Tek nükleotid değişimleri ingle Nucleotide

Tek Nükleotid DeğiĢimleri
(Single Nucleotide Polymorphisms-SNP)
Prof.Dr. A. Suha Yalçın
Ġnsan Genom Projesi
Ġki bireyin DNA dizisi karĢılaĢtırıldığında % 99.9
aynı olduğu görülür; bireyler arasındaki farklılığı
~ 3x106 nükleotid sağlar.
Farkı sağlayan % 0.1 oranındaki değiĢimin çok
büyük bir kısmını da tek nükleotid değiĢimleri
oluĢturur.
A recently completed DNA sequencing of the 15 mouse strains
most commonly used in biomedical research showed that there
were more than 8.3 million single nucleotide polymorphisms
(SNPs) in their genomes (Genomics, Proteomics and
Bioinformatics, October 26, 2006).
The OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)
database at the NCBI tracks all human mutations with
known phenotypes.
It contains a total of about 2,000 genetic diseases [and
another ~11,000 genetic loci with known phenotypes – but
not necessarily known gene sequences]
It can be searched by disease name
The HapMap Project tests linkage between SNPs in
various sub-populations.
Define patterns of genetic variation across human genome
Guide selection of SNPs efficiently to “tag” common variants
Public release of all data (assays, genotypes)
Phase I:
1.3 M markers in 269 people
Phase II: +2.8 M markers in 270 people
GenBank has a dbSNP
It is possible to search dbSNP by BLAST comparisons to a target sequence
Mutation or polymorphism?
20/3/03. By Richard Twyman
DNA sequence variations are sometimes described as mutations and
sometimes as polymorphisms. What is the difference between these terms
and how are they applied to the human genome?
A mutation is defined as any change in a DNA sequence away from normal.
This implies there is a normal allele that is prevalent in the population and that the
mutation changes this to a rare and abnormal variant.
In contrast, a polymorphism is a DNA sequence variation that is common in the
population. In this case no single allele is regarded as the standard sequence.
Instead there are two or more equally acceptable alternatives. The arbitrary cut-off
point between a mutation and a polymorphism is 1 per cent. That is, to be classed
as a polymorphism, the least common allele must have a frequency of 1per cent or
more in the population. If the frequency is lower that this, the allele is regarded as a
mutation.
Normal Dizi
ĠĢlevsel protein
Polimorfizm
Mutant Dizi
ĠĢlevsel protein
ĠĢlevsel olmayan protein
ya da protein kaybı
Tek Nükleotid DeğiĢimleri
“Single Nucleotide Polymorphism (SNP)”
SNP’ler, günümüzde birçok hastalıkla ilişkilendirilen, tanı koymada gerekli ve
kişiye özgü tedavilerin geliştirilmesinde kullanılabilen genetik değişimlerdir.
İnsan Genomunda Yaklaşık 6 Milyar
Nukleotid Vardır.
Her 1000 ila 2000 Nükleotidde bir
SNP gözlenmektedir.
Yaklaşık 3-6 Milyon SNP
SNP’ler, genlerde bulunabildikleri gibi, genler arası kodlanmayan bölgeler
ve genin kodlanmayan (intron) kısımlarında da meydana gelebilir.
Hastalıklarla ilişkilendirilen SNP’ler genelde gen içi bölgeyi (ekson)
kodlayan DNA’da meydana gelenlerdir.
SNP’ler, hatalı protein üretimi ile ve/veya üretilen proteinlerin miktarını
değiştirerek genlerin fonksiyonlarını bozabilmektedir.
• Belirli bir baz pozisyonunda meydana gelen tek
nükleotid değişiklikleridir.
• Tüm genetik varyasyonların % 90’ını oluştururlar.
SNP Analizleri Ġçin GeliĢtirilmiĢ Teknikler
1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
2. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
3. DNA Dizileme (Sequencing)
4. ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR)
Mini-sequencing of Target DNA with
Glass-immobilized primers
Allele-specific Primer Extension with
Chain Termination
Illumina Allele
Specific Primer
Extension
and Ligation
Antioksidan Gen Polimorfizmlerinin
Tanısına Yönelik DNA Analiz Kiti
Geliştirilmesi
5746 SAYILI KANUN
TEKNOGĠRĠġĠM SERMAYESĠ DESTEĞĠ
İŞ FİKRİ SAHİBİ ADI-SOYADI : GÖKHAN BİÇİM
Serbest radikaller insanlarda ve diğer memelilerde hem normal metabolik
yolların işleyişi sırasında hem de çeşitli dış etkenlerin etkisiyle oluşan çok
kısa ömürlü ve reaktif yapıda bileşiklerdir. Serbest radikaller hücrelerde ve
dokularda birçok zarara yol açarlar. Neden oldukları hücresel zararlar
arasında DNA hasarı, enzim aktivitelerinde ve lipid metabolizmasındaki
değişiklikler, lipid peroksidasyonu yoluyla zar yapısı ve fonksiyonlarının
bozulması, zar proteinlerinin ve taşıyıcı proteinlerin tahribi yer almaktadır.
Serbest oksijen radikallerinin yol açtığı hasar “Oksidatif stres” olarak da
tanımlanır.
Serbest radikallerin yaşlanma, ateroskleroz, kanser, iskemi reperfüzyon,
inflamasyon, romatoid artrit, nörodejeneratif hastalıklar, karaciğer
hastalıkları gibi birçok patolojik durumda etken rol oynadığı kabul
edilmektedir.
ANTĠOKSĠDAN SAVUNMA
Aerobik organizmalarda serbest radikallerin ana kaynağı oksijen molekülüdür.
Serbest radikallerin oluşumları artınca katıldıkları reaksiyonlar kontrolsüz bir
nitelik kazanır ve bu sürecin sonucu olarak da hücre ölümü ve doku hasarı
ortaya çıkar.
Tüm aerobik canlılarda serbest radikal oluşumunu sınırlayan ve oksidatif hasarı
engelleyen antioksidan savunma sistemleri gelişmiştir. Antioksidan moleküller
arasında çeşitli küçük moleküller yanında katalaz, süperoksit dismütaz ve
glutatyon peroksidaz gibi enzimler ile metal iyonlarını bağlayan proteinler
yer almaktadır.
Proje Aşamaları
1. Genlerin ve SNP Bölgelerinin Seçimi
2. Primer tasarımı
3. ARMS-PCR ile kontrol/doğrulama) işlemleri
4. Doğrulaması gerçekleşmeyen SNP’ler için primer tasarımları
yapılması ve tekrar doğrulama
5. Planlanan bütün bölgelerin doğrulamasından sonra mikroarray
dizilimlerinin yapılması
6. Farklı konsantrasyondaki örnek DNA’lar kullanılarak Floresans işaretli
nükleotidlerle uygulama
7. Uygulama esnasında değişik hibridizasyon ve uzama süreleri kullanılarak
koşulların optimizasyonu
8. Optimize edilmiş koşullar doğrultusunda prototip kit oluşturulması
MIKROARRAY ARMS-PCR TABANLI SNP
KĠTĠNĠN UYGULAMASI
Örnek DNA’nın Enzim Kesimi
Hibridizasyon Süreci
(Hazırlık ve Uygulama)
PCR Uygulaması
Yıkama ve Kurutma
4 Saat
30-60 Dakika
15-30 Dakika
15-30 Dakika
15-30 Dakika
Analiz
Mikroarray ARMS-PCR Çalışma Prensibi
G C
G A
Her bir SNP bölgesi üç spot la değerlendirilecek ve üç spotun olası
durumlarına göre aşağıdaki sonuçlar elde edilecektir.
M Wt C
Homozigot (Mutant)
Homozigot (Wild-type)
Heterozigot
Uygun Değil