ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ

ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ
FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
YÜKSEK LĐSANS TEZĐ
Ender BELLUR
PEKTĐN METĐLESTERAZIN SĐYAH HAVUÇTAN ĐZOLE EDĐLMESĐ,
SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BĐYOKĐMYASAL ÖZELLĐKLERĐNĐN
BELĐRLENMESĐ
GIDA MÜHENDĐSLĐĞĐ ANABĐLĐM DALI
ADANA, 2008
ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ
FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
PEKTĐN METĐLESTERAZIN SĐYAH HAVUÇTAN ĐZOLE EDĐLMESĐ,
SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BĐYOKĐMYASAL ÖZELLĐKLERĐNĐN
BELĐRLENMESĐ
Ender BELLUR
YÜKSEK LĐSANS TEZĐ
GIDA MÜHENDĐSLĐĞĐ ANABĐLĐM DALI
Bu tez 26/09/2008 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile
kabul edilmiştir.
Đmza:………………………
Yrd.Doç.Dr.M.Ümit ÜNAL
Danışman
Đmza:……….…….…………
Yrd.Doç.Dr.M.Sertaç ÖZER
Üye
Đmza:…………………………
Yrd.Doç.Dr.Ramazan BĐLGĐN
Üye
Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır.
Kod No :
Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ
Enstitü Müdürü
Đmza ve mühür
Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından
Desteklenmiştir.
Proje No : ZF2006.YL.84
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların
kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere
tabidir.
ÖZ
YÜKSEK LĐSANS TEZĐ
PEKTĐN METĐLESTERAZIN SĐYAH HAVUÇTAN ĐZOLE EDĐLMESĐ,
SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BĐYOKĐMYASAL ÖZELLĐKLERĐNĐN
BELĐRLENMESĐ
Ender BELLUR
ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ
FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
GIDA MÜHENDĐSLĐĞĐ ANABĐLĐM DALI
Danışman
Yıl
Jüri
: Yrd. Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL
: 2008, Sayfa : 43
: Yrd. Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL
Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER
Yrd. Doç. Dr. Ramazan BĐLGĐN
Bu çalışmada, siyah havuçtan izole edilen ve %80’lik amonyum sülfat
çökeltmesi ve diyalizle kısmen saflaştırılan pektin metilesterazın substrat ilgisi,
optimum sıcaklık, optimum pH, tuzların etkisi, termal stabilite ve inaktivasyon gibi
biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi araştırılmıştır.
Elma pektiniyle yapılan çalışmada enzimin Km değeri 2.14 mg/ml (r2=0.988)
ve Vmax değeri 3.75 ünite/ml olarak bulunmuştur. PME aktivitesi için optimum pH
değeri 7.5’tir ve enzim 6.0-8.5 gibi geniş bir pH aralığında yüksek aktivite
göstermiştir. PME aktitesi için optimum sıcaklık 55°C olarak bulunmuştur ve enzim
aktivitesinde bu sıcaklıktan sonra keskin düşüşler görülmüştür. Enzim 50-60°C
arasında %80’in üzerinde aktivite göstermiştir. Enzim 30-50°C aralığında oldukça
stabildir ve 50°C’den itibaren enzim aktivitesi düşmüştür. Enzimin termal
inaktivasyon sonuçlarına göre sıcaklık arttıkça kD değerleri azalmış buna karşılık
yarılanma ömrü ve D değerleri ise azalmıştır. Enzimin aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z
değerleri sırasıyla 196.8 kJmol-1 (r2=0.9957) ve 2.16ºC (r2=0.9945) olarak
bulunmuştur. Z değerinin de gösterdiği gibi enzimin termal stabilitesi çok yüksek
değildir.
Anahtar Kelimeler : Siyah havuç, pektin metilesteraz, kinetik, termal stabilite,
termal inaktivasyon
I
ABSTRACT
MSc THESIS
ISOLATION, PURIFICATION AND DETERMINATION OF SOME
BIOCHEMICAL PROPERTIES OF PECTIN METHYLESTERASE FROM
BLACK CARROT
Ender BELLUR
DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF CUKUROVA
Supervisor : Assist. Prof. Dr. M.Ümit ÜNAL
Year
: 2008, Pages : 43
Jury
: Assist. Prof. Dr. M. Ümit ÜNAL
Assist. Prof. Dr. M. Sertaç ÖZER
Assist. Prof. Dr. Ramazan BĐLGĐN
This research was undertaken to determine some of the biochemical
properties (substate specificity, optimum pH, optimum temperature, effect of salts,
thermal stability and inactivation) of pectin methylesterase isolated from black carrot
and partially purified by 80% ammonium sulphate precipitation followed by dialysis.
Km and Vmax values of the enzyme using apple pectin as substrate were 2.14
mg/ml (r2=0.988) and 3.75 unit/ml respectively. The optimum pH for PME activity
was found to be 7.5 and the enzyme showed high activity over a broad pH range of
6.0-8.5. The optimum temperature for PME activity was 55°C, after which enzyme
activity dropped sharply. Enzyme activity was more than 80% between 50-60°C. The
enzyme was very stabile between 30-50°C and the stability declined after 50°C.
According to thermal inactivation studies kD values increased as the temperature
incresed whereas half-life and D values decreased. Energy of activation (Ea) and Z
values were found to be 196.8 kJmol-1 (r2=0.9957) and 2.16ºC (r2=0.9945),
respectively. As the Z value indicates the enzyme is not very thermostabile.
Key Words : Black carrot, pectin methylesterase, kinetics, thermal stability, thermal
inactivation
II
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi
ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve
destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Yrd.
Doç. Dr. Mustafa Ümit Ünal’a teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmamın her aşamasında, bilgi ve tecrübesinden yararlandığım, değerli
hocalarım Prof. Dr. Turgut Cabaroğlu, Prof. Dr. Sadık Dinçer ve Doç. Dr. Hüseyin
Erten’e,
Çalışmamın her aşamasında yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen;
Araştırma Görevlisi Aysun Şener, kızkardeşim Dr. Esen Bellur, arkadaşlarım
Abdulkadir Avan, Aykut Aksoy, Faruk Talaş, Filiz Uçan, Halide Kaya, Hüseyin
Aslan, Muzaffer Akbaş, Selin Yabacı ve Tuğba Taze’ye,
Đlgi, sabır ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen babam Rıdvan
Bellur, annem Feride Bellur ve tüm kardeşlerime,
Destek ve katkılarından dolayı Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda
Mühendisliği Bölümü personeline ve Amylum Nişasta Sanayi ve Ticaret A. Ş. Kalite
Departmanı personeline teşekkürlerimi borç bilirim.
III
SAYFA
ĐÇĐNDEKĐLER
ÖZ...........................................................................................................................
I
ABSTRACT...........................................................................................................
II
TEŞEKKÜR........................................................................................................
III
ĐÇĐNDEKĐLER....................................................................................................... IV
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ........................................................................................
VI
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ.............................................................................................. VII
1. GĐRĐŞ…….......................................................................................................
1
2. ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR..................................................................................
5
3. MATERYAL ve METOT……….……………………………………………. 12
3.1. Materyal………………………...…………..…………………………....... 12
3.1.1. Siyah Havuç Örnekleri………………………………………………... 12
3.1.2. Analizlerde Kullanılan Araç Gereçler.………………………………... 12
3.2. Metot……………….……………………………………………………… 13
3.2.1. PME’ın Ekstraksiyonu ve Kısmi Saflaştırılması……………………… 13
3.2.2. Protein Tayini…...….…………………………………………………. 14
3.2.3. Enzim Aktivitesi ve Bazı Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi.
15
3.2.3.1. PME Aktivitesinin Belirlenmesi...……………………………….
15
3.2.3.2. Enzim Kinetiği………………..…………………………………… 16
3.2.3.3. Optimum pH ………………………………..…………………….. 16
3.2.3.4. Optimum Sıcaklık…………...…...……………..………..………... 17
3.2.3.5. Termal Stabilite.....…..……………………………………………. 17
3.2.3.6. Termal Đnaktivasyon…………………….………………………… 17
3.2.3.7. Tuzun Etkisi……………………………………………………….. 18
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA………………………………. 19
4.1. Kinetik Parametreler……….………………………………....……….…... 19
4.2. Optimum pH……………………………………………………...……….. 20
4.3. Optimum Sıcaklık………………...…………………………...…………... 23
4.4. Termal Stabilite………………………………..………...………...……… 25
IV
4.5. Termal Đnaktivasyon……………………………………….………...…
28
4.6. Tuzun PME Aktivitesine Etkisi..………..……………………………….
31
5. SONUÇ ve ÖNERĐLER ……………............................................................... 34
KAYNAKLAR…………………………………………………………………
35
ÖZGEÇMĐŞ……………………………………………………………………… 43
V
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ
SAYFA
Çizelge 4.1. Farklı PME’ların pektin ilgisi (Km)…………...…...……………....
20
Çizelge 4.2. Farklı PME’ların optimum pH değerleri.……………………..…...…22
Çizelge 4.3. Farklı PME’ların optimum sıcaklık değerleri………………………..24
Çizelge 4.4. Siyah havuç PME’ının termal inaktivasyon değerleri.…….…………28
Çizelge 4.5. Farklı PME’ların aktivasyon enerjileri(Ea)...........................................30
Çizelge 4.6. Farklı PME’ların maksimum aktivasyonu için NaCl
konsantrasyonları.…...……………………………………………………………..33
VI
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ
SAYFA
Şekil 1.1. Pektinin pektata hidrolizi………………………………..……..…...
3
Şekil 1.2. Pektin metilesterazın 3 boyutlu yapısı…………………...................
3
Şekil 3.1. Diyaliz şeması……………………………………...………………
14
Şekil 3.2. Analiz düzeneği…………………………………………………….
15
Şekil 4.1. pH’nın siyah havuç PME aktivitesine etkisi……………………….
22
Şekil 4.2. Sıcaklığın siyah havuç PME aktivitesine etkisi...………………….
24
Şekil 4.3. Siyah havuç PME’ının termal stabilitesi…..……………...………..
25
Şekil 4.4. Tuz konsantrasyonunun siyah havuç PME aktivitesine etkisi…......
31
VII
1.GĐRĐŞ
Ender BELLUR
1. GĐRĐŞ
Bitki hücre duvarındaki pektik maddelere etki eden pektik enzimler, farklı
enzimlerden oluşurlar. Pektinaz, endüstriyel pektik enzim preparatları için kullanılan
genel bir isimdir. Pektik enzimleri, pektin molekülünün galakturonan omurgasına
olan etkilerine göre pektinesterazlar (ester bağını hidrolize edici) ve depolimerazlar
(zincir kırıcı) olarak iki sınıfa ayırarak incelemek olasıdır (Maraş ve ark., 2004).
Pektin esteraz enzimi esterleşmiş pektinin demetilasyonunu katalizler. Enzim
spesifik olarak galakturonik asitin C6 pozisyonundaki metilester gruplarını katalizler
ve yüksek bitkilerde hücre duvarının parçalanmasında önemli bir rol oynar. Bu
enzim ham meyvede yüksek miktarlarda bulunur. Poligalakturonid esterleri için
spesifiktir. Divalent veya monovalent katyonlar bu enzimi aktive ederler. Optimum
pH aralıkları 5-8 arasındadır. Metoksi grupların dağılımı enzimin reaksiyon hızını
etkiler. Pektin esteraz aktivitesi için muhtemelen galakturonid zinciri üzerindeki
esterleşmiş grubun yanında serbest karboksil grubu gerekir (Lamikanra, 2002).
Pektinazlar asidik ve bazik özelliklerine göre de sınıflandırılabilir. Asidik
pektinazlar, meyve suyu endüstrilerinde ve şarap yapımında kullanılırlar. Bu
endüstrilerde ticari olarak üretilen bu meyve sularını kapsarlar; berrak meyve suları
(elma, armut ve üzüm suları), bulanık meyve suları (turunçgiller, erik, domates,
meyve suları ve nektarlar), tek hücreli ürünler. Bazik pektinazlar, endüstride
çoğunlukla bakteriyel kaynaklardan (başlıca Bacillus ssp.) üretilirler ve belirtilen
amaçlar için kullanılırlar. Fiber ürünlerinde zamkı ıslatıp yumuşatmada ve çözmede,
kağıt üretiminde, yağ ekstraksiyonunda, kahve ve çay fermantasyonunda ve meyve
suyu endüstrisindeki pektik atık suların ön muamelesinde kullanılırlar (Kashyap ve
ark., 2001; Alonso ve ark., 2003).
1
1.GĐRĐŞ
Ender BELLUR
Pektik enzimler etki mekanizmalarına göre aşağıdaki şekilde sınıflandırılırlar
(Wong, 1995).
(1)
Poligalakturonaz (PG) α-1,4-glikozidik bağlarını hidrolitik olarak parçalar.
Endo ve ekzo olmak üzere iki tipi söz konusudur. Ekzo-PG (ekzo-poli (1,4α-D-galaktuonid) galakturonohidrolaz, EC 3.2.1.67) substrata indirgen
olmayan uçtan, endo PG (endo-poli1,4- α-D-galaktuonid) glikanohidrolaz,
EC 3.2.1.15) rastgele etki eder.
(2)
Pektin metilesteraz (PE) (Pektin pektilhidrolaz, EC 3.1.1.11) metil ester
gruplarını hidrolize ederek pektini deesterifiye eder. Enzim tercihen
esterleşmemiş bir galakguronat birimi yanındaki galakturonat biriminin metil
ester grubuna etki eder.
(3)
Pektat liyaz (PEL) β-eliminasyonla esterleşmemiş galakturonat birimlerinin
kırılmasını katalizler. Hem ekzo-PEL [ekzo-poli (1,4-α-D-galakturonid)
liyaz, EC 4.2.2.9] ve hem de endo-PEL [endo-poli (1,4-α-D-galakturonid)
liyaz, EC 4.2.2.2] türleri vardır. Pektat ve düşük metoksilli pektin bu enzimler
için tercih edilen alt türleri vardır. Pektat ve düşük metoksilli pektin bu
enzimler için tercih edilen substratlardır. Her iki tipinin pH optimumu 8.011.0 arasında olup aktiviteleri için Ca+2’a ihtiyaç duyarlar.
(4)
Pektin liyaz (PNL) β-eliminasyonla esterleşmiş galakturonat birimlerinin
kırılmasını katalizler. Çalışılan bütün PNL’ler endo-enzimdir.
Pektin metilesteraz enzimi pek çok bitki, patojen küf ve bakteride bulunur.
Yüksek bitkilerden, özellikle elma, muz, çilek, böğürtlen, turunçgiller (tatlı limon,
portakal, altıntop ve mandarin), kiraz, üzüm, mango, papaya, ihtiras meyvesi, armut,
erik, fasulye, havuç, salatalık, pırasa, soğan, bezelye, patates, turp, ve domateste
PME saptanmıştır. Bu enzimin çoklu formlarına rastlanmıştır. Genel olarak
biyokimyasal özellikleri farklılık gösteren bazik, nötral ve asidik formları
bulunmuştur. PME’lar değişik dokularda bulunurlar ve serbest formları saptanmış
olsa da esas olarak hücre duvarındaki proteinlerle iyonik etkileşimlerle birleşirler
(Benen ve ark., 2003).
2
1.GĐRĐŞ
Ender BELLUR
Pektin metilesteraz pektinin pektat ve metanole hidrolizini katalizler (Şekil
1.1). Bitkilerde, hücre duvarı metabolizmasında meyvenin olgunlaşması süresince
hücre duvarının genişlemesinde ve polen filizlenmesi süresince önemli rol oynar
(Kertesz, 1955).
OH
O
O
O
O
O
OH
OH O
OH O
OH
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
OH O
OH
+ n(H2O)
OH
O
O
OH
O
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
+ n(CH3OH)
OH
OH
O
OH
OH
Pektin
Pektat
Şekil 1.1. Pektinin pektata hidrolizi (Anonymous, 2006)
Bitkisel pektin metilesterazın kristal yapısı Şekil 1.2’de gösterilmiştir. Pektin
bağlanması için uygun olduğu ortaya çıkarılan çeşitli aromatik artıklarla kaplanmış
β-helix yapı merkez boşluğunda bulunur. Aktif merkez bu boşluğun içerisindedir.
Asp157 nükleofil olarak, Asp136 bir asit/baz olarak ve Gln113/Gln135 geçiş
durumunu stabilize etmek için şekil veren bir anyon boşluğu olarak belirtilmektedir
(Anonymous, 2006).
Şekil 1.2. Pektin metilesterazın 3 boyutlu yapısı (Anonymous, 2006)
PME’ın bitkisel hücre metabolizmasında temel rol oynadığına inanılmaktadır.
Meyvelerin olgunlaşmasında ve hücre gelişimi sırasında hücre duvarının
büyümesinde rol oynamaktadır. Olgunlaşmadaki rolü metilasyon derecesi düşük
pektin oluşturmasıdır. Hücre duvarının büyümesindeki rolü ise otoliz ve büyümede
rol oynayan enzimleri aktive eden lokal pH düşmesine neden olmasıdır. PME
aktivitesinin kontrolü meyve suyu ve pürelerinin üretimi ve muhafazasıyla ilgili
3
1.GĐRĐŞ
Ender BELLUR
biyoteknolojik prosesler açısından çok önemlidir (Balestrieri ve ark., 1990). Pektinin
depolimerizasyonu genellikle meyvenin olgunlaşmasıyla ilgilidir. Bu nedenle bu
enzimler meyve ve sebzelerde hasat sonrası depolama sırasında meydana gelen
değişikliklerde çok önemli rol oynarlar.
Gıda sanayii açısından PME hem yararlı hem de zararlı etkilere sahiptir. Gıda
sanayinde turunçgil sularında istenmeyen bulanıklık kaybına neden olurlar. PME
meyve suyu ve nektarlarının bulanıklık stabilitesini olumsuz etkilemektedir. Faydalı
etkileri ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir:
(1)
ısıl işlem uygulanmış meyve ve sebze ürünlerinde sertliğin geliştirilmesi,
(2)
meyve suyu veriminde artış,
(3)
kurutma sırasında dokulardan suyun uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak
(Ly-Nguyen ve ark., 2002a).
(4)
Meyve sularının berraklaştırılması (Wong, 1995).
PME enzimi havuç da dahil olmak üzere pek çok üründen saflaştırılmış ve
özellikleri belirlenmiştir. Havucun beyazdan mora kadar soluk sarı, kırmızı, yeşil ve
siyah çeşitleri vardır. Ancak, siyah havuçtaki (Daucus carota L. ssp. sativus var.
atrorubens Alef) PME ile ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu
çalışmanın amacı, siyah havuçlardan PME enziminin ekstrakte edilerek bazı
biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesidir.
4
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
2. ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Vora ve ark. (1999)’nın havuçta yaptığı çalışmada ham ve işlenmiş ürünlerde
bozulmaya yol açan bazı enzimler saptanmıştır. PME havuç suyunda bulanıklık
stabilitesinin kaybolmasına neden olur. Farklı Avustralya havuç çeşitlerinden
saflaştırılmış PME ve bozulmada rol oynayan diğer enzimlerin lokalizasyonları,
aktiviteleri, karakterizasyonları, termal ve yüksek basınç inaktivasyonları ile ilgili
çalışmalar yapmışlar ve değişik varyetelerden gelen PME aktiviteleri arasındaki
farkın önemsiz olduğunu bulmuşlardır.
Alonso ve ark. (2003) havuç (Daucus carota L.) PME’ının saflaştırılmasını
ve karakterizasyonunu çalışmışlardır. Enzim iyon değişim ve jel filtrasyon
kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Enzim substratlarına yüksek ilgi göstermiş, elma
pektini için Km ve Vmax değerleri 0.031 mg/ml-1 ve 6.77 ünite olarak bulunmuştur.
Optimum pH değeri 7.4 civarında bulunmuş ve metalik iyonlarca aktive edildiği,
optimum aktivitelerin NaCl için 130-330 mM ; CaCl2 için 15-50 mM
konsantrasyonları arasında olduğu ortaya konulmuştur. Ayrıca enzimin çoğunlukla
Ca+2 ile aktive olduğu ve yüksek konsantrasyonlarda Na+’a toleransının yüksek
olduğu bildirilmiştir. Diğer bitkisel kökenli PME’larla kıyaslanması sonucu daha
termolabil olduğu ve 70ºC’de 5 dk ısıtmayla inaktive olduğu belirlenmiştir. Enzim
yüksek konsantrasyonlarda poligalakturonik asit ve yarışmalı olarak
D-galakturonik
asitle inhibe olmuştur.
Ly-Nguyen ve ark. (2002a, 2003) havuç PME’ının kısmi saflaştırılması,
karakterizasyonu ve termal ve yüksek basınç inaktivasyonları üzerine kinetik bir
çalışma yapmışlardır. PME CNBr-Sepharose 4B-PME inhibitör kolonunda affinite
kromatografi yoluyla saflaştırılmıştır. Tek bir protein ve PME aktivitesi piki elde
edilmiştir. Havuç PME’ının kinetik parametreleri ve molar kütle, izoelektrik
noktaları araştırılmıştır. Đkinci adımda enzimin termal ve yüksek basınç stabilitesi
çalışılmıştır. Havuçtan saflaştırılmış PME’ın izotermal ve kombine edilmiş
izotermal-izobarik inaktivasyonu bir fraksiyonel dönüştürme modeliyle açıklanmıştır.
5
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
Balogh ve ark. (2004) havuçtan (Daucus carota) ekstrakte ettikleri PME’ı bir
CNBr-Sepharose-PME inhibitör kolonunda saflaştırmışlardır. Saflaştırılmış havuç
PME’ı üzerine detaylı kinetik çalışmalar termal ve yüksek basınç uygulamalarıyla
yürütülmüştür. Ayrıca, gerçek ürünlerde (havuç suyu ve havuç parçaları) PME’ın
termal ve yüksek basınç inaktivasyonu model sistemleri araştırılmıştır. Đnaktivasyon
izotermal ve izotermal-izobarik koşullar altında yürütülmüştür. Tüm bu koşullar
altında inaktivasyon verisini tanımlayan 1. dereceli kinetik model araştırılmıştır.
Sonuçta havuç PME’ının, havuç parçalarında, havuç suyundan veya saflaştırılmış
formdan daha termostabil ve basınç-stabil olduğu bulunmuştur.
Sila ve ark. (2007) termal ve yüksek basıncın havuç (Daucus carota var.
Nerac) PME’ı stabilitesi ve katalitik aktivitesi üzerine olan etkilerini çalışmışlardır.
Saflaştırılmış PME’ın moleküler ağırlığı 32 kDa olarak bulunmuş, sonuç olarak
atmosferik basınç altında havuç PME’si 22.5ºC’deki optimum pH’sı 8.0 olarak
bulunmuştur. Bu enzim oldukça yüksek sıcaklıklarda (50ºC’nin üzerinde), 600
MPa’nın üzerindeki basınçlara özellikle 40ºC’nin altındaki sıcaklıklarda dikkate
değer bir direnç göstermiştir. Katalitik aktivite yüksek oranda uygulanan basınca ve
sıcaklığa bağımlıdır. Optimum PME aktivitesi 50ºC’de yaklaşık 300-500 MPa olan
basınç kombinasyonunda bulunmuştur.
Maraş ve ark. (2005)’nın yaptıkları çalışmalarda liyofilize pektinaz enziminin
yapısal analizleri yapılmış; pektin, poligalakturonik asit ve liyofilize bakteriyel
pektinazın kristal yapıları taramalı elektron mikroskobunda (SEM) görüntülenmiştir.
SEM’deki görüntülerinde homojen kristal yapı görülmüştür. Pektin, poligalakturonik
asit ve bakteriyel pektinaz elektron ışınlarını geçirmeyecek kadar kompakt ve sıkı
paketlenmiştir. Ayrıca substrat molekül kristallerinin pektinaz enziminden daha
küçük boyutta olduğu tespit edilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında pektinaz
enziminin kristal yapısında bulunabilecek elementlerin analizi yapılmıştır.
Espach-Barroso ve ark. (2006) çalışmalarında ise muz, havuç, domates ve
portakal gibi birkaç farklı meyveden izole edilen PME’ların termal veya yüksek
şiddetli elektrik alan uygulamalarına bağlı inaktivasyon özellikleri karşılaştırılmıştır.
Bunun için 54-81˚C arasında 120 dakikaya kadar olan sürelerde denemeler
yapılmıştır. 0.5-5.0 Hz ve 13.2-19.1 kV/cm elektrik alanlarında akımlarla deney
6
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
yürütülmüştür. Yüksek elektrik alanlarında uygulama süresiyle doğru orantılı olarak
tüm bitkisel kaynaklı PME’ların yüksek oranlarda inaktive olduğu sonucuna
varılmıştır. Bu şartlar altında maksimum PME inaktivasyonları portakal ve domates
için %87, havuç için %83 ve muz için %45 olarak bulunmuştur.
Yemenicioğlu ve Cemeroğlu (1999) salatalık (Cucumis sativus) hücre
duvarına iyonik olarak bağlı PME ve sıkı bağlı PME’ı izole ederek enzimin termal
stabilitesini ve inaktivasyonunu incelemişlerdir. PME inaktivasyonunun 65ºC’nin
üzerinde hızlandığı görülmüştür. Đyonik bağlı PME için bu sıcaklık 65ºC iken sıkı
bağlı PME için 60ºC olarak bulunmuştur.
Denès ve ark. (2000) elma PME’ının saflaştırılmasını, biyokimyasal
özelliklerini ve termal inaktivasyonunu çalışmışlardır. PME CNBr-Sepharose-PME
inhibitör kolonunda affinite kromatografi yoluyla saflaştırılmıştır. Tek bir protein ve
PME aktivitesi piki elde edilmiştir. Km=0.098 mg ml-1 ve Vmax =3.86 µmol min-1 ml-1
olarak bulunmuştur. Optimum pH 7.5’in üzerinde, optimum sıcaklık ise 63ºC olarak
saptanmıştır. Saflaştırılmış PME optimum aktivite için konsantrasyonları pH 7’de
0.13 M ve pH 4’te 0.75 M olan NaCl’e gereksinim duyduğu bulunmuştur. Termal
inaktivasyon %50 gliserol içeren ve gliserol içermeyen ortamlarda incelenmiş ve
gliserolun elma PME’ının sıcaklık direncini arttırdığı gözlenmiştir.
Guivarc’h
ve
ark.
(2005)
PME’ın
greyfurttan
(Citrus
paradisi)
saflaştırılmasını, karakterizasyonunu, termal ve yüksek basınç inaktivasyonlarını
çalışmışlardır. Saflaştırılan PME fraksiyonlarının molekül ağırlıklarının 31.5-23.7
kDa arasında olduğu bulunmuştur. 20 mM Tris tamponu içerisindeki enzimin
kombine termal ve yüksek basınç inaktivasyon denemeleri 10-62ºC ve 0.1-800 MPa
aralıklarında çalışılmıştır. PME’ın inaktivasyon sıcaklığı 58ºC ve üzeri, inaktivasyon
basıncı ise 0.1-300 MPa aralığında bulunmuştur.
Nunes ve ark. (2006) erikten (Prunus domestica) affinite kromatografi
kullanılarak saflaştırılan PME’ın termal ve yüksek basınç stabilitesini çalışmışlardır.
SDS/PAGE’de moleküler ağırlığı 31 kDa olan tek bir bant elde edilmiştir. Đzoelektrik
fokuslama elektroforezinde nötral izoelektrik noktalarında iki bant (6.8 ve 7.0) tespit
edilmiştir. Optimum pH 7.5, optimum sıcaklık ise 65ºC olarak bulunmuştur. Termal
inaktivasyon 54-70ºC arasında çalışılmıştır. Basınç inaktivasyonu ise 650-800 MPa
7
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
arasındaki basınçlarda 25ºC’de çalışılmıştır. Saflaştırılmış erik PME’ı diğer
meyvelerdekine kıyasla termal ve 600 MPa’nın altındaki basınç uygulamalarında
kararlı bulunmuştur.
Castro ve ark. (2005, 2006a, 2006b) biber (Capsicum annuum) PME’ının
yüksek basınç (0.1-600MPa) ve sıcaklık (18-65˚C) uygulamalarıyla inaktivasyonunu
incelemişler, daha sonraki çalışmalarında ise aynı üründe PME’ın optimum aktivitesi
için basınç/sıcaklık kombinasyonlarını (0.1-800 MPa ve 10-64˚C) model sistemde,
pH 5.6’da çalışmışlardır.
Arancibia ve ark. (2006)’da Tabasco biberi (Capsicum frutescens L.)
PME’ının in vitro ve in vivo aktiviteleri arasındaki farklılıkları ve pektin
bozunmasına aracılık eden poligalakturonazın değişimlerini incelemişlerdir. Olgun,
kolay toplanan meyve ve meyvenin sap çanağından kolayca ayrılması pektinin ultra
bozunmasıyla karakterize edilmiştir. Đn vivo PME aktivitesi metanol üretimiyle
değerlendirilmiştir.
Castaldo ve ark. (1996) domates sularında pastörizasyon sonrası kalıntı PME
aktivitesini araştırmışlardır. Çok düşük aktivitelerin tespiti bir affinite kromatografi
yardımıyla mümkündür. Bu metot ta siyanojen bromidle aktive edilmiş reçineye
bağlanmış kividen izole edilen bir PME inhibitörü kullanılır. Sonuçta genel
tekniklerle bunun tespiti çok zor olmakla birlikte pastörizasyon sonrası çok az da
olsa enzim aktivitesine rastlanmıştır.
Yıldız ve ark. (2006) ise domates ve Aspergillus niger’deki pektin ve PME’ın
alternatif sıcaklık uygulamalarının etkilerini çalışmışlardır. 36-108 V/cm aralığındaki
farklı elektrik alanlarında ve farklı muamele sürelerinde toplam pektin içeriği
incelenmiş, sonuç olarak yüksek elektrik alanlarında süreyle doğru orantılı olarak
PME oranında artma ve pektin miktarında azalma görülmüştür.
Sampedro ve ark. (2008) portakal suyu-süt içeceğinde sıcaklık-yüksek basınç
koşullarında PME’ın inaktivasyon kinetiklerini incelemişlerdir. Đnaktivasyon
kinetikleri sadece termal şartlarda (65-80ºC) ve termal (25-65ºC) artı yüksek basınç
(0.1-700 MPa) kombinasyonlarında incelenmiştir. Sıcaklık ve basınç dengesine
uygun olarak başlangıç aktivitesinde yaklaşık %6-8 kayıp gözlenmıştir. Portakal
suyu-süt ortamındaki koruyucu etkinin tamamen inaktivasyonu için 90ºC’de 1 dk
8
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
veya 700 MPa’da 55ºC’de 2 dk muameleye ihtiyaç duyulduğu gösterilmiştir. Bir
tampon sistem içerisindeki saflaştırılmış enzime göre portakal suyu-süt içeceğini
temel alan sistemin PME’ının daha termostabil olduğu gösterilmiştir.
de Assis ve ark. (2000) acerola (Malpighia sp.) PME’ının termal
inaktivasyonunu çalışmışlardır. PME’ın termal stabilitesi farklı sıcaklıklarda (50, 80,
90, 98 102 ve 106ºC) çalışılmış ve enzimin 50 ve 80ºC’lerde sırasıyla 100 ve 50 dk
süresince aktivitesini %90 oranında koruduğu ortaya konulmuştur. PME’ın toplam
inaktivasyon için gereken ısıtma süreleri 98, 102 ve 106ºC’lerde sırasıyla 110, 10 ve
2.17 dk’dır ve D değeri (enzimin %90 inaktive olması için gereken süre) aynı
sıcaklıklarda sırasıyla 100, 7.5 ve 2 dk olarak tespit edilmiştir. 90ºC’de elde edilen D
değerleri turunçgillerden portakal meyve pulpu PME’ı ile mukayese edildiğinde
(hesaplanan değerler sırasıyla 0.225 ve 32 sn.) çok yüksektir. Z değeri 4.71ºC olarak
bulunmuştur.
Lim ve Chung (1993) olgun papaya meyvesinden amonyum sülfat çökeltmesi
ve katyon değişim kromatografi (CM Sepharose CL-6B and Mono S.) yöntemiyle
saflaştırdıkları PME’da Ferguson analiziyle izoenzimler olarak PME1 ve PME2
olmak üzere iki farklı bileşen bulmuşlardır. Enzimin izoelektrik noktası pH 9.0’dan
daha yüksek iken moleküler ağırlığı 27 kDa olarak bulunmuştur. Her iki izozim
optimum aktiviteyi pH 8.0 ve 35°C’de göstermiştir. PME1 and PME2 için Km
değerleri sırasıyla 0.71 ve 1.66 mg/ml-1 pektin ve Vmax değerleri 741 and 800 µmol
metanol/dk/mg protein olarak bulunmuştur. Papaya PME’ı katyonlarca aktive olur
fakat divalent katyonlar monovalent katyonlara oranla daha aktiftirler. Đnhibisyon
çalışmalarında p-kloromerküribenzoik asitin enzim aktivitesi üzerine önemli bir
etkisi yok iken sükrozun yarışmalı olmayan bir inhibitör olduğu gösterilmiştir.
Leite ve ark. (2006) guava (Psidium guajava L.) meyvesinden ekstrakte
ettikleri PME’ı %70 amonyum sülfat çöktürmesi ve Sephadex G100 jel filtrasyonu
ile kısmen saflaştırmışlardır. Jel filtrasyonunda farklı moleküler ağırlık değerlerine
sahip iki PME izoenzimi bulunmuştur. ConcPME (%70 amonyum sülfat
çöktürmesiyle) ve Iso4PME (jel filtrasyonuyla izole edilen izoformlardan spesifik
aktivitesi daha yüksek olanı). Her iki enzim için optimum pH 8.5 ve optimum
sıcaklık 75-85ºC aralığında bulunmuştur. Optimum NaCl konsantrasyonu 0.15
9
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
M’dır. Km ve Vmax değerleri concPME ve Iso4PME için sırasıyla 0.32-0.23 mg/ml-1
ve 244-53.2 µmol/dk olarak bulunmuştur. Aktivasyon enerjileri (Ea) concPME ve
Iso4PME için sırasıyla 64.5 ve 103 kJ/mol olarak belirlenmiştir. Guava PME’ı
termostabilitesi yüksek bir enzimdir ve çalışılan tüm sıcaklıklarda çok yüksek bir
termal stabilite göstermiştir.
Vivar-Vera ve ark. (2007) alıç (Crataegus pubescens) meyvesinden PME’ın
ekstraksiyonu, termal stabilitesi ve kinetik davranışları üzerine bir çalışma
yapmışlardır. Enzim ekstraksiyonu prosesi farklı NaCl konsantrasyonlarında (0.5-3.0
mol/l) çalışıldıktan sonra ortaya konmuştur. 2 mol/l NaCl kullanılarak en yüksek
PME ekstraksiyonu 51.61 ünite/mg protein olarak elde edilmiştir. Kinetik
parametreler (Km ve Vmax) substrat olarak ticari bir turunçgiller pektini ve alıç pektini
kullanılarak tesbit edilmiştir. NaCl konsantrasyonlarının etkileri, pH ve sıcaklığın
PME aktivitesi üzerine olan etkileri araştırılmıştır. Enzimin turunçgil pektinine ilgisi
alıç pektinine göre daha yüksek olmuştur (Km=2.84 mg/ml ve Vmax=64.10 ünite/mg
protein). Alıç PME ekstraktı en yüksek aktiviteyi 0.4 mol/l NaCl konsantrasyonunda,
pH 7.5’te ve 55ºC’de göstermiştir. Termal inaktivasyon için Ea ve Q10 değerleri
sırasıyla 36.27 kJ/mol ve 2.01 (20-30ºC) olarak bulunmuştur. 60ºC’de 25 dk
muameleden sonra enzim halen yaklaşık %50 aktiviteye sahipken, 80ºC’de 10 dk
muameleden sonra tamamen inaktive olmaktadır. Termal inaktivasyon için Ea ve Q10
değerleri sırasıyla 146.16 kJ/mol ve 20.06 (70-80ºC) olarak bulunmuştur.
Balestrieri ve ark. (1990) PME için kivi (Actinidia chinensis) meyvesinden
izole edilmiş bir inhibitörün saflaştırılmasını ve farklı pH değerlerinde inhibisyonunu
çalışmışlardır. Bu inhibitörün bir glikoprotein olduğu ve moleküler ağırlığının
yaklaşık 28 kDa olduğu jel filtrasyon kromatografi, SDS/PAGE ve analitik
ultrasantrifüjleme yoluyla ortaya konmuştur. Ayrıca, inhibitörün PME’ı 3.5-7.5 pH
aralığında etkili olarak inhibe ettiği görülmüştür. 100°C’de 10 dk inkübe edilen
inhibitörün halen PME’ı inhibe etmesi bu inhibitötün yüksek termostabiliteye sahip
olduğunu gösterir. Bu inhibitörün sadece PME’a özgü olduğu, poligalakturonaz ve
amilaz gibi diğer polisakkaritleri parçalayan enzimlere karşı etkisiz olduğu tesbit
edilmiştir. Bu inhibitörün çalışılmış tüm kaynaklardan (portakal, domates, elma,
muz, patates, vd.) gelen PME’lara karşı inhibe edici etkileri bulunmuştur.
10
2.ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR
Ender BELLUR
Farklı meyve ve sebzelerden saflaştırılan PME’ların farklı özellikleri üzerine
bir çok çalışma yapılmıştır. Bitkilerin yanı sıra farklı bakteri, maya, küf, mantardan
da PME saflaştırılıp karakterizasyonları yapılmıştır. Celestino ve ark. (2005)
termofilik bir fungustan (Acrophialophora nainiana) ekstraselülar pektinazı
saflaştırılarak,
karakterizasyonunu
yapmışlar
ve
fizikokimyasal
özelliklerini
incelemişlerdir. PME’ın moleküler ağırlığı 31-36 kDa arasında, optimum pH’sı 8.0,
optimum sıcaklığı ise 60°C olarak bulunmuştur. Enzim en yüksek stabiliteyi 50°C’de
göstermiş, 70ºC’de aktivitede hızlı bir düşüş gözlenmiştir.
Shen ve ark., (1999) pirinç bitinden (Sitophilus oryzae L.) PME’ı Q ve SSepharose kromatografinin ardından PCR (Polimer zincir reaksiyonu) ile izole
ederek karakterize etmişlerdir. Enzimin moleküler ağırlığı 38 kDa olarak
bulunmuştur. Saflaştırılmış pirinç biti PME’ı 6-7 aralığında bir optimum pH
göstermiştir.
11
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
3.1.1. Siyah Havuç Örnekleri
Bu çalışmada kullanılan siyah havuç Đç Anadolu Bölgesi’ndeki Konya ili
Ereğli ilçesinden taze olarak temin edilmiş ve kullanılıncaya kadar soğuk hava
deposunda muhafaza edilmiştir.
3.1.2. Analizlerde Kullanılan Araç Gereçler
Araştırmada Çukurova Üniversitesi Ziraat Fak. Gıda Mühendisliği bölümü
Gıda Biyoteknolojisi laboratuarlarında bulunan alet-ekipman ve malzemeler
kullanılmıştır.
Enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde şu
kimyasallar kullanılmıştır:
•
Elma pektini (Fluka-76282),
•
Diyaliz Tüpü (Selüloz Membran Boyutu : 76mm×49mm-Sigma-D9402-100FT),
•
Trizma Base (Sigma T1503),
•
Sodyum Hidroksit-NaOH 0.1 mol/L (0,1N) Titrisol (Merck-1.09959),
•
Etanol-C2H5OH (%99) (Merck-1.00971.2500),
•
Amonyum Sülfat-(NH4)2SO4 (Merck-1.01217-1000),
•
Hidroklorik Asit-HCl (%37-38) (Merck-1.00314.2500),
•
Sodyum Klorür-NaCl (%99.5) (Merck-1.06404.1000),
•
Sodyum Disülfit-Na2O5S2 (Merck-1.06528.1000),
•
PVPP (polvinilpolipirolidon) (Merck-1.07302.0100).
12
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
3.2. Metot
3.2.1. PME’ın Ekstraksiyonu ve Kısmi Saflaştırılması
Siyah havuç PME’ı diğer meyvelerdeki gibi hücre duvarlarına iyonik olarak
bağlıdır ve hücre duvarından ekstraksiyonu için iyonik gücü yüksek uygun bir
tampona (Tris, NaCl) gereksinim duyulur. Siyah havuçların yüksek fenolik
bileşikleri içeriğinden dolayı enzim kaybını önlemek için PME ekstraksiyonundan
önce ve esnasında Na2O5S2 ve PVPP kullanılır (Nunes ve ark. 2006).
Ham enzim ekstraksiyonu Nunes ve ark. (2006), Denès ve ark. (2000) ve
Cameron ve ark. (1996)’na göre yapılmıştır. Tüm ekstraksiyon aşamaları (santrifüj,
diyaliz, karıştırma, vd.) enzim inaktivasyonunu önlemek amacıyla soğuk şartlarda
(maksimum 4°C) gerçekleştirilmiştir. Soğuk hava deposundan alınan 200 g sağlam
havuç soğuk saf suyla yıkanmıştır. Yaprak kısımları uzaklaştırıldıktan sonra
homojenizasyon işlemini kolaylaştırmak için daha küçük parçalara doğranmıştır.
Soğutulmuş Waring blender (Model HGB2WTS3, Torrington, Connecticut,
ABD)’da 500 mg/l sodyumdisülfit (Na2O5S2) içeren 300 ml soğuk saf su içerisinde 2
dk süreyle maksimum hızda homojenize edilmiştir. Renk maddelerini mümkün
olduğunca uzaklaştırmak için elde edilen homojenat 1200 ml soğuk saf su ile
yıkandıktan sonra peynir bezinden süzülmüştür. Bu yıkama ve süzme işlemi toplam
3 kez yapılmıştır. Berrak kısım atılmış ve pellet 500 mg/l sodyumdisülfit (Na2O5S2)
içeren 320 ml soğuk saf suyla karıştırıldıktan sonra 10000 × g’de 4°C’de 30 dk
santrifüj edilmiştir. Berrak kısım atılıp pellet için bu karıştırma ve santrifüj işlemleri
toplam 3 defa yapılmıştır. 1 M NaCl ve 500 mg/l Na2O5S2 içeren ve pH’sı 7.5’e
ayarlanmış 20 mM Tris-HCl (1:1.3, h/h) tamponundan 160 ml alınmış ve
soğutulmuştur. Daha sonra bu çözelti elde edilen pelletin üzerine konup
karıştırıldıktan sonra 10000 × g’de 4°C’de 30 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj işlemi
sonunda berrak kısım tutularak ve pellet atılmıştır. Toplanan berrak kısmın üzerine
%1 oranında PVPP (polivinilpolipirolidon) eklenip soğuk şartlarda (4°C) 30 dk
manyetik karıştırıcı yardımıyla karıştırılmıştır. Bulamaç 5000 × g’de 4°C’de 10 dk
santrifüj edildikten sonra üst faz toplanmış ve renk kontrolü yapılmıştır. Yeterli renk
13
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
kalitesine sahip, berrak ekstrakt elde edilene kadar PVPP uygulaması tekrar
edilmiştir. Bu işlemler dizini 5 ayrı 200’er gramlık havuçlara uygulanarak toplam 1
kg havuçtan berrak ekstrakt elde edilmiştir.
Elde
edilen
ekstraktlar
birleştirilmiş
ve
%80’lik
amonyum
sülfat
çökeltmesine tabii tutulmuştur. Çökelen proteinleri alabilmek için 10000 × g’de
4°C’de 30 dk santrifüj edilmiştir. Üstteki berrak kısım atılmış ve her santrifüj
tüpündeki çökelti 3 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) tamponu ile vortex yardımıyla
çözündürülerek toplanmıştır. Elde edilen ekstrakt, amonyum sülfatın uzaklaştırılması
için Tris tamponu içerisinde (pH 7.5) 4°C’de diyalize tabii tutularak 1 gece boyunca
diyalizde bekletilmiştir (Şekil 3.1). Daha sonra toplanan PME aktivitesi içeren berrak
örnek derin dondurucuda -25°C’de muhafaza edilmiştir.
Yarı-geçirgen
membran
Homojenat
Tampon
Diyaliz başı
Diyaliz sonu
Şekil 3.1. Diyaliz şeması
3.2.2. Protein Tayini
Protein tayini Bradford Yöntemi (1976) ile yapılmıştır. Protein tayini için
sığır albumini standardı kullanılmıştır.
14
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
3.2.3. Enzim Aktivitesi ve Bazı Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi
3.2.3.1. PME Aktivitesinin Belirlenmesi
PME aktivitesi sonucunda pektin molekülünde serbest kalan karboksil(-COO)
gruplarının oluşturduğu asitlik titrimetrik olarak saptanmaktadır. PME aktivitesinin
birimi pektin metilesteraz ünitesi (PMEU)’dir. Bu birim ‘‘7.5 pH’da ve 30ºC’de 1 dk
süre içerisinde pektinden serbest bırakılan 1.0 M asit’’ şeklinde tanımlanır
(Zimmerman, 1978).
PME aktivitesi titrimetrik yöntemle belirlenmiştir. % 0.5 pektin (a/h) içeren
20 ml 0.1 NaCl çözeltisi üzerine 0.5 ml PME ekstraktı ilave edildikten sonra pH’sı
0.1 N NaOH ilavesi ile süratle 7.5’e ayarlanmış ve 10 dk süre ile 0.01 N NaOH
ilavesi ile bu pH’da tutulmuştur. Titrasyon, 30ºC’de gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla,
su sirkülatörlü su banyosuna bağlanmış manyetik karıştırıcı ile karıştırılan bir ceketli
cam beher içerisinde gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.2).
Şekil 3.2. Analiz düzeneği
15
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
Zamana karşı alkali sarfiyatı kaydedilmiş ve enzim aktivitesi aşağıdaki
formülden hesaplanmıştır (Zimmerman, 1978).
PMEU / ml=Sarfiyat(ml)×Normalite(NaOH)×1000
Zaman(dk)×Enzim(ml)
3.2.3.2. Enzim Kinetiği
Michealis sabiti (Km)’ni ve maksimum hız (Vmax)’ı belirlemek için substrat
olarak değişik konsantrasyonlarda (0.125-4 g/l) pektin çözeltisi kullanılmıştır.
Enzimin Km ve Vmax değerleri Lineweaver ve Burk metoduyla 1/S’ye karşı 1/V’nin
eğrisinden hesaplanmıştır.
3.2.3.3. Optimum pH
PME aktivitesi 6.0-9.0 pH aralığında belirlenmiştir. Substrat olarak 1 M NaCl
içerisinde hazırlanmış %0.5’lik (a/h) elma pektininden (pH 3.4) 20 ml kullanılmıştır.
Substratın pH’sı, çalışılacak pH değerine 0.1 N NaOH çözeltisi ilavesiyle
ayarlandıktan sonra sıcaklığın 30.0ºC ’ye gelmesi için beklenmiştir. 0.5 ml enzim
ilave edildikten sonra 10 dk süre ile pH’yı hedeflenen değerde tutmak için yapılan
0.01 N NaOH sarfiyatı kaydedilmiştir. En yüksek aktivitenin görüldüğü pH değeri %
100 kabul edilmiş ve diğer pH’lardaki aktiviteler bu değerle kıyaslanıp nispi enzim
aktiviteleri hesaplanmıştır. Bu enzim için elde edilen optimum pH değeri tüm diğer
çalışmalarda kullanılmıştır.
16
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
3.2.3.4. Optimum Sıcaklık
PME aktivitesinin en yüksek olduğu optimum sıcaklığı bulabilmek için 2070°C arasında aktiviteler ölçülmüştür. Substrat olarak 1 N NaCl içerisinde %0.5’lik
(a/h) 20 ml elma pektini kullanılmıştır. En yüksek aktivitenin görüldüğü sıcaklık
değeri %100 kabul edilmiş ve diğer sıcaklıklardaki aktiviteler bu değerle kıyaslanıp
nispi enzim aktiviteleri hesaplanmıştır.
3.2.3.5. Termal Stabilite
Termal stabilite vidalı kapaklı cam tüplerde 30-70°C’ler arasında
belirlenmiştir. Bu amaçla, önceden çalışılacak sıcaklığa getirilmiş tüplere enzim
ekstraktı konup 5 dk bu sıcaklıkta tutulmuştur. Daha sonra hızlı bir şekilde buz
banyosunda soğutulup oda sıcaklığına getirilip kalıntı enzim aktivitesi belirlenmiştir.
En yüksek aktivitenin görüldüğü sıcaklık % 100 kabul edilmiş ve diğer sıcaklıklarda
hesaplanan değerler bu değerle kıyaslanarak nispi enzim aktiviteleri hesaplanmıştır.
3.2.3.6. Termal Đnaktivasyon
Siyah havuç PME’ının termal inaktivasyon kinetiği 55ºC’de 7.5, 10 ve 12.5
dk, 60 ve 65ºC’lerde ise 2.5, 5.0 ve 7.5 dk sürelerde ve deneyler vidalı kapaklı cam
tüplerde gerçekleştirilmiştir. Tüpler belirlenen sıcaklıklarda enzim eklenmesinden
önce çalışılacak sıcaklığa gelmesi için bir ön ısıtmaya tabi tutulmuştur. Enzim örneği
tüpe hızlı bir şekilde aktarılıp süratle sıcak su banyosuna konulmuş ve gerekli
sürenin sonunda tüp hızlı bir şekilde su banyosundan çıkarılmış ve buz banyosunda
soğuması sağlanmıştır. Örnek su banyosu içerisinde soğutulduktan ve oda sıcaklığına
getirildikten sonra kalıntı aktivite belirlenmiş ve (A) ile gösterilmiştir. Isıtılmamış bir
enzim örneği de kör olarak (A0) kullanılmıştır.
%
kalıntı
aktivite
ısıtılmamış
örneğin
aktivitesiyle
kıyaslanarak
hesaplanmıştır. 1. derece inaktivasyon sabiti (kD) lnA / A0-zaman grafiğinin
eğiminden; enzimin yarı ömür değerleri (t1/2) : t1/2 = 0.693 / k formülünden; desimal
17
3.MATERYAL ve METOT
Ender BELLUR
azalma süresi (D değeri) D = ln(10) / k formülünden hesaplanmıştır. Bir -log10’luk
azalma için (% 90’lık azalma) sıcaklıktaki olması gereken artış olan Z değeri ise
log10D-sıcaklık grafiğinden hesaplanmıştır. Bu grafiğin eğimi 1/Z’ye eşittir.
Aktivasyon enerjisi (Ea) Arrhenius grafiğindeki (ln k - 1/T) eğimin evrensel gaz
sabiti R (kJ.mol-1.K-1) ile çarpılması sonucu hesaplanmıştır (Marangoni, 2003).
3.2.3.7. Tuzun Etkisi
Siyah havuç PME’ının aktivitesi üzerine tuzların etkisi substrat olarak 0-0.5
M arasındaki değişik konsantrasyonlarda NaCl içerisinde hazırlanmış %0.5’lik 20 ml
elma pektini çözeltileri kullanılarak saptanmıştır. En yüksek aktivitenin görüldüğü
tuz konsantrasyonu %100 kabul edilmiş ve diğer konsantrasyonlardaki aktivite
değerleri bununla kıyaslanarak nispi aktiviteler bulunmuştur.
18
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
4.1. Kinetik Parametreler
PME’ın substrat özgüllüğü genel anlamda elder edildiği kaynağa ve enzimin
saflığına bağlı olarak değişiklik gösterir. Pektik maddeler PME için meyve ve
sebzelerde bulunan en önemli doğal substratlardır. Bu çalışmada kinetik parametreler
elma pektini kullanılarak pH:7.5’te ve 30ºC’de belirlenmiş ve Lineweaver ve Burk
metoduyla hesaplanmıştır. Siyah havuç PME için Km değeri 2.14 mg/ml (r2=0.988)
olarak hesaplanmıştır. Km değeri enzimin substrata olan ilgisinin bir ölçüsüdür ve bu
değer ne kadar küçükse enzimin substrat olan ilgisinin de o kadar yüksek olduğu
söylenebilir. Maksimum reaksiyon hızı (Vmax) ise 3.75 ünite/ml olarak bulunmuştur.
Çizelge 4.1’de değişik ürünlerden izole edilen PME’ların Km ve Vmax
değerleri verilmiştir. Çizelgeden de görüleceği gibi PME’ın substrat ilgisi kaynağa
göre değişkenlik göstermektedir. Değişik havuç türlerinden elde edilen PME’lar ile
yapılan çalışmalarda hesaplanan Km değerleri 0.031-0.197 mg/ml arasında
değişmiştir. Bitkisel PME’lerin pektik substratlara ilgisi oldukça yüksektir. Bu
çalışmada bulunan Km değeri diğer havuç çeşitlerinden elde edilen PME’ın Km
değerlerinden daha yüksek bulunmuştur.
19
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Çizelge 4.1. Farklı PME’ların pektin ilgisi (Km)
Kaynak
Km
_
Vmax
Referans
6.77 ünite
Alonso ve ark.(2003)
Havuç (Daucus carota L.)
0.031 mg/ml
Havuç (Daucus carota L.)
0.197 mg/ml
Havuç (Daucus carota)
0.04 mg/ml
0.077 ml/dk
Balogh ve ark.(2004)
0.233 ml/dk
Sila ve ark. (2007)
Ly-Nguyen ve ark.(2002a)
Havuç (Daucus carota var. Nerac)
0.154 mg/ml
Alıç meyvesi (Crataegus pubescens)
2.82 mg/ml
Vivar-Vera ve ark.(2007)
Portakal (Citrus natsudaidai)
2.30 mg/ml
Manabe (1973)
Elma (Golden sp.)
1.05 mg/ml
Castaldo ve ark.(1997)
_
-1
-1
Elma (Golden sp.)
0.098 mg/ml
3.86µmol/dk ml
Guava konsantresi (Psidium guajava L.)
0.32 mg/ml_
244µmol/dk
Leite ve ark.(2006)
53.1µmol/dk
Leite ve ark.(2006)
48.4 ünite
Alonso ve ark.(1997)
46.5 ünite
Alonso ve ark.(1997)
_
Guava-Iso4 (Psidium guajava L.)
0.23 mg/ml
Trabzon hurması (Diospyros kaki) PME1
31-54 µg/ml_
_
Denès ve ark. (2000)
Trabzon hurması (Diospyros kaki) PME2
0.104 mg/ml
Yeşil Fasulye
0.049 mg/ml_
Laats ve ark.(1997)
Yeşil Fasulye
0.52-0083 mg/ml_
Recourt ve ark.(1996)
Muz (cv. Cavendish)
0.152 mg/ml
Ly-Nguyen ve ark.(2002c)
Çilek
0.416 mg/ml
Ly-Nguyen ve ark.(2002b)
-1
-1
Castro ve ark.(2006a)
Biber (Capsicum annuum) (pH 7.0)
0.329 mg/ml
0.417 ml/dk
Biber (Capsicum annuum) (pH 5.6)
1.614 mg/ml-1
0.272 ml/dk-1
Castro ve ark.(2006a)
Papaya PME1
0.71 mg/ml
-1
741 µmol/dk
Lim ve Chung (1993)
Papaya PME2
1.66 mg/ml-1
800 µmol/dk
Lim ve Chung (1993)
Papaya
0.11 mg/ml
730 µmol/dk/mg
Fayyaz ve ark. (1995)
Greyfurt (Citrus paradisi)
0.274 mg/ml
Graviola (Anona muricata) PE1
0.52 mg/ml-1
Guivarc’h ve ark. (2005)
-1
154 µmol/dk/mg
Arbaisah ve ark.(1997a)
Graviola (Anona muricata) PE2
0.0843 mg/ml
726 µmol/dk/mg
Arbaisah ve ark.(1997a)
Fungus (Acrophialophora nainiana)
4.22 mg/ml-1
1.83 nkatal
Celestino ve ark. (2005)
4.2. Optimum pH
Enzimlerin maksimum aktivite gösterdikleri bir pH veya pH aralığı vardır. Bu
optimum pH’nın altında ve üzerinde aktiviteleri düşer. Enzimler bazı istisnalar
haricinde kuvvetli asit ve bazlara fazla dayanıklı değildirler. Ortam pH’sındaki aşırı
olmayan değişiklikler enzimin ve çoğu kez de substratın iyonik durumunda
değişikliklere neden olur. Enzimler kendileri için aşırı pH değerlerinde aktivitelerini
kaybederler. Enzimlerin maksimum reaksiyon hızına sahip oldukları pH değerine
optimum pH denir. Optimum pH’nın altında ve üstündeki pH’larda enzim veya
substratta mevcut fonksiyonel grupların yapılarında değişmeler oluşur ve reaksiyon
hızı da değişime uğrar (Koolman ve ark., 2005).
20
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Kovalent olmayan elektrostatik bağlar, hidrojen bağları, hidrofobik bağlar ve
kovalent disülfit bağları nzimlerin üçüncül ve dördüncül yapılarını stabilize eder.
Enzim üzerindeki pozitif ve negatif gruplar arasında oluşan elektrostatik bağlar
pH’dan etkilenirler. Nötral pH’larda iyonlaşabilen yan gruplar –COO-, H3N+ ve NH2C gruplarıdır ve bunlar kuvvetli elektrostatik bağlar oluşturabilirler. pH 3’ün altında
karboksil (-COOH) grupları protonlanırlar ve elektrostatik bağ oluşturamazlar. pH
10’un üzerinde ise amonyum (-NH2) grupları protonlanırlar ve elektrostatik bağlar
oluşturamazlar (Whitaker, 2003).
pH’nın PME aktivitesine etkisini belirleyebilmek için 6.0-9.0 pH aralığında
enzim aktivitesi ölçümleri yapılmış ve sonuçlar Şekil.4.2’de gösterilmiştir. Spontan
demetilasyonu bulabilmek için tüm pH değerlerinde enzim kullanmaksızın enzim
aktivitesinin ölçüldüğü koşullarda titrasyon yapılmıştır. Sadece pH 8.0, 8.5 ve 9.0’da
spontan demetilasyon görülmüştür. Bu pH değerlerinde yapılan aktivite ölçümlerinde,
spontan demetilasyondan kaynaklanan sarfiyat toplam sarfiyattan çıkarılmıştır.
pH 6.0’dan pH 7.5’e doğru artırıldıkça enzim aktivitesi de artmış ve en yüksek
aktivite pH 7.5’te gözlenmiştir. pH 7.5’ten pH 8.5’e doğru enzim aktivitesinde az da
olsa düşme gözlenmiş ve pH 8.5’ten itibaren keskin bir düşüş olmuştur. Siyah havuç
PME’ı pH 6.5-8.5 gibi geniş bir aralıkta çok yüksek aktivite göstermiştir.
Enzimlerin optimum pH değerleri meyvenin cinsine ve olgunluğuna bağlı
olarak değişebildiği gibi içerdiği substratlara ve kullanılan ekstraksiyon yöntemine
göre de değişebilmektedir (Zawitowski ve ark., 1991). Farklı ürünlerden elde edilen
PME’ın optimum pH değerleri Çizelge 4.2’de verilmiştir. Buna göre, PME’ın
optimum pH’sı ürüne göre 4.6-9.0 arasında değişmekle birlikte bitkisel PMEların
optimum pH değerleri 7.0 ve üzerindedir. Değişik havuç türlerinden izole edilen
PME’ların optimum pH’ları ise 7.4-8.0 arasındadır ve bu çalışmada bulunan 7.5
değeri bu sınırlar içerisinde yer almaktadır.
21
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Nisbi Aktivite (%)
120
100
80
60
40
20
0
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
pH
Şekil 4.1. pH’nın siyah havuç PME aktivitesine etkisi
Çizelge 4.2. Farklı PME’ların optimum pH değerleri
Kaynak
pH
Referans
Havuç (Daucus carota L.)
7.4
Alonso ve ark. (2003)
Havuç (Daucus carota L.)
7.4
Ly-Nguyen ve ark. (2002a,2003)
Havuç (Daucus carota var. Nerac)
8.0
Sila ve ark. (2007)
Trabzon hurması (Diospyros kaki) PE1
7.4
Alonso ve ark. (1997)
Trabzon hurması (Diospyros kaki) PE2
7.8
Alonso ve ark. (1997)
Elma (var. Golden)
7.5
Denès ve ark. (2000)
Erik (Prunus domestica)
7.5
Nunes ve ark. (2006)
Alıç (Crataegus pubescens)
7.5
Vivar-Vera ve ark. (2007)
Guava (Psidium guajava L.)
8.5
Leite ve ark. (2006)
Aspergillus aculeatus
4.6
Christgau ve ark. (1996)
Papaya (Carica papaya)
8.0
Fayyaz ve ark. (1995)
Papaya
8.0
Lim ve Chung (1993)
Şeftali
8.0
Javeri ve Wicker. (1991)
Patates (cv. Russet Burbank)
7.5
Puri ve ark. (1982)
Mandarin
9.0
Rillo ve ark. (1992)
Portakal kabuğu
7.5
Grsic-Rausch ve Rausch(2004)
Biber (Capsicum annuum)
7.5
Castro ve ark. (2006a)
Greyfurt (Citrus paradisi)
7.0
Guivarc’h ve ark. (2005)
Pirinç biti (Sitophilus oryzae L.)
6.0-7.0
Shen ve ark. (1999)
Fungus (Acrophialophora nainiana)
8.0
Celestino ve ark. (2005)
22
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
4.3. Optimum Sıcaklık
Kimyasal reaksiyonların hızı genellikle sıcaklıktaki artışla artar. Enzimlerle
katalizlenen reaksiyonların hızları da sıcaklıkla artmakla birlikte, yüksek
sıcaklıklarda enzimler protein yapılarından dolayı aktivitelerini kaybederler.
Yüksek sıcaklıklar enzimatik reaksiyonda rol oynayan fonksiyonel grupların
disosiye olma durumunu etkileyebilir; enzimin aktivatörlere ve inhibitörlere ilgisini
etkileyebilir;
reaksiyonda
substrat
olabilecek
oksijeninin
çözünürlüğünü
etkileyebilir. Bunların dışında, yüksek sıcaklık enzimleri inaktive edebilir.
Reaksiyon hızının maksimuma eriştiği noktadaki sıcaklık derecesine optimum
sıcaklık denir. Enzimlerin büyük çoğunluğunun optimum aktivitesi 30-40 °C’dir ve
45 °C’nin üzerinde denatürasyon başlar.
Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği sıcaklığı bulabilmek için 20°C’den
70°C’ye kadar değişik sıcaklıklarda enzim aktiviteleri belirlenmiş ve sonuçlar %
nispi aktivite olarak Şekil 4.2’de verilmiştir. Şekilden de görüleceği gibi sıcaklık
20ºC’den 55ºC’ye doğru artırıldıkça aktivite de artmış ve en yüksek aktivite 55ºC’de
görülmüştür. Yani enzim aktivitesi için optimum sıcaklık 55ºC’dir. Bu değerden
itibaren enzim aktivitesi önce yavaş sonra hızlı olarak düşmüştür. 70ºC’de
hesaplanan enzim aktivitesi optimum sıcaklıktaki aktivitenin %15’idir. Enzim 5060ºC’ler arasında oldukça yüksek (%80’in üzerinde) aktivite göstermiştir.
Değişik ürünlerden izole edilen PME’ların optimum sıcaklık değerleri
Çizelge 4.3’te verilmiştir. PME’ların optimum sıcaklıkları izole edilgiği kaynağa
göre 35-80ºC arasında değişmektedir. Havuç PME’ların optimum sıcaklıkları 48.5ºC
(Alonso ve ark., 2003) ve 50ºC (Lee ve ark., 2001) olarak bildirilmiştir. Bu
çalışmada bulunan 55ºC, bu değerlere yakındır.
23
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Nisbi Aktivite (%)
120
100
80
60
40
20
0
20
30
40
50
60
Sıcaklık (°C)
Şekil 4.2. Sıcaklığın siyah havuç PME aktivitesine etkisi
Çizelge 4.3. Farklı PME’ların optimum sıcaklık değerleri
Kaynak
Sıcaklık(°°C)
Referans
Havuç (Daucus carota L.)
48.5
Alonso ve ark. (2003)
Havuç (Daucus carota)
50
Lee ve ark. (2001)
Elma
63
Denès ve ark. (2000)
Muz (cv. Cavendish)
63
Ly-Nguyen ve ark. (2002c)
Çilek
60
Ly-Nguyen ve ark. (2002b)
Erik (Prunus domestica)
65
Nunes ve ark. (2006)
Alıç (Crataegus pubescens)
55
Vivar-Vera ve ark. (2007)
Biber (Capsicum annuum)
50-55
Castro ve ark. (2006a)
Domates
55
Van den Broeck ve ark. (2000)
Patates (cv. Russet Burbank)
55
Puri ve ark. (1982)
Guava (Psidium guajava L.)
75-80
Leite ve ark. (2006)
Papaya
35
Lim ve Chung (1993)
Papaya
65
Fayyaz ve ark. (1995)
Graviola (Anona muricata)
60
Arbaisah ve ark. (1997a)
Salatalık (Cucumis sativus)
*
60
Yemenicioğlu ve ark. (1999)
Salatalık (Cucumis sativus)
**
65
Yemenicioğlu ve ark. (1999)
Aspergillus aculeatus
45
Christgau ve ark. (1996)
Fungus (Acrophialophora nainiana)
60
Celestino ve ark. (2005)
*
: Hücre duvarına sıkı bağlı PME
: Hücre duvarına iyonik olarak bağlı PME
**
24
70
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
4.4. Termal Stabilite
Siyah havuç PME’ının termal stabilitesi 30-70°C arasında 5 dk sürede
çalışılmıştır. Sonuçlar nisbi aktivite olarak ifade edilmiş ve Şekil 4.3’te
gösterilmiştir. Şekil 4.3’ten de görüleceği gibi enzim 30-50ºC’ler arası oldukça
stabildir. 50’ºC’den sonra enzim aktivitesi hızla düşmeye başlamış, 60ºC’deki kalıntı
enzim aktivitesi %25 iken 60 ve 70ºC’lerde enzim aktivitesini büyük ölçüde
yitirmiştir.
120
Nisbi Aktivite (%)
100
80
60
40
20
0
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Sıcaklık (°C)
Şekil 4.3. Siyah havuç PME’ının termal stabilitesi
Alonso ve ark (2003) havuç (Daucus carota L.) PME’ının termal stabilitesini
bu çalışmadakine benzer sıcaklık-süre değerlerinde çalışmışlardır. Bu araştırıcılar,
40ºC’de 5 dk’da ısıtma sonucunda enzimin stabilitesini koruduğu ve 40-70ºC
arasında artan sıcaklıkla doğru orantılı olarak aktivitesini yitirdiğini bildirmişlerdir.
Bu sonuçlar, bu çalışmada elde edilen sonuçlarla benzerlik göstermektedir.
Nunes ve ark. (2006) erikten (Prunus domestica) affinite kromatografi
kullanılarak saflaştırılan PME’ın termal ve yüksek basınç stabilitesini çalışmışlardır.
pH 7.5’te 5 dk süreyle değişik sıcaklıklarda (22-80ºC) muamele edilerek termal
stabilitesi araştırılmış ve enzimin 50ºC’nin altındaki sıcaklıklarda aktivitesinin
25
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
minimum %90’ını koruduğu gösterilmiştir. 50-60ºC arasında enzim yavaş yavaş
inaktive olmaya başlamış ve 60ºC’nin üzerinde aktivite hızlı bir şekilde azalmıştır.
80ºC’de ise PME tamamen inaktive olmuştur.
Sila ve ark. (2007) sıcaklık ve yüksek basıncın havuç (Daucus carota var.
Nerac) PME’ının stabilitesi ve katalitik aktivitesi üzerine olan etkilerini
çalışmışlardır. Saflaştırılmış PME’ın farklı sıcaklıklarda (30-70ºC) 15’er dk tutularak
termal stabilitesi araştırılmış ve enzimin 50ºC’nin üzerindeki sıcaklıklarda çok hassas
olduğu ve 55ºC’de enzim aktivitesinin yaklaşık %50’sini kaybettiğini bildirmişlerdir.
Ayrıca, 60ºC’de ise enzimin aktivitesini yaklaşık %95 kaybettiği saptanmıştır. Bu
sonuçlar havuç PME’ının diğer bitkisel PME’lara kıyasla ısıya hassas olduğunu
göstermektedir.
Leite ve ark. (2006) guava (Psidium guajava L.) meyvesinden ekstrakte
ettikleri PME’ın termostabil bir enzim olduğunu ve çalışılan tüm sıcaklıklarda çok
yüksek bir termal stabilite gösterdiğini bildirmişlerdir. Farklı sıcaklık değerlerinde
(50ºC’den 125ºC’ye) çalışılan PME’ın 75ºC’de 30 dk bekletme sonucunda spesifik
aktivitesinde bir artış gözlenmiştir. Bu davranış muhtemelen enzim molekülünün
kompleks yapıdan veya mevcut bulunan regulatör/inhibitörlerin serbest kalması
nedeniyledir. Bu enzimin 98ºC’de 45 dk muamelesinden sonra aktivitede önemli bir
kayıp gözlenmemiş buna karşın, 125ºC’de 5 dk inkübasyon sonucunda sadece
%20’lik bir aktivite kaybı gözlenmiştir.
de Assis ve ark. (2000) acerola (Malpighia sp.) PME’ının termal
inaktivasyonunu saptamak için sıcaklığın enzim aktivitesi üzerine olan etkilerini
çalışmışlardır. Enzim 50ºC’de oldukça stabil olup (100 dk’da %10 aktivite
kaybetmektedir) enzimin inaktivasyonu için 98ºC’de 110 dk süreye ihtiyaç
duyulmaktadır. Enzimin 106ºC’de 2 dk inkübasyon sonucunda aktivitesinin %90’ını
kaybettiğini bildirmişlerdir Bu değerler turunçgil PME’ının inaktivasyonu için
gerekenden (90ºC’de 1 dk olarak bulunmuştur) çok daha yüksektir.
Guivarc’h
ve
ark.
(2005)
PME’ın
greyfurttan
(Citrus
paradisi)
saflaştırılmasını, karakterizasyonunu, termal ve yüksek basınç inaktivasyonunu
çalışmışlardır. Saflaştırılmış PME pH 7.0’de 80ºC’de 10 dk inkübasyondan sonra
26
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
başlangıç aktivitesinin %87’sini korumuş, fakat aynı sıcaklık ve sürede, asidik pH
koşullarında inaktive olmuştur.
Cameron ve Grohmann (1996) turunçgiller meyve suyu izoenzimleri
çalışmalarında izoformlardan birinin daha fazla termostabil olduğunu ve 95ºC’de 1
dk inkübasyondan sonra başlangıç aktivitesinin %49.2’sine sahip olduğunu
gözlemlemişlerdir. Javeri ve Wicker (1991) şeftali PME’ının 65ºC’de 5 dk
inkübasyondan sonra aktivitesinin %77’sini kaybettiğini ve 70ºC’de 5 dk
inkübasyondan sonra tamamen inaktive olduğunu bildirmişlerdir. McDonald ve ark.
(1993)’nın limon (Citrus limon) PME’ı üzerine yaptıkları çalışmada enzimin 4
izoenzimden oluştuğu ve bunlardan bir tanesinin yüksek termal stabilite gösterdiği ve
86ºC’de 9 dk inkübasyondan sonra aktivitesini yitirmediği bulunmuştur.
4.5. Termal Đnaktivasyon
PME’ın termal inaktivasyon kinetiği 55ºC’de 7.5, 10 ve 12.5 dk, 60 ve
65ºC’lerde ise 2.5, 5.0 ve 7.5 dk sürelerde çalışılmıştır. Termal inaktivasyon
parametreleri ısıl işleme maruz kalmış enzimlerin aktivitelerinin ısıtılmamış örneğin
aktivitesine kıyaslanmasıyla hesaplanmış ve sonuçlar Çizelge 4.4’te verilmiştir.
Termal inaktivasyon parametreleri lineer bölgede hesaplanmıştır. Tablodan da
görüleceği gibi, sıcaklık arttıkça inaktivasyon sabiti kD değerleri de artmıştır.
Enzimin termal stabilitesinin karakterizasyonundaki diğer bir parametre yarı ömür
değerleridir. Sıcaklıktaki artışla ters orantılı olarak yarı ömür değerleri azalmıştır.
55ºC’de enzim aktivitesini yarı yarıya azaltmak için gereken süre 17.4 dakika iken,
65ºC’de 2.1 dakika olmuştur.
Çizelge 4.4. Siyah havuç PME’ının termal inaktivasyon değerleri
-1
2
Sıcaklık(ºC)
kD ( dk )
r
t1/2 (dk)
D (dk)
55
0.040
1.000
17.4
57.7
60
0.133
0.989
5.2
17.3
65
0.337
0.944
2.1
6.8
27
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Desimal azalma süresi (D değeri) belli bir sıcaklık ve basınçta enzim
aktivitesinde %90’lık bir azalma için gereken süredir. Bu değer, sıcaklıktaki artışla
ters orantılı olarak azalmıştır. Desimal azalma süresinin sıcaklığa bağımlılığı Z
değeri ile karakterize edilir. Bu değer, D değerinde bir log10’luk düşüş (%90 azalma)
için ihtiyaç duyulan sıcaklık artışı olarak tanımlanır. Genelde, düşük Z değerleri
enzimin ısıl direncinin düşük olduğunu gösterir. Diğer taraftan, yüksek bir
aktivasyon enerjisi (Ea) ise, enzimin sıcaklık değişimlerine hassasiyetini yansıtır.
Enzimin aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z değerleri sırasıyla, 196.8 kJmol-1 (r2 = 0.9957)
ve 2.16ºC (r2 = 0.9945) olarak bulunmuştur.
Termal inaktivasyon parametrelerinin diğer araştırmaların sonuçları ile
karşılaştırılması çalışılan sıcaklık ve sürelerdeki farklılıklar nedeniyle zordur.
Çizelge 4.5’te değişik ürünlerden izole edilen PME’ın Ea değerleri görülmektedir. Bu
değer ürüne göre ve hatta aynı üründe bile önemli farklılık göstermektedir. Bu
çalışmada hesaplanan Ea değeri havuç için belirtilen değerlerin biraz altında yer
almaktadır.
Yemenicioğlu ve Cemeroğlu (1999) salatalık (Cucumis sativus) hücre
duvarına iyonik olarak bağlı PME (IPME) ve sıkı bağlı PME (TPME)’ı izole ederek
enzimin
termal
stabilitesini
ve
inaktivasyonunu
incelemişlerdir.
PME
inaktivasyonunun 65ºC’nin üzerinde hızlandığı görülmüştür. Đyonik bağlı PME için
bu sıcaklık 65ºC iken, sıkı bağlı PME için 60ºC olarak bulunmuştur. TPME için 50,
55 ve 57.5ºC’lerde aktivasyon kaybı gözlenirken çalışılan aynı sıcaklıklarda IPME
için aktivasyon kaybı gözlenmemiştir. Her iki PME inaktivasyonunun 65ºC’nin
üzerinde hızlandığı görülmüştür. Salatalık PME’larının Z değerleri termolabil IPME
için 10.7ºC, termostabil IPME için 7.6ºC, termolabil TPME için 15.0ºC ve
termostabil TPME için 9.0ºC olarak bulunmuştur. Salatalık PME’larının Ea değerleri
termolabil IPME için 51.6 kcal/mol-1, termostabil IPME için 72.4 kcal/mol-1,
termolabil TPME için 37.1 kcal/mol-1 ve termostabil TPME için 62.0 kcal/mol-1
olarak hesaplanmıştır.
Vivar-Vera ve ark. (2007) alıç (Crataegus pubescens) meyvesinden PME’ın
ekstraksiyonu, termal stabilitesi ve kinetik davranışları üzerine bir çalışma
yapmışlardır. Burada PME aktivitesinin 50ºC’de 1 dk muameleden sonra
28
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
etkilenmediği gösterilmiştir. Bununla birlikte 70ºC ve 80ºC’deki aktivite kaybı
sırasıyla %72.5 ve %97.1’dir. Bu, enzimin yüksek sıcaklıklarda hızlı bir şekilde
denatüre olduğunu göstermektedir. 60ºC’de 25 dk muameleden sonra nispi
aktivitenin hala yaklaşık %50’si artakalmakta ve 80ºC’de 10 dk muameleden sonra
tamamen inaktive olmaktadır. Q10 ve Ea değerleri sırasıyla 2.01 ve 36.27 kJ/mol
olarak hesaplanmıştır.
de Assis ve ark. (2000) acerola (Malpighia sp.) PME’ının termal
inaktivasyonunu saptamak için sıcaklığın enzim aktivitesi üzerine olan etkilerini
çalışmışlardır. PME’ın termal stabilitesi farklı sıcaklıklarda (50, 80, 90, 98 102 ve
106ºC) çalışılmış ve enzimin 50 ve 80ºC’lerde sırasıyla 100 ve 50 dk süresince
aktivitesini %90 oranında koruduğu ortaya konulmuştur. PME’ın tam inaktivasyonu
için gereken ısıtma süreleri 98, 102 ve 106ºC’lerde sırasıyla 110, 10 ve 2.17 dk’dır
ve D değeri aynı sıcaklıklarda sırasıyla 100, 7.5 ve 2 dk olarak tespit edilmiştir.
90ºC’de elde edilen D değerleri turunçgillerden portakal meyve pulpu PME’ı ile
mukayese edildiğinde (hesaplanan değerler sırasıyla 0.225 ve 32 sn.) çok yüksektir.
Z değeri 4.71ºC olarak bulunmuştur.
29
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Çizelge 4.5. Farklı PME’ların aktivasyon enerjileri(Ea)
Kaynak
Ea (kJ/mol)
Referans
Havuç (Daucus carota L.)
289.2
Ly-Nguyen ve ark. (2002a)
Havuç (Daucus carota var. Nerac)
48.92
Sila ve ark. (2007)
Havuç (labil form)
510
Anthon ve Barrett (2002)
Havuç (dirençli form)
635
Anthon ve Barrett (2002)
Patates (labil form)
493
Anthon ve Barrett (2002)
Patates (dirençli form)
759
Anthon ve Barrett (2002)
Biber (Capsicum annuum)
46.45
Castro ve ark. (2006a)
Papaya
257.9-303.9
Massaguer ve ark. (1994)
Portakal
301.4-350.5
Van den Broeck ve ark. (1999)
Portakal
292.6-404.9
Sampedro ve ark. (2008)
Portakal-süt içeceği
528.2
Sampedro ve ark. (2008)
Portakal (labil fraksiyon)
299
Espachs-Barroso ve ark. (2006)
Portakal (stabil fraksiyon)
532
Espachs-Barroso ve ark. (2006)
Erik (Prunus domestica) labil fraksiyon
273.9
Nunes ve ark. (2006)
Erik (Prunus domestica) stabil fraksiyon
354.3
Nunes ve ark. (2006)
Greyfurt (Citrus paradisi)
328.9
Guivarc’h ve ark. (2005)
Yeşil fasulye
305-330
Laats ve ark. (1997)
Alıç (Crataegus pubescens)
36.3
Vivar-Vera ve ark. (2007)
Portakal pulpu
23.4-24.0
Korner ve ark. (1980)
Şeftali
34.6
Javeri ve Wicker. (1991)
Graviola (Anona muricata)
36.0-42.0
Arbaisah ve ark. (1997b)
Guava (Psidium guajava L.) concPME
64.5
Leite ve ark. (2006)
Guava (Psidium guajava L.) Iso4PME
103
Leite ve ark. (2006)
Elma (Golden sp.)
7443 kcal/mol
Denès ve ark. (2000)
Elma
5800 kcal/mol
Lee ve Wiley, (1970)
Bramley elması (ham ekstrakt)
7643 kcal/mol
King, (1991)
Salatalık (Cucumis sativus)*
5000 kcal/mol
Yemenicioğlu ve Cemeroğlu, (1999)
Salatalık (Cucumis sativus)**
7200 kcal/mol
Yemenicioğlu ve Cemeroğlu, (1999)
Papaya
5690 kcal/mol
Fayyaz ve ark. (1995)
Patates (cv. Russet Burbank)
6200 kcal/mol
Puri ve ark. (1982)
*
: Hücre duvarına sıkı bağlı PME
: Hücre duvarına iyonik olarak bağlı PME
**
30
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
4.6. Tuzun PME Aktivitesine Etkisi
Tuzlar ve iyonlar bir enzimin aktivitesine farklı etkilerde bulunabilirler.
Örneğin inorganik iyonlar bir proteinin iyonik yan zincirlerinin bazılarına bağlı
olabilirler. Bu tür etkileşim enzimin üç boyutlu yapısının stabilitesine etki
etmemesine karşın, enzimin aktif bölgesine bağlanmasını kolaylaştırabilir. Böylece
optimum konsantrasyonlarda iyon varlığında reaksiyonun hızı artar. PME
aktivitesindeki artış substratla birlikte Na+ iyon interaksiyonlarıyla aktivasyonuyla
olabilir. Aşırı metal iyonlarının varlığıyla birlikte PME’ın inhibisyonuyla aktivitede
bir düşme gözlenebilir (Lineweaver ve Ballou, 1945).
NaCl’nin siyah havuç PME’ının aktivitesi üzerine olan etkisi çeşitli
konsantrasyonlarda (0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 M) tuz içeren elma pektini
kullanılarak çalışılmıştır. Sonuçlar % nisbi aktivite olarak Şekil 4.4’te verilmiştir.
Tuz konsantrasyonu artırıldıkça enzim aktivitesi artmış ve en yüksek aktivite 0.20 M
NaCl konsantrasyonunda gözlenmiştir. Bu değerden sonra, artan tuz kosantrasyonu
ile beraber enzim aktivitesinda az da olsa düşme gözlenmiştir. Ortamda tuz
bulunmadığı zaman PME aktivitesi %24 iken, 0.10-0.50 M NaCl içeren substratlarla
olan aktivite minimum %85 olmuştur.
120
Nisbi aktivite (%)
100
80
60
40
20
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Tuz Konsantrasyonu (m ol/l)
Şekil 4.4. Tuz konsantrasyonunun siyah havuç PME aktivitesine etkisi
31
0,5
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Alonso ve ark. (2003) havuç (Daucus carota L.) PME’ının saflaştırılmasını
ve karakterizasyonunu yapmışlardır. Pektinesteraz’ın metalik iyonlarca aktive
edildiği, optimum aktivitelerin NaCl ile 130-330 mM; CaCl2 ile 15-50 mM
konsantrasyonları arasında olduğu ortaya konulmuştur. Ayrıca, enzimin çoğunlukla
Ca++ ile aktive olduğu ve yüksek konsantrasyonlarda Na+’a yüksek derecede
toleranslı olduğu açıklanmıştır.
Sila ve ark. (2007)’nın termal ve yüksek basıncın havuç (Daucus carota var.
Nerac) PME’ı stabilitesi ve katalitik aktivitesi üzerine yaptıkları çalışmada,
saflaştırılmış PME’ın maksimum aktivite gösterdiği NaCl konsantrasyonu 0.117 M
olarak bulunmuştur.
Denès ve ark. (2000) elma PME’ının saflaştırılmasını, özelliklerini ve termal
inaktivasyonunu çalışmışlardır. Saflaştırılmış PME’ın optimum aktivite için pH 7’de
0.13 M ve pH 4’te 0.75 M NaCl’e gereksinim duyduğu bulunmuştur.
Castro ve ark. (2006a, 2006b) biber (Capsicum annuum) PME’ı ile yaptıkları
çalışmada,
pH
5.6’da
enzimin
maksimum
aktivite
gösterdiği
NaCl
konsantrasyonunun 0.4 M olduğu bulunmuştur. Castro ve ark. (2005)’nın yine biber
PME’ı üzerine yaptıkları diğer bir çalışmada ise nötral pH’da saflaştırılmış biber
PME’ının maksimum aktiviteye 0.13 M NaCl konsantrasyonunda ulaşılmıştır
Guivarc’h ve ark. (2005)’nın PME’ın greyfurttan (Citrus paradisi)
saflaştırılmasını, karakterizasyonunu, termal ve yüksek basınç inaktivasyonlarını
araştırdıkları çalışmada, optimum enzim aktivitesi için 1.27 M NaCl’e gereksinim
duyulduğu bulunmuştur.
Leite ve ark. (2006) guava (Psidium guajava L.) PME’ı
ile yaptıkları
çalışmada elde ettikleri iki izoenzim için optimum NaCl konsantrasyonları 0.20 ve
0.15 M olarak bulunmuştur. Na+ iyonları konsantrasyonu bu değerlerin üzerine
çıktığında enzim aktivitesi azalmıştır. Na+ iyonlarının enzime konformasyonal
modifikasyon ve destekleyici reaksiyon için substratla birlikte bağlandığına
inanılmaktadır. Aynı çalışmada, herhangi bir katyon içermeden ve bazı diğer
katyonlar (Li+, K+,Rb+, Ca+2 ve Mg+2) kullanılarak da enzim aktivitesi çalışılmış ve
PME’ın yüksek bir katalitik aktivitesi için en iyi katyonun Na+ olduğu bulunmuştur.
32
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Ender BELLUR
Vivar-Vera ve ark. (2007) alıç (Crataegus pubescens) PME’ı ile yaptıkları
çalışmada enzim aktivitesi 0.4 M’e kadar bir artış göstermiş daha sonra aktivite
düşmeye başlamıştır.
Çizelge 4.6’da farklı bitkisel kaynaklardan izole edilen PME’ların maksimum
aktivasyonları için gereken NaCl konsantrasyonları verilmiştir.
Çizelge 4.6. Farklı PME’ların maksimum aktivasyonu için NaCl konsantrasyonları
Bitki
NaCl (M)
Referans
Havuç (Daucus carota L.)
0.33
Alonso ve ark (2003)
Havuç (Daucus carota var. Nerac)
0.12
Sila ve ark. (2007)
Biber (Capsicum annuum) (pH 7.0)
0.13
Castro ve ark. (2005)
Biber (Capsicum annuum) (pH 5.6)
0.40
Castro ve ark. (2005)
Alıç (Crataegus pubescens)
0.40
Vivar-Vera ve ark.(2007)
Graviola (Anona muricata)
2.00
Arbaisah ve ark.(1997a)
Papaya (Carica papaya)
0.25
Fayyaz ve ark.(1995)
Trabzon hurması (Diospyros kaki) PE1
0.10
Alonso ve ark. (1997)
Trabzon hurması (Diospyros kaki) PE2
0.40
Alonso ve ark. (1997)
Trabzon hurması (Diospyros kaki)
1.60
Awad (1985)
Sharabi Elması (Golden sp.)
1.50
Al-Delaimy ve Ali (2006)
Elma (Golden sp.)
1.50
Lee ve Wiley(1970)
Elma (Golden sp.) (pH 7.0)
0.13
Denès ve ark. (2000)
Elma (Golden sp.) (pH 4.0)
0.75
Denès ve ark. (2000)
Guava Iso4 PME(Psidium guajava L.)
0.20
Leite ve ark. (2006)
Guava conc PME(Psidium guajava L.)
0.15
Leite ve ark. (2006)
Greyfurt (Citrus paradisi)
1.27
Guivarc’h ve ark. (2005)
33
5. SONUÇ VE ÖNERĐLER
Bu çalışmada siyah havuçtan izole edilen ve kısmen saflaştırılan pektin
metilesterazın (PME) biyokimyasal özelliklerinin araştırılmıştır. Bu bağlamda,
enzimin optimum pH ve sıcaklığı, termal stabilite ve inaktivasyonu ve substrat
spesifikliği belirlenmiştir.
Substrat olarak elma pektini kullanılarak gerçekleştirilen çalışmalardan elde
edilen bulgulardan;
•
Enzimin substrat ilgisinin düşük olduğu,
•
pH 6.0’dan 7.5’e doğru arttırıldıkça enzim aktivitesinin arttığı, en yüksek
aktivitenin pH 7.5’te olduğu ve enzimin pH 6.5-8.5 gibi geniş bir aralıkta çok
yüksek aktivite gösterdiği,
•
Sıcaklık 20ºC’den 55ºC’ye doğru arttırıldıkça, enzim aktivitesinin de arttığı,
en yüksek aktivitenin 55ºC’de olduğu ve 55ºC’den itibaren enzim
aktivitesinin önce yavaş sonra hızlı olarak düştüğü,
•
Termal stabilite çalışmalarında enzimin 30-50ºC’ler arasında oldukça stabil
olduğu ve 50’ºC’den sonra enzim aktivitesinin hızla düştüğü,
•
55, 60 ve 65ºC’de değişik sürelerde gerçekleştirilen termal inaktivasyon
çalışmalarında, 60 ve 65ºC’lerde inaktivasyonun birinci dereceli kinetiğe
uyduğu, 55ºC de ise bifazik olduğu, sıcaklıktaki artışla beraber kD değerleri
azalırken yarı ömür ve D değerlerinin arttığı ve enzimin termal stabilitesinin
yüksek olmadığı,
•
NaCl’nin PME aktivitesi üzerindeki etkisinin araştırıldığı çalışmalarda, tuz
konsantrasyonu artırıldıkça enzim aktivitesinin de arttığı ve en yüksek
aktivite 0.20 M NaCl konsantrasyonunda olduğu belirlenmiştir.
Bu bulgulardan hareketle, siyah havuç PME aktivitesi pH ve sıcaklık gibi
etmenlerle kolaylıkla kontrol edilebilir. Enzimin termal stabilitesinin düşük olması
nedeniyle
pastörizasyon
uygulamasıyla
öngörülmektedir.
34
enzimin
inaktif
hale
geleceği
KAYNAKLAR
AL-DELAIMY, K. S. ve ALI, S. H., 2006. Pectinesterase Extraction from Sharabi
Apples, Journal of the Science of Food and Agriculture, 20 : 660-661.
ALONSO, J., HOWELL, N. ve CANET,W., 1997. Purification and Characterisation
of two Pectin Methylesterase from Persimmon (Diospyros kaki), Journal of
the Science of Food and Agriculture, 75 : 352-358.
ALONSO, J., CANET,W., HOWELL, N. ve ALIQUE, R., 2003. Purification and
Characterisation of Carrot (Daucus carota L.) Pectinesterase, Journal of the
Science of Food and Agriculture, 83 : 1600-1606.
ANONYMOUS, 2006. www.expasy.ch.
ANTHON, G. E. ve BARRETT, D. M., 2002. Kinetic Parameters for the Thermal
Inactivation of Quality-Related Enzymes in Carrots and Potatoes, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50 : 4119-4125.
ARANCIBIA, R. A. ve MOTSENBOCKER, C. E., 2006. Pectin Methylesterase
Activity in vivo Differs From Activity in vitro and Enchanges
Polygalacturonase-Mediated Pectin Degradation in Tabasco Pepper, Journal
of Plant Physiology, 163 : 488-496.
ARBAISAH, S. M., ASBI, B. A., JUNAINAH, A. H. ve JAMILAH, B., 1997a.
Purification and Properties of Pectinesterase from Soursop (Anona muricata)
Pulp, Food Chemistry, 59(1) : 33-40.
ARBAISAH, S. M., ASBI, B. A., JUNAINAH, A.H., JAMILAH, B. ve KENNEDY,
J. F., 1997b. Soursop Pectinesterases: Thermostability and Effect on Cloud
Stability of Soursop Juice Carbohydrate Polymers, 34(3) : 177-182.
AWAD, M., 1985. Persimmon Pectinmethylesterase: Extraction and Variation
during Ripening, Journal of Food Science, 50 : 1643-1645.
BALESTRIERI, C., CASTALDO, D., GIOVANE, A., QAGLIUOLO, L. ve
SERVILLO, L., 1990. A Glycoprotein Inhibitor of Pectin Methylesterase in
Kiwi Fruit (Actinidia chinensis). European Journal of Biochemistry, 193 :
183-187.
35
BALOGH T., SMOUT C., NGUYEN B. L., VAN LOEY A. M. ve HENDRICKX
M. E., (2004). Thermal and High-Pressure Inactivation Kinetics of Carrot
Pectinmethylesterase: From Model System to Real Foods, Innovative Food
Science and Emerging Technologies, 5 : 429-436.
BENEN, J. A. E., VAN ALABEEK, G. J. W. M., VORAGEN, A. G. J., ve VISSER,
J., 2003. Pectic Esterases, (WHITAKER, J. R. , VORAGEN, A. G. J., ve
WONG, D. W. S. editörler), Handbook of Food Enzymology, Marcel Dekker
Inc., N.Y., 849-856.
BRADFORD, M. M., 1976. a Rapid and Sensitive for the Quantitation of Microgram
Quantitites of Protein Utilizing the Principle of Protein-dye Binding,
Analytical Biochemistry, 72 : 248-254.
CAMERON, R. G., ve GROHMANN, K., 1996. Purificiation and Characterisation
of a Thermally Tolerant Pectin Methylesterase from a Commercial Valencia
Fresh Frozen Orange Juice, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44 :
628-630.
CASTALDO, D., SERVILLO, L., LOIUDICE, R., BALESTRIERI, C., LARATTA,
B., QUAGLIUOLO, L. ve GIOVANE, A., 1996. The Dedection of Residual
Pectin Methylesterase Activity in Pasteurised Tomato Juices, International
Journal of Food Science and Technology, 31 : 313-318.
CASTALDO, D., LARATTA, B., LOIUDICE, R., GIOVANE, A., QUAGLIUOLO,
L. ve SERVILLO, L., 1997. Presence of Residual Pectin Methylesterase
Activity in Thermally Stabilized Industrial Fruit Preparations, LebensmittelWissenschaft und Technologie, 30 : 479-484.
CASTRO, S. M., Van LOEY, A. M., SARAIVA, J. A., SMOUT, C. ve
HENDRICKX, M. E., 2005. Activity and Process Stability of Purified Green
Pepper (Capsicum annuum) Pectin Methylesterase, Journal of Agriculture
and Food Chemistry, 52 : 5724-5729.
CASTRO, S. M., VAN LOEY, A. M., SARAIVA, J. A., SMOUT, C. ve
HENDRICKX, M. E., 2006a. Inactivation of Pepper (Capsicum annuum)
Pectin Methylesterase by Combined High-pressure and Temperature
Treatments, Journal of Food Engineering, 75 : 50-58.
36
CASTRO, S. M., VAN LOEY, A. M., SARAIVA, J. A., SMOUT, C. ve
HENDRICKX, M. E., 2006b. Inactivation of Pressure/Temperature
Combinations for Optimal Pepper (Capsicum annuum) Pectin Methylesterase
Activity, Enzyme and Microbial Technology, 38 : 831-838.
CELESTINO, S. M. C., DE FREITAS, S. M., MEDRANO, F. J., DE SOUZA, M. V.
ve FILHO, E. X. F., 2005. Purification and Characterisation of a Novel
Pectinase
from
Acrophialophora
nainiana
with
Emphasis
on
its
Physicochemical Properties, Journal of Biotechnology, 123 : 33-42.
CHRISTGAU, S., KOFOD, L. V., HALKIER, T., ANDERSEN, L. N., HOCKAUF,
M., DÖRREICH, K., DALBØGE, H. ve KAUPPINEN, S., 1996. Pectin
Methyl Esterase from Aspergillus aculeatus: Expression Cloning in Yeast and
Characterization of the Recombinant Enzyme, Biochemical Journal, 319 :
705-712.
DE ASSIS S. A., LIMA D. C. ve DE FARIA OLIVEIRA, O. M. M., 2000. Acerola’s
Pectin Methylesterase: Studies of Heat Inactivation, Food Chemistry, 71 :
465-467.
DENĔS, J. M. , BARON, A. ve DRILLEAU, J. F., 2000. Purification, Properties and
Heat Inactivation of Pectin Methylesterase from Apple (cv Golden
Delicious), Journal of the Science of Food and Agriculture, 80 : 1503-1509.
ESPACHS-BARROSO, A., VAN LOEY, A. M. ve HENDRICKX, M. E., 2006.
Inactivation of Plant Pectin Methylesterase by Thermal or High Intensity
Pulsed Electric Field Treatments, Innovative Food Science and Emerging
Technologies, 7 : 40-48.
FAYYAZ, A., ASBI, B. A., GHAZALI, H. M., CHE MAN, Y. B. ve JINAP, S.,
1995. Study of Kinetics of Papaya Pectinesterase, Food Chemistry, 53(2) :
129-135.
GIOVANE, A., SERVILLO, L., BALESTRIERI, C., RAIOLA, A., D’AVINO, R.,
TAMBURRINI, M., CIARDIELLO, M. A. ve CAMARDELLA, L., 2004.
Pectin Methylesterase Inhibitor, Biochimica and Biophysica Acta, 1696 :
245-252.
37
GRSIC-RAUSCH, S. ve RAUSCH, T., 2004. A Coupled Spectrophotometric
Enzyme Assay for the Determination of Pectin Methylesterase Activity and
its Inhibition by Proteinaceous Inhibitors, Analytical Biochemistry, 333 : 1418.
GUIVARC’H, Y., SEGIOVA, O., VAN LOEY, A. M. ve HENDRICKX, M. E.,
2005. Purification, Characterisation, Thermal and High-Pressure Inactivation
of a Pectin Methylesterase from Grapefruit (Citrus paradisi), Electric Field
Treatments, Innovative Food Science and Emerging Technologies, 6 : 363371.
JAVERI, H. ve WICKER, L., 1991. Partial Purification and Characterisation of
Peach Pectinesterase, Journal of Food Biochemistry, 15 : 241-252.
KASHYAP, D. R. , VOHRA, P. K. , CHOPRA, S. ve TEWARI, R. , 2001.
Applications of Pectinases in the Commercial Sector: a Review, Bioresource
Technology, 77 : 215-227.
KERTESZ, Z. I., 1955. Pectic Enzymes, (COLLOWICK, S. P. ve KAPLAN, N. O.
editörler), Methods in Enzymology, Academic Press, N. Y. C., 158-166.
KING, K., 1991. Characteristics of Pectinesterase Isolated from Bramley Apple
Waste, Journal of Science Food Agriculture, 57 : 43-48.
KOOLMAN, J. ve ROEHM, K. H., 2005. Color Atlas of Biochemistry, 2nd Ed.
Thieme, Stuttgart, 88-94
KORNER, B., ZIMMERMANN, G. ve BERK, Z., 1980. Orange Pectinesterase:
Purification, Properties and Effection Cloud Stability, , Journal of Food
Science, 45: 1203-1206.
LAATS, M. M., GROSDENIS, F., RECOURT, K., VORAGEN, A. G. J. ve
WICHERS, H. J., 1997. Partial Purification and Characterisation of Pectin
Methylesterase from Green Beans, Journal of Agriculture and Food.
Chemistry, 22 : 5572-5577.
LAMIKANRA, O., 2002. Enzymatic Effects on Flavor and Texture of Fresh-Cut
Fruits and Vegetables. In Fresh-Cut Fruits and Vegetables (LAMIKANRA,
O. editör), CRC Pres, Boca Raton.
38
LEE, Y. S. ve WILEY, R. C., 1970. Measurement and Partial Characterisation of
Pectinesterase in Apple Fruits, Journal of American Society for Horticultural
Science, 95 : 465-468.
LEE, G., LEE, S. K. ve LEE, S. H., 2001. Characterisation of Pectinolytic Enzyme
and Blanching Condition of Raw Carrots, Journal of Korean Society for Food
Science and Nutrition, 30 : 228-233.
LEITE, K. T. D. S. C, TADIOTTI, A. C., BALDOCHI, D. and OLIVEIRA, O. M.
M. F., 2006., Partial Purification, Heat Stability and Kinetic Characterisation
of the Pectinmethylesterase from Brazilian Guava, Paluma Cultivars, Food
Chemistry, 94 : 565-572.
LIM, Y. M. ve CHUNG, M. C. M., 1993. Isolation and Characterization of Pectin
Methylesterase from Papaya, Archives of Biochemistry and Biophysics,
307(1) : 15-20.
LINEWEAVER, H. ve BALLOU, G.A., 1945. The Effects on Cations on the
Activity of Alfaalfa Pectinesterases, Archieves of Biochemistry, 6 : 373-387.
LY-NGUYEN, B., VAN LOEY, A. M., FACHIN, D., VERLENT, I., INDRAWATI
ve HENDRICKX, M. E., 2002a. Partial Purification, Characterisation and
Thermal and High-Pressure Inactivation of Pectin Methylesterase from
Carrots (Daucus carota L.), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 :
5437-5444.
LY-NGUYEN, B., VAN LOEY, A. M., FACHIN, D., VERLENT, I., DUVETTER,
T., VU, S. T., SMOUT, C. ve HENDRICKX, M. E., 2002b. Strawberry
Pectin Methylesterase (PME) Purification, Characterisation, Thermal and
High-Pressure Inactivation, Biotechnology Programme, 18 : 1447-1450.
LY-NGUYEN, B., VAN LOEY, A. M., FACHIN, D., VERLENT, I., INDRAWATI
ve HENDRICKX, M. E., 2002c. Purification, Characterisation, Thermal and
High-Pressure Inactivation of Pectin Methylesterase from Bananas (cv.
Cavendish), Biotechnology and Bioengineering, 78 : 683-691.
LY-NGUYEN, B., VAN LOEY, A. M., SMOUT, C., OZCAN, S. E., FACHIN, D.,
VERLENT, I., TRUONG, S. V., DUVETTER, T. ve HENDRICKX, M. E.,
39
2003.
Mild-Heat
and
High-Pressure
Inactivation
of Carrot
Pectin
Methylesterase: A Kinetic Study, Journal of Food Science, 68 : 1377-1383.
MANABE. M., 1973. Purification and Properties of Citrus natsudai Pectinesterase,
Agricultural of Biological Chemistry 37 : 1487-1491.
MARANGONI, A. G., 2003. Enzyme Kinetics: A Modern Approach, Wiley,
Hoboken, New Jersey, 140-158.
MARAŞ, M., ÇAVUŞOĞLU, K., AKSÖZ, E. ve KIRINDI, T., 2004. Pektin,
Poligalakturonik Asit ve Liyofilize Pektinaz Enziminin Yapısal Analizi, ĐTÜ
Dergisi/C Fen Bilimleri, 2(1) : 1, 3-10.
MASSAGUER, P. R., MAGALHAES, M. A. ve TOSELLO, R. M., 1994. Thermal
Inactivation of Pectinesterase from Papaya Pulp (pH 3.8), In Developments in
Food Engineering (YANO, T., MATSUMOTO, R., NAKAMURA, K.,
editörler), Blackie: London, UK, 495-497.
McDONALD, H. M., EWANS, R. ve SPENCER, W. J., 1993. Purification and
Properties of Major Pectinesterases in Lemon Fruits (Citrus limon), Journal
Science of Food and Agriculture, 62 : 163-168.
NUNES, C. S., CASTRO, S. M., SARAIVA, J. A., COIMBRA, M. A.,
HENDRICKX, M. E. ve VAN LOEY, A. M., 2006. Thermal and HighPressure Stability of Purified Pectin Methylesterase from Plums (Prunus
domestica). Journal of Food Biochemistry, 30 : 138-154.
PURI, A., SOLOMOS, T. ve KRAMER, A., 1982. Partial Purification and
Characterisation of Potato Pectinesterase, Food Chemistry, 8 : 203-213.
RECOURT, K., STOLLE-SMITS, T., LAATS, J. M., BEEKHUIZEN, J. G.,
EBBELAAR, C. E. M., VORAGEN, A. G. J., WICHERS, H. J. ve VAN
DIJK, C., 1996. Pectins and Pectolytic Enzymes in Relation to Development
and Processing of Green Beans (Phaseolus vulgaris L.) Progress in
Biotechnology, 14 : 399-404.
RILLO, L., CASTALDO, D., GIOVANE, A., SERVILLO, L., BALESTRIERI, C.
ve QUAGLIUOLO, L., 1992. Purification and Properties of Pectin
Methylesterase from Mandarin Orange Fruit, Journal of Agriculture and Food
Chemistry, 40 : 591-593.
40
SAMPEDRO, F., RODRIGO, D. ve HENDRICKX, M., 2008. Inactivation Kinetics
of Pectin Methyl Esterase Under Combined Thermal-High Pressure
Treatment in an Orange Juice-Milk Beverage, Journal of Food Engineering,
86 : 133-139.
SHEN, Z., MANNING, G., REESE, J. C. ve REECK, G. R., 1999. Pectin
Methylesterase from the Rice Weevil, Sitophilus oryzae (L.) (Coleoptera:
Curculionidae): Purification and Characterisation, Insect Biochemistry and
Molecular Biology, 29 : 209-214.
SILA, D. N., SMOUT, C., SATARA, Y., TRUONG, V., VAN LOEY, A. ve
HENDRICKX, M., 2007. Combined Thermal and High Pressure Effect on
Carrot Pectinmethylesterase Stability and Catalytic Activity, Journal of Food
Engineering, 78 : 755-764.
VAN DEN BROECK, I., LUDIKHUYZE, L. R., VAN LOEY, A. M., WEEMAES,
C. ve HENDRICKX, M. E., 1999. Thermal and Combined PressureTemperature Inactivation of Orange Pectinesterase: Influence of pH and
Additives, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 47 : 2950-2958.
VAN DEN BROECK, I., LUDIKHUYZE, L. R., WEEMAES, C., VAN LOEY, A.
M. ve HENDRICKX, M.E., 2000. Effects of Temperature and/or Pressure on
Tomato Pectinesterase Activity, Journal of Agriculture and Food Chemistry,
48 : 551-558.
VIVAR-VERA, M. A., SALAZAR-MONTOYA, J. A., CALVA-CALVA, G. ve
RAMOS-RAMǏREZ, E. G., 2007. Extraction, Thermal Stability and Kinetic
Behavior of Pectinmethylesterase from Hawthornn (Crataegus pubescens)
Fruit, Food Science and Technology, 40 : 278-284.
VORA, H. M., KYLE, W. S. A. ve SMALL, D. M., 1999. Activity, Localisation and
Thermal Inactivation of Deteriorative Enzymes in Australian Carrot (Daucus
carota L.) Varieties, Journal Science of Food and Agriculture, 79 : 11291135.
WHITAKER, J. R., 2003. Enzyme Catalyzed Reactions: Experimental Factors that
Affect Rates. In Handbook of Food Enzymology (J. R. WHITAKER, A. G. J.
VORAGEN, D. W. S. WONG editörler) Marcel Dekker, New York, 31-65.
41
WONG, D. W. S., 1995. Food Enzymes, Chapman & Hall, New York, 212-236.
YEMENĐCĐOĞLU, A. ve CEMEROĞLU, B., 1999. Separation and Thermal
Characterization
of
Ionically
and
Tightly
Cell-Wall-Bound
Pectin
Methylesterase from Cucumbers (Cucumis sativus) Z Lebensm Unters Forsch
A., 208 : 369-372.
YILDIZ, H. ve BAYSAL, T., 2006. Effects of Alternative Current Heating
Treatment on Aspergillus niger , Pectin Methylesterase and Pectin Content in
Tomato, Journal of Food Engineering, 75 : 327-332.
ZAWITOWSKI, J., BILIADERIS, C. G. ve ESKIN, N. A. M., 1991. Oxidative
Enzymes in Foods (ROBINSON, D. S. ve ESKIN, N. A. M. editörler),
Elsevier, New York, 217-273.
ZIMMERMAN, R. E., 1978. A Rapid Assay for Pectinesterase Activity Which can
be Used as a Prescreen for Pectinesterase Inhibitors, Analytical Biochemistry,
85 : 219.
42
ÖZGEÇMĐŞ
1977 yılında Antakya’da doğdum. Đlk, orta ve lise öğrenimimi Adana’da
tamamladım. 1995 yılında Çukurova Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksek
Okulu Tıbbi Laboratuar Bölümü’nde ön lisans öğrenimime başladım. 1997 yılında
Tıbbi Laboratuar Teknikeri ünvanı ile mezun oldum. 1997 yılında Mustafa Kemal
Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü’nde lisans öğrenimime
başladım. Aynı dönemde halen çalışmakta olduğum Amylum Nişasta Sanayi ve
Ticaret A.Ş.’inde kalite güvence departmanında işe başladığım için okulu bıraktım.
2000 yılında Dikey Geçiş Sınavı ile yerleştiğim Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat
Fakültesi Biyoloji Bölümü’nde lisans öğrenimime başladım. 2003 yılında Biyolog
ünvanı ile mezun oldum. 2005 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda yüksek lisans öğrenimime başladım. Halen
öğrenimime devam etmekteyim.
43