzeyine çıkamazlar. Triasulfuron’un buğdaydaki 29 mekanizması Fenil halkasının hidroksilasyonu ve urea köprüsünün hidrolitik ayrılması ile işler. Hidrolitik ayrılmadan sonra oluşan kalıntı esas Triasulfuron’dur ve düzenleyici olarak etki eder. Buğdaydaki metabolik mekanizma yabancı otlarda da aynı şekilde işler, ve otlar için düzenleyici olarak etki eden kalıntı esas bileşiktir (Pesticide Petition Filing, 1998). 30 3.MATERYAL METOD Yaptığımız tez çalışmasında materyal olarak insan periferik kanı, test maddesi olarak Triasulfuron kullanılmıştır. Denek olarak sağlıklı, sigara kullanmayan, 26-31 yaşları arasında 3 bayan ve 3 erkek donor seçilmiştir. Bu kimyasal maddenin periferik kan kültüründeki genotoksisitesini tespit etmek amacı ile kromozom aberasyonları (KA), kardeş kromatid değişimi (KKD) ve mikronukleus (MN) test yöntemleri kullanılmıştır. Uygulanan test yöntemleri ile KA, KKD ve MN sayıları saptanmış ve bölünme indekslerini tespit etmek için sırası ile MI, PI ve CBPI oranları belirlenmiştir. Pozitif kontrol olarak mitomisin C (MMC), eritici kontrol olarak ise Triasulfuron’u çözen Dimetil sulfoksit (DMSO) kullanılmıştır. Periferik kanın Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml) ve pozitif kontrol (MMC) ile 24 ve 48 saat muamelesi sonucu elde edilen veriler, eritici kontrol (DMSO) ile muamele sonucu elde edilen veriler ile istatistiksel olarak karşılaştırılmış ve sonuçlar değerlendirilmiştir. 3.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddelerin Hazırlanışı 3.1.1. Triasulfuron konsantrasyonlarının seçimi Çalışmada uygulanacak Triasulfuron konsantrasyonlarının seçimi için ön çalışma yapılmıştır. Uygulanacak konsantrasyonlar MI inhibisyonu (MI)>%50 temeline dayanılarak seçilmiştir (Sivikova ve Dianovski, 2000). 48 saat muamelede % 50 inhibisyona neden olan konsantrasyon 100 µg/ml, % 61 inhibisyona neden olan konsantrasyon 200 µg/ml olarak tespit edilmiştir. % 50 inhibisyona neden olan 100 µg/ml’nin iki katı 200 µg/ml ve yarısı 50 µg/ml çalışmamızda uygulanacak olan diğer 31 konsantrasyonlar olarak seçilmiştir. Bundan başka, konsantrasyon artışına bağlı olarak anormallik oranını tespit etmek amacı ile uygulanacak olan yüksek konsantrasyonların alt katları olan 5 ve 10 µg/ml çalışmamızda uygulayacağımız düşük konsantrasyonlar olarak seçilmiştir. Çözücü olarak kullanılan DMSO’in konsantrasyonu toksik olmayan miktarda, daha önce yapılan araştırmalara dayanarak seçilmiştir (Borroto vd 2001, Laffon vd 2001, Borroto vd 2002,). Kültür ortamındaki son konsantrasyonu %1’ i geçmemektedir. 3.1.2. Triasulfuron konsantrasyonları ve kimyasal yapısı Bu tez çalışmasında; KA, KKD ve MN test yöntemleri ile insan periferik kan hücreleri üzerindeki genotoksisitesi araştırılan Triasulfuron’un, kullanılan konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml) DMSO’te hazırlanmıştır. Çalışmamızda kullanılan Triasulfuron % 99 saflıktadır (CAS no: 82097-50-5 RIEDEL Kod:33383). Triasulfuron’un kimyasal yapısı aşağıda verilmiştir (PMRA, 1995). İsim:Triasulfuron Kod No: CGA-131036 Kimyasal İsmi: 1-[ 2-(2-chloroethoxy)phenylsulphonyl]-3-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5triazin-2-yl)urea CAS No: 82097-50-5 Moleküler Formülü: C14H16ClN5O5S Molekül ağırlığı: 401.83 Fiziksel formu: Katı kristal Renk: Beyaz-gri 32 Triasulfuron’un moleküler yapısı 3.1.3. Eritici kontrol konsantrasyonu Triasulfuron organik çözücülerde çözünen bir kimyasal formülasyona sahiptir. Organik çözücü olarak DMSO kullanılmıştır (Sigma CAS No: 67-68-5) Doku kültüründe DMSO’e bağlı anormallikleri, DMSO’te çözünmüş Triasulfuron’un neden olduğu anormalliklerden ayırmak amacı ile DMSO eritici kontrol olarak seçilmiştir. DMSO’in kültür ortamında fazla miktarda bulunması, bu kimyasala bağlı anormalliklere neden olacağından ortamdaki konsantrasyonu %1’i geçmemektedir (Laffon vd. 2001, Borroto vd. 2001, Borroto vd. 2002). 3.1.4. Pozitif kontrol konsantrasyonu Laboratuar şartlarımızda periferik kan kültürü metodunun standartlar ölçüsünde uygulandığını göstermek amacı ile daha önceden pozitif etkisi kanıtlanmış, anormallik yapan, genotoksik bir madde kullanılmıştır. Bunun için KA, KKD ve MN testlerinde pozitif sonuçlar veren MMC seçilmiştir (Sigma CAS No:50-07-7). Kan kültürüne MMC muamelesi sonucu anormallik sayısının istatistiksel açıdan anlamlı olması yöntemin 33 doğru uygulandığını göstermektedir. Yapılan ön çalışmalar sonucunda; KA ve KKD test yöntemi için 0.1 µg/ml MMC, MN test yöntemi için 0.25 µg/ml MMC’nin aberasyonlara neden olduğu tespit edilmiş ve pozitif kontrol olarak bu konsantrasyonlar kullanılmıştır. MMC flakonları (2 mg) 5 ml’lik steril distile su ile sulandırılmıştır. Elde edilen ana stoktan 1 ml alınarak 80 ml’ye distile su ile tamamlanmıştır. Hazırlanan bu solüsyondan KA ve KKD test yönteminleri için kültür ortamındaki son konsantrasyonu 0.1 µg/ml olacak şekilde 0.1 ml, MN test yöntemi için ise son konsantrasyonu 0.25 µg/ml olacak şekilde 0.25 ml alınarak kültür ortamına ilave edilmiştir. 3.1.5. Sörensen Fosfat Tamponunda Giemsa boyasının hazırlanışı Önce Sörensen fosfat A ve Sörensen fosfat B tampon çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmıştır. %10’luk giemsa boyası; 10 ml Giemsa (Merck) boyası, 5’er ml fosfat A ve B tamponu, 80 ml distile su karıştırılarak hazırlanmıştır(pH 6.8). Boya süzülerek kullanılmıştır. Buffer A: 11.34 gr KH2PO4 + 250 ml su (pH 4.8) Buffer B: 14.83 gr Na2HPO4.12H2O + 250 ml su (pH 9.3) 3.1.6. 5-Bromo-2- deoksiuridin (BrdUrd) hazırlanışı KKD test yönteminde kullanılan BrdUrd’in (Sigma CAS No: 59-14-3) kültür ortamındaki konsantrasyonu 10 µg/ml’dir. Bunu hazırlamak için BrdUrd’den 0.0025 gr tartılmış 5 ml steril distile su ilave edilerek mikropor filtrasyon (por çapı 0,2 µm) ile steril edilmiştir. Solüsyon dondurularak saklanmıştır. Kullanılacağı zaman bu solüsyondan 0.1 ml alınarak 5 ml’lik kültür ortamına ilave edilmiştir. 34 3.1.7. 2 x Standart Saline Citrate (SSC) solüsyonunun hazırlanışı 17.532 gr NaCl ve 8.823 gr Sodyum sitrat alınmış, steril distile su ile 1 lt’ye tamamlanmıştır (pH 6.8). 3.1.8. Hoechst 33258 hazırlanışı 0.0012 gr Hoechst 33258 (Sigma CAS No: 23491-44-3) 12 ml distile su eklenerek hazırlanan stok solüsyon +4 C0’de karanlıkta saklanmıştır. KKD yönteminde kullanılan Hoechst solüsyonu hazırlanırken, 100 ml 2xSSC solüsyonuna stok Hoechst solüsyonundan 0.05 ml ilave edilmiştir. 3.1.9. Cytochalasin B (Cyt-B) hazırlanışı Cyt-B (Sigma CAS No: 14930-96-2 ) stok solüsyonu 2 mg/ml olacak şekilde DMSO’te eritilerek hazırlanmıştır. Bunun için 10 mg Cyt-B 5 ml DMSO’te eritilmiş, elde edilen solüsyon 1’er ml olacak şekilde 5 tüpe bölünerek tüpler –70 C0’de saklanmıştır. MN test yönteminde kullanılacağı zaman 1’er ml’lik dondurulmuş stoklardan biri alınarak 20 ml’ye steril distile su ile tamamlanmıştır. Cyt-B’nin kültür ortamında son konsantrasyonu 6 µg/ml olacak şekilde seyreltilmiş solüsyondan 0.30 ml alınarak 5 ml’lik kültür ortamına ilave edilmiştir. 35 3.1.10. Antibiyotiklerin hazırlanışı Kültür ortamında oluşacak kontaminasyonu önlemek amacı ile Streptomisin ve Penisilin antibiyotikleri kullanılmıştır. 1 gr’lık Streptomisin sulfat (İ.E. Ulagay) flakonuna 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiş, 0.05 ml’si 100 ml’lik besiyerine eklenmiştir. 500 IU’lik penisilin (Bilim İlaç) flakonuna 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiş, 0.1 ml’si 100 ml’lik besiyerine eklenmiştir. 3.1.11. Phytohaemagglutinin M (PHG) hazırlanışı 1.2 mg’lık PHG-M (Biochrom) 5 ml steril distile su ilave edilerek eritilmiştir. 5 ml’lik kültür ortamına eritilmiş PHG’ten 0.07 ml eklenerek hücre stimülasyonu sağlanmıştır. 3.1.12. Kolkisin hazırlanışı 0.002 gr kolkisin (Sigma) 100 ml distile suda eritilmiş mikropor filtrasyon ile steril edilerek saklanmıştır. Kültür süresi bitmeden 4 saat önce son konsantrasyonu 0,6 µg/ml olacak şekilde kültüre kolkisin ilave edilmiştir. 36 3.1.13. Fosfat tamponunda giemsa boyası hazırlanışı 0.34 gr K2PO4 distile suda eritilerek 100 ml’lik solüsyon hazırlanmıştır. pH 6.8 olana kadar %50 NaHO ile titre edilmiştir. %5’lik giemsa boyası 5 ml giemsa ve 95 ml fosfat tamponu karıştırılarak hazırlanmıştır. 3.1.14. Hipotonik solüsyon hazırlanışı Hipotonik solüsyon taze olarak kullanıldığından preparasyon sırasında 0.279 gr KCl tartılarak 50 ml disitle suda eritilerek 0.075 M KCl hazırlanmıştır. Hazırlanan solüsyon 37 C0’lik etüvde bekletilmiştir. 3.1.15. Kültür ortamının hazırlanışı 79 ml Ham’s F-10 20 ml Fetal Calf Serum (FCS) 0.05 ml streptomisin sulfat 0.1 ml penisilin 1.4 ml PHG Yukarda verilen maddeler steril şartlarda karıştırılarak, hazırlanan 100 ml’lik besiyeri 25 ml’lik steril şişelere 5’er ml olacak şekilde paylaştırılmıştır. Hazırlanan besiyeri 5 gün içersinde kullanılmıştır. 5 ml’lik kültür ortamına donordan 1/10 oranında heparinli enjektör ile alınan kandan 0.3 ml ilave edilmiştir. 37 3.2. Kromozom Aberasyonu Sitogenetik Analiz Yöntemi Kromozom aberasyonu izlemek amacı ile hücre kültürünün yapılması ve preparatların hazırlanması. 3.2.1. Hücre kültürünün yapılması Triasulfuron’un neden olduğu kromozom aberasyonlarını izlemek amacı ile yapılan periferik kan kültürüne 48 saatlik inkübasyon süresi uygulanmıştır. Kanın 0,3 ml’si ilave edilerek hazırlanan kültür 37 C0’lik etüvde 48 saat inkübe edilmiştir. 48 saatlik muamelele için etkisi incelenecek kimyasal madde inkübasyon süresinin başlangıcında kültür ortamına eklenmiş, hasat işlemine kadar ortamda kalmıştır. 24 saatlik muamele için etkisi incelenecek kimyasal madde, inkübasyonun 24. saatinde kültür ortamına ilave edilmiş, hasat işlemine kadar ortamda kalmıştır. Bu işlem tüm Triasulfuron konsantrasyonları (5, 10, 50, 100, 200 µg/ml), eritici ve pozitif kontrol için 6 donorda uygulanmıştır. 3.2.2. Preparatların hazırlanması Kültür ortamına inkübasyon süresi (48 saat) dolmadan 4 saat önce, son konsantrasyonu 0.6 µg/ml olacak şekilde Kolkisin ilave edilerek, metafaz blokajı sağlanmıştır. İnkübasyon süresi sonunda sırası ile aşağıdaki işlemler uygulanmıştır. 1. Kültürler santrifüj tüplerine alınmış 2. 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiş 38 3. Süpernatan dikkatlice alınarak atılıp tüpün dibinde biriken hücreler pipetaj yapılarak dağıtılmış 4. Hücre süspansiyonu üzerine taze hazırlanmış, 37 C0’lik etüvde bekletilmiş 10 ml hipotonik eriyik (0.075 M’lık KCl) damla damla ilave edilmiştir. 5. Tüpler 37 C0’lik etüvde 12 dk bekletilmiştir. 6. 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir. 7. Süpernatan atılarak hücre kümesi pipetaj yapılarak dağıtılmıştır 8. Hücre süspansiyonu üzerine taze hazırlanmış +4 C0’de soğutulmuş 10 ml fiksatif (3/1 Metanol:Glacial acetic acid) damla damla karıştırarak ilave edilmiştir 9. Tüpler 20-30 dk +4 C0’de bekletilmiştir. 10. 2000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir 11. Süpernatan atılarak tüpün dibindeki hücre kümesi pipetajla dağıtılmıştır 12. 5 ml fiksatif ilave edilmiştir 13. Santrifüjden sonra süpernatanın atılıp pipetajın yapılması ve hücre kümesi üzerine 5 ml fiksatif ilave edilmesi işlemi iki defa daha tekrarlanmıştır 14. Son süpernatanın atılmasından sonra hücre kümesi üzerine 1 ml fiksatif ilave edilmiştir 15. Fikse edilmiş materyal yaklaşık 50 cm yükseklikten temizlenmiş soğuk lamlar üzerine damlatılarak kromozom preparatları hazırlanmıştır. 3.2.3. Boyama işlemi En az bir gece kurutulan preparatlar Sörensen buffer’da hazırlanan %10’luk giemsa ile 5 dk boyanmıştır. Boyadan çıkan preparatlar distile suda çalkalanmıştır. Boyanan preparatlar en az 1 gece kurutulmuş, entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. 39 3.3. Kardeş Kromatid Değişimi Sitogenetik Analiz Yöntemi Bir kromozomun kardeş kromatidlerinin farklı boyanması için FPG (Fluorescence Plus Giemsa) tekniğinin modifiye edilmiş şekli kullanılmıştır (Perry ve Wolff, 1974). 3.3.1. Kardeş kromatid değişiminin saptanması KKD test yöntemi kimyasal ve fiziksel ajanların sebep olduğu sitogenetik hasarın incelenmesinde kullanılan hassas bir metoddur. Bu test insanda, genellikle periferik kan lenfositlerine uygulanır. Periferik lenfositler hücre siklusunun G0 dinlenme evresinde oldukları için, fitohemaglutinin gibi mitojen tarafından bölünmeye girmesi için uygulanır. Yeterli sayıda mitotik hücre sayısı elde etmek ve fiksasyondan önce hücreleri (pro)metafazda durdurmak için iğ ipliği inhibitörü eklenir. KKD test yönteminde; kardeş kromatidler arasında meydana gelen değiş tokuşu mikroskopta görebilmemiz için kültür ortamına DNA’ya bağlanan ve farklı boyanma özelliği gösteren BrdUrd (5-bromo-2-deoxyuridine) eklenir. BrdUrd kromozoma yerleşen Timin analoğudur. İki tam hücre siklusu boyunca kültür ortamına BrdUrd eklenir. Böylece replikasyon sırasında, Timin bazı yerine, onun analoğu olan BrdUrd, DNA ipliğine yerleşmiş olur. Kromatidlerde DNA’nın bir ipliğine (polinükleotid zincirine) BrdUrd yerleşmişse mikroskopta Giemsa boyası ile koyu boyalı şekilde görülür. Eğer DNA’nın 2 ipliğine (polinükleotid zincirine) BrdUrd yerleşmişse mikroskopta açık renk görünür. Eğer bisbenzimidazole boyası olan Hoechst 33258 (bu bileşik DNA’da A+T baz çiftlerine bağlanır) kullanılırsa, DNA’nın her iki iplikçiği normal Timin içeriyorsa fluoresan mikroskopunda çok parlak görülür, DNA çift ipliğinin biri Timin diğeri BrdUrd içeriyorsa daha az parlak görülür. Böylece kardeş kromatidler birbirlerinden farklı boyanma özelliği gösterirler. Kardeş kromatid değişiminin olduğu noktada farklı boyanan kromatidler karşılıklı yer değiştireceğinden 40 dolayı oluşan kardeş kromatid değişimleri tespit edilebilir. Sonuçta KKD tanımlamada boyanma farklılığı temel belirleyicidir (Rooney ve Czepulkowski, 1992). KKD sayısını saptamak amacı ile 2. mitozu geçiren hücrelerden en az 20’sinin metafaz kromozomları incelenir (Schaeffer, 1980). Bunların ortalaması bulunur. Kontrol ve muamele edilen kültürlerin hücrelerindeki ortalama KKD sayıları arasındaki farkın önemli olup olmadığı istatistik olarak araştırılır. 3.3.2. Hücre kültürünün yapılması KKD yönteminde kullanılan kan kültürü 3.1.15.’te anlatıldığı şekilde hazırlanmış farklı olarak kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını sağlamak amacı ile inkübasyon başlangıcında ortama 10 µg/ml BrdUrd ilave edilmiştir. Kültür şişeleri aluminyum folyo ile sarılarak 37C0’de karanlıkta 72 saat inkübe edilmiştir. 3.3.3. 24 ve 48 saat muamele 48 saatlik muamelelerde etkisi incelenecek kimyasal madde inkübasyonun 24.saatinde, 24 saatlik muamelelerde etkisi incelenecek kimyasal madde inkübasyonun 48.saatinde kültür ortamına ilave edilmiş böylece lenfositlerin belli sürelerle kimyasal maddeler ile muamele edilmesi sağlanmıştır. Kimyasal maddeler inkübasyon sonuna kadar (hasat işlemi başlayana kadar) kültür ortamında kalmıştır. Bu işlem tüm Triasulfuron konsantrasyonları (5, 10, 50, 100 200 µg/ml), eritici ve pozitif kontrol için 6 donorda uygulanmıştır. 41 3.3.4. Preparatların hazırlanması İnkübasyonun 68. saatinde kültür ortamına 0.6 µg/ml Kolkisin ilave edilmiştir. 72. saatin sonunda, 3.2.2.’te anlatıldığı şekilde preparatlar hazırlanmıştır. 3.3.5. Boyama işlemi Bir günlük preparatlar 10 dk Hoechst 33258 solüsyonunda karanlıkta bekletilmiş, distile su ile yıkanmıştır. 2xSSC ile film teşkil edecek şekilde lamların üzeri kaplanarak 12 cm yükseklikteki 254 nm UV lambası altında 30 dk bekletilmiştir. Lamlar 2xSSC solüyonuna alınarak 60 C0’lik etüvde 60 dk inkübe edilmiştir. 2xSSC’den çıkarılan preparatlar pH: 6.8 Fosfat tamponunda hazırlanmış % 5’lik Giemsa’da 10 dk boyanmıştır. Preparatlar çeşme suyunda yıkanarak distile suda çalkalanmış, en az 1 gece kurutulmuş ve entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. 3.4. Mikronukleus Sitogenetik Analiz Yöntemi 3.4.1. Hücre kültürünün yapılması Çalışmamızda kullandığımız kimyasal maddelerin mikronukleus oluşumuna etkisini görmek için sitokinezi-blok MN yöntemi uygulanmıştır (Fenech ve Morley 1985). Kan kültürü 3.1.15.’de anlatıldığı gibi yapılmış farklı olarak sitokinezi önlemek amacı ile inkübasyonun 44. saatinde kültür ortamına 6 µg/ml Cyt-B ilave edilmiştir. Fenech ve Morley’in (1985) önerdikleri yöntemde sitokinezi bloklayan optimal Cytochalasin B konsantrasyonu 3 µg/ml olarak belirtilmesine rağmen daha sonra 42 Surrales vd. 1994’te tüm kan kültürleri için bu konsantrasyonu 6 µg/ml olarak bildirmişlerdir (Fenech vd. 1999). 3.4.2. 24 ve 48 saat muamele MN test yönteminde bir kez bölünmüş olan iki nukleuslu hücreler değerlendirmeye alınmıştır. Ancak bu yöntemde, hücre kültürünün 48. saatinde hücreler bir kez bölünmüş olmalarına rağmen, hem daha fazla iki nukleuslu hücre elde elde etmek hem CBPI oranını saptamak için 68 saatlik kültür süresi uygulanmıştır. 24 saat kimyasal madde muamelesi görmüş iki nukleuslu hücrelerde MN sayısını saptamak için kültür ortamının 44. saatinde, 48 saat kimyasal madde muamelesi görmüş iki nukleuslu hücrelerde MN sayısını saptamak için kültür ortamının 20. saatinde farklı konsantrasyonlarda Triasulfuron (5, 10, 50, 100 200 µg/ml) kültüre ilave edilmiştir. Ayrıca deneyin bir eritici kontrolü ve bir de pozitif kontrolü vardır. 3.4.3. Preparatların hazırlanması 1. 68 saatlik inkübasyon süresi sonunda kültür ortamı santrifüj tüplerine alınıp, 800 rpm’de 10 dk santrifüj edilmiştir 2. Süpernatan atılarak hücre kümesi hafif pipetaj yapılarak dağıtılmış 3. Üzerine buz soğuğunda taze hazırlanmış 0.075 M KCl ilave edilerek 2-3 dk oda ısısında bekletilmiştir 4. 800 rpm’de 10 dk santrifüj edilmiş 5. Süpernatan atılarak hafif pipetaj yapılmıştır 6. 6 ml %1 oranında formaldehit içeren soğuk Carnoy fiksatifi damla damla ilave edilerek pipetaj yapılmış 43 7. 20 dk oda ısısında bekletilmiş 8. 1000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir 9. Supernatan atılıp pipetaj yapılarak 5 ml formaldehitsiz fiksatif eklenmiş 10. 1000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir 11. Supernatan atılıp pipetaj yapılarak 5 ml formaldehitsiz fiksatif ilave edilmiş 12. 1000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir 13. Süpernatan atılarak pipetaj yapılmış 1 ml fiksatif eklenmiş 14. 3-4 cm yükseklikten temiz lamlar üzerine damlatılarak hücrelerin dağılması sağlanmış 15. Preparatlar bir gece kurutulmuştur. 3.4.4. Boyama işlemi 1 günlük preparatlar pH:6.8 Fosfat tamponunda hazırlanan %5’lik Giemsa ile 10 dk boyanmıştır. Boyadan çıkan preparatlar çeşme suyunda yıkanarak distile suda çalkalanmıştır. Preparatlar kurutularak entellan ile kapatılmıştır. 3.5. Daimi preparatların incelenmesi Uygulanan test yöntemlerinden elde edilen preparatların mikroskobik incelemeleri x1000 (10x100) büyütmede yapılmıştır. 3.5.1. KA test yöntemine göre hazırlanan preparatların incelenmesi KA test yöntemi ile hazırlanan preparatlarda iyi dağılmış 46 kromozom bulunan metafazlar tespit edilerek kromozomlarda kromatid kırık, kromozom kırık, kromatid gap, kromozom gap, kromatid değişimi, fragment gibi aberasyonlar belirlenmiştir. Her bir konsantrasyon ve muamele süresi için her donordan iyi dağılmış 100 metafaz hücresi sayılmıştır. 44 3.5.2. KKD test yöntemine göre hazırlanan preparatların incelenmesi KKD test yöntemi ile hazırlanan preparatlarda iyi dağılmış, 46 kromozom bulunan metafazlar tespit edilerek kardeş kromatidler arasında parça değişimleri belirlenmiştir. Her donordan, her bir konsantrasyon ve muamele süresi için ikinci mitozu geçiren 30 hücrede KKD sayısı saptanmıştır. 3.5.2.1. Kardeş kromatidlerin farklı boyanması Kromatidlerin BrdUrd ile farklı boyanmaları şekil 3.5.2.1.1.’de şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 3.5.2.1.1.’de üç generasyon boyunca hücrelerin bölünmeleri gösterilmektedir. Kesiksiz çizgi Timin yerleşmiş DNA ipliğini, kesikli çizgi BrdUrd yerleşmiş DNA ipliğini göstermektedir. Kromozomlarda siyah boyalı bölgeler Hoechst 33258 veya Akridin oranj ile boyandığında, floresan parlaklığının azaldığını gösteren bölgelerdir. Şekil 3.5.2.1.1. A’da: -1. bölünmenin sentez evresinde; BrdUrd Timin bazı yerine geçtiğinden, yeni oluşan 2 DNA moleküllerinin birer iplikleri BrdUrd içermektedir. - 2. bölünmede; bir ipliği BrdUrd içeren DNA molekülü, sentez fazında BrdUrd’li ortamda replike olacağından, oluşan 2 DNA molekülünden bir tanesinin iki iplikçiği de BrdUrd içerecektir. Diğer kromatidde DNA molekülünden biri BrdUrd içerirken, diğeri normal Timin bazı içerecektir. İki ipliği de BrdUrd içeren kromatid floresan mikroskobunda az parlak görülürken diğeri parlak görülecektir. Giemsa ile boyama yapılırsa sadece BrdUrd içeren kromatid açık renk, Timin bulunan kromatid koyu renk görülecektir. -3. bölünmede de; Timin yerine BrdUrd yerleşmesi ve yeni oluşan kromozomlar görülmektedir. Şekil 3.5.2.1.1. B’de: -1. bölünmenin sentez evresinde; KKD gerçekleşmektedir. Ancak bir iplik Timin bazı, diğer DNA ipliği BrdUrd içerdiğinden mikroskopta koyu boyalı görünmektedirler. 45 -2. bölünmede; kardeş kromatid değişikliği yapmış kromozomlar replike olurken, aynı kromatid üzerinde Timin içeren ve Timin içermeyen bölgeler meydana gelecektir. Şekil 3.5.2.1.1. C’de 2. bölünmede ve D’de 3. bölünmede gerçekleşen KKD sonucu, kromozomlarda tanımlamada bu BrdUrd boyanma ile farklı farklılığı boyanma temel gösterilmektedir. belirleyicidir (Rooney KKD ve Czepulkowski,1992). Şekil 3.5.2.1.1. Ökaryotik kromozom yapısında BrdUrd ile işaretleme modeli. Şekilde boyanmamış kısımlar Floresan mikroskobunda parlak, ışık mikroskobunda ise Giemsa ile koyu renk görünecektir. 3.5.3. MN test yöntemine göre hazırlanan preparatların incelenmesi MN test yöntemi ile hazırlanan preparatlarda iki nukleuslu hücreler tespit edilerek mikronukleuslu hücre sayısı ve içerdiği mikronukleus sayısı belirlenmiştir. Her donordan, tüm konsantrasyon ve muamele süreleri için 1000 hücre sayılmıştır. 46 3.6. Bölünme Oranının Saptanması 3.6.1. Mitotik indeks (MI) KA test yönteminde bölünme oranını tespit etmek amacı ile her donordan, tüm konsantrasyon ve muamele süreleri için 2500 hücre sayılarak bölünen hücre sayısı belirlenmiştir. MI=MX100/T (M:Metafaz hücre sayısı, T:Toplam hücre sayısı) formülüne göre hesaplanmış. Mitotik indeks inhibisyonu, 100-(Muamele MI X 100/kontrol MI) (Rojas vd. 1993) formülüne göre hesaplanmıştır. 3.6.2. Proliferasyon indeksi (PI) KKD test yönteminde birinci, ikinci, üçüncü bölünmeyi geçiren hücre sayısını tespit etmek amacı ile 100 metafaz incelenmiştir. PI=(MI+2.MII+3.MIII)/N (MI: 1.bölünmedeki hücre sayısı, MII: 2.bölünmedeki hücre sayısı, MIII: 3. bölünmedeki hücre sayısı, N: Toplam metafaz sayısı) formülüne göre hesaplanmıştır. 3.6.2.1. Birinci, ikinci, üçüncü mitoz hücrelerinin tespit edilmesi Normal Timin bazı içeren DNA çift iplikçiğinin, birinci replikasyonu sırasında tamamlayıcı ipliklerine BrdUrd girmektedir. Replikasyondan sonra bu kromozomun, her iki kromatidinde de DNA çift iplikçiğinden biri normal Timin, diğer iplikçik BrdUrd içermektedir. Birinci mitoz bölünme sırasında bu hücrelerin kromozomları Giemsa ile koyu renk boyanarak şekil 3.6.2.1.1.’deki gibi görünmektedir. Aynı hücreler ikinci bölünmeye girecekleri zaman replikasyon sırasında DNA zincirinin tamamlayıcı 47 ipliklerine BrdUrd girmektedir. Dolayısı ile bir kromozomun bir kromatidi normal Timin ve BrdUrd, diğer kromatid sadece BrdUrd içermektedir. İkinci mitoz bölünme sırasında bu hücrelerin kromozomlarının kromatidleri farklı boyanma özelliği göstermektedir. Bir kromatidi oluşturan DNA çift iplikçiğinden ikisi de BrdUrd içeriyorsa o kromatid Giemsa ile çok açık renk, çift iplikçikten biri BrdUrd diğeri normal Timin içeriyorsa koyu renk boyanarak şekil 3.6.2.1.2.’deki gibi görünmektedir. Kardeş kromatid değişimleri ikinci mitoz bölünmeyi geçiren bu hücrelerde tespit edilmektedir. Bu hücreler üçüncü bölünmeye girdiklerinde replikasyon sırasında tamamlayıcı ipliklerine BrdUrd girmektedir. Böylece üçüncü bölünmede; DNA iplikçiği tamamen BrdUrd içeren, Giemsa ile boyanmamış kromozomlar ile sadece bir kromatidi Giemsa ile boyanan kromozomlar şekil 3.6.2.1.3’teki gibi görünmektedirler. Hücre kültüründe replikasyon indekslerinin hesaplanabilmesi için birinci, ikinci ve üçüncü bölünmelerini geçiren hücreler tespit edilmektedir. Şekil 3.6.2.1.1. SCD boyama tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda birinci bölünmeyi geçiren bir hücrenin metafaz görünüşü. Kromozomların her iki kromatidleri de Giemsa ile koyu boyanmaktadır. 48 Şekil 3.6.2.1.2. SCD boyama tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda ikinci bölünmeyi geçiren bir hücrenin metafaz görünüşü. Kromozomların birer kromatidi Giemsa ile koyu boyanmakta, diğer kromatid boyanmamaktadır. Oklar KKD’lerini göstermektedir. Şekil 3.6.2.1.3. SCD boyama tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda üçüncü bölünmeyi geçiren bir hücrenin metafaz görünüşü. Bazı kromozomlar Giemsa ile boyanmamakta, bazı kromozomların bir kromatidleri koyu boyanmaktadır. 49 3.6.3. Sitokinezi-blok proliferasyon indeksi (CBPI) MN test yönteminde bir, iki, üç ve dört nukleuslu hücre oranını tespit etmek amacı ile 500 hücre sayılmıştır. CBPI= (MI+2.MII+3.M(III+IV))/N (MI: 1 nukleuslu hücre sayısı, MII: 2 nukleuslu hücre sayısı, MIII: 3 nukleuslu hücre sayısı, MIV: 4 nukleuslu hücre sayısı, N: Toplam hücre sayısı) formülüne göre hesaplanmıştır (Surrales vd. 1995). 3.6.3.1. İki, üç, dört nukleuslu hücrelerin ve mikronukleusların tespit edilmesi CBPI hesaplanmasında bir, iki, üç ve dört nukleuslu hücreler tespit edilmektedir. CBMN tekniğine göre hazırlanan hücre kültürlerinde lenfosit hücresi sitokinez önlenerek bölündüğünden dolayı oluşan iki yeni nukleus aynı sitoplazma içinde kalacaktır. Bir kez bölünmüş iki nukleuslu hücreler Şekil 3.6.3.1.1.’deki gibi görünmektedirler. Mikronukleus tespiti bir kez bölünen ve iki nukleus taşıyan hücrelerde yapılmaktadır. Oluşan iki nukleuslu hücrede bulunan nukleuslardan biri bir kez daha bölünme geçirirse, aynı sitoplazma içinde üç nukleus bulunacaktır. Üç nukleuslu hücreler mikroskopta şekil 3.6.3.1.2.’deki gibi görünmektedir. İki nukleuslu hücrelerde bulunan nukleusların ikisi de ikinci mitoz geçirirse aynı sitoplazma içinde dört nukleus bulunacaktır. Dört nukleuslu hücreler mikroskopta şekil 3.6.3.1.3.’teki gibi görünmektedir. 50 Şekil 3.6.3.1.1. Sitokinezi-blok MN tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda birinci bölünme sonucu oluşan iki nukleuslu evre. İki nukleuslu hücrede gözlenen mikronukleuslar oklarla gösterilmektedir. Şekil 3.6.3.1.2. Sitokinezi-blok MN tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda birinci bölünme sonucu oluşan 2 nukleustan birinin, ikinci bölünmesini yapması sonucu gözlenen üç nukleuslu evre. 51 Şekil 3.6.3.1.3. Sitokinezi-blok MN tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda birinci bölünme sonucu oluşan iki nukleustan, ikisinin de ikinci bölünmesini yapması sonucu gözlenen dört nukleuslu evre. 3.7. İstatistik Analizler Galloway vd. (1994) çalışmalarında deneysel birimin hücre olduğunu bundan dolayı yapısal aberasyonlu hücre yüzdelerinin değerlendirilmesi gerektiğini bildirmişlerdir. Bizim çalışmamızda kullanılan kimyasal maddenin kontrole göre anlamlı KA ve MN’lara neden olup olmadığı X2 testi kullanılarak tespit edilmiştir. KKD test yöntemi sonuçları SPSS 10.0 programında Mann Whitney U testi kullanılarak değerlendirilmiştir. MI, CBPI ve PI değerlerinin anlamlılığı X2 testi ile tespit edilmiştir. MN test yönteminde anormalliklerin doza bağlı etkileri (doz-cevap eğrileri) fortran IV programlama dili ile Contampoisson ve Mpol programları yardımı ile hesaplanmıştır. 52 KA, KKD ve MN test yöntemlerinden elde edilen anormallikler, bölünme indeksleri ve konsantrasyonlar arasındaki ilişki regresyon analizi ile tespit edilmiş, anlamlılıkları Pearson korelasyon testi ile tespit edilmiştir. 53 4.SONUÇLAR 4.1. Kromozom Aberasyon (KA) testi Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan lenfosit kültüründe altı donorda gözlenen total KA’ları ve MI değerleri Tablo 4.1.1.’de verilmiştir. Tabloda; çalışmada gözlenen izokromatid kırık, kromatid kırık, izokromatid gap, kromatid gap, kromatid değişimi, fragment gibi kromozom aberasyonlarından başka hücre başına düşen kromozom aberasyon sayısı ve anormal hücre yüzdesi de gösterilmiştir. KA test yönteminde, deneysel birim hücredir. Dolayısı ile anormallik taşıyan hücrelerin yüzde oranları hesaplanarak test edilen kimyasalın klastojenitesi değerlendirilmiştir. Her bir konsantrasyon ve muamele süresi için 100 metafaz sayılmıştır. Kromozomlarda despiralizasyon bölgeleri olarak düşünülen gaplar, kromozom aberasyonları olarak kabul edilmemekle beraber, bir anormallik sonucu ortaya çıkmış yapılardır. Bu nedenle, tablolarda gaplara sahip hücreler gösterilmiş fakat bu hücreler istatistiksel olarak değerlendirilmeye alınmamıştır. Tüm donorlardan elde edilen sonuçlar total olarak değerlendirildiğinde; (Tablo 4.1.1.) 24 ve 48 saat muameleli grupların her ikisinde de; Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının uygulanması sonucu anormal hücre yüzdesinde anlamlı artış gözlenmemiştir. Deneysel birim olarak hücreyi kabul ettiğimiz ve KA frekansını değerlendirdiğimizden dolayı, total veriler de kromozom kırıklarına neden olmadığından dolayı Triasulfuron’un klastojenik olmadığı saptanmıştır. 24 ve 48 saat muameleli gruplar kendi aralarında karşılaştırıldığında; muamele süresi ile KA sıklığı arasında anlamlı bir ilişkinin olmadığı gözlenmiştir. KA test yönteminde hücrelerin bölünme oranları toksisite değerlendirilmesinde kullanılan bir kriterdir. Donorlardan elde edilen MI değerleri total olarak değerlendirildiğinde 24 ve 48 saat muameleli gruplarda ve tüm konsantrasyonlarda Triasulfuron MI’i anlamlı olarak düşürmüştür (Tablo 4.1.1.). 6 donordan elde edilen total MI değerlerinin inhibisyon % oranları da hesaplanmıştır. Buna göre 48 saat 54 muameleli grupta 100 µg/ml Triasulfuron konsantrasyonu MI’i %50, 200 µg/ml Triasulfuron konsantrasyonu MI’i %61 oranında inhibe ettiği gözlenmiştir. 24 saat muameleli grupta 100 ve 200 µg/ml Triasulfuron konsantrasyonları ise MI’i sırasıyla %28 ve %33 oranında azaltmıştır. Mitotik indeks inhibisyon oranı sonuçlarına göre; insan lenfosit kültürlerinin Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 48 saat muamelesi sonucu gözlenen toksisite, 24 saat muamelesi sonucu gözlenen toksisiteden fazladır (Şekil 4.1.1.). MI değerlerinin konsantrasyon artışına bağlı olarak azaldığı saptanmıştır. Her iki muamele süresinden elde edilen MI değerleri ile uygulanan konsantrasyonlar arasındaki ilişki kuadratik regresyon analizi ile tespit edilmiş, Pearson korelasyon testi ile anlamlılığı araştırılmıştır. 24 saat için Kuadratik regresyon R2=%83.2, Pearson korelasyon testi p=0.04; 48 saat için Kuadratik regresyon R2=%81.8, Pearson korelasyon testi p=0.04 olarak saptanmıştır. Dolayısı ile konsantrasyon artışı ile toksisite artışı birbirleri ile ilişkilidir. Konsantrasyon arttıkça MI azalmaktadır. (Şekil 4.1.1.) Şekil 4.1.2.’de; 24 ve 48 saat muamele sonucu 6 donordan elde edilen total KA%’si ile MI%’si grafik üzerinde gösterilmiştir. Her ikisinde de MI düştükçe KA sayısının arttığı görülmektedir. KA frekansı ile MI arasındaki ilişki Lineer regresyon analizine göre tespit edilmiş, Pearson korelasyon testine göre aralarında anlamlı negatif korelasyon saptanmıştır (24 saat için Lineer regresyon R2=%90.1, Pearson korelasyon p=0.002; 48 saat için Lineer regresyon analizi R2=%87.3, Pearson korelasyon p=0.006). Toksisite ile aberasyon oranı ilişkilidir. Toksisite arttıkça kromozom aberasyonları da artmaktadır. Bundan başka 48 saatlik muamelede KA%’si ile konsantrasyon artışı arasında ilişki saptanmıştır (Regresyon analizi R2=%88.2;Pearson korelasyon p=0.005 ). Çalışmada gözlenen KA’larına ait örnekler şekil 4.1.3, 4.1.4, 4.1.5, 4.1.6., 4.1.7. ve 4.1.8.’de gösterilmiştir. KA testi sonuçlarına göre test edilen konsantrasyonlarda Triasulfuron insan periferik kan lenfosit kültüründe düşürdüğünden dolayı sitotoksiktir. klastojenik değildir. Ancak MI’i anlamlı 55 Tablo 4.1.1. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan lenfosit kültüründe 6 donorda (I, II, III, IV, V, VI) gözlenen total kromozom aberasyonları (KA) ve mitotik index (MI) değerleri. Konsant, konsantrasyon; KA/hücre, Kromozom aberasyonu/hücre; Izok kırık, izokromatid kırık; Krom kırık, Kromatid kırık; Krom Değişim, Kromatid değişimi; krom gap, kromatid gap; izok gap, izokromatid gap; MI, mitotik index. *P≤0,05; **P≤0,01; ***P≤0,001 (KA için Fisher’s exact X2 testi, MI için X2 testi uygulanmıştır) (İzokromatid kırık, gap ve kromatid değişimi kromozomda iki yerde kırılma meydana gelmesi sonucu oluştuğundan dolayı, total anormallik sayısı belirlenmesinde bu anormallikler iki katı olarak hesaplanmıştır). Süre (saat) 24 Anormal hücre % ±S.H. 0 0±0 10 µl/ml DMSO 0.1 MMC 5 10 50 100 200 10 µl/ml DMSO 0.1 MMC 5 10 50 100 200 MI 48 Konsant. (µg/ml) KA/ hücre (gap-) Kromozom aberasyonları Kromatid tip Kromozom tip aberasyonlar aberasyonlar Krom Krom Frag- Krom İzok Izok kırık Değişim ment gap kırık gap 0 0 0 5 0 2 MI 7,33±0,48 0,16 0.03 0.03 0.03 0.04 0.05 **9,33±2,37 1,83±0,54 2,17±0,98 2,33±0,71 2,83±0,79 3,17±0,87 10 4 3 10 8 6 11 0 1 0 0 0 3 1 3 1 0 2 9 3 3 16 2 7 32 6 6 3 9 11 3 1 2 2 4 1 ***4,00±0,71 ***6,16±0,78 ***6,30±0,78 ***5,64±0,71 ***5,25±0,91 ***4,88±0,93 0,01 0,83±0,31 0 0 3 2 3 0 7,26±0,89 0,29 0,03 0,04 0,03 0,07 0,09 ***17±1 2,17±0,70 2,5±1,17 2,67±1,17 4±1,55 5,33±2,57 28 4 6 8 4 2 36 1 0 0 0 1 9 1 2 5 2 8 4 6 4 10 5 15 33 7 9 3 18 21 3 3 0 2 2 1 ***3,00±0,57 ***5,50±0,72 ***5,04±0,65 ***3,92±0,70 ***3,63±0,40 ***2,86±0,43 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 y = -1,2708Ln(x) + 7,3201 R2 = 0,9333 y = -2,3608Ln(x) + 7,2904 R2 = 0,983 10 µl/ml DM SO M I 24 saat 5 µg/ml Trias. 10 µg/ml Trias. M I 48 saat 50µg/ml Trias. 100µg/ml 200µg/ml Trias. Trias. Log. (M I 24 saat) Log. (M I 48 saat) Şekil 4.1.1. Periferik kan kültüründe Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının 24 ve 48 saat muamelesi sonucu gözlenen MI değerleri. (24 saat ve 48 saat muamele sürelerinde MI ile konsantrasyon arasında ilişki her ikisinde de Pearson korelasyon p=0,04). 56 7,5 4 y = -0,1216x 2 + 1,3944x - 0,981 R2 = 0,9208 3,5 7 6,5 2,5 2 MI KA% 3 6 1,5 5,5 1 5 y = 0,0336x 2 - 0,6819x + 7,804 R2 = 0,931 0,5 0 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. KA% 10 µg/ml Trias. MI 50µg/ml Trias. Polinom (KA%) 100µg/ml Trias. 4,5 200µg/ml Trias. Polinom (M I) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 8 y = 0,0705x 2 + 0,3108x + 0,759 R2 = 0,9481 7 6 5 MI KA% A 4 y = 0,1005x 2 - 1,5246x + 8,513 R2 = 0,9776 3 2 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. KA% 10 µg/ml Trias. MI 50µg/ml Trias. Polinom (KA%) 100µg/ml Trias. 200µg/ml Trias. Polinom (M I) B Şekil 4.1.2. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi sonucu altı donorda gözlenen total KA%’si ve MI değerleri. A; 24 saat muamele sonuçları; B, 48 saat muamele sonuçları. KA%’si ile MI arasında ilişki (Pearson korelasyon 24 saat için: p=0,002; 48 saat için p=0,006). KA%’si ile konsantrasyon arasında ilişki (Pearson korelasyon 48 saat için: p= 0,005). 57 Şekil 4.1.3. 200 µg/ml Triasulfuron’un 1. donorun lenfosit kültüründe 48 saat muamelesi sonucu gözlenen fragment ve kromatid gap. Şekil 4.1.4. 50 µg/ml Triasulfuron’un 3. donorun lenfosit kültüründe 48 saat muamelesi sonucu gözlenen kromatid kırık. 58 Şekil 4.1.5. 5 µg/ml Triasulfuron’un 3. donorun lenfosit kültüründe 24 saat muamelesi sonucu gözlenen kromatid gap. Şekil 4.1.6. 200 µg/ml Triasulfuron’un 3. donorun lenfosit kültüründe 48 saat muamelesi sonucu gözlenen fragment. 59 Şekil 4.1.7. 100 µg/ml Triasulfuron’un 1. donorun lenfosit kültüründe 48 saat muamelesi sonucu gözlenen izokromatid kırık. Şekil 4.1.8. 0,1 µg/ml MMC’nin 1. donorun lenfosit kültüründe 24 saat muamelesi sonucu gözlenen kromatid değişimi. 60 4.2. Kardeş Kromatid Değişim (KKD) testi Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan lenfosit kültürlerinde altı donorda gözlenen total ortalama KKD/hücre, PI değerleri Tablo 4.2.1.’de verilmiştir. KKD test yönteminde deneysel birim hücredir. Her bir konsantrasyon ve muamele süresi için ikinci mitoz bölünmeyi geçiren 30 iyi dağılmış metafaz hücresi sayılmıştır. Sayılan 30 hücrenin tamamı KKD içermektedir. Dolayısı ile KKD testinin analizinde KKD içeren hücreler değil, hücre başına düşen KKD sayıları değerlendirilerek test edilen kimyasalın genotoksisitesi değerlendirilmiştir. 6 donorun total verilerine bakıldığında; Triasulfuron’un tüm konsantrasyonları 24 ve 48 saat muamele sonucu, ortalama KKD/hücre sayısında anlamlı artışa neden olmuştur (Tablo 4.2.1.). Triasulfuron’un 5, 100, 200 µg/ml konsantrasyonlarının 24 saatlik muamelesi, 10, 50, 100, 200 µg/ml konsantrasyonlarının 48 saat muamelesinin PI’ini kontrole göre anlamlı olarak düşürdüğü görülmektedir (Tablo 4.2.1.). Şekil 4.2.1.’de 24 ve 48 saat muamele sonucu altı donordan elde edilen total ortalama KKD/hücre ve PI değerleri grafik üzerinde gösterilmiştir. 48 saatlik muamele süresinde ortalama KKD/hücre ile PI arasında anlamlı ilişki saptanmıştır (Kuadratik Regresyon analizi R2=81.5%; Pearson korelasyon p= 0.03). KA test yönteminden elde edilen MI ve KKD test yönteminden elde edilen PI arasında ilişki olduğu saptanmıştır. Konsantrasyon arttıkça MI ve PI indeksleri azalmaktadır. PI ve MI arasındaki ilişki 24 saat muamelede anlamlı olmamasına rağmen (Pearson korelasyon p=0.09), 48 saat muamelede aralarındaki ilişki anlamlıdır (Kuadratik Regresyon analizi R2= % 84.1; Pearson korelasyon p= 0.03). KKD çalışması sonucunda elde edilen kardeş kromatid değişimlerine ait örnekler şekil 4.2.2, 4.2.3, 4.2.4, 4.2.5, 4.2.6’da gösterilmektedir. KKD testi sonuçlarına göre, Triasulfuron insan lenfosit kültüründe DNA üzerinde hasar yaparak tüm konsantrasyonlarda ortalama KKD/hücre frekansını kontrole göre anlamlı olarak arttırdığı için muhtemel genotoksik, replikasyon indeksi olan PI değerini kontrole göre anlamlı olarak düşürdüğü için sitotoksik etkilidir. 61 Tablo 4.2.1.Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan lenfosit kültüründe 6 donorda (I, II, III, IV, V, VI) gözlenen Kardeş kromatid değişimleri (KKD) ve Proliferasyon indeksi (PI) değerleri. *P≤0,05; **P≤0,01; ***P≤0,001. (Ortalama KKD/hücre için Mann Whitney U testi, PI için X2 testi uygulanmıştır.) 10 µl/ml DMSO 0,1 MMC 5 10 50 100 200 4,74±0,12 ***26,38±1,32 ***6,29±0,20 ***6,39±0,17 ***6,65±0,19 ***7,35±0,21 ***6,99±0,21 M1' deki hücre sayısı 157 223 163 146 146 168 192 10 µl/ml DMSO 0,1 MMC 5 10 50 100 200 5,11±0,24 ***65,62±1,75 ***5,99±0,20 ***6,93±0,23 ***6,84±0,24 ***7,42±0,26 ***7,45±0,22 77 236 85 118 166 165 148 Muamele Konsantrasyon süresi (µg/ml) (saat) 24 48 Ortalama KKD/hücre ±S.E M2' deki hücre sayısı 162 243 201 178 190 202 176 207 261 185 207 194 223 206 M3' teki PI hücre sayısı 281 2,21±0,07 134 ***1,85±0,06 236 *2,12±0,07 276 2,22±0,07 264 2,20±0,08 230 **2,10±0,08 232 *2,07±0,07 316 103 330 275 240 212 246 2,40±0,05 ***1,78±0,05 2,41±0,04 **2,26±0,06 ***2,12±0,08 ***2,08±0,07 ***2,16±0,08 62 8 y = 1,2911Ln(x) + 4,986 R2 = 0,8967 2,25 7 2,2 6,5 2,15 6 5,5 PI Ortalama KKD/hücre 7,5 2,3 2,1 5 y = -0,0089x 2 + 0,0402x + 2,148 R2 = 0,5627 4,5 4 2,05 2 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml T rias. 10 µg/ml T rias. 50µg/ml 100µg/ml 200µg/ml T rias. T rias. T rias. Ortalama KKD/hücre Log. (Ortalama KKD/hücre) PI Polinom (PI) 8 Ortalama KKD/hücre 7,5 7 y = -0,1016x 2 + 1,1655x + 4,085 R2 = 0,9631 6,5 6 5,5 y = 0,0141x 2 - 0,1653x + 2,603 R2 = 0,8391 5 4,5 4 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. 10 µg/ml Trias. Ortalama KKD/hücre Polinom (Ortalama KKD/hücre) 3 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2 PI A 50µg/ml 100µg/ml 200µg/ml Trias. Trias. Trias. PI Polinom (PI) B Şekil 4.2.1.: Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi sonucu altı donorda gözlenen total ortalama KKD/hücre ve PI değerleri. A; 24 saat muamele sonuçları; B, 48 saat muamele sonuçları. (48 saatlik muamele grubunda ortalama KKD/hücre ile PI arasında ilişki vardır. R2= 81,5; Pearson korelasyon p= 0,03). 63 Şekil 4.2.2. SCD boyama tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda ikinci bölünmeyi geçiren bir hücrenin metafaz görünüşü. 10 µl/ml DMSO’in 1.donorda 48 saat muamelesi sonucu gözlenen KKD’ler oklarla gösterilmiştir. Şekil 4.2.3. 5 µg/ml Triasulfuron’un 2. donorun lenfosit kültüründe 48 saat muamelesi sonucu gözlenen KKD’ler. 64 Şekil 4.2.4. 5 µg/ml Triasulfuron’un 1. donorun lenfosit kültüründe 24 saat muamelesi sonucu gözlenen KKD’ler. Şekil 4.2.5. 50 µg/ml Triasulfuron’un 3. donorun lenfosit kültüründe 24 saat muamelesi sonucu gözlenen KKD’ler. 65 Şekil 4.2.6. 0.1 µg/ml MMC’nin 2. donorun lenfosit kültüründe 48 saat muamelesi sonucu gözlenen KKD’ler. 66 4.3. Mikronukleus (MN) testi İnsan lenfosit kültürlerinin Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilmesi sonucu altı donorda gözlenen total MN sayısı, ‰ BNMN değerleri tablo 4.3.1.’de verilmiştir. Ayrıca tablolarda iki nukleuslu hücrelerde mikronukleus dağılımı, sitotoksisite indeksleri olarak sitokinezi-blok proliferasyon indeksi (CBPI) ve iki nukleuslu hücre frekansı (%BN) da gösterilmiştir. MN test yönteminde mikronukleus taşıyan iki nukleuslu hücrelerin (BNMN) ‰ oranları analiz edilerek genotoksisite değerlendirmesi yapılmıştır. Her bir konsantrasyon ve muamele süresi için 1000 iki nukleuslu hücre sayılarak kontrole göre anlamlılığı test edilmiştir. Altı donordan elde edilen total verilere göre, MN sayısında 24 ve 48 saat muamele sürelerinin her ikisinde de kontrole göre anlamlı artış görülmektedir (Tablo 4.3.1.). BNMN ‰’sinde ise 24 saatlik muamelede 100 ve 200 µg/ml Triasulfuron, 48 saatlik muamelede 200 µg/ml Triasulfuron konsantrasyonları istatistiksel açıdan kontrole göre anlamlı BNMN oluşumuna yol açmıştır. 48 saatlik muamele grubunda muamele edilen konsantrasyon arttıkça ‰BNMN frekansının da arttığı görülmektedir. 48 saat muameleli gruplarda gözlenen sonuçlara göre, doz-cevap eğrisi şekil 4.3.1.’de gösterilmiştir (U testi U>1.96; Lineer regresyon analizi R2=84.1; Pearson korelasyon testi p=0.01). MN test yönteminde insan lenfosit kültürüne 24 ve 48 saat süre ile muamele edilen tüm Triasulfuron konsantrasyonlarının CBPI’i düşürdüğü Tablo 4.3.1.’te görülmektedir. Şekil 4.3.2.’de 24 ve 48 saat muamele sonucu altı donordan elde edilen total BNMN ‰’si ve CBPI değerleri grafik üzerinde gösterilmiştir. Konsantrasyon ve süreye bağlı olarak çalışmamızda gözlenen KA ve MN frekansları şekil 4.3.3.’te gösterilmiştir. Lineer regresyon analizi ve Pearson korelasyon testine göre her iki muamele periyodunda MN‰’si ile KA%’si arasında anlamlı pozitif korelasyon saptanmıştır (24 saat için Lineer regresyon analizi R2= 88.8%, Pearson korelasyon p=0.001; 48 saat için Lineer regresyon analizi R2=95.3%, Pearson korelasyon p=0.005). Çalışmada gözlenen MN’lara ait örnekler şekil 4.3.4, 4.3.5’te gösterilmiştir. MN test sonuçlarına göre; KA test yönteminde elde edilen MI değerlerini %50’den daha yüksek oranlarda inhibe eden toksik konsantrasyon olan 200 µg/ml 67 Triasulfuron konsantrasyonu, MN test yönteminde BNMN‰ frekansını hem 24 hem de 48 saat muamele süresinde anlamlı arttırdığı için genotoksik etkilidir. Triasulfuron’un tüm konsantrasyonları, bölünme indeksi olan PI değerlerini anlamlı düşürdüğü için test edilen herbisit sitotoksik etkilidir. 68 Tablo 4.3.1. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muameleli insan lenfosit kültüründe altı donorda gözlenen toplam MN, BNMN ve CBPI değerleri. MN,toplam mikronukleus sayısı; BNMN, bir veya birden fazla mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre sayısı; BNMN‰±S.H., Ortalama 1000 iki nukleuslu hücrede gözlenen mikronukleus sayısı±Standart Hata; BN%, İki nukleuslu hücre yüzdesi; CBPI, sitokineziblok proliferasyon indeksi. *P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001 (BNMN için Fisher’s exact testi ve CBPI için X2 testi yapılmıştır.) Süre (saat) Konsant. >4 BN hücrelerde MN dağılımı MN (µg/ml) 0 24 BN MN BNMN ‰±S.H. Nukleus sayısına göre BN CBPI±S.H. hücrelerin dağılımı % 1 2 3 4 >4 32 1 0 1 0 0 38 5733 240 19 4 1 3 16 310 ***267 ***44,5±7,13 2008 958 16 18 31,93 ***1,34±0,06 5 5919 74 6 1 0 0 0 89 ***81 13,5±2,81 1924 929 55 92 30,97 ***1,41±0,06 10 5923 70 5 1 1 0 0 87 ***77 12,83±2,23 1989 903 32 76 30,1 ***1,37±0,07 50 5920 73 6 1 0 0 0 88 ***80 13,3±3,0 1770 1055 59 116 35,17 ***1,47±0,02 100 5904 85 9 1 0 1 7 113 ***96 *16±4,68 1789 1021 72 118 34,03 ***1,47±0,04 200 5905 88 6 0 0 1 6 106 ***95 *15,8±3,83 2078 832 45 45 27,73 ***1,34±0,05 10 µl/ml 5946 DMSO 47 6 1 0 0 0 62 54 9±2,03 1853 1030 52 65 34,33 5237 668 79 11 4 1 6 881 ***763 ***127,2±13, 2349 628 12 65 11 20,93 ***1,22±0,03 5 5943 51 4 1 1 0 0 66 57 9,5±1,31 1936 996 27 41 33,2 **1,38±0,03 10 5918 74 3 3 0 2 13 102 *82 13,67±2,57 2067 825 30 78 27,5 ***1,35±0,07 50 5904 79 14 1 2 0 0 118 ***96 16±2,5 2053 873 29 45 29,1 ***1,34±0,04 100 5890 97 10 2 0 1 7 130 ***110 18,3±3,2 1992 918 37 53 30,6 **1,37±0,04 200 5871 91 13 22 3 0 0 195 ***129 *21,5±4,41 2233 706 26 35 23,53 ***1,28±0,05 10 µl/ml 5966 DMSO MMC 48 MN MMC MN/hücre 0,04 1 34 5,66±0,09 2 3 4 1268 1541 75 116 51,37 1,64±0,048 1,42±0,04 y = 0,0128e0,005x R2 = 0,982 0,03 0,02 0,01 0 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Konsantrasyon M N 48 saat Üstel (M N 48 saat) Şekil 4.3.1. Triasulfuron’un artan konsantrasyonları ile 48 saat muamele edilen periferik kan lenfositlerinde gözlenen MN sayısı ile konsantrasyon arasındaki ilişkinin doz-cevap eğrisi. (U testi U>1,96) (Lineer regresyon analizi R2=%84.1; Pearson korelasyon p=0.01). 69 18 2 BNMN 16 1,9 1,8 14 1,7 12 1,6 10 1,4 1,5 y = -0 ,1 1 5 1 L n (x ) + 1 ,5 7 6 3 R 2 = 0 ,5 1 0 7 8 6 CBPI y = 5 ,2 0 9 5 L n (x ) + 7 ,1 4 7 6 R 2 = 0 ,8 3 9 1 1,3 1,2 1,1 4 1 10 µ l/ml D M SO 5 µ g/ml T rias . 10 µ g/ml T rias . 50µ g/m l T rias . BN M N ‰ Log. (B N M N ‰ ) 100µ g/m l 200µ g/m l T rias . T rias . CBPI Log. (C B P I) A 1,45 BNMN 22 20 y = 0 ,1 0 7 x 2 1,43 2 1,41 + 1 ,8 6 0 4 x + 6 ,5 3 3 R = 0 ,9 8 2 5 18 1,39 16 1,37 1,35 14 12 y = -0 ,0 0 0 2 x 2 - 0 ,0 1 9 9 x + 1 ,4 2 9 R 2 = 0 ,7 1 5 6 10 8 1,33 1,31 CBPI 24 1,29 1,27 6 4 1,25 10 µl/ml D M SO 5 µg/ml T rias. 10 µg/ml T rias. 50µg/ml 100µg/ml 200µg/ml T rias. T rias. T rias. BN M N ‰ CBPI Polinom (BN M N ‰ ) Polinom (CBPI) B Şekil 4.3.2. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi sonucu altı donorda gözlenen total BNMN ‰ ve PI değerleri. A; 24 saat muamele sonuçları; B, 48 saat muamele sonuçları. 70 25 120 y = 31,276Ln(x) + 42,871 100 R 2 = 0,8393 20 KA 60 y = 9,8268Ln(x) + 1,5579 10 2 R = 0,9493 MN 80 15 40 5 20 0 0 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. 10 µg/ml Trias. 50µg/ml 100µg/ml 200µg/ml Trias. Trias. Trias. Konsantrasyon KA% M N‰ Log. (M N‰) Log. (KA%) A 35 140 25 KA 120 y = 0,6429x2 + 11,157x + 39,2 R 2 = 0,9825 100 20 80 15 y = 0,4286x2 + 1,8286x + 4,6 R 2 = 0,9483 10 60 40 5 20 0 0 10 µl/ml DM SO 5 µg/ml Trias. 10 µg/ml Trias. MN 30 50µg/ml 100µg/ml 200µg/ml Trias. Trias. Trias. Konsantrasyon KA% M N‰ Polinom (M N‰) Polinom (KA%) B Şekil 4.3.3. İnsan periferik kan lenfosit kültürüne Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarının muamelesi sonucu KA ve MN test yöntemlerinden elde edilen KA ve BNMN frekansları. A; 24 saat, B; 48 saat. 24 saatlik muamelede KA ve MN frekansı arasında ilişki Lineer regresyon analizine göre R2=%88.8, Pearson korelasyon testi p=0.001; 48 saatlik muamelede KA ve MN frekansı arasında ilişki Lineer regresyon analizine göre R2=%95.3 Pearson korelasyon testi p=0.005. 71 Şekil 4.3.4. Sitokinezi-blok MN tekniğine göre hazırlanmış preparatlarda birinci bölünme sonucu, 2 nukleuslu hücrede gözlenen 2 mikronukleus oklarla gösterilmiştir. 100 µg/ml Triasulfuron’un 6.donorun lenfosit kültürüne 48 saat muamelesi sonucu gözlenen MN’lar. Şekil 4.3.5. 200 µg/ml Triasulfuron’un 4.donorun lenfosit kültüründe 24 saat muamelesi sonucu gözlenen mikronukleuslar oklarla gösterilmiştir. 72 5.TARTIŞMA Pestisitlerin insanlar üzerindeki zararlı etkilerinin bilinmesi insan sağlığı açısından önemlidir. Bu nedenle çeşitli testler kullanılmaktadır. Kimyasal maddelerin insan kan lenfositlerindeki etkilerini araştırmakta kullanılan KA, KKD ve MN testleri en uygun analiz yöntemleri olarak kabul edilmektedir (Meng ve Zheng, 1992). Çalışmamızda da Sulfonylurea bileşiği olan Triasulfuron herbisitidinin genotoksik etkileri insan periferik kanında KA, KKD ve MN test yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır. Natarajan ve Obe 1980’de, 72 saatlik kültürlerin, hücrelerin iki hücre siklusu geçirmesine izin verdiğini ve birinci siklusta oluşan değişikliklerin ikinci siklusta hücresel onarıma girebileceğini bildirmişlerdir (Seligmann vd. 2003). Tucker ve Preston (1996) indüklenen kromozom aberasyon frekansının doğru tahmin edilmesi için sitogenetik değerlendirmelerin muameleden sonra kısa süre içinde; hücreler muameleden sonraki birinci mitoz bölünmelerini geçirirken yapılması gerektiğini söylemişlerdir. Bu bilgilere göre ikinci hücre siklusunda aberasyonlar onarılabilmekte ve aberasyonlar gerçek frekanslarının altında görülebilmektedir. Çalışmamızda olası in vitro onarım sistemi etkisinden korunmak amacı ile KA test yönteminde 48 saatlik kültür süresi uygulanmıştır. Triasulfuron’un farklı konsantrasyonlarını insan periferik kan lenfosit kültürü ile muamele ederek genotoksisitesini araştırdığımız bu çalışmada; KA deneyleri total verilerine bakıldığında, Triasulfuron’un test edilen konsantrasyonlarının periferik kan kültüründe 24 ve 48 saat muamelesinin anlamlı KA oluşumuna neden olmadığı gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre test edilen konsantrasyonlarda Triasulfuron klastojenik değildir. Nitekim daha önce Triasulfuron’un genotoksisitesini belirlemek amacı ile yapılan çalışmalarda; Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarına neden olmadığı, Çin Hamsterlerinde MN testinde, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde UDS testlerinde, Triasulfuron’un mutajenik, klastogenik olmadığı saptanmıştır (EPA, 1998a). Bundan başka Triasulfuron gibi triazinylsulfonylurea grubuna ait bazı herbisitlerin genotoksisite çalışmaları da negatif sonuçlar vermiştir; Tribenuron methyl’in insan lenfosit in vitro periferik kan 73 lenfosit kültüründe yapısal KA’larını indüklemediği (FAO, 2002), DPX-66037’nin (triazinylsulfonylurea) insan lenfosit kültüründe klastojenik olmadığı (PMRA 1999), Metsulfuron methyl’in in vitro sıçan kemik iliğinde KA’larını indüklemediği (EPA, 1998b), Chlorsulfuron’un in vitro sitogenetik testinde negatif sonuç verdiği (EPA, 2002), Ethametsulfuron’un sıçan kemik iliğinde KA’larına neden olmadığı (EPA, 1997a) bildirilmiştir. Diğer bir urea grubu bileşiği olan sulfosulfuron’un (sulfonylureapyrimidinyl sulfonylurea) in vitro insan lenfosit kültüründe KA frekansını arttırmadığı ve klastojenik olmadığı rapor edilmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar diğer araştırmacıların sonuçları ile uygunluk göstermektedir. Triasulfuron’un ticari formülasyonu olan Logran hebisiti ile yaptığımız çalışmalarda; bu herbisitin fare kemik iliğinde ve insan lenfosit kültüründe kromozom kırıklarına neden olduğunu bildirmiştik (Muranlı ve Kaymak 2004, Göç ve Kaymak 2004). Bu sonuçlar şimdiki çalışmamızdan elde edilen sonuçlarla uygunluk göstermemektedir. Holland vd. (2002) çalışmalarında adjuvanların, ticari pestisitlerin çözünürlüğünü arttırmak ve aktif içeriğini güçlendirmek üzere onlara ilave edilen kimyasallar olduğunu, bu kimyasalların polivinil bileşikler, polioksietilenler, parafin yağları içerdiklerini ve özel olarak belirtilmediğini fakat “katkı maddeleri” kategorisi altında ticari pestisitlerin bu maddeleri içerdiğini belirtmişlerdir. Daha önceki çalışmalarımız ile bu çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçların farklı olmasının nedeni; ticari formlarda aktif içeriği güçlendiren ve çözünebilirliği arttıran katkı maddelerinin bulunuşu olabilir. Scassellati-Sforzolini vd. (1997)’nin urea herbisiti olan Linuron’un saf ve ticari formülasyonlarının in vivo şartlarda genotoksisitesini değerlendirdikleri çalışmalarından elde ettikleri sonuçlar bizim sonuçlarımızı destekler niteliktedir. Bu araştırıcılar, çalışmalarında saf ve ticari formülasyon ile elde ettikleri sonuçlar arasındaki kısmi farkın ticari formülasyondaki zararlı katkı maddelerinden kaynaklanabileceğini, bunun da ticari formülasyonların zararlı maddeleri içerdiğinin göstergesi olduğunu rapor etmişlerdir. In vitro KA deneylerinde MI indüklenen hücresel toksisiteyi izlemek için kullanılır. MI, hücre siklusunda metafazdaki hücre yüzdesini verir. Azalmış MI, hücre siklusu ilerlemesinde inhibisyonu ve/veya proliferatif kapasitedeki kaybı gösterir. Amorim vd. 2000’de sitotoksisite derecesinin tespit edilmesinin, uygun preparasyon zamanını ve test konsantrasyonlarını seçmek için gerekli olduğunu ve özellikle 74 sonuçların insanların maruz kalabileceği bileşiklerin risk değerlendirmesi için kullanıldığında önem taşıdığını bildirmişlerdir (Seligmann vd. 2003). Çalışmamızda donorlar total olarak değerlendirildiğinde; 24 ve 48 saat muameleli gruplarda ve tüm konsantrasyonlarda, Triasulfuron MI’i anlamlı olarak düşürmüştür. 48 saatlik uygulama periyodunda MI’i % 50 oranında düşüren toksik konsantrasyon 100 µg/ml iken, 24 saatlik uygulama periodunda 100 µg/ml MI’i %28, 200 µg/ml MI’i %33 oranında düşürmüştür. 24 saatlik uygulama periodunda, MI’i %50 oranında düşüren konsantrasyonun daha yüksek olabileceği düşünülmektedir. Dolayısı ile KA test yönteminde, hücrelerin 48 saat Triasulfuron muamelesine maruz kalmaları bu hücrelerin toksik açıdan daha fazla etkilenmelerine neden olmaktadır. 48 saat muamele sonucu gözlenen toksisite 24 saat muamele sonucu gözlenen toksisiteden fazladır (Şekil 4.1.1.). Triasulfuron hücre siklusu ilerleyişini inhibe ederek toksik etki göstermiştir. Çalışmamızın sonuçlarına göre Triasulfuron muamelesi sonucu gözlenen toksik etki, muamele süresine bağlı olduğu gibi konsantrasyon artışı ve KA frekansına bağlı olarak da değişim göstermiştir. Konsantrasyon artışı ile mitotik indeksin azalması yani hücresel toksisite arasında negatif ilişki saptanmıştır. Triasulfuron ile 24 ve 48 saatlik muameleli gruplarda, muamele süresinin artışına bağlı olarak KA frekansının da arttığı fakat muameleli gruplar arasındaki farkın önemli olmadığı görülmüştür. Gözlenen sonuçlara göre; konsantrasyon arttıkça toksisite ve buna bağlı olarak kromozom aberasyonları artmıştır. Bu da daha yüksek konsantrasyonlardaki Triasulfuron muamelesinin insan periferik kan kültüründe KA frekansını anlamlı olarak arttırabileceğini düşündürmektedir. WHO’nun 1985’teki bildirisine göre; KKD test yöntemi genotoksisite değerlendirmesinde kullanılan hassas bir metottur (Ribas vd. 1996). KKD test yönteminde kardeş kromatid değişimlerini gözleyebilmek için ikinci hücre bölünmesini geçiren metafaz hücrelerini elde etmek gereklidir. Bundan dolayı çalışmamızda KKD test yönteminde 72 saat kültür süresi kullanılmıştır. KKD, DNA replikasyon ürünlerinin homolog bölgeleri arasında DNA kırılması ve yeniden birleşmesi sonucu parça değişiminin sitolojik göstergesidir. Tucker vd. 1993 yılındaki bildirilerine göre; KKD sıklığı genotoksik etkinin belirtisidir yorumu ya KKD sayısının kontrole göre iki katına çıkması veya herhangi bir dozda istatistiksel anlamda 75 artış olması (p<0.05) temeline dayanmaktadır (Rodriguez-Mercado vd. 2003). KKD genellikle kimyasal etkilenmeye sitogenetik cevabın değerlendirilmesi amacıyla kullanılır ve sitogenetik tartışma KKD değerlendirilmesi yapılmadan eksik kalır (Rodriguez-Mercado vd. 2003, Tucker ve Preston 1996). Bizim çalışmamızda in vitro muameleli insan lenfosit kültüründe Triasulfuron’un test edilen tüm konsantrasyonları 24 ve 48 saatlik muamele süresinde ortalama KKD/hücre sayısında kontrole göre anlamlı artışa neden olduğundan dolayı bu herbisidin insan lenfositleri için muhtemel genotoksik olduğu saptanmıştır. Triasulfuron muamelesi sonucu KKD frekansının artması, diğer urea grubu herbisitler ile elde edilen sonuçlarla uygunluk göstermektedir. Piridisulfonylurea herbisiti olan DPX E9636’nın in vitro sığır lenfosit kültüründe (Lioi vd. 1998a) ve insan lenfositlerinde (Lioi vd. 1998b) KKD sayısını arttırdığı ve genotoksik olduğu bildirilmiştir. Urea grubu herbisitlerinin genotoksisitesi Allium cepa test sistemi kullanılarak da tespit edilmiştir. Badr ve Elkington (1982) Isoproturon’un Allium cepa ve Hordeum vulgare’de iğ ipliği aparatında bozulmaya sebep olduğunu, bitki test sisteminde klastojenik olduğunu, Chauhan vd. (2001) Isoproturon’un faklı konsantrasyonlarının Alium cepa kök meristem hücrelerinde mitotik aberasyonlara neden olduğundan dolayı genotoksik etkili olduğunu bildirmişlerdir. İlk kez Nicholas vd. (1979) diğer test sistemlerinde mutajenik olmayan bir kimyasalın KKD’leri indüklediğini saptamışlardır. Bu farkın sebeplerinden birisi; KKD’lerin düşük konsantrasyonlardaki kimyasal muameleler ile de indüklenebildiğidir. KA ve MN’lar daha yüksek konsantrasyonlardaki muameleler sonucu meydana geldiklerinden bu test yöntemlerine göre değerlendirilen bir kimyasal madde mutajenik olarak görülmezken, aynı kimyasal madde KKD test yöntemine göre mutajenik olabilir (Nicholas vd. 1979). Çalışmalarında toksik olmayan veya letal olmayan konsantrasyonların KKD’leri indüklediğini, kromozom kırıkları veya diğer genetik etkileri gözlemek için gereken konsantrasyonların letal olabileceğini bildirmişlerdir (Nicholas vd. 1979). Bizim çalışmamızda test edilen konsantrasyonlar KKD oluşumuna neden olmuş ancak aynı konsantrasyonlar KA’larına neden olmamıştır. Sonuçlarımıza göre konsantrasyon artışına bağlı olarak KA sayısı artma eğilimindedir. Bu sonuçlar da çalışmamızda kullandıklarımızdan daha yüksek konsantrasyonların KA testine göre insan lenfositlerinde genotoksik etkili olabileceğini düşündürmektedir. Bu sonucumuz 76 Nicholas (1979)’ın ileri sürdüğü görüşü destekler niteliktedir. Cid ve Matos (1984) insektisid olan Aldicarb’ın insan lenfosit kültüründe anlamlı KKD oluşumunu indükleyerek genotoksik olduğunu bildirmişlerdir. Ancak Blevins vd. 1977’de yaptıkları araştırmalarına göre; bu kimyasal insan fibroblastlarında DNA hasarı oluşturmamakta, Seiler’ın 1977’de elde ettiği sonuçlara göre; farede MN oluşumuna neden olmamakta, Dunken ve Simmon’un 1980’de yaptıkları çalışmaya göre; Ames testinde bu kimyasal ile negatif sonuçlar elde edilmektedir (Cid ve Matos, 1984). Bu sonuçlar aynı kimyasal maddenin farklı test yöntemleri ile farklı sonuçlar verdiğinin göstergesidir. Bu da bizim çalışmamızı doğrular niteliktedir. Latt vd.’nin 1980’de yaptıkları araştırmaya göre; normal DNA onarım şeklinin göstergesi olan kardeş kromatid değişim yöntemi, birçok fiziksel ve kimyasal maddenin potansiyel DNA hasarının indirekt olarak değerlendirilmesini sağlamak için kullanılmaktadır (Schwartz vd. 1990). Wolff 1978’de, Lin ve Wertelecki 1982’de, Hedner vd. 1982’de KKD’lerinin kromozom kırılmasından bağımsız bir mekanizma sonucu oluştuğunu bildirmişlerdir (Schwartz vd. 1990). Perry ve Evans 1975’te, Popescu vd. 1977’de, Fornace vd. 1981’de, Latt ve Schreck 1980’de, Natarajan vd. 1980’de, Evans ve Vijayalaxmi 1981’de yaptıkları çalışmaların sonuçlarına göre; KKD’leri spesifik lokus mutasyonları ile klastojenik etkilere göre daha fazla ilişkilidirler ve fiziksel ajanlara göre kimyasal ajanlar tarafından daha fazla indüklenmektedirler (Schwartz vd. 1990). Çalışmamızda KKD indüksiyonu görülmesine rağmen, test edilen kimyasalın KA’larına neden olmaması KKD’lerin kromozom kırıkları nedenli olmayıp farklı bir mekanizma ile oluştuğunu göstermektedir. Gri vd. (2003), test edilen kimyasalın indüklediği KKD frekansının doz cevap ilişkisinin olmaması ve KA oluşumu ile doz cevap ilişkisinin bulunmasının bunların farklı mekanizmalar tarafından oluşabileceğinin göstergesi olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bizim çalışmamızda da KKD test yönteminde doz-cevap ilişkisi tespit edilmemesine rağmen, KA test yönteminde 48 saatlik muamele grubunda doz cevap ilişkisi bulunmuş; anormal hücre yüzdesi ile konsantrasyon arasında ilişki tespit edilmiştir (Lineer regresyon analizine göre R2= %88.2, Pearson korelasyon p=0.005). Aynı zamanda çalışmamız sonuçlarına göre MN testinde MN sayısı konsantrasyon arttıkça anlamlı artış gösterirken KKD sayısında doz-cevap ilişkisi görülmemektedir. 77 Bu da klastojenik ve aneujenik nedenli MN oluşumu ile KKD’lerin oluşumunun farklı mekanizmalar tarafından meydana geldiğinin göstergesi olabilir. Tucker vd. (1993) ökaryotik hücrelerde KKD frekansının, DNA replikasyonu ile etkileşime girerek DNA hasarını indükleyen genotoksik ajanların etkisi ile arttığını bildirmişlerdir. Yager vd. 1993’te, Giri ve Cahtterjee 1998’de, Shaham vd. 2001’de, Giri vd. 2002’de KKD frekansını genotoksik ajanları tanımlamak üzere kullandıklarını bildirmişlerdir (Giri vd. 2003). Çalışmamızda test ettiğimiz farklı konsantrasyonlardaki Triasulfuron herbisiti tarafından indüklenen KKD frekansındaki anlamlı artış, bu kimyasalın hücresel DNA replikasyonu ile etkileşime girdiğini ve DNA hasarına yol açtığını göstermektedir. MN test yönteminde bir kez bölünmüş olan iki nukleuslu hücreler değerlendirmeye alınmıştır. Ancak bu yöntemde, hücre kültürünün 48. saatinde hücreler bir kez bölünmüş olmalarına rağmen, hem daha fazla iki nukleuslu hücre elde elde etmek hem CBPI oranını saptamak için 68 saatlik kültür süresi uygulanmıştır. Bazı hücreler sonradan uyarılarak mitoza girdiğinden dolayı 68.saate kadar ortamda sadece bir kez bölünmüş olan hücre sayısı artacaktır. Çalışmamızda MN verileri incelendiğinde total BNMN‰’sinde 24 saatlik uygulamada 100 ve 200 µg/ml, 48 saat muamelede 200 µg/ml Triasulfuron ile anlamlı MN indüksiyonu gözlenmiştir. Benzer olarak phenylurea herbisiti olan Isoproturon da memeli in vivo MN test sisteminde yüksek dozlarda anlamlı MN oluşumuna neden olmuştur (Behera ve Bhunya, 1990). Seiler 1978’de fluometuron’un, Sharma vd. 1985’te siduron’un, Garret vd. 1986’da monuron’un fare kemik iliğinde MN oluşumuna neden olduğunu bildirmişlerdir (Behera ve Bhunya, 1990). Aynı şekilde Agrawal vd. (1996) Diuron’un fare kemik iliğinde MN oluşturduğunu saptamışlardır. Buna karşın Triasulfuron’un Çin hamsterlerinde Tribenuron methyl ve ethametsulfuron’un in vivo fare kemik iliği MN testinde negatif sonuç verdiği bildirilmiştir. Çalışmamızda 48 saat muamele grubunda KA testinde KA frekansı ile konsantrasyonlar arasında, MN testinde MN frekansı ile konsantrasyonlar arasında anlamlı ilişki tespit edilmiştir. Aynı zamanda KA frekansı ile MN frekansı arasındaki ilişkinin 24 saat muameleli grupta (Pearson correlation p=0.001) ve 48 saat muameleli grupta (Pearson correlation p=0.005) anlamlı olduğu tespit edilmiştir. Dolayısı ile 78 Fenech ve Morley (1985)’in bölünmeyen hücreler ile bir veya birden fazla bölünen hücreleri birbirinden ayırmak ve sitokinezi durdurmak üzere Cyt-B kullanarak geliştirdikleri MN testi, klastojeniteyi belirlemek için hassas bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Çalışmamızda kullanılan dozlarda total verilerde Triasulfuron anlamlı KA oluşumuna neden olmadığı halde yüksek konsantrasyonlarda anlamlı MN oluşumuna neden olmuştur. MN oluşumu klastojenik veya aneujenik nedenli olabilmektedir. KA testinde kullanılan konsantrasyonlarda klastojenik etki görülmemiş olması ancak yüksek dozlarda MN oluşumun gözlenmesi Triasulfuron’un yüksek dozlarda aneugenik olabileceğini düşündürmektedir. Dolayısı ile FISH tekniği ile daha ileri çalışma yapılarak Triasulfuron’un klastojenik ve/veya aneujenik etkisi araştırılabilir. Çalışmamızda Triasulfuron ile elde edilen sonuçlar Linuron (phenylurea) ile elde edilen sonuçlara uygunluk göstermektedir. Her ikisi de akut memeli toksisiste çalışmalarında düşük aktivite gösteren herbisitlerdir. EPA’nın 1988 yılındaki bildirisine göre; Linuron CHO hücrelerinde, Salmonella typhimurium’da UDS ve in vivo sıçan kemik iliği gibi birçok in vitro ve in vivo yöntemde genotoksisite göstermemektedir (Papapaulou vd. 2001). Linuron, fare kemik iliği hücrelerinde çok az sayıda kromozom hasarına neden olmuştur (Roloff vd. 1992). Triasulfuron, Linuron ve diğer sulfonylurealar gibi negatif sonuçlar vermiştir. Triasulfuron ile S. typhimurium, S. cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonları testinde, Çin hamsterlerinde MN testinde, insan fibroblast ve fare hepatositlerinde UDS testlerinde negatif sonuçlar elde edilmiştir. Ancak Papapaulou vd. (2001) Linuron’un insan lenfosit kültüründe MN frekansını doza bağlı şekilde lineer olarak arttırdığını ve CBPI’i düşürerek doza bağlı sitotoksik etkili olduğunu bildirmiştir. Çalışmamızın verilerine göre de Triasulfuron, insan lenfosit kültüründe MN frekansını doza bağlı arttırmıştır (U testi U>1.96) ve CBPI’ı düşürerek sitotoksik etki göstermiştir. Fenech’in 1997’deki bildirisine göre; KKD ve MN testlerinde elde edilen PI ve CBPI ortalama değerleri hücre siklusu kinetiğinin ölçülmesini sağlamakta ve bu ölçümler belli kimyasal veya fiziksel ajanların sitotoksik etkileri hakkında önemli verileri yansıtmaktadır (Laffon vd. 2001). İndekslerdeki anlamlı azalma, yeni bir DNA replikasyon prosesi başlamadan önce indüklenen genotoksik hasarı onarmak üzere onarım sistemlerine izin veren hücre siklusu gecikmesini göstermektedir (Laffon vd. 79 2001). Hücre bölünme kinetiğini ifade eden bir parametre olan PI, test edilen bileşiğin sitotoksisitesini analiz etmek üzere kullanılır. Çünkü test edilen kimyasal maddenin hücre siklusu ile etkileşime geçmesi bu indeksi hızlandırır veya geciktirir (Sivikova ve Dianovsky, 2000). Çalışmamızda test edilen kimyasal in vitro insan lenfosit kültüründe MN testinde 24 ve 48 saat muameleli gruplarda tüm konsantrasyonlarda CBPI değerlerini, KKD testinde 24 saat muameleli grupta 5, 100, 200 µg/ml, 48 saat muameleli grupta 10, 50, 100 ve 200 µg/ml konsantrasyonlarda PI değerlerini anlamlı azaltarak sitotoksik etki göstermiştir. Guadano vd. (1998)’ne göre; MI ve PI değerlerinin konsantrasyona bağlı olarak paralel azalması, test edilen kimyasalın sitotoksik etki gösterdiği anlamına gelmektedir (Sivikova ve Dianovsky, 2000). Rojas vd. (1993) test edilen kimyasal ajanın sitotoksik ve/veya sitostatik etkilerini birbirinden ayırmak için MI ve PI inhibisyonları arasındaki ilişkinin tespit edilmesi gerektiğini bildirmişlerdir. Sivikova ve Dianovsky (2000) çalışmalarında, MI ve PI arasında pozitif ilişki bulunmasının test edilen kimyasalın sitotoksik etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Çalışmamız sonuçlarına göre MI ve PI arasında 24 saat (Pearson correlation; 0.74 p=0.09) ve 48 saat (Pearson correlation;0.86 p=0.03) muamele gruplarında pozitif korelasyon saptanmıştır. Bu sonuç Triasulfuron herbisitinin sitotoksik etkili olduğunu göstermektedir. Urea grubu herbisitlerinin toksik etkileri Allium cepa test sistemi kullanılarak da tespit edilmiştir. Bitkilerdeki sitogenetik araştırmalarda; Badr ve Elkington (1982) Isoproturon’un Allium cepa ve Hordeum vulgare’de mitotik aktiviteyi düşürdüğü, iğ ipliği aparatında bozulmaya sebep olduğu, bitki test sisteminde sitotoksik olduğunu, aynı şekilde Chauhan vd. (2001) Isoproturon’un faklı konsantrasyonlarının Alium cepa kök meristem hücrelerinde MI’i doza bağlı anlamlı olarak inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Ayrıca Triasulfuron’un hem KKD oluşumuna neden olması, hem de PI’i azaltması genotoksisite ile sitotoksisitenin ilişkili olduğunu göstermektedir ki; bu ilişki 48 saat muamele grubunda daha açık görülmektedir. Ancak sitotoksisitenin genotoksisite ile ilişkisi gözlenirken, MN testinde Triasulfuron tüm dozlarda anlamlı CBPI azalmasını indüklediği gibi tüm dozlarda anlamlı MN oluşumuna neden olmadığından dolayı, sitotoksisite klastojenite ilişkisi görülmemektedir. MN indüksiyonu görülmemesine rağmen konsantrasyona bağlı olarak CBPI değerlerinin azalması diğer bazı çalışmalarda da (Borroto vd. 2001, 2002) gözlenmiştir. 80 24 ve 48 saat muamele grupları arasında ortalama KKD/hücre sayıları arasında fark olmadığı tespit edilmiştir. Ancak 48 saatlik muamele grubunun Triasulfuron’un sitotoksik etkisinden daha fazla etkilendikleri gözlenmiştir. Dolayısı ile muamele süresi arttıkça toksisitenin de arttığı görülmektedir. 48 saatlik muamele, 24 saatlik muameleye göre BNMN sayısının daha fazla artmasına neden olsa da MN frekansları arasında önemli bir fark gözlenmemiştir. Her iki muamele süresinde de toksik etki görülmektedir ve aralarında fark saptanmamıştır. Çalışmamız sırasında Triasulfuron donorlar üzerinde farklı etki göstermiştir. Elde edilen bu sonuç, donorların farklı genetik yapılarına bağlı olarak ortaya çıkmış olabilir. Sonuç olarak, bu çalışmanın verileri insan lenfosit kültüründe Triasulfuron’un DNA metabolizması ile etkileşime girerek KKD’leri indüklediğini bundan dolayı muhtemelen genotoksik olduğunu göstermektedir. Triasulfuron’un insan lenfosit kültüründe KA’larına neden olmayarak klastojenik olmadığı saptanmıştır. Ancak yüksek konsantrasyonlarda MN’ları indüklemektedir. Bunun nedeni kullanılan herbisitidin aneujenik etkisinden kaynaklanabilir ki bunun araştırılması gerekmektedir. Ayrıca genotoksisitesine karar verebilmek için diğer in vivo ve mutajenite testlerinin de yapılması gerekmektedir. Bu çalışmanın sonuçlarına göre Triasulfuron’un replikasyon hızını da etkilediği saptanmış, MI, CBPI ve PI oranlarını düşürerek sitotoksik etki göstermiştir. 100 ve 200 µg/ml konsantrasyonları, toksik konsantrasyonlar olup MI’i %50 ve daha yüksek oranlarda inhibe etmektedir. Anormallikler en fazla bu konsantrasyonlarda meydana gelmektedir. Dolayısı ile Triasulfuron yüksek konsantrasyonlarda kullanılmamalıdır. Tarım alanlarında kontrollü uygulamalar yapılarak, çok düşük konsantrasyonlarda ve katkı maddesiz kullanılabileceği düşüncesindeyiz. 81 6.KAYNAKLAR Agrawal, R.C., Kumar, S., Mehrotra, N.K., 1996, Micronucleus induction by diuron in mouse bone marrow. Toxicology Letters, 89, 1-4. Agrawal, R.C., Mehrotra, N.K.,1997, Effect of diuron on germ cells of mice. Indian Journal of Experimental Biology, 35, 1256-1257. Agrawal, R.C., Kumar, S., 1999, Hepato-toxic effects of diuron in albino rats. Indian Journal of Experimental Biology, 37(5), 503-504. Almassy, Z., Krepinski, A.B., Bianco, A., Köteles, G.J., 1987, The present state and perspectives of Micronucleus Assay in radiation Protection. A review. Appl. Radiat. Isot., 38, 241-249. Al-Saleh, I.A., 1994, Pesticides: A review article. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology, 13(3), 151-161. Badr, A., Elkington, T.T., 1982, Antimitotic and chromotoxic activities of Isoproturon in Allium cepa and Hordeum vulgare. Environmental and Experimental Botany, 22(3), 265-270. Behera, B.C., Bhunya, S.P., 1990, Genotoxic effect of isoproturon (herbicide) as revealed by three mammalian in vivo mutagenic bioassay. Indian Journal of Experimental Biology, 28, 862-867. Borroto, J.I.G., Creus, A., Marcos, R., 2001, Genotoxic evaluation of the furylethylene derivative 2-furyl-1-nitroethene in cultured human lymphocytes. Mutation Research, 497, 177-184. Borroto, J.I.G., Creus, A., Marcos, R., 2002, Genotoxic evaluation of the furylethylene derivative 1-(5-bromofor-2-yl)-2- nitroethene in cultured human lymphocytes. Mutation Research, 519, 179-185. Carrano, A.V., Natarajan, A.T., 1988, Consideration for population monitoring using cytogenetic techniques, Mutation Res., 204, 379-406. Chauhan, L.K.S., Saxena, P.N., Sundararaman, V., Gupta, S.K., 1998, Diuron-induced Cytological and Ultrstructural Aşlterations in the Root Meristem Cells of Allium cepa. Pesticide Biochemistry and Physiology,62, 152-163. 82 Chauhan, L.K.S., Saxena, P.N., Gupta, S.K., 2001, Evaluation of cytogenetic effects of isoproturon on the root meristem cells of Allium sativum. Biomedical and Environmental Science, 14(3), 214-219. Chauhan, L.K.S., Gupta, S.K., 2005, Combined cytogenetic and ultrastructural effects of substituted urea herbicides and synthetic pyrethroid insecticides on the root meristem cells of Allium cepa. Pesticide Biochemistry and Physiology, 82, 2735. Ciba-Geigy Corporation, 1985, MRID No. 40271947. Ciba-Geigy Corporation, 1986a, MRID No. 40271965, 4052401, 40887601. Ciba-Geigy Corporation, 1986b, MRID No. 40271949. Cicchetti, R., Bari, M., Argentin, G., 1999, Induction of micronuclei in bone marrow by two pesticides and their differentition with CREST staining: an in vivo study in mice. Mutation Research, 439, 239-248. Cid, M.G., Matos, E., 1984, Induction of sister chromatid exchanges in cultured human lymphocytes by Aldicarb, a carbamate pesticide. Mutation Research, 138, 175179. Classification of herbicides, 2005, Compendium of Pesticide Common Names, Herbicides. http://www.hclrss.demon.co.uk/index.html Cox, C., 1993, Sulfometuron methyl Sheet, Northwest Coalition for Alternatives to Pesticides, Eugene, OR. Journal of pesticide Reform, 13(4). http://www.panna.org/resources/pestis/PESTIS.burst.694.html Çelik, M., Ünal, F., Yüzbaşıoğlu, D., Ergün, M.A., Arslan, O., Kasap, R., 2005, In vitro effect of karathane LC (dinocap) on human lymphocytes. Mutagenesis, 20(2), 101-104. D’Souza, U.J.A., Zain, A., Raju, S., 2005, Genotoxic effects in the bone marrow of rats exposed to a low dose of paraquat via the dermal route. Mutation Research, 581, 187-190. DAR, 2004, Final addentum to the Draft Assessment Report (DAR), Initial risk assessment provided by the rapporteur Member State Sweden for theexisting active substance Tribenuron of the second stage of the review programme referred to in Article 8(2) of Council Directive 91/414/EEC. 83 Demirel, S., Zamani, A.G., 2002, Mikronukleus tekniği ve kullanım alanları, Genel Tıp Derg, 12(3), 123-127. Dolara, P., Salvadori M., Capobianco, T., Toricelli, F., 1992, Sister chromatid exchanges in human lymphocytes induced by dimethoate, omethoate, deltamethrin, benomyl and their mixture. Mutation Research, 283, 113-118. DPR, 1987, California EPA’s Department of Pesticide Regulation (DPR) Medical Toxicology Branch, 1987, Summary of Toxicology Data Linuron, http://www.cdpr.ca.gov/docs/toxsums/pdfs/361.pdf DuPont Chemical Company, 1979, Mutagenic activity in the Salmonella/Microsome assay (Ames test). Unpublished study, MRID No: 93206031. DuPont Chemical Company, 1981a, Chinese hamster ovary cell assay for mutagenicity. Unpublished study, MRID No: 93206032. DuPont Chemical Company, 1981b, In vitro cytogenetics mutagenicity evaluation of H13647-03 in an In vitro Cytogenetic Assay measuring chromosome aberration frequencies in chinese hamster ovary (CHO) cells. Unpublished study, MRID No:00146846. DuPont Chemical Company, 1984, Long term feeding study in rats with Benzoic acid, 2-(((((4,6-dimethyl-2-pyrimidiniyl)Amino)carbonyl)-Amino)sulfonyl)-,methyl ester (INT-5648). Unpublished study, MRID No:00146849. DuPont Chemical Company, 1987, Oncogenicity study with INT –5648, Long term feeding study in mice. Unpublished study, MRID No: 41273602. DuPraw, E.J., 1970, DNA and chromosomes. Holt, Rinehart and Winston, New York. EEC, 2000, Opinion of the scientific committee on plants on the evaluation of sulfosulfuron in the contex of council directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market (opinion adopted by the scientific committee on plants on 30 november 2000). EPA, 1989, Pesticide Fact Sheet. Tribenuron methyl Herbicide Profile 6/89. Fact Sheet No:219, Data Issued: June 30. http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/herbgrowthreg/sethoxydim-vernolate/tribenuron EPA, 1990, Pesticide Factsheet, Primisulfuron methyl Herbicide Profile 6/90. http://www.cce.cornell.edu/profiles/herb-growth/naa-rimsulfuron/primisulfuronmethyl 84 EPA, 1992, Grants Conditional Registration 7/92. EPA’s decision to conditionally register‘Amber’.http:/pmep.cce.cornell.edu/profiles/herb-growthreg/sethoxydimvernolate/triasulfuron EPA, 1996, U.S. Environmental Protection Agency, Triflusulfuron methyl; Pesticide Tolerance, 61(116), 30167-30170. EPA, 1997a, Federal Register: Notice of Filing of Pesticide Petitions, Ethametsulfuronmethyl, http://www.epa.gov/fedrgst/EPA-PEST/1997/December/Day-17/p32936.htm EPA, 1997b, Federal Register, Notice of Filing of Pesticide Petitions, sulfosulfuron, 62(242),66083-66091.http:/www.epa.gov/fedrgst/EPA-PEST/1997/December/ Day-17/p32936.htm EPA, 1998a, Environmental Protection Agency, Pesticide Tolerance Petitions Filing, Triasulfuron 5/98, 29401-29409. EPA, 1998b, Federal Register: Notice of Filing of Pesticide Petitions, Metsulfuronmethyl. Federal Register: March 19, ,63(53), 13401- 13404.http://www.epa.gov/fedrgstr/EPA-PEST/1998/March/Day-19/p7141.htm EPA, 2001, Pesticide Petition Filing 7/01, Triflusulfuron-methyl, PF-2036; FRL-67954.http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/herb-growthreg/sethoxydim-vernolate/triflusulfur EPA, 2002, Notice of filing a Pesticide Petition to Establish a Tolerance for a Certain Pesticide Chemical in or on Food. Federal register:March 8,2002, 67(46), 10722-10727 Chlorsulfuron http://www.epa.gov/fedrgstr/EPA-PEST/2002/March/ Day-08/ p5446.htm EXTOXNET, 1994, Extension Toxicology Network Pesticide Information Profile Sulfometuron methyl. http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/pyrethrinsziram/sulfometuron-methyl-ext.html EXTOXNET, 1996a, Extension Toxicology Network Pesticide Information Profiles. Tebuthiuron. http://extoxnet.orst.edu/pips/tebuhiu.htm EXTOXNET, 1996b, Extension Toxicology Network Pesticide Information Profiles. Fluometuron. http://extoxnet.orst.edu/pips/fluometuron.htm FAO, 2002, Food and Agricultural Organization of the United Nations, FAO Specifications and Evaluations For Plant Protection Products, TribenuronMethyl.syf 17. 85 Fenech, M., Morley, A.A., 1985, Measurement of Micronuclei in lymphocytes. Mutation Research, 147, 29-36. Fenech, M., Holland, N., Chang, W.P., Zeiger, E., Bonassi, S., 1999, The Human MicroNucleus Project-An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research, 428, 271-283. Flogel, M., 1998, VPIRG Vermont Public Interest Research Group Backgrounder on Sulfonyl Urea Herbicides. http://www.vpirg.org/downloads/sb.pdf Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ischidate, M.J., Ivetti, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., 1994, Report from working group on in vitro tests for chromosomal aberrations. Mutation Research, 312, 241-261. Giri, S., Giri, A., Sharma, G.D., Prasad, S.B., 2003, Induction of sister chromatid exchanges by cypermethrin and carbosulfan in bone marrow cells of mice in vivo. Mutagenesis, 18, 53-58. Göç, P., Kaymak, F., 2004, Etkin Maddesi Triasulfuron olan Logran herbisitinin Mus musculus üzerine sitogenetik etkisi. XVII. Ulusal Biyoloji Kongresi, 21-24 Haziran, Özet Kitapçığı, Çukurova Üniversitesi, syf 76, Adana. Healy, C.E., Heydens, W.F., Naylor, M.W., 2004, Mammalian toxicology overview and human risk assessment for sulfosulfuron. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 39, 310-324. Holland, N., Duramad, P., Rothman, N., Figgs, L.W., Blair, A., Hubbard, A., Smith, M.T., 2002, Micronucleus frequency and proliferation in human lymphocytes after exposure to herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in vitro and in vivo. Mutation Research, 521, 165-178. Khera, K.S., Whalen, C., Trivetti, G., Angers, G., 1979, Teratogenicity studies of pesticidal formulations of dimethoate, diuron and lindane in rats. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 22(4-5), 522-529. Kirkland, D., 1998, Chromosome aberrations testing in genetic toxicology-past, present and future. Mutation Research, 404, 173-185. Kirsh-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, J.M., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surrales, J., 86 Vanhauwaert, A., Wakata, A., 2003, Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research, 540, 153-163. Laffon, B., Pasaro, E., Mendez, J., 2001, Genotoxic effects of styrene-7,8-oxide in human white blood cells: comet assay in relation to the induction of sisterchromatid exchanges and micronuclei. Mutation Research, 491, 163-172. Liebert, M.A., 1990, Final report on the safety assessment of diazolidiyl urea. J Amm Coll Toxicol, 9(2), 229-245. Lioi, M.B., Scarfi, M.R., Santoro, A., Barbieri, R., Zeni, O., Berardino, D.D., Ursini, M.V., 1998a, Genotoxicity and oxidative stress induced by pesticide exposure in bovine lymphocyte cultures in vitro. Mutation Research, 403, 13-20. Lioi, M.B., Scarfi, M.R., Santoro, A., Barbieri, R., Zeni, O., Salvemini, F., Berardino, D.D., Ursini, M.V., 1998b, Cytogenetic damage and induction of pro-oxidant state lymphocyte exposed in vitro to gliphosate, vinclozoline, atrazine and DPXE9636. Environmental and Molecular Mutagenesis, 32(1), 39-46. Malpuech-Brugere, C., Grizard, G., Boule, P., Boucher, D., 2001, Effects of a herbicide Diuron (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) biotransformation products, 3,4-dichloroaniline and one (3,4-DCA), of on its human spermatozoa. Andrologie, 11(2), 69-75. Meng, Z., Zhang, L., 1992, Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by sodium bisulfite. Mutation Research, 298, 63-69. Morimoto, K., Sato-Mizuno, M., Koizumi, A., 1985, Sister chromatid exchanges and cell-cycle kinetics in human lymphocyte cultures exposed to alkylating mutagens: apparent deformity in dose-response relationships. Mutation Research, 152, 187-196. Muranli, F.D.G, Kaymak, F., 2004, The cytogenetic effects of Logran on human lymphocyte culture. Cytologia, 69(4), 467-473. Natarajan, A.T., Obe, G., 1982, Mutagenicity Testing with cultured Mammalian Cells. Cytogenetic Assays. Mutagenicity:New Horizons in Genetic Toxicology.Copyright 1982 by Academic Pres.Inc. ISBN:0-12-336180-X. Natarajan, A.T., 2002, Chromosome aberrations: past, present and future. Mutation Research, 504, 3-16. 87 Nicholas, A.H., Viene, M., Berghe, H.V.D., 1979, Induction of sister chromatid exchanges in cultured human cells by an organophosphorous insecticide:Malathion. Mutation Research, 67, 167-172. Obe, G., Pfeiffer, P., Savage, J.R.K., Johannes, C., Goedecke, W., Jeppesen, P., Natarajan, A.T., Martinez-Lopez, W., Folle, G.A., Drets, M.E., 2002, Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. Mutation Research, 504, 17-36. Özalpan, A., 2001, Temel Radyobiyoloji, T.C. Haliç Üniersitesi Yay., No:3001, DK 01 001 002, ISBN: 975-8574-00-0, 1. Basım, Syf:67-74. Pan American Health Organization, 2002, Epidemiologic stuations of Acute Pesticide Poisining in Central America. 1992-2000, Epidemiological Bulletin, 23.5-9. Papapaulou, P., Vlastos, D., Stephanou, G., Demopoulos, N.A., 2001, Linuron cytogenetic activity on human lymphocytes treated in vitro. Evaluation of clastogenic and aneugenic potential using cytokinesis block micronucleus assay in combination with fluorescence in situ hybridization (FISH), Fresenius Environmental Bulletin, 10(5), 431-437. Perry, P., Wolff, S., 1974, New Giemsa Method for differential staining of sister chromatids. Nature, 25, 156-158. Perry, P., Evans, H.J., 1975, Cytological detection of mutagen carcinogen exposure by sister chromatid Exchange. Nature (London) 258, 121-125. Pesticide Petition Filing, 1998, triasulfuron (Amber) 5/98. http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/herb-growthreg/sethoxydimvernolate/triasulfuron/triasulfuron_pet_598.html Pfuhler, S., Wolf, H.U., 2002, Effects of the formaldehyde releasing preservatives dimethylol urea and diazolidinyl urea in several short-term genotoxicity tests. Mutation Research, 514, 133-146. PMRA, 1995, Pest Management Regulatory Agency, Decision Document E95-03. http://www.pmra-arla.gc.ca/english/pdf/rdd/rdd_e9503-e.pdf PMRA, 1998, Pest Management Regulatory Agency, Sulfosulfuron Proposed Regulatory Decision PRDD98-01. 88 PMRA, 1999, Pest Management Regulatory Agency, Report on Triflusulfuron-methyl. Regulatory note REG99-03. Health Canada, Ottawa. http:/www.fluoridealert.org/pesticides/effects.genotoxix.f-pestici.htm Pommier Y., Zwelling L.A., Kao-Shan C.,Whang-Peng J., Bradley M.O., 1985, Correlations between Intercalator-induced DNA Strand Breaks and Sister Chromatid Exchanges, Mutations, and Cytotoxicity in Chinese Hamster Cells. Cancer Research, 45, 3143-3149. Powley, C.R., 2003, Sulfonylurea herbicides.Handbook of Residue Analytical Methods for Agrochemicals. John Wiley and Sons Ltd, 400-410. Renner, H.W., Münzner, R., 1980, Mutagenicity of sulphonylureas. Mutation Research, 77, 349-355. Ribas, G., Surrales, J., Carbonell, E., Xamena, N., Creus, A., Marcos, R., 1996, Genotoxicity of the herbicides alachlor and maleic hydrazide in cultured human lymphocytes. Mutagenesis, 11, 221-227. Rodriguez-Mercado, J.J., Roldan-Reyes, E., Altamirano-Lozano, M., 2003, Genotoxic effects of vanadium (IV) in human peripheral blood cells. Toxicology Letters, 144, 359-369. Rojas, E., Herrera, L.A., Sordo, M., Gonsebatt, M.E., Montero, R., Rodriguez, R., Ostrosky,-Wegman, P., 1993, Mitotic index and cell proliferation kinetics for identification of antineoplastic activity. Anticancer Drugs, 4(6), 637-640. Roloff B.D., Belluck, D.A., Meisner, L.F., 1992, Cytogenetic studies of herbicide interactions in vitro and in vivo using atrazine and linuron. Arch Environ Contam Toxicol, 22(3), 267-271. Rooney, D.E., Czepulkowski B.H., 1992, Human Cytogenetics Volume I Constitutional Analysis A Practical Approach. Oxford University Pres, Published in United States. Syf: 106-110. Saxena, P.N., Chauhan, L.K.S., Chandra, S., Gupta, S.K., 2004, Genotoxic effects of diuron contaminated soil on the root meristem cells of Allium sativum: A possible mechanism of chromosome damage. Toxicology Mechanisms and Methods, 14(5), 281-286. Scassellati-Sforzolini, G., Pasquini, R., Moretti, M., Villarini, M., Fatigoni, C., Dolara, P., Monarca, S., Caderni, G., Kuchenmeister, F., Schmezer, P., Pool-Zobel, B.L., 89 1997, In vivo studies on genotoxicity of pure and commercial linuron. Mutation Research, 390,207-221. Schaeffer S.J.,1980, Cytogenetics. Springer Verlag New-York Inc. 1980. ISBN 3-54090467-0 Syf: 179-183. Schwartz, S., Astemborski, J.A., Budacz, A.P., Boughman, J.A., Wasserman, S.S., Cohen, M.M., 1990, Repeated measurement of spontaneous and clastogeninduced sister-chromatid exchange. Mutation Research, 234, 51-59. Seligmann, I.C., Lima, P.D.L., Cardoso, P.C.S., Khayat, A.S., Bahia, M.O., Buchi, D.F., Cabral, I.R., Burbano, R.R., 2003, The anticancer homeopatic composite “Canova Method” is not genotoxic for human lymphocytes in vitro. Genetics and Molecular Research, 2(2), 223-228. Sivikova, K., Dianovski J., 2000, Mitotic index and cell proliferation kinetics as additional variables for assessment of genotoxic effect of the herbicide modown. Acta Vet Brno, 69, 45-50. Soloneski, S., Gonzales, M., Piaggio, E., Reigosa, M.A., Larramendy, M.L., 2002, Effect of dithiocarbamate pesticide zineb and its commercial formulation, azzuro III. Genotoxic evaluation on Chinese hamster ovary (CHO) cells. Mutation Research, 514, 201-212. Surrales, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H., Marcos, R., 1995, Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, 341, 169-184. Topaktaş, M., Rencüzoğulları, E., Sitogenetik. 1995 Adana. Çukurova Üniversitesi FenEdebiyat Fak. Biyoloji Böl. ISBN 975-487-026-8. Tucker, J.D., Auletta, A., Cimino, M.C., Dearfield, K.L., Jacobson-Kram, D., Tice, R.R., 1993, Sister chromatid exchange: second report of the Gene-tox program. Mutation Research, 297, 101-180. Tucker, J.D., Preston, J.R., 1996, Chromosome aberrations, micronuclei, aneuploidy, sister chromatid exchanges and cancer risk assessment. Mutation Research, 365, 147-159. Vigreux, C., Poul, J.M., Deslandes, E., Lebailly, P., Godard, T., Sichel, F., HenryAmar, M., Gauduchon, P., 1998, DNA damaging effects of pesticides measured 90 by the single cell gel electrophoresis assay(comet assay) and the chromosomal aberration test, in CHOK1 cells. Mutation Research, 419, 79-90. Villarini, M., Moretti, M., Pasquini, R., Scassellati-Sforzolini, G., Fatigoni, C., Marcarelli, M., Monarca, S., Rodriquez, A.V., 1998, In vitro genotoxic effects of the insecticide deltamethrin in human peripheral blood leukocytes: DNA damage (‘comet’ assay) in relation to the induction of sister-chromatid exchanges and micronuclei. Toxicology, 130, 129-139. Wang, S.W., Chu, C.Y., Hsu, J.D., Wang, C.J., 1993, Haemotoxic effects of phenylurea herbicides in rats: Role of haemoglobin adduct formation in splenic toxicity. Food and Chemical Toxicology, 31(4), 285-295. Watson, W.A.F., Petrie, J.C., Galloway, D.B., Bullock, I., 1976, In vivo cytogenetic activity of sulphonylurea drugs in man. Mutation Research, 38, 71-80. Zeljezic, D., Garaj-Vrhovac V., 2004, Chromosomal aberrations, micronuclei and nuclear buds induced in human lymphocytes by 2,4-dichlorophenoxyacetic acid pesticide formulation. Toxicology, 200, 39-47.
