klinik mikrobiyolojide son yıllarda yeni neler var
advertisement
KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE SON YILLARDA YENİ NELER VAR Mikroflora Dirençli bakteriler Yeni teknolojiler Dr Uğur Çiftçi Düzen Laboratuvarlar Grubu Workshop 2011 Bağırsak Flora Bakterileri Bağırsak Mikroflorası • Mikroflora = Flora = Mikrobiota • Bağırsak mikroflorası insan ve hayvanların ince ve kalın bağırsaklarında (sindirim kanalında) yaşayan mikroorganizmaların tümüne verilen isimdir. • Microbiome Bağırsak Mikroflorası • İnsan – Bağırsak mikroflorası ilişkisi Kommensal ilişki??? Simbiyotik ilişki!!! Unutulan Organ Bağırsak mikroflorasını teşkil eden bakteriler tarafından meydana getirilen metabolik aktiviteler çoklu fonksiyon gören bir organın işlevini görmektedir ve bilim adamları yakın bir süre önce unutulan bu organı! hatırlamışlardır. Niçin Bağırsak Mikroflorasına İlgi Başladı • Fekal materyalden ekstrakte edilen bakteriyel nükleik asitlerdeki 16 S Ribozomal RNA (rRNA) genlerinin sekansı ile bakterilerin idantifikasyon ve sınıflandırılması kolaylaşmıştır. • Metagenomik yaklaşımlarla bağırsak bakterilerinin idantifikasyonu ve yoğunluğu belirlenmiş ve daha önce bilinmeyen ekosistemlerin yapısı ortaya çıkartılmıştır. İnceleme Yöntemleri Moleküler fingerprint Ekolojik istatistik yaklaşımlar Gnotobiotik farelerde yapılan çalışmalar Bağırsak Mikroflorasının Rolü • • • • • • • Bağırsak gelişimi ve fonksiyonunda Immun modülasyonda Gastrointestinal hareketde İlaç metabolizmasında Gıda toksinlerinin parçalanmasında Karsinojenlerin parçalanmasında Mikronutrientlerin sentezlenmesinde Bağırsak Mikroflorasının Rolü • Hazmolmayan gıda maddelerinin fermantasyonunda • Bazı elektrolitlerin ve eser minerallerin absorbsiyonunda • Enterosit ve kolonisitlerin çoğalmasında • Bağırsak lumenine patojen bakterilerin kolonizasyonunu önlemede rol aldığı görülmüştür. Bağırsak mikroflorasının obezitede rolü John K. Dibaise ve and. Mayo Clinic Proceedings 2008 83 460-469 Bağırsak mikroflorasının obezitenin ve insülin direncinin gelişimindeki rolü Coni PD ve ark. Pathol Biol 2008 56:305-309 Obesite tedavisinde bağırsak mikroflorası Tsukumo DM ve ark. Arg.Bras.Endocrinol. Metabol. 2009 53:139-144 IBS (Irritable Bowel Syndrome) patogenezinde bağırsak mikroflorası) Lee BJ, Bal YT J. Neurogastroenterology 2011 17:252-66 IBD (Inflamatory Bowel Disease) etiyolojisinde bağırsak mikroflorasının rolü? Hugat J.P Best Proct. Res. Clin. Gastroenterol. 2008 18:451-62 Bağırsak Mikroflorası • Yakın zamana değin sağlık üzerindeki rolü küçümsenmiştir. • Yaşamsal öneme sahiptir. Sağlıklılık halini güçlendiren özelliklere sahiptir • Sağlık üzerine henüz netleşmemiş bir çok rolü olduğu tahmin edilmektedir. Ve konu üzerinde daha bir çok araştırmaya gereksinim olduğu düşünülmektedir. İlaca Dirençli Bakteriler • Şayet önlem alınmazsa, Dünya, antibiyotik sonrası çağa doğru gitmektedir, birçok harcıalem enfeksiyon artık tedavi edilemeyecek ve halen antibiyotiklerle tedavi edilebilen enfeksiyon hastalıkları bir kez daha ölümcül hale gelecektir. Dr. M. Chan DSÖ Genel Müdürü DSÖ Dirençle İlgili Son Durum Raporundan • Geçen yıl Dünya genelinde 440.000 MDR tüberküloz belirlendi ve en az 150.000 i ölümle sonuçlandı. • Sıtma paraziti en yeni kuşak ilaçlara bile direnç kazanmaktadır. • Gonore ve dizanteriden sorumlu dirençli suşlar, tedavi alternatiflerini giderek sınırlandırmaktadır. DSÖ Dirençle İlgili Son Durum Raporundan • Hastane kökenli ciddi enfeksiyonların büyük bir kısmından MRSA gibi dirençli bakteriler sorumlu olmaktadır. • İlaca dirençli suşlar uluslar arası yayılım göstermektedir. • Hastaneler yüksek dirençli patojenlerin yuvası haline gelmiştir. • MRSA (Metisilin Dirençli Staphylococcus aureus) • VRE (Vankomisin Dirençli Enterokoklar) • C. difficile (Clostridium difficile) • CRKP (Karbapenem Dirençli Klebsiella pneumoniae) • MDR TB/XDR TB (Çoklu İlaca Dirençli TB, Yaygın İlaca Dirençli TB) • Bakteriyel direnç -Yapısal (intrinsic) - Sonradan kazanılmış direnç (acquired) Kromozomal Plazmide bağlı Bakteriyel direncin plazmid ile transferi MRSA kaynağı? • HA – MRSA • CA – MRSA NDM-1 KP NDM-1 New Delhi metallo-betalactamase -1 PCM (Plasmid encoding Carbapenem resistant Metallobetalactamase) Çoklu İlaca Dirençli TB MDR-TB (Multi Drug Resistant Tuberculosis) X DR-TB (Extensively Drug Resistant Tuberculosis) İlaç Dirençli TB halk sağlığını tehdit eden global bir sorun haline gelmiştir. İlaca Duyarlı TB, Nasıl İlaca Dirençli Hale Geliyor? İlaca duyarlı TB hastalarının uygunsuz / yetersiz ilaç kullanımı MDR / XDR TB için Ne Yapılabilir? • Erken teşhis için laboratuvarların güçlendirilmesi • Hasta odaklı etkin tedavi • Bulaşmayı önleyici politikalar Laboratuvarın Rolü Ne Olabilir? • Referans laboratuvarlar ağı içinde kalitesine güvenilen ilaç duyarlılık testlerinin ve diğer laboratuvar proseslerinin kullanılması • Hızlı laboratuvar sonucu Hızlı ve etkin tedavi Sağlıklı toplum Laboratuvar Testleri Klasik Yöntemler • ARB • Geleneksel yöntemlerle kültür/idantifikasyon/duyarlılık testi • Otomatize sistemlerle kültür/idantifikasyon/duyarlılık testi Doğrudan materyalden MTB-DNA tayini Cobas Taqman MTB PCR NAA TB İlaç Direnç Genleri Belirlenmesi • Real time nükleik ait amplifikasyonu teknolojisi ve reverse hibridizasyon ile direnç genlerinin belirlenmesi yoluyla doğrudan TB direncinin gösterilmesi • X pert MTB/RIF Otomatize nükleik asit amplikasyonu ile eş zamanlı TB idantifikasyonu ve Rifampisin duyarlılığının belirlenmesi KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE YENİ TEKNOLOJİLER Geleneksel Kültür- Antibiyogramda • Kültür ve idantifikasyon süresi uzun olduğundan klinisyenler tedavilerini klinik semptomlara göre başlıyor (non-spesifik tedavi) • Geniş spektrumlu ilaçlar kullanılıyor • Laboratuvar bulgusuna dayalı tedavi ancak 3-5 gün sonra başlayabiliyor Geleneksel Uygulama Sonuçları • • • • Tedavi süresi uzuyor Dirençli suşlar çoğalıyor Mortalite artıyor Parasal kayıplar artıyor Niçin Hızlı İdantifikasyon • Etkili antibiyotiklerin hızla uygulanmasını sağlıyor • Hedefe yönelik antibiyotik kullanımı ile etkin tedavi yapılabiliyor • Mortalite azalıyor • Hastanede kalış süresi kısalıyor • Dirençli suşların ortaya çıkması azalıyor. Hızlı İdantifikasyon Sağlayan Moleküler Metotlar • PNA-FISH (Peptide Nucleic Acid Fluorencent in situ hybridization) • Real-time PCR Hızlı İdantifikasyon Sağlayan Moleküler Metotlar • Avantajları Hızlı sonuç Laboratuvar iş akışına kolay adaptasyon • Dezavantajları Gram boyaya ihtiyaç göstermesi Test edilen mikroorganizma menüsünün sınırlı olması Geleneksel kültür-antibiyogram testlerinin paralel yürütülmesi zorunluluğu MS (Mass spectrometry) Teknolojisi • PCR/ESI-MS (PCR ile kombine electrospray ionizasyon-mass spectrometry) • MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry) PCR / ESI-MS • Bakteri veya mantarların genomlarında multipleks PCR ile hedef bölgeleri çoğaltır. • Ampliconların mass/charge oranını ölçer • Veri tabanındaki bilenen mikroorganizma kompozisyonuna göre idantifiye eder. • Genetik idantifikasyon suşun tipini ve antimikrobik direnç genlerini belirleyebilir. • Bu nedenle idantifikasyon yanında epidemiyolojik sürveyans ve enfeksiyon kontrolünde de kullanılabilir. MALDİ-TOF MS • Protein biomarkerlarını mass spectrometry ile ölçer (Ribosomal, chaperone, transcription / translation factor proteinleri) • Bakteri, mantar, mikobakterileri tür düzeyinde idantifiye eder. • Doğrudan koloninin veya bakteriyel ekstresinin doğrudan ionizasyonu ile protein profilleri elde edilir. İdantifikasyon referans suşlardan elde edilen veri tabanı ile karşılaştırılarak yapılır. • Mikroorganizma gruplarına göre ayrı işlem gerekmez. MALDİ TOF MS PEAKS MALDİ-TOF MS • • • • Doğru idantifikasyon yeteneği yüksek Sarf malzemelerinin bedeli düşük Hızlı sonuç İdantifiye edilecek mikroorganizma ile ilgili ön bilgi gerekmiyor • Prefraksinasyon aşaması gerekmiyor. • 2-20 kDa arasındaki bütün m/z değerini ölçer Mikrobiyoloji Pratiği Renal tüberküloz düşünülen bir hasta var hekim idrarda tbc tetkiki yaptırmak istiyor. a) b) c) d) e) Teksifle ARB Tbc PCR Tbc kültürü LJ Tbc kültürü Bactec / MGIT İdrar mikroskobisi En uygun tek yanıt verecek olursanız hangisini önerir siniz? Renal tüberküloz düşünülen bir hasta var hekim otomatize sistemle tbc kültürü yaptırmak istiyor örnek olarak aşağıdakilerden hangisini önerir siniz? a) b) c) d) e) Spot idrar (herhangi bir saatte) 24 saatlik toplanmış idrar Orta idrar Sabah ilk idrarın tamamı Ön idrar Hekim hastadan Quantiferon gold testi istedi test pozitif çıktı bu test bize ne bilgi verir? a) b) c) d) Hastada aktif tbc enfeksiyonu vardır. Hastada latent tbc enfeksiyonu vardır. Hasta tbc’ye karşı bağışıktır. Hastada aktif/latent tbc enfeksiyonu vardır bu testle ayırt edilemez. e) Hastada tbc hastalığı vardır Quantiferon gold (gama interferon) testi için kan hangi tüpe/tüplere alınır? a) b) c) d) e) Düz kan tüpü EDTA’lı kan tüpü Heparinli kan tüpü Sitratlı kan tüpü TB antijenleri içeren tüp Resimde görülen Balgam örneğinden hazırlanan Ziehl-Nelson boyalı preparatı nasıl rapor eder siniz? a) b) c) d) e) Aside dirençli basil görüldü. Tüberküloz basili görüldü. Gram negatif basil görüldü. Bakteri görülmedi artefaktlar görüldü. Difteroid basil görüldü Hastada çalışılan EBV serolojik test profilinde aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir • • • • VCA IgG VCA IgM EA EBNA : Pozitif : Negatif : Negatif : Pozitif a) b) c) d) e) Primer enfeksiyondur Geçirilmiş enfeksiyondur EBV enfeksiyonu yok Belirsiz sonuç Reaktivasyondur Hastada çalışılan EBV serolojik test profili • • • • VCA IgG VCA IgM EA EBNA : Pozitif : Pozitif : Negatif : Negatif a) Primer enfeksiyondur b) Geçirilmiş enfeksiyondur c) EBV enfeksiyonu yok d) Belirsiz e) Reaktivasyondur Bir çocuk hastada EBV profili çalışılmış • • • • VCA IgM: Pozitif VCA IgG : Pozitif EA-D IgG : Pozitif EBNA IgG : Pozitif bulunmuştur. a) Erken dönem primer enfeksiyon b) Geç dönem / geçirilmiş enfeksiyon c) Reaktivasyon d) Belirsiz sonuçtur Yetişkin bir hastada yapılan serolojik testde Toksoplazma IgM : Pozitif Toksoplazma IgG : Negatif Bir ay sonra testler tekrarlanmış aynı sonuç bulunmuştur. a) b) c) d) e) Yeni başlayan (akut dönemde) bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Geçirilmiş bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Sub akut dönemde bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Toksoplazma ile enfekte olmamıştır. Reaktive olmuş toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Yetişkin bir hastada yapılan serolojik testde Toksoplazma IgM : Pozitif Toksoplazma IgG : Pozitif Altı ay ve bir yıl sonra testler tekrarlanmış aynı sonuçlar bulunmuştur. a) b) c) d) e) Yeni başlayan (akut dönemde) bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Geçirilmiş bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Sub akut dönemde bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. Toksoplazma ile enfekte olmamıştır. Reaktive olmuş toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur. 1 aylık gebe kadından yapılan serolojik testde Rubella IgM : Pozitif Rubella IgG : Pozitif Rubella IgG Avidite Testi : Düşük avidite a) b) c) d) e) Yeni başlayan (akut dönemde) bir rubella enfeksiyonu ile uyumludur. Geçirilmiş bir rubella enfeksiyonu ile uyumludur. Sub akut dönemde bir rubella enfeksiyonu ile uyumludur. Rubella ile enfekte olmamıştır. Reaktive olmuş rubella enfeksiyonu ile uyumludur. Resimdeki yapıya dışkı örneğinde incelemede rastlanmıştır. a) b) c) d) Kancalı kurt larvası Strongiloides larvası Pseodoparazit Ascaris Resimdeki yapı dışkıda görülmüştür, boyutu 25 μm dir. a) Entamoeba histolytica kisti b) Entamoeba hartmani kisti c) Entamoeba coli kisti d) Endolimax nana kisti Erişkin Ascaris lumbricoidesler vücutta hangi bölgede bulunur? a) b) c) d) e) Akciğer Karaciğer İnce bağırsak Kalın bağırsak Mide İdrar kültür örneğinin hemen ekimi yapılamıyorsa a) Oda ısısında 8 saate kadar bekletilebilir b) Dondurarak 48 saat bekletilebilir c) +4 °C (buzdolabında) 24 saat kadar bekletilebilir d) 37 °C etüvde 8 saate kadar bekletilebilir. e) Bekletilemez Akut idrar yolu enfeksiyonlarında etken olarak en sık rastlanan mikroorganizma a) Escherchia coli b) Klebsiella pneumoniae c) Proteus mirabilis d) Staphylococcus saprophyticus e)Streptococcus pyogenes Yetişkinlerde bakteriyel menenjit etkeni olarak en sık rastlanan bakteri a) Streptococcus pneumoniae b) Neisseria meningitidis c) Haemophilus influenza d) Escherichia coli e) Klebsiella pneumonia Endokarditlerle ilişkili olarak en sık rastlanan mikroorganizma a) b) c) d) Viruslar Neisseria Stafilokoklar Streptokoklar e) Riketsiyalar Aşağıdakilerden hangisi bağırsağın normal flora bakterileri arasında değildir? a) b) c) d) Shigella Clostridium Peptostreptococcus Laktobasil e) Bifidobacterium Bakteri kökenleri (suşları) en iyi hangi ısı derecesinde muhafaza edilebilir? a) b) c) d) e) 37 °C Oda sıcaklığı + 4 °C - 20 °C - 70 °C A grubu Streptokokların tip ayırımında hangisi kullanılır? a) b) c) d) e) ASO (anti streptolizin O) Bacitracin diski T antijen M antijen C karbohidratı Beta hemolitik Streptokoklarda A Grubu ayırımı için a) b) c) d) e) Gram boya yapılır Koagulaz testi yapılır PYR testi yapılır Beta hemolizin kuvvetli olmasına bakılır Bacitracin duyarlılığına bakılır (Birden fazla doğru yanıt olabilir) Basitracin duyarlılığı aşağıdakilerden hangisi için kullanılır. a) Stafilokokların mikrokoklardan ayrılmasında b) Streptokokların Stafilokoklardan ayrılmasında c) Neisseriaların muhtemel teşhisinde d) Hemophilus’ların muhtemel teşhisinde e) Pnomokokların muhtemel teşhisinde Aşağıdakilerden hangisi sifiliz için doğrulama testidir. a) TPHA (Treponema pallidum hemaglütinasyon testi) b) VDRL c) RPR d) Kolmer e) CRP Sifiliz tedavisinin takibinde kullanılır. a) b) c) d) e) VDRL titresi TPHA titresi FTA-Abs titresi CRP Abbott architect syphilis assay
