DENEYSEL OLARAK ENFLAMASYON OLUŞTURULAN

TC.
ATATÜRK ÜNĐVERSĐTESĐ
SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
ECZACILIK FAKÜLTESĐ
BĐYOKĐMYA ANABĐLĐM DALI
DENEYSEL OLARAK ENFLAMASYON OLUŞTURULAN RATLARDA
Peltigera rufescens (WEĐS) HUMB.
ĐSĐMLĐ LĐKENDEN ELDE EDĐLEN
METANOL EKSTRELERĐNĐN ANTĐOKSĐDANT ENZĐM AKTĐVĐTELERĐ
ÜZERĐNE ETKĐSĐ
Sevil TANAS
Tez Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU
Yüksek Lisans Tezi
Erzurum 2007
I
Sayfa No :
ĐÇĐNDEKĐLER
I
TEŞEKKÜR
V
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ
TABLOLAR LĐSTESĐ
KISALTMALAR
ÖZET
SUMMARY
1.GĐRĐŞ VE AMAÇ
2. GENEL BĐLGĐLER
VI
VIII
IX
XII
XIII
1
4
2.1. Likenler
2.1.1 Peltigera Wild.
4
6
2.1.2. Peltigera Rufescens (Weis)Humb
7
8
8
2.2. Enflamasyon
2.2.1. Akut Enflamasyon
2.2.2. Kronik Enflamasyon
2.3. Antienflamatuvar Đlaçlar
22
2.3.1. Steroidal Antienflamatuvar Đlaçlar (SAEI)
2.3.2 Non Steroidal Antienflamatuvar Đlaçlar
24
25
25
2.4. Antioksidanlar
2.4.1. Serbest Radikaller
2.4.1.1. Serbest Radikal Çeşitleri
47
47
48
2.4.2. Serbest Radikallerin Kaynakları
53
2.4.3. Serbest Radikallerin Etkileri
2.4.4. Antioksidan Savunma Sistemleri
2.4.4.1. Doğal (Endojen) Antioksidan
58
63
64
2.4.4.1.1. Primer Antioksidanlar (Enzimler)
64
2.4.4.1.1.1. Süperoksit Dismutaz (SOD)
2.4.4.1.1.2. Katalaz (CAT)
2.4.4.1.1.3.Glutatyon Peroksidaz (GPx)
2.4.4.1.1.4. Glutatyon Redüktaz (GR)
64
65
66
67
2.4.4.1.1.5. Glutatyon S-Transferaz (GST):
2.4.4.1.2. Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar)
67
69
II
2.4.4.1.2.1. Glutatyon (GSH)
2.4.4.1.2.2. Diğer Sekonder Antioksidanlar
69
71
2.4.4.2. Ekzojen Antioksidanlar
72
2.4.4.3. Gıda Antioksidanları
2.4.5. Antioksidan Etki Tipleri
3. MATERYAL VE METOD
3.1. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar
3.2. Deneylerde Kullanılan Cihazlar
3.3. Deneylerde Kullanılan Çözeltiler Ve Hazırlanışları
3.4. Deney Bitkileri
73
73
74
74
74
75
77
3.5. Bitki Ekstresinin Hazırlanması
3.6. Deney Hayvanları
78
3.7. Cotton Pelletler Kullanılarak Kronik enflamasyon
3.8. Karragenin Kullanılarak Akut enflamasyon
3.9. Biyokimyasal Ölçümleri
3.9.1. Biyokimyasal Analizler Đçin Pençe Doku Homojenatlarının Hazırlanması
3.9.2. CAT Aktivitesinin Ölçümü
3.9.3. GPx Aktivitesinin Ölçümü
79
79
80
80
81
82
3.9.4. Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü
83
3.9.5. Total GSH Miktarı Ölçümü
84
3.9.6. LPO Miktarı Ölçümü
85
3.10. Bitki Ekstresinin Antioksidant Aktivitesinin Belirlenmesi
87
3.11. Bitki Ekstresinin Total Fenolik Bileşiklerin Miktarlarının Belirlenmesi
88
3.12. Bitki Ekstresinin Đndirgeme Kuvvetinin Belirlenmesi
89
3.13. Đstatistiksel Analizler
4. BULGULAR
78
89
90
4.1. Makroskopik Bulgular
90
4.1.1. Karragenin (Car) Đle Deneysel Olarak Oluşturulan Pençe Ödemleri Üzerine
P. Rufescens’ten Elde Edilen Metanol Ekstresi (PRME)’nın ve Pozitif Kontrol
Olarak Kullanılan Diklofenak (DIC) ile ındometazin (IND)’in etkileri
90
III
4.1.2. Pamuk Bilyeler (Koton Pelletler) Đle deneysel olarak oluşturulan
Enflamasyonun Proliferatif Fazı (Kronik Enflamasyon) Üzerine P. Rufescens’ten
Elde Edilen Metanol Ektresi (PRME)’nın ve Pozitif Kontrol Olarak Kullanılan
Diklofenak (DIC) Đle Đndometazin (IND)’in etkileri
93
4.2. Biyokimyasal Bulgular
95
4.2.1. Rat Pençelerindeki Katalaz (Cat) Enzim Aktiviteleri Üzerine Peltigera
Rufescens’in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak
(DIC)’in etkileri
95
4.2.2. Rat Pençelerindeki Glutatyon Peroksidaz (Gpx) Enzim Aktiviteleri Üzerine
Peltigera Rufescens’in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve
Diklofenak (DIC)’in etkileri
97
4.2.3. Rat Pençelerindeki Süperoksit Dismutaz (SOD) Enzim Aktiviteleri üzerine
Peltigera Rufescens’in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve
Diklofenak (DIC)’in etkileri
99
4.2.4. Rat Pençelerindeki Glutatyon (GSH) seviyeleri üzerine Peltigera
Rufescens’in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak 101
(DIC)’in etkileri
4.2.5. Rat Pençelerindeki Lipit Peroksidasyon (LPO) Seviyeleri Üzerine
Peltigera Rufescens’in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve
Diklofenak (DIC)’in etkileri:
103
4.3. Peltigera Rufescens’in Metanol Ekstresi (PRME)’nin, Antioksidan
Özellikleri
105
5. TARTIŞMA
6. KAYNAKLAR
107
118
IV
TEŞEKKÜR
Gösterdiği
özveri
ve
anlayışdan
dolayı
eğitimimin
her
aşamasında
deneyimlerinden ve bilgisinden yararlandığım değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Fehmi
ODABAŞOĞLU’na, yardımlarını ve desteğini esirgemeyen hocam sayın Doç. Dr.
Ahmet ÇAKIR’a çalışmalarımın başından sonuna kadar her türlü desteği sağlayan ve bu
çalışmanın ortaya çıkmasında çok büyük emekleri olan Okutman Yasin Bayır’a her
zaman yanımda olan Kimyager Fadime ATALAY’a ve katkılarında dolayı Araş. Gör.
Mesut B.HALICI’ya, Araş. Gör Murat KOÇ’a likenlerle çalışmam da katkıları olan
Sayın Yrd. Doç. Dr. Ali ASLAN’a, Çalışmalarım esnasında kapılarını sonuna kadar
açan ‘Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi’ne ve Farmakoloji A.B.D.
Başkanı Prof. Dr. Fatma GÖÇER, Doç. Dr. Halis SÜLEYMAN’a özellikle de deney
aşamasında yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Zekai HALICI’ya ve Araş. Gör.
Elif ÇADIRCI’ya
Yüksek lisans tezi olarak sunduğum ve Atatürk Üniversitesi Eczacılık
Fakültesi’nde gerçekleştirilen bu çalışmanın ortaya çıkmasında desteklerini esirgemeyen
Fakültemiz Dekanı sayın Prof. Dr. Yunus KARA, Temel Bilimler Bölüm Başkanı sayın
Prof. Dr. Yücel KADIOĞLU ve nezdinde tüm Eczacılık Fakültesi personeline,
desteğinden dolayı Araş. Gör Elif KESMEN’e sonsuz teşekkür ve şükranlarımı sunarım.
Ve tabi ki bu yolda beni sonsuz destekleyen ve yüreklendiren canım Anneme ve
Babama sonsuz şükranlarımı ve teşekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim.
V
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ
Sayfa No :
Şekil 1. Peltigera rufescens (Weis)Humb.`un doğal ortamında çekilmiş resimleri.
6
Şekil 2. Araşidonik asit metabolitleri yolu………………………………………..
17
Şekil 3. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller…….
56
Şekil 4. GSH’nin molekül yapısı………………………………………………….
69
Şekil 5. Araştırmada kullanılan ratları gösteren fotoğraf………………………….
78
Şekil 6. GSH miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik…………...
85
Şekil 7. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik…………
87
Şekil 8. Toplam fenolik bileşiklerin miktarının belirlenmesinde kullanılan
gallik asit standart grafiği……………………………………………………..
88
Şekil 9. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonda pence hacimleri üzerine saatlere bağlı olarak
Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve
93
diklofenak (DIC)’ın anti-enflamatuvar etkilerinin değişimi………………………
Şekil 10. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki katalaz (CAT) enzim
aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME), indometazin
96
(IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkilerinin değişimi………………………………..
Şekil 11. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki glutatyon peroksidaz (GPx)
enzim aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME),
98
indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkilerinin değişimi………………….
Şekil 12. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki süperoksit dismutaz (SOD)
enzim aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME),
100
indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkilerinin değişimi………………….
Şekil 13. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki glutatyon (GSH) miktarları
üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve
diklofenak (DIC)’ın etkilerinin değişimi………………………………………….
102
VI
Şekil 14. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki lipit peroksidasyonu (LPO)
seviyeleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME), indometazin
104
(IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkilerinin değişimi………………………………..
Şekil 15. Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME)’nin, trolox’un ve
askorbik asitin antioksidan aktiviteleri. …………………………………………..
106
VII
TABLOLAR LĐSTESĐ
Sayfa No :
Tablo 1. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonun 4. saatinde pence hacimleri üzerine Peltigera
rufescens’in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak
92
(DIC)’ın anti-enflamatuvar etkileri………………………………………………..
Tablo 2. Ratlarda pamuk bilyeler (koton pellet) kullanılmak suretiyle deneysel
olarak oluşturulan kronik (proliferatif faz) enflamasyon üzerine Peltigera
rufescens’in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak
94
(DIC)’ın anti-enflamatuvar etkileri………………………………………………..
Tablo 3. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki katalaz (CAT)
enziminin aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME),
96
indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkileri. ……………………………...
Tablo 4. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki glutatyon
peroksidaz (GPx) enziminin aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol
98
ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkileri……………
Tablo 5. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki süperoksit
dismutaz (SOD) enziminin aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol
100
ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkileri……………
Tablo 6. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki glutatyon
(GSH) miktarları üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME),
102
indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkileri……………………………….
Tablo 7. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak
oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki lipit
peroksidasyonu (LPO) seviyeleri üzerine Peltigera rufescens’in metanol ekstresi
104
(PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC)’ın etkileri…………………….
Tablo 8. Peltigera rufescens’in metanol ekstresi (PRME)’nin total antioksidan
aktivitesinin, indirgeme gücünün ve fenolik bileşik miktarının karşılaştırılması…
106
VIII
KISALTMALAR
ADP
: Adenozin difosfat
AMP
: Adenozin monofosfat
ASA
: Asetilsalisilik asit
BSA
: Sığır Serum Albumin
CAT
: Katalaz
CAR
: Karragenin
CCl4
: Karbontetraklorür
CC3
: Triklorometil
COX
: Siklooksijenaz
cGMP
: Siklikguanozin monofosfat
COX
: Siklooksijenaz enzimi
DNA
: Deoksiribonükleik asit
DIC
: Diclofenac
GĐS
: Gastro Đntestinal Sistem
GPx
: Glutatyon peroksidaz
GR
: Glutatyon redüktaz
GSH
: Glutatyon
GST
: Glutatyon S-Transferaz
H2O2
: Hidrojen peroksit
.
HO
: Hidroksil radikali
HO2-
: Peroksil
LO
: Lipooksijenaz
LPO
: Lipit peroksidasyonu
LPS
: Lipopolisakkarit
IX
IG
: Đndirgeme gücü
IgE
: Đmmunglobulin E
IFN γ
: Đnterferon
IL
: Đnterlökin
IND
: Đndometazin
MDA
: Malondialdehit
MPx
: Miyeloperoksidaz
NAD+
: Nikotinamid adenin dinükleotid
NADPH
: Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat
.
NO
: Nitrik oksit
NO+
: Nitronyum iyonu
NO2-
: Azot protoksit
NO2
:Azot dioksit
NOS
: Nitrik oksit sentaz
cNOS
: Yapısal nitrik oksit sentaz
iNOS
: Đndüklenebilir nitrik oksit sentaz
eNOS
: Nitrik oksit sentaz
nNOS
: Nöronal nitrik oksit sentaz
NSAID
: Steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar
NBT
: Nitro blue tetrazolium
O2• –
: Süperoksit radikali
1
O2
: Singlet oksijen
PGE
: Prostaglandin
PMN
: Polimorfo nükleer
X
PUFA
: Polidoymamış yağ asiti
PRME
: Peltigera rufescens’in metanol ekstresi
RNA
: Ribo nükleik asit
.
: Alkoksil radikalleri
RO
.
ROO
: Peroksil radikalleri
ROS
: Reaktif Oksijen türleri
.
: Sülfenil
RSO
RSO2
.
: Tiyol peroksil radikali
TXA2
: Trombosit agregan ajan ve vazokonstrüktör
TNF α ve β
: Tümör nekrozis faktör
SAĐĐ
: Steroid antiinflamatuvar ilaçlar
SOD
: Süperoksit dismutaz
WHO
: Dünya Sağlık Teşkilatı
XI
ÖZET
Bu çalışmada, ratlarda karregenin (CAR) ile uyarılmış akut ve pamuk bilyeler
(Cotton Pellet) ile uyarılmış kronik enflamasyon modeli kullanılarak Peltigera rufescens adlı
liken türünden elde edilen metanol ekstresi (PRME)’nin in vivo anti-enflamatuvar etkisi
araştırıldı ve PRME’nin anti-enflamatuvar etkisi ticari anti-enflamatuvar ilaçlar olan
diclofenac ve indometazin’in anti-enflamatuvar etkileri ile mukayese edildi. Akut
enflamasyon deneylerinde PRME’ in 50, 100, 200 ve 400 mg/kg’lık dozları denenirken,
kronik enflamasyonda ise akut enflamasyonda en yüksek anti-enflamatuvar etkiyi gösteren
200 mg/kg doz, çalışma dozu olarak belirlendi. Akut enflamasyon çalışmaları PRME’nin
50, 100, 200 ve 400 mg/kg’lık dozlarının ile diclofenac ve indometazinin (25 mg/kg
dozlarda) karregenin inflamasyonunu dördüncü saatte sırası ile % 19.3, 31.6, 42.1, 38.6,
45.6 ve 47.4 oranında azatlığını göstermiştir. PRME’nin anti-enflamatuvar etkisi 200
mg/ kg doza kadar doza bağımlı olarak artmasına rağmen, 400 mg/kg dozunda antienflamatuvar
aktivitenin
azaldığı
dikkati
çekmektedir.
Kronik
enflamasyon
çalışmalarında ise PRME (200 mg/kg), DIC (25 mg/kg) ve IND (25 mg/kg)’ in sırasıyla
% 63.5, % 76.1 ve % 83.8 oranında anti-proliferatif etkiye sahip oldukları belirlendi.
Enflamasyon sürecinde rol oynayan önemli faktörlerden birisi de oksidadif
hasara sebep olan serbest oksijen radikalleri olduğu düşünülmektedir. Bu düşünceden
yola çıkarak tüm sıçan pençe dokularında lipit peroksidasyonu (LPO) düzeyi belirlendi.
Gerçektende, LPO seviyesi CAR ile uyarılmış enflamasyonlu pençe dokularında sağlıklı
doku ile mukayese edildiğinde oldukça yüksek düzeyde bulundu. PRME, DIC ve IND
tarafından enflamasyonun azaltıldığı dokularda ise LPO düzeyi CAR’ın aksine daha
düşük düzeyde olduğu tespit edildi. Canlı sistemlerde oksidadif hasara karşı süperoksit
XII
dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve indirgenmiş glutatyon
(GSH) gibi antioksidan savunma sistemi mevcuttur. Bu bilgilerden yola çıkılarak tüm
sıçan pençe dokularında yukarıda adı geçen antioksidan parametrelerin seviyesi de
belirlendi. CAR ile uyarılmış pençe dokularında SOD ve GSH seviyelerinin sağlıklı
doku ile mukayese edildiğinde düştüğü gözlendi. Bu sonuçlar bize CAR’ın antioksidan
savunma sistemini olumsuz etkileyerek LPO ‘ya sebep olduğunu göstermektedir. CAR‘lı
dokuların aksine PRME, DIC ve IND ile enflamasyonun azaltıldığı dokularda bu
antioksidanların seviyeleri daha yüksek düzeyde tespit edildi. Diğer taraftan CAR’ın
GPx aktivitesi üzerine anlamlı bir etkisi gözlenmemiştir. Bununla beraber, IND ve
PRME’nin 50 ve 100 mg/kg‘lık dozları çok az oranda da olsa GPx aktivitesini
artırmıştır. Đlginçtir ki, CAR CAT aktivitesini sağlıklı dokuya nazaran önemli oran da
yükseltmiştir. CAT enziminin aktivitesi anti-enflamatuvar ilaçlar (DIC ve IND)
tarafından yeniden azaltılırken, PRME’nin tüm dozları tarafından doza bağlı olarak ise
önemli oranda artırılmıştır.
Sonuç olarak, mevcut çalışma PRME’nin anlamlı bir anti-enflamatuar etkiye
sahip olmasının yanı sıra, enflamasyon ve enflamasyonun azaltılması sürecinde
oksidadif hasarın ve antioksidan savunma sisteminin de önemli rol oynadığını
göstermektedir.
XIII
SUMMARY
The effects of methanol extract of Peltigera rufescens on the activities of antioxidant
enzymes in experimental inflammated rats.
In this study, in vivo anti-inflammatory effect of methanol extract of the lichen
species Peltigera rufescens (PRME) was investigated in the carrageenan (CAR)-induced
acute, and cotton pellet induced chronic inflammation models and the anti-inflammatory
effect of PRME was compared to that of diclofenac (DIC) and indomethacin (IND) which
are commercial anti-inflammatory agents. 50, 100, 200 and 400 mg/kg doses of PRME were
tested in acute inflammation experiments, whereas 200 mg/kg dose of PRME, showed the
highest anti-inflammatory effect in acute inflammation, was selected as test dose in chronic
inflammation. In acute inflammation studies 50, 100, 200 and 400 mg/kg doses of PRME,
diclofenac (25 mg/kg) and indomethacin (25 mg/kg) decreased the carrageenan induced
inflammation by 19.3, 31.6, 42.1, 38.6, 45.6 and 47.4%, respectively. It is interesting to
find that the anti-inflammatory effect of PRME increases in a dose dependent manner up
to 200 mg/kg dose, whereas the anti-inflammatory activity decreases at 400 mg/kg dose.
In chronic inflammation studies, PRME (200 mg/kg), DIC (25 mg/kg) and IND (25
mg/kg) possessed 63.5%, 76.1% and 83.8% anti-proliferative effect, respectively.
It is thought that oxidative damage caused by reactive oxygen radicals play an
important role in the inflammation process. In the light of this consideration lipid
peroxidation (LPO) levels were determined in all rat paw tissues. Really, LPO levels in
inflammatory paw tissues induced by carrageenan were found to be very high when
compared to healthy paw tissues. However, in the paw tissues in which reduced
inflammation by PRME, DIC and IND, LPO levels were found at lower levels in
contrast to CAR groups. Living organisms possess an antioxidant defense systems
XIV
including superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx),
and reduced glutathione (GSH). In the light of these data, the levels of antioxidant
parameters mentioned above, were also investigated in all rat paw tissues. A decrease
was observed in the SOD and GSH levels in the car-induced paw tissues when compared
to healthy tissues. These results show that CAR causes a lipid peroxidation by inhibiting
the antioxidant defense system. In contrast to CAR treated tissues, the levels of these
antioxidants were higher in the paw tissues treated with PRME, DIC and IND. On the
other hand, no significant effect of CAR on GPx activity was determined. Nevertheless,
25 mg/kg dose of IND and 50 and 100 mg/kg doses of PRME increased GPx activity
even though at very low ratios. It is interesting that CAR strongly increased the CAT
activity in comparison to healthy paw tissues. CAT enzyme activity was reduced by antiinflammatory drugs (DIC and IND), whereas it was increased by all doses of PRME in a
dose dependent manner.
In conclusion, the present study showed that, besides PRME possesses a
significant anti-inflammatory effect, oxidative damage and antioxidant defense system
plays an important role in the inflammation process and/or to decrease inflammation.
1
1.GĐRĐŞ VE AMAÇ
Enflamasyon organizmada enfeksiyöz, fiziksel, kimyasal ve diğer etkenlerin neden
olduğu doku hasarına karşı sellüler ve hümoral düzeyde oluşan güçlü ve abartılmış bir
fizyolojik cevaptır1-3. Böyle bir reaktif cevabın amacı, hasarlayıcı etkeni ve ortaya çıkan
ürünleri ortadan kaldırmak ve zararlıyı olduğu yerde sınırlı tutarak kontrol sağladıktan
sonra,
hasarlanmış
dokunun
tamir
ve
yenilenmesini
mümkün
kılmaktır1-3.
Enflamasyonun oluşmasında histamin, serotonin, bradikinin, nitrik oksit, lipooksijenaz
ürünleri, sitokinler, serbest oksijen radikalleri, lizozomal enzimler ve PG’ler gibi
enflamasyon mediyatörlerinin rolü bilinmektedir4-7. Enflamasyon akut ve kronik olmak
üzere iki şekilde sınıflandırılır.
Akut enflamasyon kısa sürelidir, birkaç dakika ile birkaç gün sürer. Akut
enflamasyon
eksudasyon
(vasküler)
ve
lökosit
akümülasyonu
(hücresel)
ile
karakterizedir1,8,9. Enflamasyonun bu fazında çok sayıda faktör rol oynar ve bu
faktörlerden bir grubununda antioksidant sistem olduğu düşünülmektedir.
Kronik enflamasyon aktif iltihap ve iyileşme süreçlerinin birlikte görüldüğü uzun
süreli
bir enflamasyon
olarak
kabul
edilir3,10,11.
Kronik
enflamasyon
inatçı
enfeksiyonlar12–14, potansiyel toksik ajanlara uzun süre maruz kalma ve otoimmün
hastalıklar sırasında oluşabilir.
Akut
enflamasyonu
kronik
enflamasyon
izleyebilir.
Akut
enflamasyon
oluşumundan çok kısa bir süre sonra proliferatif hücrelerin oluşması ile enflamasyon
kronikleşerek devam eder; bu hücreler yaygın veya granüloma şeklinde olur15.
Antiproliferatif etki, ilaçlar tarafından kollajen liflerinin oluşumunun engellenmesi,
mukopolisakaridlerin supresse edilmesi şeklindedir16. Kronik enflamasyonda nötrofil
infiltrasyonu ve eksudasyondan daha ziyade monosit infiltrasyonu ve fibroblast
2
proliferasyonu rol oynar. Aktive edilmiş monositler ve makrofajlar; antitümör,
antimikrobik ve patojenlere karşı fagositoz fonksiyona sahip kan hücreleridir17.
Hem akut hemde kronik enflamasyon araştırmalarında çeşitli deneysel modeller
geliştirilmiştir. Karragenin enflamasyon modeli, maddelerin enflamasyonun akut fazına
etkilerini araştırmak için, cotton pellet granuloma testi ise enflamasyonun kronik fazına
etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır18,19.Akut enflamasyonun oluşmasında
eikozanoidlerin (araşidonik asit metabolitleri) rolü bilinmektedir20. Steroidal ve
nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaçların etki mekanizması enflamasyonun kimyasal
mediyatörlerinin sentezini inhibe etme esasına dayanmaktadır21. Steroidal antienflamatuvar ilaçlar olarak bilinen glukokortikoidler adrenal kortekste sentez edilirler.
Bazı çalışmalar ilaçların anti enflamatuvar etki mekanizmasında adrenal korteks
hormonlarının rolünün olduğunu göstermiştir16.
Likenler, mantar ve alglerin bir araya gelerek teşkil ettikleri simbiyotik (ortak
yaşayan) bir bitki grubudur. Günümüzde 20000 den fazla alt türe sahip olduğu bilinen
likenlerin, ülkemizdeki florası henüz tamamlanmamış olup bölgemiz ile ilgili yapılan
çalışmalar ise son derece azdır22-24. Likenlerin çok sayıda madde sentezlemekte oldukları
ve bu maddelerin çoğunun biyolojik aktivitelere sahip oldukları tespit edilmiştir25–30.
Liken ve liken metobolitlerinin gösterdiği aktivitelerden bir kısmı; antiviral31,
antibakteriyel32–37, antitümöral38–40, allerjen41, bitki büyüme inhibitörü42, antiherbivor43,
enzim inhibitörü44–50 şeklinde sıralanabilir. Parfüm sanayinde27, kozmetik krem
sanayinde51. Hava kirliliğinin belirlenmesinde52–54 faydalanılan likenler pek çok ülkede
de besin olarak kullanılmaktadır28. Likenlerin üstün yaşam mukavemeti kendi
bünyelerinde ürettikleri çok özel moleküllerden ileri gelmekte27 ve yapılan biyolojik
aktivite
ölçümlerinde
liken
metabolitlerinin
her
geçen
gün
yeni
özellikleri
3
keşfedilmektedir. Üstelik bu maddelerin genellikle sitotoksik özelliklerinin az olması,
ilaç özelliklerinin araştırılmasında önemli yer tutmaktadır.
Literatürde liken ekstrelerinin ve liken metabolitlerinin anti-enflamatuvar
etkilerinin incelendiği çok az sayıda araştırmaya rastlanmıştır55,56. Anti-enflamatuvar
etki sürecinin mekanizmaları hakkında ise bilgiler oldukça sınırlıdır. Bu açıdan
bakıldığında bu çalışma enflamasyonun önlenmesinde oksidatif süreç üzerinde bir liken
türü olan Peltigera rufescens (Weis) Humb. kullanılarak elde edilen metanol
ekstraktlarının etkili olup olmadığının tespit edilmesi açısından önemli bir eksikliği
tamamlayacaktır.
Bu
araştırmada;
sıçanlarda
karragenin
ile
oluşturulan
akut
enflamasyon ve pamuk bilyeler ile oluşturulan kronik enflamasyon modelleri kullanarak
bir liken türü olan Peltigera rufescens’den elde edilen metanol ekstraktının’nın invivo
antienflamatuvar etkileri ve bu etkilerin antioksidant mekanizmalar [CAT, GPx ve SOD
enzimleri, GSH ve lipit peroksidasyon (LPO) düzeyleri] ile ilişkisi tespit edilmeye
çalışıldı.
4
2.GENEL BĐLGĐLER
2.2.LĐKENLER
Likenler, en az iki organizmadan (fungus ve alg) oluşan bitkilerdir. Fungus, kendi
karbonhitratını üretemez, fotosentez partneri olan yeşil alg ve cyanobakterilerden hazır
olarak alırlar. Bunlar da ekosistem için çalışır ve fungus için glukoz üretirler. Đki
organizma da tek başlarına yaşayamayacakları yerlerde beraber kolonize olup
yaşayabilirler. Likenler, dünyada ve ülkemizde çok eski zamanlardan beri halk
hekimliğinde birçok hastalığın tedavisinde kullanılmıştır. Dünya Sağlık Örgütünün
(WHO) birçok ülkedeki yayınlara dayanarak hazırladığı bir araştırmaya göre, dünyada
tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin toplam tür sayısı 20 000 civarındadır22,23,24.
Ülkemizde 9000’e yakın bitki türünün doğal olarak yetiştiği ve bunların kimyasal
içerikleri hakkındaki çalışmaların yok denecek kadar az olduğu da vurgulanmaktadır57.
Bitkisel organizmalar içerisinde incelenen likenler de antik çağlardan beri tıbbi
özellikleri itibariyle değerlendirilmişlerdir58. Likenler yavaş üremelerinden kaynaklanan
rekabette zayıf kalma dezavantajlarını, ürettikleri özel maddeler sayesinde telafi ederler.
Özellikle aromatik yapılı sekonder metabolitler, onların en güçlü antagonistik
maddelerini oluşturmaktadır. Diğer taraftan likenlerin boya ve parfümeri sanayisinde
ham madde olarak27,59,60 ve hava kirliliği indikatörü olarak52-54,61 kullanıldıkları da
kaydedilmiştir. Her ne kadar likenlerin global krizlerde besin kaynağı olarak
kullanılabileceği teklif edilmişse de, doğal yolla üremeleri çok yavaş olduğundan, bu tür
bir değerlendirmenin ekonomik olmadığı ifade edilmiştir62.
Likenler, yeterli nemin bulunduğu kızgın çöllerde, arktik ve antartik bölgelerde
yüksek dağların dondurucu soğuklarında, diğer bitkilerin yaşayamadığı taşlar, verimsiz
5
topraklar, kuru ağaç kabukları ve kiremitler üzerinde dahi yetişebilmektedirler. Bu
özelliklerinden dolayı dünyanın hemen her yerinde yayılış gösterdikleri rapor
edilmiştir30. Türkiye florası likenler bakımından oldukça zengin olmasına rağmen
taksonomik, floristik ve kimyasal liken metabolitleri üzerinde çalışmalar son yıllarda
başlamıştır. Avrupa ülkelerinde, likenlerin 16. yüzyıldan beri, çeşitli hastalıkların
tedavisinde dekoksiyon veya infüzyon şeklinde kullanıldığına dair birçok kayıt
bulunmaktadır36,38.
Đkinci Dünya Savaşı’ndan sonra mevcut antibiyotiklerin azlığı üzerine, likenler
üzerinde antimikrobiyal araştırmaların yapılmasına başlanmıştır. Likenlerde bulunan
antimikrobiyal etki, yapılarında bulunan liken asitlerden ileri gelmektedir. Farklı liken
türlerinden izole edilmiş protolikesterinik asit, pulvinik asit türevleri, depsid grubundan
evernik, olivetorik asit, tridepsid grubundan giroforik asit, depsidon grubundan fisodik,
lobarik, fumarprotosetrarik asitler ile dibenzofuran türevlerinden usnik asitin
antimikrobiyal etkileri saptanmıştır63.
Likenlerde bulunan maddelerin çoğu asit özelliği gösterdiği için bunlara
karakteristik liken asitleri denilmektedir. Likenlerin kayaları parçalama özelliğini
sentezledikleri bu asitler vasıtasıyladır. Likenlerin bu asidik maddeleri %1–5 oranında,
çoğu zaman da %25 oranında içermeleri bu maddelerin izolasyonunu kolaylaştırmakta,
dolayısıyla da likenlerin bu yönüyle tohumlu bitkilerden daha fazla önem kazanmasına
neden olmaktadır24. Uzun zamandır hastalıkların önlenmesinde kullanılan likenlerin
iyileştirici
özelliklerinin,
yapılarında
bulunan
asitlerden
kaynaklandığı
düşünülmektedir64. Liken primer metabolitleri yalnız algler tarafından fotosentezle
sentezlenmektedir. Likenlere özgü çeşitli polisakkaritlerin yanı sıra çeşitli amino asit,
amin ve proteinler de likenlerden izole edilmiş primer metabolitlerdir65.
6
Likenler tarafından sentezlenen alifatik ve aromatik bileşikler ise sekonder
metabolitlerdir. Günümüze kadar 300’den fazla sekonder metobolit saflaştırılmış olup
yapısı spektroskopik yöntemlerle aydınlatılarak karakterize edilmiştir25,26,66.
2.1.1. Peltigera wild.
Bu genusa ait türlerde tallus yapraksı ve rozet şeklindedir. Loplar yuvarlak ya da
kısmen uzamış kenarları girintili çıkıntılıdır. Thallusun rengi parlak yeşil, mavimsi-gri,
gri-kahverengi, ya da kahverengi, düz, hafif dalgalı mat ya da parlak olabilir. Keçimsi ya
da unsu, kenarlar tam ya da az çok loblu ya da yapraksı, schizidia ya da soralialı alt
yüzey korteksli değil yoğun olarak ağsı - keçemsi yapılıdır. Açıktan koyu damarlı
yapıya kadar bu damarlar bariz rhizinlidirler. Cehalodia mevcut olduğu zaman bu cinse
ait türlerin üst ya da alt yüzeylerinde yeşil alg içeren noscos türü schizidia ya da soralialı
alt yüzey korteksli değil yoğun olarak ağsı - keçemsi yapılıdır. Açıktan koyu damarlı
yapıya kadar bu damarlar bariz rhizinlidirler. Cehalodia mevcut olduğu zaman bu cinse
ait türlerin üst ya da alt yüzeylerinde yeşil alg içeren noscos türü vardır. Cortex yalancı
parankimalıdır. Fotobiont mavi yeşil alg (noscos) ve chlorococcoid (coccomyxa).
Medulla beyaz az çok gevşekçe örülmüş hifli yapıda ascomata apotesyumludur. Bu
apotesyum semer şeklindedir. Kimyasal olarak 6-diagnostic hopane triterpanoitler ve
tridepsitler içerirler67. Ekolojik olarak çıplak topraklar üzerinde ya da kısa püskül
şeklinde yosunlu ağaç gövdeleri ve kütükler üzerinde bulunurlar67.
2.1.2. Peltigera rufescens (Weis) Humb.
Açık güneşli alanları seven bir liken türüdür. Bu liken morfolojisi ve rengi ile
ekstrem sıcaklık şartlarına dayanıklıdır. Öyle ki maksimum sıcaklıklar yazın +50
7
dereceyi, kışın –50 dereceyi bulabilir. Bu kararsız mevsimsel sıcaklık değişimleri
Peltigera rufescens’in fotosentetik sıcaklığının mevsimsel olarak optimum şartlarda
tutulmasını sağlar68. Bu yüzden; Peltigera rufescens’in tallusu mat görünüşlü, gri veya
kahverengi renkte: büyük yapraksı yapıdadır. Üst yüzey tomentöz yapıda; lob uçları kal
Şekil 1. Peltigera rufescens (Weis)Humb.un doğal ortamında çekilmiş resimleri.
kık ve kırılgandır. Alt yüzeydeki damarlar dar ve birbiriyle bağlantılıdır. Rizinler çok
dallanmıştır. Apotesium genellikle esmer şekildedir. Çoğunlukla kuru ve kalkerli
topraklarda ve ağaç diplerinde nadiren de silisli kayalar üzerinde bulunur.
Arktik’ten Akdeniz Havzası’nın güneyine kadar yayılış göstermektedir69. Bu liken
türünün büyümesinde ısı, ışık ve nem etkilidir70. Peltigera rufescens Doğu Karadeniz
8
ormanlarında ve Türkiyenin birçok bölgesinde bulunmaktadır. Bu likenin sert iklime
sahip Erzurumun Oltu Bölgesinde de bulunduğu rapor edilmiştir69.
2.2. ENFLAMASYON
Enflamasyon
çok
basit
olarak
lokalize
lökosit
akümülasyonu
şeklinde
tanımlanabilse de, gerçekte çeşitli endojen ve eksojen uyarıların vaskülarize dokularda
oluşturduğu
kompleks
savunma
mekanizmasıdır1,2.
Đnflamasyon
organizmada
enfeksiyöz, fiziksel, kimyasal ve diğer etkenlerin neden olduğu doku hasarına karşı
sellüler ve hümoral düzeyde oluşan güçlü ve abartılmış bir fizyolojik cevaptır1-3.
Enflamasyon ilk kez M.S. I. yüzyılda yaşamış olan Celsus tarafından, kızarıklık,
sıcaklık artışı, ağrı ve şişme ile tanımlanmış olup; sonraları fonksiyon kaybı da bu
özelliklere eklenmiştir71,72. Böyle bir reaktif cevabın amacı, hasarlayıcı etkeni ve ortaya
çıkan ürünleri ortadan kaldırmak ve zararlıyı olduğu yerde sınırlı tutarak kontrol
sağladıktan sonra, hasarlanmış dokunun tamir ve yenilenmesini mümkün kılmaktır1-3.
Enflamasyonlarla ilgili birçok sınıflandırma olsa da kabul gören sınıflandırma
enflamatuvar prosesin süresi göz önüne alınarak yapılan sınıflandırmadır. Bu
sınıflandırmaya göre enflamasyon akut ve kronik olmak üzere ikiye ayrılır71,73.
2.2.1. Akut enflamasyon: Akut enflamasyon kısa sürelidir, birkaç dakika ile birkaç gün
sürer. Akut enflamasyon eksudasyon (vasküler) ve lökosit akümülasyonu (hücresel) ile
karakterizedir1,8,9.
Vasküler Değişiklikler: Akut enflamatuvar süreçte kan damarları reaksiyonun
merkezini oluşturur. Akut enflamasyonun üç temel komponenti bulunmaktadır;
9
1. Vasküler çap değişikliği (vazodilatasyon), kan akımında artış (konjesyon-staz).
2. Mikrovasküler sahada yapısal değişiklikler, permabilite artış74.
3. Lökositlerin endoteli geçerek zedelenen dokuda toplanması75.
Enflamasyonun en erken fazında çok kısa süreli refleks vazokonstrüksiyon olur76.
Bunu takiben arteriol kapiller yatak ve venüllerde oluşan vazodilatasyon meydana
gelir76-78. Vazodilatasyon artışı bölgesel kan akımını artırarak, intravasküler hidrostatik
basıncı yükseltir. Bu basınç yükselmesi stazı ortaya çıkarır. Staz sonucu ekstravasküler
dokuya proteinden zengin sıvı geçerek ödemi oluşturur2,73,74. Staz sonucu doku
aralığında biriken bu sıvının o bölgede birikmiş olan toksik ve irritan maddelerin dilüe
edilmesinin yanı sıra, lökosit ve kompleman faktörlerinin taşınmasında da önemli rolleri
vardır71,73.
Hücresel Değişiklikler: Akut enflamasyonun ikinci ayağını oluşturan lökosit hareketleri
üç aşamada oluşur. Marginasyon denen ilk aşamada lökositler damar içinde perifere
doğru yer değiştirerek vasküler endotelle karşı karşıya gelirler. Adezyon kuvvet denilen
ikinci aşamada lökositler endotele sıkı bir şekilde yapışırlar. Migrasyon aşamasında ise
lökositler kemotaktik ajanlar yardımıyla endotel dışına hasarlı bölgeye göç
ederler71,73,79,80. Lökositler vasküler lümenden ekstravasküler boşluğa çıkarak, hasarlı
bölgede mikroorganizmaları öldürüp, nekrotik dokuları ve yabancı antijenleri parçalayıp,
kimyasal mediatörleri ve oksijen radikallerini serbestleştirerek doku hasarına yol
açar71,81,82. Lökositlerin bu hakimiyeti ilk 6–24 saat sürerken, takip eden 24–48 saatte bu
tablo monositlerin lehine dönüşür83.
10
Enflamasyonun Kimyasal Mediatörleri:
a-Vazoaktif Aminler
Histamin: Histamin biyolojik sistemlerde belirli hücrelerde sentez edilip depolanan
endojen aktif maddedir. Özellikle vücudun iç kısımlarının dış ortamla temas ettiği
bölgelerde, (akciğer, gastrointestinal sistem, deri gibi) histamin miktarı nisbeten
yüksektir9,84.
Kanda histaminin ana deposu bazofil lökositlerdir. Histaminin en zengin kaynağı
bağ dokusu mast hücreleridir. Mast hücreleri histamini sentezler ve salgı granüllerinde
depo eder. Antijen-antikor kompleksi, ısı, soğuk, toksinler, travma ve kimyasal ajanlar
histaminin salınmasına yol açar. Salgılanan histamin akut hipersensitivite ve allerjik
cevapta önemli rol oynar. Histaminin kardiyovasküler sistemdeki en önemli etkisi
(vazodilatasyon nedeniyle) arteryal kan basıncını düşürmesidir.
Histaminin damarlardaki etkisi, kapiller permabiliteyi artırarak hücre dışı alana
plazma, protein ve sıvı sızmasını sağlaması şeklindedir. Lenf dolaşımındaki sıvı miktarı
ve protein içeriğindeki artışla ödem oluşur76,85.
Artmış histamin endotelial hücreleri kasar. Bu durumda da plazma proteini ve
plazma sıvısı buradan serbestçe geçer. Endotelde bulunan ve bir adhezyon molekülü
olan P selektin’ in varlığı sayesinde lökosit migrasyonu artırılır86. Cilt içine ufak dozda
histamin injekte edilmesi Lewis’in üçlü cevabı denilen bir reaksiyonun oluşmasına
neden olur20. Bu reaksiyonda histamin tarafından damarların genişletilmesi, kapiller
permeabilitesinin arttırılması ve afferent sinir uçlarının stimüle edilmesi rol oynar76,85.
Đnjeksiyon yerinde önce bir kızarıklık ve daha sonra kan sıvısının sızması sonucu ödem
papülü oluşur. Bu kızarıklık ve onun yerini alan papül, üçlü cevabın iki öğesini
oluşturur. Üçüncü öğe ise papül çevresinde oluşan nisbeten geniş bir alana yayılan ve dış
11
sınırı düzensiz olan hale şeklindeki kızarıklıktır84. Bu kızarıklık akson refleksi sonucu
cilt damarlarının genişlemesine bağlıdır.
Histamin damar dışındaki diğer düz kasları nadiren gevşetir, genellikle kasar.
Vazodilatatör etkiden H1 ve H2 reseptörleri, permeabilite artışından ise sadece H1
reseptörleri
sorumludur.
Kasılma
çoğunlukla
H1,
gevşeme
ise
H2
reseptör
aktivasyonuyla olur. Đnsan bronş düz kaslarında H1 reseptörlerinin kasıcı etkileri
baskındır. Barsak kaslarında histamin cevapları bölge ve türe göre değişir. Fakat klasik
etki kasılmadır84. Mesane, üreter, safra kesesi, iris ve çoğu diğer düz kas histamin
tarafından çok az etkilenir. Histamin çeşitli sinir uçlarını uyarır. Bu yüzden
epidermisden salındığında kaşıntıya yol açar, dermiste ağrı hissi uyandırır. Periferik
nöronlarda histamin reseptörleri genellikle H1 tipindedir.
Serotonin: Serotonin ya da diğer adıyla 5-HT (5-Hidroksitriptamin) temel bir aminoasit
olan triptofandan sentezlenir87,88. Serotonin sentezinin başlangıç ve hız kısıtlayıcı enzimi
triptofan hidroksilazdır87. Yetişkin bir insanda ortalama 5-10
mg serotonin
bulunmaktadır. Đntestinal mukozada bulunan enterokromaffin hücrelerde lokalize
olmuştur. Serotonin burada düz kasları stimüle ederek gastrointestinal motiliteyi
arttırır88. Kandaki tüm serotonin trombositlerde depolanır. Trombositlerde serotonin
sentez edilmez, trombositler serotonini plazmadan alırlar ve depolarlar. Trombosit
agregasyonu ile salınımı uyarılır2. Serotoninin lokal enjeksiyonu o bölgede
enflamasyona yol açar89.
b-Plazma Proteazları
Kompleman Sistemi: “Kompleman”, çoğunluğu enzim prekürsörü olan toplam 20
kadar proteini kapsayan genel bir tanımdır. Normalde bu proteinlerin tümü plazma
12
proteinleridir ve kapiller damardan dokuya sızan plazmada da bulunurlar. C1’den C9’a
kadar
sıralanan
komponentler
normalde
plazmada
inaktif
halde
bulunurlar.
Aktivasyonları klasik ve alternatif olmak üzere iki yolla olur88,90,91. C3’ün ayrışması en
kritik aşama olup, her iki yolda bu noktadan sonra ortak aktivasyon şeklini izler.
Antijen-antikor kompleksleri klasik yolu, mikrobial yüzeyler ve polisakkaritler ise
alternatif yolu aktive ederler.
1.Opsonizasyon ve Fagositoz: Kompleman reaksiyon zincirinin bir ürünü olan C3b,
nötrofil ve makrofajların fagositozunu uyarır. Bu, hücrelerin antijen-antikor kompleksini
bağlamış olan bakteriyi içlerine almalarını sağlar. Bu işlem opsonizasyon adını alır ve
yok edilen bakteri sayısını yüzlerce kat artırabilir1,2,10,90,91.
2.Lizis: Kompleman reaksiyon zincirinin en önemli ürünlerinden biri litik kompleks adını
alan, kompleman faktörlerinden birçoğunun oluşturduğu ve C5b6789 olarak gösterilen
moleküler komplekstir. Bu kompleksin bakteri ya da diğer istilacı organizmaların
membranlarını direkt yırtma etkisi vardır1,2,10,90,91.
3.Aglütinasyon: Kompleman ürünlerinin istilacı organizmanın yüzeyini değiştirerek
birbirlerine yapışmalarını ve aglütinasyonlarını kolaylaştırıcı etkidir1,2,10,90,91.
4.Virusların Nötralizasyonıı: Kompleman enzimleri ve diğer kompleman ürünlerinin
bazı viruslerin yapılarına saldırarak, onları avirulan hale getirmesidir1,2,10,90,91.
5.Kemotaksi olayı: C5a fragmanı nötrofil ve makrofajların kemotaksisini ve böylece çok
sayıda fagositin antijenik ajanın bulunduğu bölgeye göçmesini sağlar1,2,10,90,91.
6.Mast Hücresi ve Bazofil Aktivasyonu: C3a, C4a ve C5a mast hücresi ve bazofilleri
aktifler. Aktiflenen bu hücreler lokal sıvılara histamin, heparin ve diğer maddeleri
salgılarlar. Bu maddelerin salgılanması bölgesel kan akımını, dokulara sıvı ve plazma
13
proteinlerinin
sızmasını
artırır
ve
antijenik
ajanın
hareketsizleştirilmesini
ve
inaktivasyonunu sağlar.
Enflamatuvar Etkiler: Mast hücreleri ve bazofilleri uyararak oluşturdukları
enflamatuvar etkilerinin yanısıra, diğer birçok kompleman ürününün de lokal
enflamatuvar etkisi vardır. Bu kompleman ürünleri artmış olan kan akımını daha da
artırarak kapillerlerden dokuya protein sızmasını sağlarlar. Sızan bu proteinler doku
aralıklarında pıhtılaşarak saldırgan organizmaların dokular arasında yayılmasının
engellenmesini sağlar.
Pıhtılaşma Sistemi: Koagülasyon sıvı olan kanın, pıhtı ya da trombus denilen jel
kıvamlı katı bir maddeye dönüşmesidir. Pıhtılaşma plazma proteinlerinden fibrinojenin
fibrine dönüştüğü zaman gerçekleşir. Fibrinojen karaciğer tarafından yapılan ve normal
insanların serumunda her zaman bulunan çubuk şeklinde bir proteindir92. Fibrin
başlangıçta gevşek ağ gibidir. Oluştuktan hemen sonra kovalent çapraz bağların
oluşmasıyla kuvvetlenir. Bu olay faktör XIII denilen bir plazma enzimi sayesinde
gerçekleşir. Fibrinojen kanda her zaman bulunur. Trombin normalde kanda bulunmaz,
yalnızca pıhtılaşma olayı uyarıldığı zaman oluşur92. Uyarılmadan önce kanda protrombin
denilen inaktif şekilde bulunur. Kan damarının yaralandığı bölgede enzimatik olarak
trombine çevrilir. Trombin de faktör XIII’ü aktive eder. Pıhtılaşmaya bırakılan kan
örneğinde pıhtılaşma sonrası ayrılan sıvıya serum denir11.
Serum plazmadan farklı olarak fibrinojen ve bazı pıhtılaşma faktörlerini kapsamaz.
Bunun dışında bileşimi plazma ile aynıdır. Pıhtılaşma olayında rol oynayan trombin
14
lökosit adezyonunu kuvvetlendirir. Fibrinojenin fibrine dönmesi sırasında oluşan
fibrinopeptidler de vasküler permabiliteyi artırırken lökositler için de kemotaktiktirler.
Kinin Sistemi: Hageman faktörün aktivasyonu sonrası oluşan bir sistemdir.
Đnflamatuvar reaksiyonlarda önemli rolleri vardır2,93,94. Kinin sisteminin aktivasyonu
dolaşımdaki yüksek moleküler ağırlıklı kininojenin bradikinine dönüşmesini sağlar.
Bradikininde histamine benzer şekilde vasküler permeabiliteyi artırır, arterioler
dilatasyon yapar. Ekstravasküler düz kas kasılmasına yol açar95. Ayrıca deriye enjekte
edildiğinde ağrı oluşturur96,97. Bradikininin etkisi kısa sürelidir. Çünkü plazma ve
dokularda bulunan kininazlarla hızlı bir şekilde parçalanır. Bradikininler, substans P, ve
prostanoidler ağrı yolaklarını stimule ederler ve enflamasyonun dolor' u oluşur. Kininler
etkilerini Bı ve B2 olarak adlandırılan iki tip reseptörle oluştururlar93,97,98. Bı reseptörleri
doku hasarı ve enflamasyon gibi patolojik durumlarda indüklenirken, normal dokularda
bulunmaz96. B2 reseptörleri afferent sinir uçlarında ve SSS’de bulunur, ağrı
reseptörlerinin duyarlılığını artırı96,99,100. Kininler vücutta bulunan enflamasyon veya
doku hasarında, aktifleşen çeşitli hücrelerden serbest radikaller ve pro-enflamatuvar
etkili maddelerinin de salınımına katkı sağlarlar. Mast hücrelerinden histamin salınımını
da artırırlar94.
P Maddesi: P maddesi SSS’de yaygın olarak bulunur101. P maddesinin periferden gelen
ve nosiseptif uyarıları santral sinir sistemi (SSS)'ne taşıyan primer duyusal nöronlarda,
omuriliğin arka boynuzunda ve duyusal trigeminus çekirdeğindeki akson uçlarında
glutamat ile birlikte bulunduğu gösterilmiştir. P maddesi SSS'de ağrının birinci nörondan
ikinci nörona taşınmasında rol oynar. Yapılan birçok deneysel çalışma P maddesinin
15
enflamatuvar cevaba katkısı olduğunu desteklemektedir102,103. Lewis’in üçlü cevabında
vazodilatasyon yapması104 ve ayrıca karrageninle oluşturulan enflamasyon modelinde
(sıçan pençesinde yapılan ölçümlerde 15. dakika ve sonrasında) P maddesinin artması bu
kanıtı desteklemektedir78.
c-Araşidonik Asit Metabolitleri (AA): Araşidonik asit poliansatüre bir yağ asidi olup
hücre membranındaki fosfolipidlerde önemli bir miktarda bulunur. Sellüler fosfolipaz
aktivasyonuyla membran fosfolipitlerinden ortaya çıkar105. Hücresel fosfolipazlar
mekanik, kimyasal, fiziksel uyarı veya C5a gibi iltihabi mediatörlerce aktive edilirler.
AA metabolizması iki major yoldan biri şeklinde ilerler. AA metabolizmasından
kaynaklanan ürünler başta enflamasyon, ateş, ağrı ve hemostaz olmak üzere, birçok
biyolojik olay üzerine etkilidir106,107. Bu ürünler kısa zamanlı hormonlar olarak
değerlendirilirler107. Yapıldıkları yerde lokal olarak etki ederler ve daha sonra çok hızlı
bir şekilde spontan veya enzimatik olarak yok edilirler. 1930 yılında Von Euler prostat
bezinde bulduğu bir maddenin düz kasları kastığını farketmiş ve bulduğu yerden
esinlenerek bu maddeye “Prostaglandin (PG)” adını vermiştir108.
Araşidonik asit metabolitlerine Eikozanoidler de denir. Eikozanoidler prekürsör
yağ asitlerinden oluşumlarında rol oynayan enzim türüne göre; siklooksijenaz ürünleri,
lipooksijenaz ürünleri ve 450 monoksijenaz ürünleri şeklinde 3 ana gruba ayrılır21,109.
Siklooksijenaz Yolu Ürünleri: Burada PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2 ve tromboksan
(TXA2) bulunur. Araşidonik asit COX ile siklik endoperoksitlere (PGG2, PGH2)
dönüşür110,111. PGH2 çok labil bir madde olup diğer biyolojik ürünlerin öncüsüdür.
Prostaglandin E, F ve D'ler doğrudan doğruya siklik endoperoksid ara ürünlerinden
16
oluşurlar ve bunlara primer PG'ler adı verilir112,113. Primer PG'ler enflamasyonda anahtar
mediatör olarak rol oynarken, bunların her biri spesifik bir enzim etkisi ile oluşur. Bu
enzimlerin
bazılarının
dokulardaki
dağılımı
sınırlıdır.
Örneğin
trombositlerde
tromboksan sentetaz enzimi vardır. Dolayısıyla güçlü bir trombosit agregan ajan ve
vazokonstrüktör olan TXA2, ana prostaglandin ürün olarak bu hücrelerde bulunur114,115.
Diğer yandan endotel tromboksan sentetaz içermez. Ancak PGI2 oluşumunu sağlayan
prostasiklin sentetaz içerir. PGI2 güçlü bir trombosit agregasyon inhibitörü ve ayrıca
önemli bir vazodilatatördür114,115. PGD2, siklooksijenaz yolunun mast hücrelerindeki
ana metabolitidir. PGE2, PGF2 ile birlikte bulunur. PGD2 vazodilatasyona neden olur ve
ödemi artırır. Aspirin ve ibuprofen gibi nonsteroid anti-enflamatuvar ilaçlar (NSAEĐ)
proksimal siklooksijenaz aktivitesini inhibe ederler. Bu anti-enflamatuar ajanlardan
lipooksijenaz yolu etkilenmez.
Son
yapılan
çalışmalarda
siklooksijenazın
(COX)
iki
formu
olduğu
gösterilmiştir114,116. COX–1 ile COX–2 arasındaki en önemli fark COX–1' in esas olarak
konstitütif, COX-2'nin ise indüklenebilir olmasıdır117. Bu iki enzim %60 oranında,
homolog aminoasit dizilişine sahip olup farklı genler tarafından kodlanmaktadır106.
Đlginç olarak gastrik mukozada COX–1 mevcutken, COX–2 yoktur. Bu bölgede mukozal
prostaglandinler COX–1 etkisiyle oluşurlar ve aside bağlı hasarı engellediklerinden
koruyucudurlar. NSAEĐ ve aspirin, siklooksijenazı inhibe ederek prostaglandin sentezini
bloke edip, enflamasyonu azaltırken, gastrik ülsere de zemin hazırlar. Anti-enflamatuvar
etkilerini korumak ve gastrik mukoza üzerindeki zararlı etkilerinden kaçınmak için
birçok oldukça seçici COX–2 inhibitörleri geliştirilmiştir. Bunlardan gastrik mukoza
ülserasyonu oluşturmadan anti-enflamatuvar etkiler beklenmektedir. COX-1 ayrıca
damar endotelinde, trombositlerde, böbrek glomerül ve tubulüs hücrelerinde ve vezikula
17
seminaliste fazla miktarda bulunur. COX-2’nin başta endotoksinler, interlökin 1α,
interlökin–6 ve tümör nekroz faktörα olmak üzere enflamasyona neden olan değişik
faktörlerce (bazı büyüme faktörleri, trombosit aktive edici faktör, endotelin, koryonik
gonadotropin, serotonin ve ayrıca mekanik bir uyarı olan sürtünme stresi) indüklenir. Bu
nedenle COX-2’nin olması, enflamasyon gibi patolojik olaylardan sorumlu olan
PG’lerin
sentezlenmesinde
rol
aldığını
düşündürmektedir21,106,118.
COX-2’nin
sentezlenmesinden sorumlu olan gen glukokortikoidler ile baskılanabilir. Sadece
dışardan verilen glukokortikoidler değil bazal glukokortikoidlerin de COX–2’yi süprese
edebildikleri gösterilmiş olup, COX–1 geni için bu sözkonusu değildir119.
PGE1: Đntradermal injeksiyonu eritem ve hiperaljezi oluşturur. Karragenin, histamin,
bradikinin
ile
oluşan
ödematöz
cevabı
potansiyelize
eder.
Pirojen
olduğu
söylenmektedir.
PGE2: Hiperaljezi oluşturur. Çok düşük dozlarda bile olsa karegenin, histamin,
bradikinin ile oluşan ödematöz cevabı potansiyelize eder. Düşük dozlarda diğer
enflamasyon mediatörlerinin etkilerini arttırırken yüksek dozlarda direkt enflamatuvar
etki oluşturur.
PGG2: Etkileri PGE2’ye benzemektedir.
18
Stimulus
Hücre membran harabiyeti
Fosfolipidler
Kortikosteroidlerr
NSAĐ
Fosfolipaz
Araşidonik asit
Siklooksijenaz
Lipoksijenaz
Lökotrienler
TX
PG’ler
PGI2
LTB4
LTC4/
Fagosit
aktivasyonu
Lökosit modülasyonu
DP değişiklikleri
Bronkokonstriksiyon
Sekresyon artışı
Đnflamasyon
Enflamasyon
Şekil 2. Araşidonik asit metabolitleri yolu.
Lipooksijenaz Yolu Ürünleri: 5-lipooksijenaz nötrofillerde baskın olarak bulunan AA
metabolizması enzimidir. 5-HPETE AA'nın 5-hidroperoksi ürünüdür. 5-HPETE oldukça
kararsızdır; ya 5-HETE'ye indirgenir ya da topluca lökotrienler diye adlandırılan
bileşiklere dönüşür120,121.
enzimatik
hidrolizle
5-HPETE’den türeyen ilk lökotrien A4 (LTA4) olup bu
LTB4’e
dönüşür
veya
glutasyon
eklenmesiyle
LTC4
oluşur122,123,124. Bunların alt ürünleri olan LTD4 ve LTE4 vazokonstrüksiyon,
bronkospazm ve vasküler permeabilite artışına neden olurlar. LTB4 lökosit, monosit ve
doğal
öldürücü
hücrelerin
güçlü
stimülasyonuna
ve
kemotaksisine,
nötrofil
aktivasyonuna, lizozomal enzim ve süperoksit salınımına ve sitokinin üretimine yol açan
19
pro-enflamatuvar bir maddedir122-125. Özet olarak; ağrı ve ateş mekanizması da dahil
olmak üzere eiokosanoidler akut enflamasyonun her aşamasında yer alırlar.
d-Trombosit Aktive Edici Faktör (PAF): Trombosit aktive eden faktör (PAF)
fosfolipid kökenli mediatör olup mast hücresi ve bazofil başta olmak üzere birçok
hücreden salınır. Trombosit agregasyonuna ve degranülasyona sebep olması nedeniyle
bu şekilde adlandırılmıştır. PAF asetil gliserol eter fosfokolin yapısındadır. Fosfolipaz
A2 etkisiyle nötrofillerin, monositlerin, bazofillerin, endotelin, trombositlerin ve diğer
bazı hücrelerin membran fosfolipidlerinden elde edilir126.
Trombositlerin uyarılmasının yanı sıra vazokonstriksiyon ve bronkokonstriksiyona
sebep
olur.
Vazodilatasyonun
stimüle
edilmesinde
ve
damar
geçirgenliğinin
artırılmasında, histaminden 100 ila 10000 kez daha güçlüdür. Aynı zamanda lökosit
adezyonunu, kemotaksisini, lökosit degranülasyonunu ve oksidatif reaksiyonları artırır.
Hedef hücreleri spesifik reseptörleri üzerinden etkiler. Böbrek kan akımını azaltır.
Kalpte negatif inotrop etkiye neden olur126,127. Eikozanoidler başta olmak üzere diğer
bazı mediatörlerin sentezini de stimüle eder.
e-Sitokinler: Sitokinler aktive olmuş lenfositler ve makrofajlar başta olmak üzere birçok
hücreden sentezlenen ve diğer hücrelerin fonksiyonlarının düzenlenmesinde rol oynayan
polipeptid yapıdaki maddelerdir. Hücresel immün cevap üzerine etkilerinin yanısıra
enflamatuvar
yanıtın
oluşumunda
da
ilave
önemli
rolleri
vardır1,9,10,87,90,101
Đnflamasyonun oluşmasında rol alan en önemli sitokinler; interlökin–1 (IL-1, IL-8),
tümör nekrozis faktör (TNF α ve β), interferon (IFN γ) ve kemokinlerdir. Sistematik akut
faz reaksiyonlarını stimüle eden bu sitokinlerin endotel, lökositler ve fibroblastlar
20
üzerine lokal etkileri de bulunmaktadır9,101. IL–1 ve TNF-α, aktive olmuş makrofajlar
tarafından sentezlenir1,90.
Sitokinlerin sekresyonu, endotoksinler, immün kompleksler, fiziksel travma ve
bazı enflamasyon mediatörleri tarafından stimüle edilir. IL-1 ve TNF-α, endotelyal
aktivasyon olarak isimlendirilen bir grup değişikliği stimüle eder9. Bu değişiklikler
adhezyon moleküllerinin artmış dışa vurumu, bazı sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin
sekresyonu, eikozanoidlerin ve nitrik oksitin (NO) sentezlenmesi ve endotel
trombojenisitesinin
artmasıdır.
TNF-α,
ayrıca
nötrofillerin
agregasyonu
ve
aktivasyonunu stimüle eder. Mezenkimal hücrelerden proteolitik enzimlerin salınımını
uyararak doku hasarına neden olur2.
IL–1 ve TNF-α enfeksiyonlara ya da yaralanmalara eşlik eden sistemik akut faz
reaksiyonlarını uyarır1,101. Bunun yanı sıra TNF-α septik şokta hipotansif etkilerin ortaya
çıkmasına neden olan NO sentezini de indükler. IFN-γ makrofaj ve nötrofiller için güçlü
bir aktivatördür. Onların oksidatif yıkımdan sorumlu enzimlerini arttırarak fagosite
edilmiş mikroorganizmaların öldürülmesini sağlar. Aynı zamanda önemli bir "NO
sentaz" uyarıcısıdır9.
Kemokinler enflamatuvar hücreler için kemotaktik moleküller olmaları ve bazı
sitokin etkilerini göstermeleri nedeniyle bu şekilde adlandırılmışlardır. Đlk tanımlanan
kemokinlerden birisi olan Interlökin-8 (IL-8), güçlü bir kemotaktik ajandır. Başlıca
nötrofilleri aktive eder1,9,101. IL-1 ve TNF-α’ya cevap olarak aktive olmuş
makrofajlardan, endotelden ve fibroblastlardan salınır.
21
f-Nitrik Oksit ve Oksijen Kaynaklı Serbest Radikaller.
Nitrik Oksit (NO): Otokrin ve parakrin bir hücresel ajan olan NO, normal fizyolojik koşullar
ile birçok patofizyolojik durumda homeostazın sürdürülmesinde önemli bir etkendir.
Memelilerde nitrik oksidin varlığı ilk kez 1916 yılında gösterilmiş olup 1985'de aktive
olmuş
makrofajların
NO
saldığı
bulunmuştur128.
Makrofajlar
tarafından
mikroorganizmalar ve tümör hücrelerine karşı sitotoksik bir metabolit olarak kullanılır.
Siklikguanosin monofosfatın (cGMP) düzeyini yükselterek, damar düz kaslarında
gevşemeye yol açan guanil siklazı aktive eder.
Nitrik oksit, L-argininden sitrulin oluşumu sırasında, L-argininin guanidin nitrojen
grubunun hidroksilasyonu ile oluşan ara üründür. Bu reaksiyon bir dizi nitrik oksit
sentaz (NOS) enzimi tarafından katalize edilir129-131. Nitrik oksit sentaz enzimleri yapısal
nitrik oksit sentaz (cNOS) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) olmak üzere iki
ana gruba ayrılır132. Yapısal NOS vasküler endotelde, nöronlarda ve trombositlerde
bulunur133. Nöronlarda bulunan, nöronal nitrik oksit sentaz (nNOS), endotel hücrelerinde
bulunan endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) adını alır. cNOS kardiyomiyositler,
hepatositler, nöronlar, mikroglial hücreler, nötrofiller, vasküler endotel ve düz kas
hücrelerinde bulunur. Yapısal NOS tarafından yapılan nitrik oksit hücreler arası ve hücre
içi
haberleşmede
rol
oynar.
Yapısal
NOS
enzimleri
ortamdaki
kalsiyum
konsantrasyonlarının artışından etkilenirken, iNOS etkilenmez134,135 . iNOS'un
enflamasyon olayının fizyopatolojisinde önemi rol aldığı bilinmektedir. Bu enzimler IL–
1, TNF-α, IFN-γ; gram negatif bakterilerin duvarında bulunan lipopolisakkarit (LPS)
tarafından oluşturulan mediatörler ve çeşitli enflamatuvar sitokinlerle uyarılmaktadır136.
Yapısal NOS çeşitli organ sistemleri için bazal seviyelerde gereklidir133.
22
Arterlerde venlerden daha fazla NO üretilir137. NO enflamasyonda birçok rol
üstlenir136-139.
Enflamasyondaki
trombositlerin
çeşitli
bu
aşamalarda
rolleri:
damar
düz
aktivasyonu136,142,143,
kas
aktive
gevşemesi140,141,
makrofajlarda
mikroorganizmaları öldüren ajan olması136, lökosit endotel ilişkisinin sağlanması144,
endotel hücre adhezyon moleküllerinin salınımı145, Lenfosit proliferasyonu146 şeklinde
özetlenebilir.
Nitrik oksidin serbest oksijen radikalleriyle etkileşimi ve antioksidan özellikleri ile
ilgili araştırmalardan elde edilen sonuçlar çelişkilidir. Aktif makrofajların mikrosidal
aktivitelerini NO aracılığıyla gösterdikleri ileri sürülmekle birlikte asıl mediatörün
NO'dan üretilen nitrojen dioksit (NO2) gibi ikincil bir oksidan madde olabileceği
düşünülmektedir147. Ayrıca nitrik oksidin yara iyileşmesinde de etkili olduğu
gösterilmiştir148.
h-Lizozomal Unsurlar: Nötrofil ve monositler lizozomal granüller içerirler.
Nötrofillerde üç tip granül izlenir. Spesifik granüller laktoferrin, lizozim, defensin,
alkalen fosfataz, kollejenaz gibi enzimler içerir. Primer granüller myeloperoksidaz,
lizozim, defensin, asit hidrolazlar ve nötral proteazlar içerir. Tersiyer granüllerde ise;
asid hidrolazlar ve jelatinazlar bulunur. Bu enzimlerin birçoğu matriks proteinlerini
parçalayarak, destrüktif doku hasarına neden olurlar1,2,4,10,90,149.
2.2.2. Kronik Enflamasyon: Kronik enflamasyon aktif iltihap ve iyileşme süreçlerinin
birlikte görüldüğü uzun süreli bir enflamasyon olarak kabul edilir3,10,11. Kronik
enflamasyon akut enflamasyonu izleyebilir. Bu geçiş zedeleyici etkenlerin ısrarla devam
etmesi veya iyileşme proçeslerinde bozukluklar nedeniyle ortaya çıkar. Zedelenmenin
23
bazı türlerinde ise zedeleyici etkene karşı yanıt başlangıçtan itibaren kronik
enflamasyondur. Kronik enflamasyonu ortaya çıkaran zedeleyici etkenler akut
enflamasyon yapanlardan daha az toksik olmalarına rağmen, iyileştirme proçeslerinde
bir yetersizlik olması daha uzun süren bir zedelenmeye neden olabilir. Fibrozis birçok
kronik enflamatuvar hastalığın ortak özelliğidir ve organ disfonksiyonunun önemli
nedenlerinden biridir. Kronik enflamasyon; inatçı enfeksiyonlar12-14, potansiyel toksik
ajanlara uzun süre maruz kalma ve otoimmün hastalıklar sırasında oluşabilir.
Kronik
Đnflamasyon
Hücreleri:
Kronik
enflamasyon
proliferatif
hücrelerin
oluşmasıyla ortaya çıkar. Bunlar makrofajlar, lenfositler ve plazma hücreleridir71,150.
Makrofajlar kemik iliği orijinli hücrelerden oluşan dolaşımdaki monositler ve doku
makrofajlarından ibaret mononükleer fagositik sistemin bir komponentidir151. Kandaki
monositlerin yarı ömrü yaklaşık 1 gün kadardır151. Monositler ektstravasküler dokuya
ulaştıkları zaman bir değişim geçirirler ve daha büyük, makrofaj olarak adlandırılan,
fagositik hücreleri oluştururlar152,153. Makrofajların da aktive olabilme özellikleri
vardır154,155. Aktive olduklarında hücrenin büyüklüğü ve lizozomal enzim içeriği artar.
Metabolizması daha aktif hale gelir. Fagosite ettikleri organizmaları ve bazı tümör
hücrelerini öldürebilme yetenekleri ortaya çıkar. Makrofajları aktive edici sinyaller;
hassaslaşmış
T
lenfositlerden
salınan
sitokinler
(özellikle
IFN-γ),
bakteriyel
endotoksinler, akut enflamasyon sırasında oluşan çeşitli mediatörler ile fibronektin gibi
ekstrasellüler matriks proteinlerinden oluşur. Aktive olan makrofajlar çok sayıda
biyolojik olarak aktif ürün salgılarlar156-158. Bunlar; sitokinler, eikosanoidler, reaktif
oksijen ürünleri, nötral proteazlar, kompleman komponentleri ve koagulasyon
faktörleridir. Bu mediatörler kronik iltihabın karakteristik özellikleri olan doku
24
destrüksiyonunu, anjiogenezisi ve fibrozisi oluştururlar. Akut iltihapta irritan maddenin
temizlendiği ve iyileştiği yerlerde makrofajlar ölürler ve lenfaktiklere girerek vücuttan
atılırlar. Ancak kronik iltihap odağında makrofaj birikimi kalıcıdır. Lenfosit kökenli
faktörlerin devamlı salgılanması iltihabi odakta makrofajların toplanmasını veya
immobilize olmasını sağlayan önemli bir mekanizmadır. IL-4 veya IFN-γ da
makrofajları uyararak, bu hücrelerin birleşmelerine ve dev hücreler adı verilen büyük,
çok nükleuslu hücreleri oluşturmalarına yol açarlar. Uygun koşullarda makrofajlar
çoğalma kapasitesine de sahiptirler. Kronik iltihapta rol oynayan diğer hücre tipleri;
lenfositler ve plazma hücreleridir157.
Lenfositler non-immün enflamasyonda olduğu gibi herhangi bir immün
reaksiyonda da mobilize olurlar. T lenfositler kronik enflamasyonda makrofajlarla
karşılıklı bir ilişki halindedir. Plazma hücreleri B lenfosit aktivasyonu sonucunda
oluşurlar.
Đnflamasyon
bölgesindeki
antijenlere
karşı
veya
değişen
doku
komponentlerine karşı antikor oluştururlar. Eosinofiller karakteristik olarak parazitik
enfeksiyonlar çevresinde veya allerjilerde olduğu gibi immunglobulin E (IgE) ile
oluşturulan immun reaksiyonlarda rol oynarlar.
Granülomatöz Đnflamasyon: Granülamatöz iltihap kronik iltihabın ayrı bir paternidir.
Büyümüş skuamöz epitel hücresine benzer bir görünümde aktive makrofajların
kümelenmesi ile karakterizedir. Granülomlar tüberküloz başta olmak üzere nisbeten az
sayıda patolojik durumlarda görülürler12. Bundan dolayı granülamatöz paterni tanımak
sınırlı sayıda ancak bazıları yaşamı tehdit eden hastalıkları belirlemek açısından
önemlidir. Granülomlar parçalanması güç olan yabancı cisimlere karşı da oluşabilir ve
yabancı cisim granulomları olarak adlandırılır12. Granülomlar T hücreleri tarafından
25
immünolojik yanıt verilen bazı organizmalara (Listeria, Salmonella) karşı veya
hazmedilemeyen partiküllere karşı meydana gelebilir12-14. Bu durumlarda aktive T
lenfositlerden salgılanan sitokinler makrofajların epiteloid hücreye veya dev hücreye
dönüşmesini sağlarlar159.
Granülomlar ayrıca sarkoidoz, Wegener granülamotozisi ve crohn hastalığı gibi
otoimmün hastalıklarda da görülebilir160. Đlginç olarak hodgkin ve non-hodgkin lenfoma
gibi bazı malignensilerde de granülom formasyonu görülmektedir161. Kısaca söylemek
gerekirse granülom kronik enfeksiyona karşı organizmayı korumaktadır12.
2.3 Anti-enflamatuvar Đlaçlar: Ağrı ve enflamasyon tedavisinde kullanılan ilaçların
başında, steroid anti-enflamatuvar ilaçlar (SAEĐ) ve steroid olmayan anti-enflamatuvar
ilaçlar (Nonstorodial anti-enflammatuar ilaçlar; NSAEĐ) gelir106,162. NSAEĐ’ler
antibiyotiklerden sonra en sık reçete edilen ilaçlardandır. Toplumda NSAEĐ kullanım
prevalansı %5 olarak hesaplanmaktadır163. Ayrıca enflamatuvar olaylarda yukarıda
belirttiğimiz anti-enflamatuvar ilaçlar haricinde penisilamin, kolşisin, kinin türevleri,
altın
bileşikleri
ve
anti-enflamatuvar
etkisi
kanıtlanmış
bazı
bitkiler
de
kullanılmaktadır164-168.
2.3.1. Steroidal Anti-enflamatuvar Đlaçlar (SAEĐ): Steroidal anti-enflamatuvar ilaçlar
NSAEĐ’a göre daha belirgin anti-enflamatuvar etki oluştururlar169. Bu etkileri
muhtemelen; lizozomal membran stabilizasyonu, kapiller geçirgenliğin azalması,
lökositlerin enflamasyon alanına göçünün önlenmesi, hasarlı hücrelerin fagositozunun
(özellikle T lenfosit yapımının azalması) ve lökositlerden IL–1'in salınımının
inhibisyonuna bağlıdır. Kortizol; iNOS, COX ve fosfolipaz A2’nin sentezini
26
baskılar170,171. Fosfolipaz A2 aktivitesini, dolaylı yoldan, bir inhibitör protein olarak
bilinen lipokortinin salınımını artırarak baskılar172-174. Fosfolipaz A2 inhibisyonu,
araşidonik asit salınımını azaltarak, PG’ler, tromboksanlar, ve lökotrienlerin oluşumunu
da inhibe eder ve SAEĐ’ın anti-enflamatuvar etkisinin en önemli mekanizmasını
oluşturur175.
2.3.2 Non Steroidal Anti-enflamatuvar Đlaçlar: Klasik NSAEĐ ağrı, ateş, kızarıklık ve
ödemin giderilmesinde etkili oldukları için enflamasyonla seyreden hastalıkların
tedavisinde en fazla tercih edilen ilaçlardır176,177. Bu ilaçların anti-enflamatuvar etkileri,
SAEĐ’ınkinden daha düşüktür. Fakat yukarıda belirttiğimiz üç etkinin bir arada
bulunması NSAEĐ’ın kullanımını oldukça artırmıştır. Ayrıca günümüzde enflamasyon,
ağrı ve ateşte NSAEĐ’ın öncelikli kullanılmasının en önemli nedenlerinden biri de
narkotik analjezikler gibi bağımlılık yapmaması178 ve etkilerine karşı tolerans
gelişmemesidir179.
NSAEĐ'ın kısa tarihçesine bir göz atıldığında, ilk kez 1820’de kolşisin, 1860 da
salisilik asitin tanımlandığı ve ilk Aspirin tabletinin 1898 de sentezlendiği dikkati
çeker180. NSAEĐ isminin 1949’da ilk kullanılışı fenilbutazon' un sentezlenmesi ile eş
zamanlıdır. 1971’de bu serüven Dr. John Wyane' in etki mekanizmaları konusunda
yaptığı çalışmalar ve ilk siklooksijenaz enzimini tanımlaması ile yeni bir boyut
kazanırken, John Wyane’e de Sir ünvanı ve Nobel yolu açılmıştır181. 1976’da ise,
serüvende yeni bir durak olan, prostoglandin endoperoksit sentetaz (siklooksijenaz =
COX) enzimi elde edilmiş, böylece NSAEĐ'ın etki mekanizmaları, yan etkileri ve
güvenlik profili üzerine olan çalışmalar hızlanmıştır. Bu konuda son gelişme 1990’lı
yılların başında COX'un tek bir molekül olmadığını birden fazla izomerlerinin
27
bulunduğunu ve her bir izomerin farklı işlevlerde rol aldığı gösterilmiştir. Böylece
klinik çalışmalar da yeni bir boyut kazanmıştır182,183.
NSAEĐ’ın Sınıflandırılması:
1. Salisilatlar
a- Asetil salisilik asit, salisilik asit, metil salisilat ve Sodyum salisilat
b- Diflunisal
2. Paraaminofenol türevleri
a- Asetaminofen
b- Fenasetin
3. Pirazolon türevi ilaçlar
a- Aminopirin
b- Propifenazon
c- Metamizol sodyum
d- Fenilbutazon
e- Oksifenbutazon
4. Profenler (Fenilropionik asid türevleri)
a- Đbuprofen
b- Naproksen
c- Fenbufen
d- Tiaprofenik asid
e- Ketoprofen
f- Fenoprofen kalsiyum
g- Flurbiprofen
28
h- Đndoprofen
k- Zomepirak
5. Fenilasetik asid türevleri
a- Nabumeton
b- Fenklofenak
c- Diklofenak sodyum
6. Đndol asetik asid türevleri
a- Đndometazin
b- Asemetasin
c- Tolmetin
d- Ketorolak
e- Sulindak
7. Fenamik asid türevleri
a- Mefenamik asid
b- Flufenamik asid
c- Etofenamat
8. Oksikamlar ve diğer ilaçlar
a- Piroksikam
b- Tenoksikam
c- Prokuazon
d- Azapropazon
e- Metotrimeprazin
9. COX-2 inhibitörleri
a- Meloksikam
29
b- Nimesulid
c- Etodolak
d- Selekoksib
e- Rofekoksib
COX enzim aktivitesi ile membran fosfolipitlerinden prostaglandin sentezine giden
yol kontrol edilir. Bu enzimin NSAEĐ ile inhibisyonu, prostaglandin sentezinde azalma
oluşturur. Lipooksijenaz yolunun inhibisyonu ise, lökotrienlerin sentezini inhibe eder.
NSAEĐ’ın Etki Mekanizmaları: NSAEĐ’ın anti-enflamatuvar etki mekanizmaları COX
ve lipooksijenaz (LO) ürünlerinin sentezinin inhibisyonu, toksik oksijen radikallerinin ve
lizozomal enzim salınımının engellenmesi, nötrofil agregasyonu, adezyon ve
kemotaksisinin önlenmesi, oksidatif fosforilizasyonun uncoplingi şeklinde sıralanabilir.
Prostaglandin sentez yolağındaki enzim COX enzimidir184. Bu enzim, araşidonik asiti
stabil olmayan PGG2 ve PGH2’ye çevirir. Bugün COX–1 ve COX–2 diye adlandırılan
iki siklooksijenaz formu olduğu bilinmektedir185. COX–2 enflamatuvar bölgede
sitokinler, enflamatuvar mediatörler, endotoksinler ve mitojenik ajanlar tarafından
indüklenir186-188. COX–1 dediğimiz temel form ise trombositler, damar endoteli, mide
mukozası, böbrek, pankreas langerhans adacıkları, seminal veziküller ve beyin gibi
birçok normal hücre ve dokuda bulunur176,189. Bununla birlikte, COX–2, böbrek ve
beynin bazı bölgelerinde üretilebilir190,191. COX–1 midede bulunurken, COX-2 midede
bulunmaz. Bu da selektif COX–2 inhibitörlerinin GĐS üzerindeki yan tesirlerinin daha az
olduğunu gösterir.
30
Araşidonik asitten 5-lipooksijenaz enzimi aracılığıyla LO ürünleri oluşur. NSAEĐ
siklooksijenaz
yolunu
inhibe
ederek
prostaglandin
sentezini
önlerler,
ancak
lipooksijenaz yolunu inhibe edemezler ve lökotrien oluşumunu önleyemezler. Aspirin
kovalent bağ yaparak, hem COX–1 hem de COX–2 enzimini inhibe eder. Geri dönüşlü
siklooksijenaz inhibitörü olan tüm diğer NSAEĐ’ın primer olarak etkisi ilacın
farmakokinetik klirensi ile ilişkilidir. NSAEĐ kabaca yarılanma ömrü 6 saatten kısa ve
10 saatten uzun olan iki gruba ayrılır. Đnsan vücudunda terapötik dozlardaki aspirin ve
diğer NSAEĐ’ın prostaglandin biosentezini azalttığına ilişkin birçok önemli kanıtlar
vardır21,182,192. Ve bu ilaçların anti-enflamatuvar etkinlikleri ile, siklooksijenazı inhibe
edebilme potansiyelleri arasında anlamlı bir korelasyon görülmüştür71,174. Buna rağmen
bazı istisnalar bulunmaktadır, fakat bu istisnalar in vivo ortamı taklit edemeyen deneysel
ortamların kullanılmasına bağlanmaktadır193.
Birçok bulgu NSAEĐ’ın primer terapötik etkisinin prostaglandin sentez inhibisyonu
ile oluşmasına karşın, NSAEĐ’ın supresör T lenfositlerini situmüle ederek, yardımcı T
lenfositlerin IL–1 salgılamalarını baskıladıkları da tespit edilmiştir. Đnflamasyonda
aktive olan makrofaj ve fibroblastlardan, IL–1’den başka sitokinler de salınmaktadır. IL–
6, TNF ve interferon da enflamasyonda rol oynarlar. NSAĐ ilaçların, IL–1 ve IL–6
yapımını ve salınımını inhibe ettikleri çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir194.
Đnflamatuvar eklem hastalıklarında sinoviyal dokuda ve kartilaj yüzeylerinde polimorf
nüveli lökosit sayısı artmakta ve bunlardan diğer mediyatörler gibi proteolitik enzimler
de salınmaktadır. Bu enzimler enflamasyonun başlamasına ve aynı zamanda
periartiküler kemiğin yıkımına sebep olmaktadır. NSAEĐ lizozomal membran
stabilizasyonu sağlayıp, lizozomal enzimlerin salınımını önleyerek de etkilerini
31
göstermektedirler. Aynı zamanda cAMP düzeyini artırarak da, lizozomal enzim
salınımını inhibe ettikleri ileri sürülmektedir194.
NSAEĐ’ın iltihaplı dokuda serbest oksijen radikallerinin oluşmalarını inhibe
ettikleri
veya
oluşanları
bağlayarak
inaktive
ettikleri
çeşitli
araştırmalarda
gösterilmiştir195. NSAEĐ’ın anti-enflamatuvar etkilerine katkıda bulunan diğer özellikleri
ise sırayla; nötrofil agregasyonu, adezyon ve kemotaksisinin önlenmesi, NADPH
oksidaz ve fosfolipaz C aktivitesinin antagonizma edilmesi olarak sayılabilir181,196,197.
NSAEĐ’ın Kullanıldığı Yerler: Bu ilaçlar, analjezik olarak kullanıldıklarında,
genellikle diş ağrısı gibi hafif şiddette ağrılara karşın etkin olurlar178. Merkezi sinir
sistemi üzerinde opiatların istenmeyen etkilerine sahip değildirler (solunum bozukluğu,
fiziksel bağımlılıkta artış). NSAEĐ ateşli durumlarda vücut sıcaklığını düşürürler, fakat
normal vücut sıcaklığını değiştirmezler. Gerçekte seçkin COX–2 inhibitörleri etkin
antipiretik etkilidirler. Romatizmal eklem iltihapları ve kemik eklem iltihaplarının
tedavileri NSAEĐ’ın temel klinik uygulamaları arasında bulunur198.
Hastaların, rofecoksib ve selekoksible yapılan kronik tedavilerinde, gastrik
toksisitesiz bir şekilde enflamasyonun baskı altına alınması, selektif COX–2
inhibitörlerinin diğer NSAEĐ’dan daha avantajlı olduğunu göstermektedir. Genel olarak
NSAEĐ sadece hastalıktan kaynaklanan enflamasyon ve ağrıların yarattığı semptomlarda
rahatlamayı
sağlar,
hastalığın
dokulara
verdiği
patolojik
zararın
ilerlemesini
engelleyemez.
NSAEĐ’ın
diğer
kullanım
alanları
prostaglandin
biyogenezini
önleme
kapasitelerine bağlıdır. Prostaglandinler duktus arteriosusun gelişiminde de yer
edinmektedir. Bu nedenle indometazin ve benzeri ajanlar yeni doğanlarda kapanmamış
32
duktusları kapatmak için kullanılmaktadır. Diğer yandan non-selektif NSAEĐ’ın hamile
kadınlarda kullanımı, intrauterin duktus arteriozusun prematüre kontraksiyonuna sebep
olabilir. Fetal hayatta COX–1 ve COX–2 tarafından sentezlenen prostaglandinlerin
(vazodilatatör PG), duktus arteriosusun açıklığını sürdürmesinde etkili olduğu
belirlenmiştir199. Fetal duktusun açık kalmasını sağlayan izoformların oluşmasını
önlediği için, gebe kadınlarda selektif COX–2 inhibitörlerinin kullanımında tedbirli
olmak
gerekir.
Menstrüasyon
esnasında
endometrium
tarafından
salınan
prostaglandinler, primer dismenorede ki diğer semptomların ve sert krampların nedeni
olabilir ki bu durumun tedavisi NSAEĐ ile sağlanmaktadır. Yeni bir çalışma, selektif
COX–2 inhibitörü refekoksibin, dismenore tedavisinde, naproksen sodyum kadar iyi
olduğunu ortaya koymuştur.
Sistemik mastositozisli hastalardaki hipotansiyon ve şiddetli vazodilatasyonun
major mediatörünün, mast hücrelerinden fazla oranda salınan PGD2 olduğu
bulunmuştur. Bu hastaların sadece antihistaminiklerle tedavisi etkili değildir, ancak
tedaviye NSAEĐ’ın eklenmesi ile etkili bir şekilde bu epizotlar önlenebilmektedir200.
PGE2’ in bazı kanserlerdeki humoral hiperkalsemi ile ilişkili olduğu da bulunmuştur.
NSAEĐ ile tedavi bazı hastalarda serum kalsiyum düzeylerini etkili bir şekilde
düşürmektedir201.
NSAEĐ’ın
önemli
bir
kullanım
alanıda
kolon
kanserinin
önlenmesidir.
Epidemiolojik çalışmalar sık olarak aspirin kullanımının kolon kanserinin insidansında
önemli ve çarpıcı bir azalma meydana getirdiğini göstermektedir202. Đlginç olarak bu
azalış 325 mg’lık tabletlerden haftalık 4 ya da 6 tane alınacak kadar az bir dozla
sağlanmaktadır.
33
NSAEĐ’ın Yan Etkileri: NSAEĐ’ın kullanımına bağlı görülen en sık yan etkiler
gastrointestinal sisteme ait yan etkilerdir. GĐS semptomları; dispepsi203. gastrik erozyon,
peptik ülser, üst GIS kanaması203, barsak enflamasyonu gibi geniş bir yelpaze içinde
dağılmıştır204,205. GĐS intoleransı %30, endoskopik ülser prevalansı ise %10–30 arasında
rapor edilmektedir. Avrupa'da, üst GĐS kanaması nedeniyle her gün hastaneye
yatırılmakta olan 1000 kişiden 400'ün de kanama/perforasyon doğrudan NSAEĐ’a
bağlanmaktadır. Genitoüriner sistemde; glomerüler filtrasyonda azalma, akut böbrek
yetmezliği, papiler nekroz, serum kreatinin seviyesinin yükselmesi, su retansiyonu,
proteinüri oluşabilmektedir206–211.
Solunum sisteminde ise; bronkospazm, astım provakasyonu211 ve pnömonitis
görülmesi nadir değildir. Karaciğerde; toksik hepatit212, kolestatik sarılık, karaciğer
yetmezliği213, Reye Sendromu214 gibi çeşitli rahatsızlıklar oluşabilir. Nöropsikiyatrik yan
etkileri
başağrısı,
baş
dönmesi,
sersemlik,
tinnutus,
depresyon,
konfüzyon,
hallusinasyon gibi problemlerin ortaya çıkışıyla görülmektedir163. Kognitif disfonksiyon,
hafıza kaybı, irritabilite, uykusuzluk, konsantrasyon bozukluğu, unutkanlık, kişilik
değişiklikleri ve hatta paranoid reaksiyonların da görüldüğü bildirilmektedir117.Yaşlı
hastalarda bu yan etkilerin daha fazla olduğu, yine bu yan etkilerin yüksek doz
kullanımında daha sık ortaya çıktığı bilinmektedir. Dermatolojik olarak yan etkiler;
ürtiker215,
morbiliform
lökositoklastik
erüpsiyonlar,
vaskülit,
eritema
vezikülobüllöz
multiforme216,217,
erüpsiyonlar,
ilaç
erüpsiyonu,
eksfoliyatif
eritrodermi,
fotosensitivite218 şeklinde ortaya çıkabilmektedir. Ayrıca Stevens Johnson Sendromu,
toksik epidermal nekroliz gibi toksik etkilerden de bahsedilmektedir. Hematolojik yan
etkiler ise kanamaya eğilim219, aplastik anemi220, trombositopeni, agranülositozdur216.
34
NSAEĐ, prostaglandin sentezini inhibe etmeleri nedeniyle (antinatriüretik etkileri
ve vazokonstriksiyona eğilim yaratmaları) hipertansiyonlu hastalarda kan basıncını
yükseltmektedir221,222. NSAEĐ’ın salisilatlarda olduğu gibi glikozaminoglikan sentezini
bozduğu ve kıkırdak matriksinin temel maddesi olan proteoglikan kaybını artırdığı
çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. enflamasyon ile seyreden eklem hastalıklarında
proteoglikan
sentezini
bozmakta
ve
ekstrasellüler
matriksin
rezorbsiyonunu
artırmaktadırlar223.
NSAEĐ’ın Kontrendikasyonları: NSAEĐ, gastrointestinal kanama hikâyesi veya
semptomları bulunan şahıslarda kullanılmamalıdır. Hamilelik süresini uzattığı, düşük
doğum ağırlıklı bebek ve doğum öncesi ve sonrası kanama eğilimi arttırdığı için
gebelerde de kullanılmamalıdır179. Özellikle viral enfeksiyon geçiren çocuklarda aspirin
başta olmak üzere NSAEĐ’ın kullanımı ölümcül olabilen Reye Sendromu oluşturduğu
için, çocukluk çağı viral enfeksiyonlarında kullanılmamalıdır214. Diğer yandan NSAEĐ,
astımı proveke ettikleri için astım hikayesi olan şahıslarda kontrendikedir211.
1.Salisilatlar
Asetilsalisilik asit: Aspirin adıyla tanınan, bu grup içinde en fazla kullanılan ve en ucuz
olanıdır. Asetilsalisilik asit (ASA) PG, prostasiklin, tromboksan A2 sentezini inhibe eden
COX’ lara özgül olmayan bir anti-enflamatuvar, analjezik ve antipiretik etkili ilaçtır224.
ASA COX-1’i COX-2’ye
dönüşümsüzdür225.
göre daha fazla inhibe eder ve bu inhibisyon
35
Farmakokinetiği: ASA mideden kolaylıkla absorbe olabilir. Oral alımdan 20 dakika
sonra kanda minumum etkin düzeylere, 1-2 saat sonra ise maksimum düzeylere çıkarak
analjezik etkisini gösterir. ASA karaciğer ve kanda salisilata hidrolize edilir.
Etki Mekanizmaları:
A) Anti-enflamatuvar Etkileri: ASA, eikozanoid mediatörlerinin sentezini inhibe
etmesinin yanında kallikrein sisteminin kimyasal mediyatörlerini de engeller. Bunun
sonucunda lezyonlu damarlarda granülositlerin yapışmasını inhibe eder, lizozomları
stabilize eder ve polimorf nüveli lökositlerin ve makrofajların iltihap odağına göçünü
frenler226.
B) Analjezik Etkileri: ASA’nın iltihap odağındaki periferik etkileri yanında aynı
zamanda subkortikal bölgede ağrı uyarılarını da inhibe ettiği düşünülmektedir. Kasiskelet sistemi ağrıları ve vasküler orijinli ağrılarda etkindir.
C) Antipiretik Etkileri:ASA yükselen sıcaklığı düşürür. Normal vücut sıcaklığı üzerine
etkisi hafiftir. Sıcaklığın düşmesi yüzeyel damarların vazodilatasyonuna bağlıdır. Ayrıca
ısı kaybı terleme yoluyla da olmaktadır227.
D- Platelet Etkileri: ASA’nın tromboksan sentezini inhibe eder. Buna bağlı olarak
trombosit agregasyonu oluşmaz ve kanama zamanı uzar228. Tromboksan A2
trombositlerin şeklini değiştirmesine, granüllerini boşaltmasına ve agrege olmalarına
neden olan bir araşidonik asit ürünüdür. ASA siklooksijenaz enziminin dönüşümsüz
asetilasyonuyla Tromboksan A2 sentezini inhibe eder229. Diğer salisilatlar siklooksijenazı
inhibe ederler ancak siklooksijenazı asetilleyemedikleri için inhibitör etkileri kısadır ve
yan etkileri reversibldir. ASA’nın etkisi irreversibl olduğundan trombosit agregasyonunu
yeni trombositler meydana gelinceye kadar bozar.
36
Klinikte Kullanımı: ASA anti-enflamatuvar ve analjezik etkilerinden dolayı romatoid
artrit, gut, romatizmal ateş, juvenil romatoid artrit, spondiloartropati gibi hastalıkların
tedavisinde kullanılır229,230. Bu hastalıklarda aspirinin tercih edilmesi yüksek dozlarda
ortaya çıkan güçlü anti-enflamatuvar etkisinden kaynaklanmaktadır. Bunların dışında
artralji, myalji gibi ağrılı durumlarda da kullanılabilmektedir. Antipiretik etkisinin güçlü
olması nedeniyle ateş tedavisinde sıklıkla kullanılan ASA, düşük dozlarda da platelet
agregasyonunu inhibe ettiği için kardiovasküler alanda231 ve serebrovasküler trombüsün
kronik tedavisinde de kullanılır. Aynı zamanda kesin olmamakla birlikte kolon kanseri
profilaksisinde de kullanılmaktadır224, 232.
Yan Etkileri:
a) Gastrointestinal Sistem Etkileri: ASA, gastrointestinal sistemde özellikle midede
mukoza ile direkt temas sonucu yüzeyel peteşi ve ülser oluşmasına neden olmaktadır.
Bunların sonucunda ise gizli kanama, akut kanama veya perforasyon ortaya
çıkabilmektedir233,234. Bu etkileri alınan tabletin mide mukozasını zedelemesi, iyonize
olmayan salisilatın mideden absorbsiyonu ya da koruyucu prostaglandinlerin salınımının
inhibisyonuna bağlı olarak gelişmektedir235,236. Araştırmalarda ASA’nın peptik ülsere
neden olduğu gösterilememişse de; epidemiyolojik araştırmalarda ASA kullananlarda
mide ülseri oranının arttığı, daha az olarak da duedonum ülseri sıklığının arttığı
görülmüştür.
b) Kanama ve Hemostaz Etkileri: Aspirin heparin ve diğer antikoagülan ilaçların
etkilerini potansiyalize eder. Yüksek dozda aspirin karaciğerde protrombin ve diğer
pıhtılaşma faktörlerinin sentezini doza bağımlı olarak azaltmaktadır. K vitamini ile bu
azalma tersine çevrilebilir. Aspirin kullanımı protrombin zamanını ve koagülasyon
zamanını uzatmaktadır.
37
c) Santral Sinir Sistemi Etkileri ve Salisilizm: Yüksek dozlarda salisilat kullanımı
başağrısı, başdönmesi, uyuşukluk, tinnitus, işitme kaybı, bazen bulantı-kusma ve
diyareye sebep olabilir237. Toksisite sınırında olan salisilat düzeylerinde ise
ventilasyonun artması, respiratuar alkaloz ve daha sonra da solunum merkezinin
depresyonu ve asidoz tablosu gelişir238. Plazma salisilat düzeylerinin 30–35 mg/dl
olması ile solunum merkezi stimüle olarak solunumun dakika hacmi artar ve böylece
derin ve hızlı solunum gelişir. Salisilat düzeyi arttıkça solunum merkezi ve vazomotor
merkez deprese edilir. Asidoz, damarlarda dilatasyon ve dolaşım kollapsı meydana
getirir. Bu sırada hücre potasyumunun mobilizasyonu sonucu hiperkalemi oluşur.
d) Hipersensitivite: Hipersensitivite ASA alanların %15’in de görülebilmektedir.
Bronkokonstriksiyon ve bronşial astım şeklinde görüleceği gibi ürtiker, anjionörotik
ödem şeklinde de görülebilir. Bu yan etkiler prostaglandin sentezinin inhibisyonu
sonucu gelişmektedir. Fetal anaflaktik şok nadirdir239.
e) Diğer Etkileri: ASA diğer NSAĐ ilaçlar gibi prostaglandin sentezi inhibisyonuna bağlı
olarak böbrek kan akımını ve glomerül filtrasyon hızını azaltır. Böbrek tübülüslerinde
sodyum ve su reabsorbsiyonunu artırarak ıtrahlarını azaltır. Böylece vücutta su ve tuz
retansiyonu gelişir. Uzun süre aspirin kullanımı papiller nekroz ve analjezik nefropatisi
gibi bazen kalıcı olan böbrek bozukluklarına neden olmaktadır240. Yüksek dozlarda ASA
(4 g veya üstü), ürat ekskresyonunu artırır ürik asit düzeylerini düşürür. Buna karşılık
düşük dozlarda (2 g veya altında) hiperürisemiye neden olarak gut atağını provake
edebilir238.
ASA bağlı gelişen hepatit genellikle semptom vermez. Nadiren bulantı, iştahsızlık,
sigaradan tiksinme, hepatomegali gelişebilir. Transaminaz düzeyleri yükselebilir ancak
karaciğer fonksiyon testleri aspirin kesildikten birkaç hafta sonra normale döner.
38
Hepatotoksisite daha çok çocuklarda ve karaciğer hastalığı olanlarda görülmektedir.
ASA’nın glukoz toleransı üzerine etkisi çok azdır. Yüksek dozda salisilat alındığında
sempatik bir etkiyle, adrenal medulladan katekolamin salgılanarak glikojenoliz,
hiperglisemi ve glikozüri yapabilir. Diabetes mellitusu olan bir hastada yüksek doz
salisilat glikoz utilizasyonunu arttırır ve glisemiyi düşürür. Ayrıca insülin gereksinimini
azaltır.
Diflunisal: Salisilik asidin difluorofenil türevi olan diflunisal ASA’ya göre daha yeni bir
anti-enflamatuvar ajandır. Anti-enflamatuvar etkisi ile birlikte analjezik ve daha zayıf
olan antipiretik etkileri de vardır. Plazma yarılanma ömrü ASA yakın veya daha
uzundur. En sık görülen yan etkileri; dispeptik şikayetler, bulantı, kusma, diyare ve karın
ağrısıdır. Nefrotoksisite ve hepatotoksisitesi zayıfdır. Oral antikoagülan kullananlarda
protrombin zamanını uzatabilir241.
Sodyum Salisilat: Sodyum salisilatın analjezik, antipiretik ve anti-enflamatuvar etkisi
ASA’ ya göre zayıftır. Tromboksan sentazı zayıf inhibe ettiği için antiagregan etkisi
belirgin değildir. COX enzimini ASA’ya göre zayıf inhibe etmesine rağmen romatizmal
hastalıklarda ASA kadar etkili olduğu bilinmektedir. Diğer salisilat türleri sistemik etki
oluşturmak için kullanılmazlar.
2. Paraaminofenol Türevleri
Parasetamol (Asetaminofen): Bu grupta, günümüzde artık sadece parasetamol
kullanılmaktadır. Analjezik ve antipiretik etkinliği bakımından aspirine alternatif bir
ilaçtır. Ancak aspirin gibi anti-enflamatuvar etkinliği olmadığı için enflamasyon
hadiselerinin tedavisinde kullanılmaz242. Çok iyi tolore edilir. Çok az yan etkiye sahip
olmasına rağmen aşırı doz alınması öldürücü sonuçlar doğurabilir. Asetaminofenin zayıf
39
anti-enflamatuvar etkinliği, yüksek peroksit içeren ortamlarda (enflamasyonlu dokularda
da olduğu gibi), siklooksijenazı inhibe edememesine bağlıdır241. Tersine antipiretik
etkinliğinin varlığı da beyin gibi peroksitlerin az olduğu ortamlarda siklooksijenaz
inhibisyonu sağlamasına bağlanmaktadır. Asit baz dengesini bozmaz. Gastrik irritasyona
neden olmaz. Trombositlere, kanama zamanına ve ürik asit atımına etkisi yoktur.
Yarılanma ömrü 2 saat olan bu ilacın tamamı GĐS’den emilir. Özellikle aspirinin
kontrendike olduğu durumlarda analjezik ve antipiretik amaçlı kullanımı uygundur243.
Đntoksikasyonunda ağır karaciğer hasarı oluşur244. Çok nadir olarak methemoglobinemi,
hemolitik anemi, nefropati, larinks ödemi ve bronkospazm yapabilir238,241.
3. Pirazolon Türevleri: Bu grupta; metamizol, aminopirin, propifenazon, fenilbutazon
ve oksifenbutazon yer alır.
Metamizol: Güçlü analjezik ve zayıf antipiretik, anti-enflamatuvar etkili bir ilaçdır244.
Vücutta aktif metaboliti olan 4-metil aminoantipirine dönüşür245. Bu aktif madde ise
COX inhibisyonu yapar. Metamizolun klinik kullanımında hem oral hem de parenteral
formları vardır. Yaptığı COX inhibisyonu ve anti-enflamatuvar etkinliği zayıf olmasına
karşılık analjezik etkinliği oldukça güçlüdür. Omuriliğe uzanan ve ağrı inhibisyonu
yapan yolakları aktive etmesi de analjezik etkisine katkıda bulunur245. Ateşli
durumlarda, enflamasyonlu ağrılarda, dismenore gibi hafif ve orta şiddetteki ağrılarda
kullanılır. GĐS ile ilgili yan etkileri nadir değildir. Anemi, trombositopeni ve
agranülositoz gibi hematolojik yan etkiler yapabilir.
4. Fenilpropiyonik Asit Türevleri: Bu grup ilaçlar analjezik, anti-enflamatuvar ve
antipiretik etki gösterirler. COX’ un her iki izoformunu da inhibe ederler246.
40
Đbuprofen: Mide barsak kanalından %80 oranında ve çabuk absorbe edilir. Bir saat
içerisinde analjezik etkisi başlar. Yüksek oranlarda plazma proteinlerine bağlanır.
Yarılanma ömrü 1–2 saat olup sinoviyal dokuda plazmadakinden daha uzun süre kalır.
Biyoyararlanımı açısından aç karnına alınması tavsiye edilebilir. Đyi tolere edilen bir
ilaçtır. Aspirine göre gastrointestinal sistem yan etkileri daha az olarak ortaya
çıkmaktadır246. Diğer NSAEĐ’da görülen renal, hepatik ve hematolojik yan etkiler nadir
de olsa beklenebilir. Antikoagülan ilaçlar ile etkileşimi nadirdir. Nadiren allerjik
kaynaklı kemik iliği depresyonu yapabilir242. Son yapılan çalışmalarda ibuprofenin
Alzheimer tedavisinde kullanıldığı ve olumlu sonuçlar alındığı gösterilmiştir247.
Yenidoğan ve prematürelerde kullanılması patent ductus arteriozus açıklığını kapatmada
oldukça yararlıdır248.
Naproksen: Fenilpropiyonik asit türevleri içinde yarılanma ömrü en uzun olandır.
Plazma proteinlerine yüksek oranda bağlanır. Đltihabi dokuda lökosit aktivasyonu ve
migrasyonu üzerinde belirgin inhibitör etki meydana getirmektedir139. Aspirin gibi
trombosit agregasyonunu inhibe ederek kanama zamanını uzatır. Anti-enflamatuvar
etkisi yeterli dozlarda (500–1000 mg) verildiğinde indometazin ve aspirin kadar
güçlüdür. Çocuklarda uzun süreli kullanımının güvenilirliği saptanmış bir ilaçtır (10
mg/kg/gün). Yan etkileri açısından aspirine benzerse de bu etkiler daha az ve daha
hafiftir. Genel olarak GĐS ile ilgili yan etkiler çoğunluktayken daha az olarak başağrısı,
baş dönmesi ve depresyon görülebilir242,249.
Ketoprofen: Fenilpropiyonik asit türevi olup, hem sikloosijenazı hem de lipoksijenazı
inhibe etme özelliği göstermektedir. Hem santral hem de periferik analjezi etkisi
vardır250. Ankilozan spondilit, romatoid artrit, gut artriti, bursit, tendinit ve travmatik
41
snovitte kullanılır251. Yan etkileri naproksene benzemekle beraber ketoprofende kontakt
ve fotokontak reaksiyonlar daha sık görülür215.
Tiaprofenik asit: Diğer nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaçlardan farklı olarak kıkırdak
dokusundaki proteoglikan sentezini inhibe etmemesi ile dikkati çekmektedir.
Araştırmalarda kıkırdaktaki katabolik etkisinin azaldığını gösterir şekilde stromelysin
düzeylerinde belirgin azalma olduğu saptanmıştır. Osteartrozda kıkırdak proteinlerini
yıkan kollajenaz ve proteoglikanaz enzimlerini azaltır. Bu enzimlere paralel olarak
proteoglikan yıkım enzimleri (metalloproteazları) azalttığı ayrıca sinovial sıvıda PGE2
ve prekürsörlerini de azalttığı gösterilmiştir. Uzun süreli araştırmalarda kıkırdak matriks
biyosentezi üzerinde toksik etkisinin gözlenmemesi osteoartit gibi uzun süreli NSAĐ ilaç
gereksinimi olan hastaların tedavisinde tercih edilme nedeni olabilir. Yan etkileri diğer
propiyonik asit türevlerinde olduğu gibi görülmektedir.
5. Fenilasetik Asit Türevleri: Bu grubun üyeleri; diklofenak, nabumeton ve
fenklofenaktır.
Diklofenak: Fenilasetik asidin basit bir türevi olup, flurbiprofen ve meklofenamata
benzer. Siklooksijenazın güçlü bir inhibitörüdür ve indometazine yakın antienflamatuvar etki gösterir. Diklofenak ile hem COX–1 ve COX–2 hem de
lipooksijenazın inhibe edildiği ve ayrıca lökositlerde araşidonik asit konsantrasyonunu
azalttığı bildirilmiştir139,249. Oral yolla alındığında süratle absorbe olur. Hastalar
tarafından iyi tolere edilir. Doz alındıktan 1–2 saat sonra maksimum plazma
konsantrasyonları elde edilir. Yarılanma ömrü kısadır (1–2 saat kadar). Sinovial sıvıya
geçebilmektedir. Aspirin ile birlikte kullanılırsa diklofenak’ ın plazma düzeyleri azalır.
Rektal, parenteral ve topikal kullanımı mümkündür. Yan etkileri diğer NSAĐ ilaçlarda
42
görülen
yan
etkilere
benzer.
Ancak
daha
az
ve
daha
hafif
bulgularla
seyredebilmektedir243.
Nabumeton: Asidik yapıda olmayan naftilalkanon türevidir. Zayıf siklooksijenaz
inhibisyonu sağlar. Ön ilaç olarak alındıktan sonra karaciğerde naftil asetik aside
dönüşür252. Bu metabolit naproksene benzer. Nonasidik olan bu ilaç oral yolla
alındığında mide mukozasında koruyucu prostaglandin (COX–1) sentezi üzerindeki
bozucu etkisini minimuma indirir. Yan etkileri diğer NSAEĐ’a göre daha az görülmekte
ve hafif seyretmektedir.
6. Đndolasetik Asit Türevleri
Đndometazin: Bir indol türevi olan indometazin, nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaçlar
arasında en etkili anti-enflamatuvar etkiye sahip olanıdır55. Prostaglandin sentezini güçlü
bir şekilde inhibe eder. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak inaktive ettiği
gösterilmiştir139. Bazı araştırmalarda da indometazinin kondrosit metabolizması üzerinde
olumsuz etkileri olduğu ve proteoglikan sentezini inhibe ettiği belirtilmektedir.
Ankilozan spondilit, osteoartrit, romatoid artrit, gut artriti, bursit, tendinit ve travmatik
snovitte kullanılır242,253.
Đndometazinin yan etkileri doza bağımlı olarak artış göstermektedir. Günlük dozun
(150 mg) artırılması yan etkilerin sıklığını ve şiddetini arttırmaktadır. Yüksek doz
uygulamalarda olguların en az 1/3’ün de tedavinin kesilmesini gerektiren reaksiyonlar
ortaya çıkabilmektedir. Gastrointestinal sistem yan etkilerinin yanısıra % 25–50’ye
yakın oranlarda vasokonstriktör etki ile birlikte başağrısı, baş dönmesi, konfüzyon,
depresyon veya hallusinasyon görülebilir. Kan basıncında yükselmeye neden olabilir.
Hematolojik yan etkiler görüleceği gibi yine renal yan etkileri açısından da
43
önemsenmelidir. Böbrek fonksiyonları sağlıklı olmayan kişilerde kullanımı sakıncalıdır.
Son olarak kemik iliğini deprese edici etkisinden dolayı çocuklarda kullanılmamalıdır.
Ketorolak: Trimetamin propiyonik asidin pirolopirol derivesidir. Yapısı itibariyle
tolmetine benzer. Güçlü siklooksijenaz inhibitörü özelliği yanında güçlü analjezik etkisi
de bulunmaktadır139. Suda çözünebilir olması nedeniyle daha çok parenteral
kullanımlarına yer verilmektedir. Romatizmal hastalıklarda denenmiş olup ancak tercih
edilmemiştir. Daha çok postoperatif ağrılı durumlarda kısa süreli (2–5 gün) olarak
analjezi için kullanılır.
Sülindak: Sulfoksid grubu içeren karaciğerde biyotransformasyonu sonucu sülfide
çevrildikten sonra etkin hale gelen bir ön ilaçtır. Sülfid safra ile atıldıktan sonra
barsaktan reabsorbe olur. Mideden inaktif halde geçtiğinden gastrik yan etkilerinin
oldukça azaldığı düşünülmektedir. Renal prostaglandin ve prostasiklin sentezini fazla
inhibe etmediği ve bu nedenle de böbrek üzerine olan yan etkilerinin daha az olduğu
düşünülmektedir248. Araştırmalarda hipertansiyonlu hastalarda tercih edilmesi gerektiği
vurgulanmıştır. Çünkü antihipertansif ilaçların etkinliğinde azalmaya neden olmadığı
belirtilmektedir. SSS yan etkileri indometazine göre daha çok olarak görülmektedir.
Kemik iliği üzerine yan etkiler, gastrointestinal yan etkiler, renal yan etkiler ve
hipersensitivite reaksiyonları görülebilir248.
7. Fenamik Asit Türevleri: Mefanemik asit, flufenamik asit ve etofenamat bu grubun
üyeleridir.
Mefanemik asit: Fenamatlar gurubunda yer alan mefenamik asit anti-enflamatuvar
etkisini prostaglandin sentezini inhibe ederek göstermektedir249. Analjezik etkisi aspirine
eşdeğer, anti-enflamatuvar etkisi ise aspirinden daha zayıftır. Yan etkileri nedeniyle
44
uzun süre kullanılmaması gerekmektedir. Araştırmalarda gastrointestinal sistem ve renal
yan etkiler ile kemik iliği üzerine önemli yan etkileri rapor edilmektedir249. Uzun süreli
tedavilerde nefrotoksik yan tesirleri görülmüştür. Çocuklarda kullanılmamaktadır.
Flufenamik asit: Antiiflamatuvar etkisi mefenamik asitten daha güçlü olamsına rağmen
analjezik etkisi daha zayıftır139. Yan etkileri açısından mefenamik aside benzer özellikler
göstermektedir.
Etofenamat: Flufenamik asidin lipofilik ester türevidir. Doku içine nüfuz etme özelliği
nedeniyle topikal kullanımları tercih edilir.
8. Oksikamlar: Bu grupta; piroksikam, tenoksikam ve meloksikam yer alır.
Piroksikam: Enolik asidin oksikam türevidir. Güçlü siklooksijenaz inhibisyonu yapan
ancak lipooksijenaz yolunu etkilemeyen bir ilaçtır175. Eliminasyon yarılanma ömrünün
oldukça uzun bir süre (50 saat) olması nedeniyle günde tek doz kullanımı olanak
dâhilindedir254. Oral olarak hızla absorbe olmakta, 3–5 saat içerisinde maksimum etkin
plazma düzeylerine ulaşmaktadır. En sık görülen yan etkisi gasrointestinal sistemde
olup, ilaç alanların % 20’sin de görülür241,255.
Tenoksikam: Güçlü siklooksijenaz inhibisyonu sağlayan tenoksikam bir oksikam
türevidir. Farmakolojik etkileri piroksikama benzer. Tek farkı eliminasyon yarılanma
ömrü piroksikamdan daha uzundur (60–70 saat). Günde tek doz kullanımı mümkündür.
Daha çok gastrointestinal sistem yan etkileri gözlenmektedir. Diğer yan etkiler açısından
ise oksikamlarda bildirilen yan etkilerin ortaya çıktığı görülmektedir.
9. COX–2 Selektif Đnhibitörleri: Bu grup içinde meloksikam, nimesulid, rofekoksib ve
selokoksib vardır.
45
Meloksikam: Yeni bir enolik asit türevi olarak çıkarılan bu ilacın selektif COX–2
inhibisyonu yaptığı bazı araştırmalarda gösterilmektedir256,257. Oral yolla alındıktan 5–6
saat sonra maksimum plazma düzeylerine çıkmaktadır. Eliminasyon yarılanma ömrü
ortalama 20 saattir. Rektal veya intramuskuler kullanımı da mümkündür. Hastalar
tarafından iyi tolere edilir258. Yüksek oranda plazma proteinlerine bağlanır. Atılımı idrar
ve feçesle olur. Zayıf bir PGE2 inhibitörü olması nedeniyle gastrik yan etkilerin az
olduğunu gösteren çalışmalar rapor edilmekte ve bu ilaç ile ilgili araştırmalar devam
etmektedir.
Nimesulid: Sulfonanilid grubu içermesi nedeniyle diğer enol ve karboksil grupları ihtiva
eden NSAĐ ilaçlardan farklıdır. Selektif COX–2 inhibitörüdür258. Nimesulidin COX–2
inhibisyonu doza bağımlıdır. Doz arttıkça COX–2 selektivitesi azalıp daha çok COX–1
inhibisyonu oluşur259. Ayrıca prostaglandin sentezi inhibisyonundan farklı olarak oksijen
radikallerinin oluşumunu ve myeloperoksidaz enziminin serbestleşmesini de inhibe
etmektedir260,261. Bununla paralel olarak nimesulidin beyinde de oksijen kökenli serbest
radikallerini azalttığı bildirilmiştir262. Yan etkileri diğer NSAEĐ ile benzerlik
göstermektedir. Ancak gastrointestinal yan etkilerinin daha az olduğu üzerinde
durulmaktadır. Hatta steroidlerle beraber nimesulid verilmesi steroidlerin mide dokusuna
olan hasarını bile önlemektedir263. Son yıllarda spesifik olarak COX–2 enzimini inhibe
eden ilaçlar gündeme gelmiştir. Bu ilaçlar diğer nonsteroidal anti-enflamatuvarlar gibi
analjezik264, anti-enflamatuvar264-266 ve antipiretiklerdir267. Yapılan araştırmalarda mide
dokusunda COX–1 reseptörlerinin çok fazla olduğu, COX–2 reseptörlerinin ise az
olduğu bulunmuştur. Buna paralel olarak NSAEĐ’ın kullanımına bağlı gelişen mide
dokusu hasarının COX–2 inhibitörü kullanılarak en aza indirilebileceği gösterilmiştir.
Yapılan birçok çalışma COX–2 inhibitörü ilaçların GĐS üzerindeki yan etkisinin oldukça
46
az olduğunu263,265,266,268-270 göstermiştir. Bu grup ilaçlara koksib grubu ilaçlar
denilmektedir. Bu ilaçların analjezik ve anti-enflamatuvar etkilerinin diğer NSAĐ ilaçlar
kadar
olduğu
fonksiyonlarını,
ancak
platelet
Tromboksan
A2’yi
agregasyonunu
ve
inhibe
etmedikleri
kanama
zamanını
için
trombosit
etkilemedikleri
araştırmalarda gösterilmektedir269–271.
Rofekoksib ve Selokoksib; Bu ilaçlar COX–2’yi nimesulid ve meloksikama göre
yüzlerce kat daha fazla inhibe ederler218. Yiyeceklerle etkileşimleri minimaldir.
Gastrointestinal emilimi tama yakındır272. Yarı ömürleri uzun olduğu için, günlük tek
doz yeterlidir. Metabolizması lineer olmadığından ilacın yeterli kan düzeyine ulaşması
için belli bir düzeyde birikmesi gerekmektedir. Karaciğerde sitozolik enzimlerle inaktive
edildiği için ilaç etkileşiminin az olması en önemli avantajlarından biridir. Đlacın % 72’si
idrarla, % 14’ü feçes yoluyla atılır117,267,272. Akut ağrı ve primer dismenorede yüksek doz
önerilirken, romatoid artrit ve osteoartrozda düşük doz kullanımı önerilmekte olup etkisi
naproksen sodyumla eşdeğerdir266,269. Yapılan çalışmalar spesifik COX–2 inhibitörü
olan rofekoksib ve selekoksibin aspirin gibi kolon kanserini önlemede etkin olduğunu bu
nedenle profilaktik olarak kullanılmasının yarar sağlayabileceğini göstermiştir273,274.
Diğer yeni bir gelişme ise bu ilaçların Alzheimer hastalığının gelişmesini ve ilerlemesini
önemli ölçüde azalttığını göstermektedir275. COX–2’lerin kardiyovasküler sisteme olan
etkileri yapılan birçok çalışmayla gösterilmiştir. Đlk olarak bu ilaçların kan basıncını
yükselttiği gösterilmiş olup, bu etki selekoksib kullanan hastalarda rofekoksib
kullananlara göre daha az görülmektedir276,277. Vasküler endotelde PGI2 sentezi ağırlıklı
olarak COX–2 üzerinden olmaktadır ve bu etki özellikle endotel hücrelerinde çeşitli
enflamatuvar olaylar sonucu artış göstermektedir278. Yapılan çalışmalar kalpte geç faz
iskemik hasarda COX–2 mediatörlerinin koruyucu etkili olduğunu göstermiştir279.
47
Teorik olarak vasküler endotelde COX–2 enzimi üzerinden olan PGI2 sentezinin
koksibler ile inhibe edilmesi, buna karşın trombositlerde tromboksan üretiminin COX–1
üzerinden devam etmesi koksiblerin özellikle trombojenik açıdan önemli bir risk
taşıyabileceğini düşündürmektedir. Bu etkinin klinik anlamı yapılan prospektif ve
retrospektif çalışmalarda halen incelenmektedir280,281. Ayrıca yapılan bir çalışma da
COX–2 inhibitörlerinin ovulasyonu bozduğunu ve bu ilaçların potansiyel bir infertilite
etkeni olabileceğini göstermiştir282. COX–2 selektif inhbitörlerinin böbrekler üzerinde
etkisi mezanjiolitik hasar, albüminemi ve glomerüler endotelial hücre hasarına bağlı
olarak gelişen glomerulonefrittir283. Bu nedenle kronik kullanılmaları halinde böbrek
fonksiyon testleri ile hasta periodik olarak kontrol edilmelidir.
2.4. ANTĐOKSĐDANLAR
2.4.1. Serbest Radikaller
Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron ihtiva eden atom
veya moleküllerdir. Bu tip moleküller ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça
aktiflerdir ve bu yüzden nüfuz edici özelliğe sahiptirler. Serbest radikaller üç yolla
meydana gelirler284.
1 - Kovalent bağlı bir molekülün her bir grubunda ortak elektronlardan birinin
kalarak homolotik olarak bölünmesi.
X:Y
.
X + Y.
2 - Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik
bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atom veya
atom gruplarının birinde kalırlar. Böylece serbest radikaller değil iyonlar meydana gelir.
48
X :- + Y+
X:Y
3 - Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi
A. –
A+e
Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan
radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler
oksijenin kendisi, süperoksit, hidrojen peroksit, geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil
radikalleridir285. Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları sonuncu genellikle
hidroksil radikalleri meydana gelir. Oksijen elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu
elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir di radikal olarak
değerlendirilmektedir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca
reaksiyona girmesini sağlarken, radikal olmayan maddelerle ise nispeten daha yavaş
reaksiyona girmesini sağlar. Oksijenin son indirgenme ürünü genellikle sudur, ancak
kısmi redüksiyonla çok sayıda yüksek derecede reaktif ürünler de oluşturabilmektedir.
2.4.1.1. Serbest Radikal Çeşitleri
Süperoksit Radikali: Hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron olarak
–
indirgenmesi sonucu serbest süperoksit radikal anyonu (O2• ) meydana gelir.
O2 + e•
–
O2•
–
49
Süperoksit bir radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak zarar vermez.
Süperoksitin zararlı etkileri çok iyi anlaşılmamasına rağmen, yüksek derecede toksik
olduğuna dair birçok deliller vardır286,287.
Bununla beraber oksidatif hasarda nadiren rol alırlar, çünkü hızlı bir şekilde
süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından hidrojen perokside (H2O2) çevrilirler.
Buna ilaveten asidik durumlarda H2O2 ve peroksil (HO2-) radikallerini üreten spontan
protonasyona uğrarlar287.
Bu süperoksit radikallerinin asıl zararları, hidrojen peroksit kaynağı ve geçiş
metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarıdır.
–
O2• + O2 + 2H+
H2O2 + O2
Süperoksit fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit ile birleşmesi sonucu
reaktif bir oksijen türevi olan peroksinitrit meydana getirir.
–
O2• + NO.
ONOO-
Böylece NO. in normal etkisi inhibe edilir. Ayrıca peroksinitritlerin doğrudan
proteinlere zararlı etkileri vardır ve azot protoksit (NO2- ), hidroksil radikali ( .OH ) ve
nitronyum iyonu (NO+ ) gibi başka toksik ürünlere de dönüşürler.
Süperoksit anyonu hem oksitleyici hem de indirgeyici özelliğe sahiptir. Adrenalin,
dopamin, askorbat ve hidroksil amini oksitler, nitrobluetetrazolium ve sitokrom c'yi
indirger. Redüktan olarak görev yaptığında, ferrisitokrom c’nin redüksiyonunda bir
50
elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise
epinefrinin oksidasyonunda bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir284.
Süperoksit ile perhidroksil radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside
olurken diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonu sonucu oksijen ve hidrojen
peroksit meydana gelir288.
HO2. + O2•
–
+ H+
H2O2 + O2
Diğer taraftan indirgenmiş geçiş metallerinin oto oksidasyonu da süperoksit
meydana getirebilmektedir289.
Fe2+ + O2
Fe3+ + O2•
–
Cu+ + O2
Cu2+ + O2•
–
Bu reaksiyonlar geriye dönüşlü redoks reaksiyonları olarak kabul edilmektedir ve
serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir290.
Hidrojen Peroksit: Asidik ortamda moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki
elektron alması veya süperoksitin bir elektron alması sonucu hidrojen peroksit meydana
gelir288,291.
–
O2• + e- + 2H+
O2 + 2e- + 2H+
H2O2
H2O2
51
Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi süperoksitin
dismutasyonu ile olur. Süperoksit molekülü proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler
oksijeni oluştururlar289.
Bu dismutasyon ya spontandır ya da süperoksit dismutaz enzimi tarafından
katalizlenir. Spontan dismutasyon pH 4.8 'de en hızlıdır. Süperoksit dismutaz tarafından
katalizlenen dismutasyon ise daha geniş bir pH aralığında olur.
–
2 O2• + 2H+
SOD
H2O2 + O2
H2O2 kendi başına serbest radikal değildir, çünkü ortaklanmamış bir elektron
içermemektedir286,292. Hidrojen peroksit serbest bir radikal olmadığı halde, reaktif
oksijen türleri içine girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü
Fe ve Cu gibi geçiş metalleri varlığında süperoksit ile reaksiyona girerek en reaktif ve
zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla
yıkılabilir288.
H2O2 + O2•
–
Fe2+ veya
Cu
+
OH. + OH- + O2
Bu reaksiyona ‘Haber - Weiss Reaksiyonu’ adı verilir. Haber - Weiss Reaksiyonu
katalizör varlığında veya katalizörsüz cereyan eder. Fakat katalizörsüz reaksiyon
oldukça yavaş ilerler. Demirle katalizlenen ikinci şekli ise çok hızlıdır. Bu reaksiyonda
önce ferri demir (Fe3+) süperoksit tarafından ferro demire (Fe2+) indirgenir. Sonra bu
ferro demir kullanılarak “Fenton reaksiyonu” ile hidrojen peroksitten .OH ve OHüretilir293. Reaksiyon mekanizması aşağıdaki şekildedir289.
52
O2•
–
+ Fe3+
Fe2+ + H2O2
O2 + Fe2+
Fe3+ + .OH + OH-
Hidroksil radikali: Hidroksil radikali (.OH) hidrojen peroksidin geçiş metallerinin
varlığında indirgenmesiyle (Fenton reaksiyonu) meydana gelir288.
Suyun yüksek enerjili iyonize edici reaksiyona maruz kalması sonucunda da
hidroksil radikali oluşur.
H-O–H
H. + .OH
Son derece reaktif bir oksidan radikaldir. Oluştuğu yerde büyük hasara neden olur.
Hidroksil radikali birçok biyolojik molekülden hidrojen atomu koparır. Bunlardan birisi
de tiollerdir.
R-SH + .OH
RS. + H2O
.
.
Meydana gelen sülfür radikali oksijenle birleşerek RSO2 ve RSO gibi oksisülfür
radikallerini meydana getirir. Bu radikaller de biyolojik moleküllerde hasar yapıcı etkiye
sahiptir.
Belki de hidroksil radikalinin en iyi tanımlanmış biyolojik hasarı lipit
peroksidasyonu’nu uyarmasıdır. Bu durum hidroksil radikallerinin membranlara yakın
bir yerde üretilmesi ve membran fosfolipid zincirinin yağ asidi tabakasına atak yapması
53
ile meydana gelir. Bu radikalin araşidonik asit gibi doymamış yağ asitlerine olan ilgisi
daha fazladır.
Singlet oksijen: Singlet oksijen (1O2) ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal
olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana
geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. Singlet oksijen
elektronlarından birinin enerji alarak ters spinli başka bir orbitale uyarılması sonucu
oluşur286.
Diğer radikaller: Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller
(R.), peroksil radikalleri (ROO.), alkoksil radikalleri (RO.), tiyol radikalleri (RS.) gibi
önemli serbest radikaller de oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ
asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol
radikalleri ise oksijenle tekrar reaksiyona girerek sülfenil (RSO.) veya tiyol peroksil
(RSO2.) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler.
2.4.2. Serbest Radikallerin Kaynakları
Biyolojik kaynakları:
Aktive olmuş fagositler: (Respiratory Burst)283,288.
Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin ve adriamisin
Radyasyon294.
Alışkanlık yapan maddeler: Alkol ve uyuşturucular
Çevresel ajanlar: Hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, hiperoksitler,
pestisitler, sigara dumanı, solventler, anestezikler ve aromatik hidrokarbonlar
54
Stres: Streste katekolamin düzeyi artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest
radikal kaynağıdır. Bu olay, stresin hastalıkların patojenezindeki rolünün serbest radikal
üretimiyle ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir.
Đntrasellüler kaynakları:
Küçük moleküllerin oto oksidasyonu: Tioller, hidrokinonlar, katekolaminler,
fiavinler, tetrahidropterinler, antibiyotikler293, 295,296.
Enzimler ve proteinler: Ksantin oksidaz, dioksijenaz, hemoglobin. Birçok enzimin
katalitik siklusu esnasında serbest radikaller açığa çıkar. Ksantin oksidaz serbest radikal
oluşturan enzimler içinde en çok araştırılmış olanıdır288. Normalde NAD bağımlı
dehidrojenaz olarak etki eder ve herhangi bir serbest radikal üretimine sebep olmaz.
Fakat in vivo olarak oluşturulan iskemi, enzimin dehidrojenaz formundan oksidaz
–
formuna dönüşmesine ve süperoksit (O2• ) radikalinin üretimine sebep olur292. Aldehit
oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer ve substratlarının çoğu aynı olup,
süperoksit radikali üretir. Benzer şekilde triptofan dehidrojenaz gibi enzimler de radikal
oluşumuna sebep olurlar289,297.
Mitokondriyal elektron transportu: Normalde hücrelerde en büyük serbest radikal
kaynaklarından biri elektron transport zincirinden elektron sızıntısıdır. Mitokondri iç
zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği
zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar289. Böylece NAD+ bağlı substratlar,
süksinat, ADP ve oksijen gibi endojen faktörler oksidatif fosforilasyonu regüle ederek
mitokondriyal radikal üretimine etki ederler.
Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron transport sistemleri:
(Sitokrom P-450, sitokrom b5) Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda ise
serbest radikal üretimi membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır.
55
Membrana bağlı sitokrom P–450 ve b5, doymamış yağ asitleri ve ksenobiyotikleri
redükte ederken dioksijen ve diğer substratları ise okside ederler.
Peroksizomlar, oksidazlar, flavoproteinler: Peroksizomlar çok önemli hücre içi H2O2
kaynağıdırlar. Bu organeldeki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit
oksidaz ve yağ asidi açil COA oksidaz gibi oksidazlar süperoksit üretmeden bol
miktarda H2O2 üretimine sebep olurlar. Ancak peroksizomlarda katalaz aktivitesi de çok
yüksek olduğu için bu organelden sitozole ne kadar H2O2 geçtiği bilinmemektedir 289.
Aktive olmuş fagositler: Bakterisidal
rollerinin sonucu olarak
süperoksit
üretirler288,294, 298.
Plazma membranı: Plazma membranı serbest radikal oluşum reaksiyonlarının kritik
bir bölgesidir. ekstraselüler olarak üretilen serbest radikaller diğer hücre komponentleri
ile reaksiyona girmeden önce plazma membranını geçmek zorundadırlar. Bu geçiş
sırasında membranda toksik maddeleri üreten reaksiyonlar başlatabilirler. Membranda
yer alan ve fosfolipitler, glikolipitler, gliseridler ile sterollerin bünyesinde bulunan
doymamış yağ asitleriyle okside olabilen ve amino asit içeren transmembran proteinleri
serbest radikal hasarından çabuk etkilenirler. Lipit peroksidasyonu veya yapısal olarak
önemli proteinlerin oksidasyonunun sebep olduğu artmış membran permeabilitesi
transmembran iyon gradiyentinin bozulmasına, sekretuar fonksiyonlarının kaybına ve
integre sellüler metabolik proseslerin inhibisyonuna sebep olur291. Hidrojen peroksit,
membranları neredeyse su kadar kolay geçebilme özelliğine sahiptir. Saldırgan O2•
–
radikal anyonu membranları ve transmembranal anyon kanallarını geçerek hücreye girer.
Aynı zamanda polianyonik hücre yüzeyi, çevre doku sıvısından 2–3 pH daha düşük
olduğu tahmin edilen bir mikro çevre sağlayan çoğu çözünmüş H+ den oluşan son derece
56
zıt bir konsantrasyonu çeker. Bu pratik çevre O2•
–
in protonla reaksiyonu sonucu
perhidroksil radikalinin oluşumunu sağlar291.
H- + O2•
–
–
HO2•
–
–
HO2• , O2• den daha güçlü bir oksidandır, bu nedenle lipitlerin ve proteinlerin
hidrofobik kısımlarını daha iyi parçalayabileceği ve toksik etkilerinin daha fazla
olabileceği düşünülmektedir. Bu sebeple saldırgan oksijen radikallerine karşı bir bariyer
oluşturan hücre yüzeyleri, diğer radikal türlerine reaktif bir forma modifiye eden ve daha
permeabl bir kapı görevi görür. Serbest radikallerin fagositik hücre plazma
membranında, NADPH-oksidaz aracılı üretimi, serbest radikallerin önemli bir biyolojik
kaynağıdır288. Fagosit kökenli serbest radikaller hem oluştukları hücreye, hem de
yakınında bulunan hücrelere hasar verirler. Lipoksijenaz ve siklooksijenaz gibi plazma
membranıyla bağlantılı enzimler ile mikrozomlar tarafından serbest radikal üretimi, bu
enzimlerin predominant substratı olan araşidonik asit metabolizması ile ilişkili pek çok
yeni buluş ve biyolojik açıdan önemli ürünlerin meydana gelmesinden dolayı ilginçtir.
Bu ürünler prostaglandinleri, tromboksanları, lökotrienleri ve anaflaksinin slow-reakting
substratını içerir (Şekil 2). Son zamanlarda araşidonat metabolizmasında yer alan bu
enzimatik proseslerin otokatalitik lipit peroksidasyonuna öncülük etmesi bu konuya olan
ilgiyi artırmıştır289.
Araşidonik asit metabolizması reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir
kaynağıdır289. Araşidonik asitin biyoaktif ürünlere dönüşümü esnasında geniş
spektrumlu oksijen, karbon ve hemoprotein radikalleri oluşur ve bunlar doku hasarına
57
yol açar299. Prostaglandin sentezi esnasında hidroksil radikali veya diğer radikallerin
üretimi, siklooksijenazın (COX) feed-back regülasyonuna yol açar, prostaglandin
biyosentezinin hız ve süresini modüle eder ve prostaglandin sentezinden sonra ikinci
ulak ve sitotoksik etkilerini hızlandırır. COX, ksenobiyotikleri daha toksik türlere
metabolize etme yeteneğine de sahiptir300,301. Trombositlerde tromboksan sentezinin
imidazol ve nordihidroguiaretik asit gibi radikal toplayıcılarla inhibe edilmesi,
prostaglandin endoperoksitinin tromboksanlara dönüşümünün bir serbest radikal
reaksiyonu sonucu olabileceği düşüncesini kuvvetlendirmektedir287. Lipoksijenaz
kaynaklı peroksitler oksidan-sensitif siklooksijenaz aktivitesini modüle edebilir301. Bu
sebeple, prostaglandin ve tromboksanların biyosentezi, biyosentetik enzimin kendisi ve
diğer hücre komponentleri ile reaksiyon yeteneğine sahip hemoprotein-oksijen ve
karbon merkezli serbest radikallerin oluşmasıyla sonlanır.
Araşidonik Asit
Siklooksijenaz (COX)
5- Lipooksijenaz
.
OH Porfirin Radikali
Peroksitler
Prostaglandin H
Serbest radikal ara ürünleri
Prostaglandinler
Tromboksan
Prostasiklinler
5-HPETE
Lökotienler
Şekil 3. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller
58
Serbest radikallerle prostaglandin metabolizması birbirleriyle yakından ilişkilidir.
Reaktif oksijen metabolitleri fosfolipaz aktivasyonu yolu ile prostaglandin E2, F2, 6-keto
PGF1∝ ve TXB2 sentezini gerçekleştirirler. PGE2 ve I2 adenilat siklazı aktive ederek
cAMP sentezini artırırlar ki, süperoksit de cAMP sentezini artırıcı etkiye sahiptir. Bu
bilgiler reaktif oksijen türlerinin prostaglandin sentezi yolu ile cAMP konsantrasyonunu
artırdıklarını doğrulamaktadır284.
— Hayvan hücrelerinde süperoksitin bir başka kaynağı da askorbik asit, tioller
(glutatyon, sistein gibi) adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin oto
oksidasyonudur284.
— Oksidatif stres yapıcı durumlar: Đskemi, travma, intoksikasyon284.
Hücrelerde serbest radikal üretimi bazı yabancı toksik maddeler tarafından da
büyük oranda artırılabilir. Bu tip maddeler dört grupta toplanabilir284.
1 - Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Kirli havanın koyu rengini veren azot
dioksit302.
gazını buna örnek verebiliriz. NO2. gazı radikalik bir madde olup aynı zaman da iyi bir
lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır.
2 - Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Mesela toksik bir madde olan
karbontetraklorür (CCl4) karaciğerde sitokrom P–450 tarafından triklorometil (CCl3)
serbest radikaline dönüştürülür. Bu radikalin oksijenle reaksiyonu sonucu meydana
gelen peroksil radikali de güçlü bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır.
CCl3 +O2
CCl3O2
59
3 - Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Bunun tipik
bir örneği paraguattır.
4 - Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Mesela parasetamolün karaciğerde sitokrom
P–450 tarafından metabolizması sonucu glutatyon la reaksiyona girerek ve miktarını
azaltan bir ürün meydana getirir.
2.4.3. Serbest Radikallerin Etkileri
Serbest radikaller hücrelerin lipit, protein, DNA, karbohidrat ve enzim gibi tüm
önemli bileşenlerine etki ederler. Mitokondrideki aerobik solunumu ve kapiller
permeabiliteyi bozarlar ve hücrenin potasyum kaybını ve trombosit agregasyonunu
artırırlar. Proteaz, fosfolipaz, elastaz, siklooksijenaz, ksantin oksidaz, Lipoksijenaz,
triptofan dioksijenaz ve galaktoz oksidaz gibi litik enzimleri aktifleştirirken alfa-1antitripsin gibi bazı savunma sistemlerini de inaktive ederler286. Serbest radikallerin
etkileri aşağıdaki şekilde gruplandırılabilir:
Membran lipitlerine etkileri (Lipit peroksidasyonu): Biyomoleküllerin tüm büyük
sınıfları serbest radikaller tarafından etkilenmesine karşın, bunlar arasında en hassas
olanı lipitlerdir. Lipit peroksidasyonu bir serbest radikal kaynağıdır, oksijenle karşılaşan
lipitlerin peroksidasyona uğraması (oto oksidasyonu) sadece besinlerin bozulmasından
(acıma) sorumlu olmayıp aynı zamanda, kanser, yangısal hastalıklar, ateroskleroz,
yaşlanma vb. gibi olaylara neden olabilen doku hasarından da sorumludur. Bu yıkıcı
etkiler metilenle kesintiye uğramış çift bağlar içeren doymamış yağ asitlerinden, peroksit
oluşması sırasında üretilen serbest radikaller (ROO·, RO·, OH·) tarafından başlatılır.
Membranlardaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış(çift) bağları serbest radikallerle
kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Lipit radikallerinin
60
hidrofobik yapıda olması yüzünden reaksiyonların çoğu membrana bağlı moleküllerde
meydana gelir. Bundan da membran permeabilitesi ve mikro vizkozitesi ciddi bir şekilde
etkilenir. Polidoymamış yağ asitlerinin (PUFA) oksidatif yıkımı “lipit peroksidasyonu
(LPO)” olarak bilinir ve oldukça zararlıdır. Çünkü LPO kendi kendini devam ettiren
zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve bu oto katalitik reaksiyonu sonucu oluşan lipit
peroksit, membranının stabilizasyonunu ortadan kaldırarak, hızlı hücre ve doku
bozulmalarına neden olurken lipit, alkol ve aldehitler gibi istenmeyen yan ürünler
oluşur289,303,304. Bu ürünlerin ya hücre düzeyinde metabolize edilirek veya başlangıçtaki
etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarak birçok hastalığa
ve doku hasarına neden olular305. Bu ürünlerden en çok bilineni malondialdehittir
(MDA)306,307. Serbest radikaller tarafından zar lipitlerine direkt saldırı dönüşümlü ve
dönüşümsüz kardiyak etkilerin oluşumuna yol açar. LPO sonucunda, bazıları serbest
radikal aktivitesinin göstergeleri olarak kullanılan, birçok ürün oluşur. LPO’nun
başlangıç aşamalarında dien konjugatlarının oluşumu ile bir moleküler düzenlenme
oluşur. Đnsanlarda en sık görülen linoleik asitin 9,11 izomeridir. Daha sonraki yayılma
evresinde daha ileri LPO ve fragmentasyon(parçalanma) oluşur. Ortaya çıkan son
ürünlerden biri yukarıda bahsedildiği gibi MDA’dır308.
Olayın tamamı aşağıdaki şekilde özetlenebilir304.
1. Başlama safhası
LOOH + metal (n)+
LOO· + metal (n-1)+ + H+
X·
L·
+
LH
+
XH
61
2. Đlerleme safhası
L·
+
O2
LOO·
LOO· + RH
LOOH + R· , vb
3. Sonlanma safhası
LOO· +
LOO·
LOOL + O2
LOO· +
L·
LOOL
L·
+
L·
LL
Olayı başlatan moleküler öncüller genel olarak hidroperoksit ürün LOOH
olduğundan LPO, potansiyel yıkıcı etkileri olan bir zincir tepkimesidir. Gerek insanlar
ve gerek doğada LPO’yu denetlemek ve azaltmak için antioksidanlar kullanılır. Propil
gallat, butillenmiş hidroksianizol (BHA) ve butillenmiş hidroksitoluen (BHT)
antioksidan olarak kullanılan gıda katkılarıdır. Doğada görülen antioksidanlar yağda
çözünen ß-karoten ile E vitaminini (tokoferol), ve suda çözünen C vitaminini kapsar
286,306
.
Proteinlere etkileri: Serbest radikallerin doymamış ve sülfür içeren moleküllerle olan
reaktivitesi sebebiyle, triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metiyonin ve sistein gibi
amino asit içeren proteinler bu serbest radikallerden kolayca etkilenirler. Bu
etkilenmenin sonucunda da sülfür radikalleri ve karbon merkezli radikaller oluşur289. Bu
istenmeyen reaksiyonlar sonucu immünoglobulin G ve albümin gibi çok sayıda disülfid
bağı bulunduran proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını
62
yerine getiremezler. Nitekim serum proteinlerinde, kataraktlı lens proteinlerinde ve
enflamatuar eklem hastalığı olan kişilerin sinoviyal sıvılarındaki IgG ‘lerinde serbest
radikal hasarı tespit edilmiştir284.
Sitoplazmik ve membran proteinleri, ozon ve protoporfirin IX gibi okside edici
ajanlara maruz kaldıktan sonra çapraz bağlanarak dimerleşir veya daha büyük
agregatlara dönüşür. Prolin ve lizin; süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil
radikali üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona
uğrayabilmektedirler
284
. Hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar
gören proteinlerdendir. Örneğin; oksi hemoglobinin O2•
–
veya H2O2 ile reaksiyonu
methemoglobin oluşumuna sebep olmaktadır288,289.
–
O2• + HbFe+2...O2
2H+
Hb-Fe+3 + H2O2 + O2
2H+
H2O2 + 2Hb-Fe+2-O2
2Hb-Fe+3 + 2H2O + O2
Nükleik asit ve DNA’ya etkileri: Đyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller
DNA’yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Sitotoksite büyük oranda,
nükleik asit baz modifikasyonundan doğan kromozom değişikliklerine veya DNA’daki
diğer bozukluklara bağlıdır284,309. OH. radikalinin hem prokaryotik hem de ökaryotik
hücrelerde, radyasyonun sebep olduğu hücre ölümünden büyük oranda (% 80 oranında)
sorumlu bir ajan olduğu düşünülmektedir289. Aktivite olmuş nötrofillerden kaynaklanan
H2O2 membranlardan kolayca geçtikten sonra hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına,
hücre disfonksiyonuna ve hatta ölümüne yol açabilir. Bu yüzden DNA serbest
radikallerden kolay zarar görülebilen açık bir hedeftir. Süperoksite maruz kalan DNA
molekülleri hayvanlara enjekte edildiğinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu
63
oldukça önemli bir etkidir. Çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus
eritematosuz (SLE) ve romatoid artritte (RA) dolaşımında anti-DNA antikorları bulunur.
Süperoksit ve hidrojen peroksitin enzimatik toplayıcıları, (.OH) prekürsörlerinin
konsantrasyonunu azaltarak DNA’yı korur284.
Karbohidratlara etkileri: Serbest radikallerin karbohidratlar üzerine de önemli etkileri
vardır. Monosakkaritlerin oto oksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksitler ve
okzalaldehitler meydana gelir. Bu maddeler diyabet ve sigara içimi ile ilişkili kronik
hastalıkların patolojik proseslerinde de önemli rol oynarlar284.
Okzalaldehitler DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilme ve aralarında çapraz
bağlar oluşturabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etkiye sahiptirler. Böylece kanser
ve yaşlanma olaylarında da önemli rol oynarlar284.
Serbest radikaller enflamatuar cevap ve sekonder doku hasarının modülasyonunda
da önemli rol oynar. Đltihap hücreleri ile ilişkili doku hasarında risk altında bulunan
kollagen ve hiyaluronik asit gibi ekstraselüler doku komponentlerinin, enflamatuar
osteoatiritle etkilendikleri görülmüştür289. Kıkırdak dokunun esas öğesi olan kollagen
O2•
–
ile hasarlanır ve jelasyonu önlenir310. SOD kollagen jelasyonunu süperoksit
inhibisyonundan korur. Eklem sıvısının vizkositesinin devamı için gerekli olan
hiyaluronik asit O2•
süperoksit
–
oluşturan
–
ile depolimerize edilebilir310,311. O2• , H2O2 ve OH. toplayıcıları
sistemden
hyaluronik
asitin
depolimerizasyonunu
önler.
ekstraselüler sıvının çok düşük seviyede SOD ve CAT aktivitesine sahip olması
nedeniyle redükte oksijen türlerinin küçük miktarları bu bölümlerde yaygın hasara sebep
olabilirler289.
Revers, pasif Arthus reaksiyonunun, carragenan’le indüklenen bacak ödeminin
inhibisyonu aktive olmuş lökositlere bağlı akciğer kapiller endotelyal hücre hasarı ve
64
pulmoner
ödemin
azalması
süperoksit
dismutazın
anti-enflamatuar
etkilerinin
örnekleridir195,312.
2.4.4. Antioksidan Savunma Sistemleri
Reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek
için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma
sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinir. Antioksidanlar, (doğal)endojen ve
ekzojen kaynaklı olabilmektedirler. Antioksidanlar aynı zamanda serbest radikal
oluşumunu engelleyen ve mevcut radikalleri etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye
ayrılırlar. Ayrıca enzim ve enzim olmayanlar şeklinde de sınıflandırılan antioksidanlar
hücrelerin hem sıvı hem de membran kısmında bulunurlar.
2.4.4.1. Doğal (Endojen) Antioksidanlar
2.4.4.1.1. Primer Antioksidanlar (Enzimler)
2.4.4.1.1.1. Süperoksit dismutaz (SOD): Süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler
oksijene dönüşümünü katalizleyen bu enzim, beyinde yaygın bir şekilde bulunur ve
aktivitesi yaş artışıyla beraber artar. Đnsanlarda iki tipi vardır. Bunlar sitozolde bulunan
dimerik Cu ve Zn ihtiva eden CuZnSOD ile mitokondri de bulunan tetramerik Mn ihtiva
eden MnSOD287,306 izomerlerdir. SOD’nin Fe ihtiva eden izomeri (FeSOD) ise sadece
mikroorganizmalarda ve bazı bitkilerde bulunur.
Genel olarak hücrede en bol bulunan
izomer sitozolik Cu, Zn-SOD dir. Cu, Zn-SOD ilk defa, 1969'da, Mc Cord ve Fridovic
tarafından hayvan, bitki dokuları ve mayadan saflaştırılmış ve tanımlanmıştır. Molekül
kütlesi 32.000 Daltondur. Đki alt ünitesi vardır ve bunların her birinde bir Cu ve bir Zn
atomu bulunmaktadır. Ayrıca her alt birimde bir zincir içi disülfür köprüsü, bir sülfidril
65
grubu ve bir de asetillenmiş terminal amino grubu bulunmaktadır. Cu/Zn-SOD
enziminin ayrı formları bulunmaktadır. Sitoplazmada bulunanın dışında bazı hayvanların
plazmasında 130.000 Dalton molekül kütleli Cu/Zn-SOD bulunduğu tespit edilmiştir64.
Mn-SOD
mitokondrial
bir
enzimdir
ve
prokaryatların
sitozolünden
elde
edilebilmektedir. Đlk kez 1970 yılında Keele ve arkadaşları tarafından izole edilmiştir.
Buradaki mangan +3 değerliklidir ve iki alt birimden oluşmuştur. Her alt birimde bir Mn
atomu vardır ve 23.000 Dalton molekül kütlesine sahiptir. Mitokondrial SOD hemen
hemen total SOD'nin % 60 'ını içerir. Zira süperoksit sitozole göre mitokondride hemen
hemen iki kat daha fazla oluşur. Tüm SOD'ler fizyolojik şartlarda süperoksite karşı etkin
bir koruma sağlarlar285. Her iki enzimin katalizlediği reaksiyon aynıdır. Enzimin
fizyolojik fonksiyonu lipid peroksidasyonunu inhibe ederek oksijeni metabolize eden
hücreleri süperoksit serbest radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır289,309.
Normalde
metabolizma
sırasında
hücreler
tarafından
fazlaca
süperoksit
üretilmesine rağmen bu enzim sayesinde intrasellüler düzeyleri düşük tutulur. SOD
fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. Bu yüzden SOD
granülosit fonksiyonu için çok önemlidir. Lenfositlerde de granülositlerden daha fazla
oranda SOD bulunur.
2.4.4.1.1.2. Katalaz (CAT): Doğada yaygın bir şekilde mevcut olduğu ilk defa 1901'de
O. Leew tarafından bulunmuştur. Yine ilk defa 1937'de Summer ve Dounce tarafından
karaciğerden kristal formda izole edilmiştir. Molekül kütlesi 240.000 Daltondur. Dört alt
üniteden oluşmuştur. Peroksizomlarda, lizozomlarda ve mitokondride bulunur. Kandaki
katalaz aktivitesi büyük ölçüde eritrositlerden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle insan
eritrositleri katalaz yönünden çok zengindir. GPx esas olarak mitokondri ve sitozolde
bulunurken, katalaz peroksizomlarda bulunur. Eritrositlerde mitokondri olmadığı halde
66
yüksek aktivitede CAT ve GPx vardır. Katalaz 4 tane hem grubu bulunan bir
hemoproteindir. Peroksizomlarda lokalizedir309. Büyük moleküllü lipit hidroperoksidlere
etki etmezken, hidrojen peroksidi oksijen ve suya parçalar313.
2H2O2
CAT
2H2O + O2
2.4.4.1.1.3. Glutatyon peroksidaz (GPx): GPx hidroperoksidlerin indirgenmesinden
sorumlu, tetramerik 4 selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Memeli
eritrositlerinden ilk defa Mills ve arkadaşları tarafından karakterize edilmişlerdir. Daha
sonra yapılan araştırmalarla enzim hakkındaki bilgiler artırılmıştır. Dominant olarak
sitozolik bir enzimdir ve mitokondride düşük düzeylerde bulunur. GPx aktivitesindeki
azalma, hidrojen peroksitin artmasına ve bu da hücre hasarına yol açar. GPx'in beyin
düzeyleri düşüktür. Prostetik grup olarak selenyum (Se) içeren metalloenzimdir.
Beyinde, beyin selenyumunun çok az bir kısmını içerdiğinden dolayı diyetle elde
edilebilirliğinden çok fazla etkilenmez. GPx sitozolik hasara karşı etkin koruyucu bir
mekanizma sağlar. Bu enzim, H2O2'i ve lipid peroksitlerini GSH'u kullanarak redüksiyon
yoluyla uzaklaştırır. GPx aşağıdaki reaksiyonları katalize eder311.
H2O2+ 2GSH
ROOH + 2GSH
GPx
GPx
GSSG + 2H2O
GSSG + ROH + H2O
Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz da (PLGPx) monomerik, selenyum
atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Membran fosfolipid hidroperoksitlerini
alkollere indirger284,309.
67
Membrana bağlı en önemli antioksidan olan vitamin E yetersiz olduğu zaman,
PLGPx membranı peroksidasyona karşı korur.
Hidroperoksitlerin redükte olması ile meydana gelen GSSG, glutatyon redüktazın
katalizlediği aşağıdaki reaksiyon ile tekrar GSH a dönüştürülür314.
GSSG + NADPH + H+
Glutatyon
Redüktaz
2 GSH + NADP
2.4.4.1.1.4. Glutatyon redüktaz (GR): Glutatyon redüktaz 50.000 daltonluk alt
birimlere sahip bir dimerdir. Görevi yükseltgenmiş glutatyonu (GSSG) indirgenmiş
(GSH) hale çevirmektir. Bu indirgenme işlemi sırasında NADPH’dan gelen elektronlar
okside glutatyonun disülfid bağına direkt olarak transfer edilemezler. Sıklıkla önce
NADPH’dan sıkıca bağlı bulunan FAD’ye transfer edilirler. Daha sonraki alt
birimlerdeki 2 sistein arasında bulunan disülfid köprüsüne transfer edilmek suretiyle
okside glutatyona aktarılmış olurlar. Her bir subunit 3 tane yapısal alan içerir, bunlar:
FAD bağlayıcı olan, NADPH bağlayıcı olan ve ara yüz alanıdır. FAD alanı ve NADP+
alanı birbirine benzer ve diğer dehidrojenazlardaki nükleotid bağlayıcı alanlara
benzerler. FAD ve NADP+’nin izoalloksozin ve nikotinamid halkaları birbirine geçecek
şekilde geniş ölçüde aralarında bağlanırlar. Oksidize glutatyon için bağlayıcı alanın bir
alt biriminin FAD alanı ile diğer alt birimin ara yüz alanından meydana geldiği
belirtmek gerekir315.
GSSG + NADPH + H+
GR
2GSH + NADP+
Alyuvarlardaki pentoz fosfat yolu ise, GR’nin GSSG’yi GSH’ye çevrimi için
gereken NADPH’ı sağlar304.
68
2.4.4.1.1.5. Glutatyon S-Transferaz (GST): GST’lar başta araşidonik ve lineolat
hidroperoksitleri olmak üzere lipid peroksitlerine karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz
aktivitesi göstererek bir defans mekanizması oluştururlar309.
ROOH + 2GSH GST
GSSG + ROH + H2O
GST’ler, sisteinin sülfür atomu üzerinden çeşitli elektrofillere glutatyonu aktaran
proteinlerdir. GST, bunun yanı sıra hem, bilirubin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve
deksametazon gibi hidrofobik bileşiklere de yüksek bir afiniteyle bağlanabilmektedir.
E.coli’den insana kadar çok çeşitli türlerden GST saflaştırılabilirken ençok da sıçan
karaciğerinden saflaştırılmıştır. GST’ler en az 7 alt üniteden oluşan homodimer veya
heterodimerlerdirler. Spesifik GST alt ünitelerinin fenobarbitol, 3-metilşolantren, transstilben oksit gibi çeşitli ksenobiyotikler tarafından indüklenmesinden ve dokuya spesifik
bir tarzda ekspresse olmasından beri, GST gen ailesi gen ekspresyonunun dokuya özel
düzenlenmesi ve indüksiyonunun araştırılmasında yararlı bir model sistemi olmuştur316.
GST’ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere LPO’lara karşı
Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi koruyucu mekanizma oluştururlar309.
GST’ler antioksidan aktivitelerine ilave olarak çok önemli biyokimyasal
fonksiyonlara da sahiptirler. Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahip
GST’lerin tüm canlı hücrelerde bulunması hayati önemlerinin bir göstergesidir. Hem
detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Katalitik
olarak, yabancı maddeleri glutatyonda ki sisteine ait -SH grubu ile bağlayarak onların
elektrofilik bölgelerini nötralize eder ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini
sağlarlar. Oluşan bu GSH konjugatları böylece organizmadan atılabilir ve daha ileri bir
69
ürüne metabolize olabilirler. GSH’den glutamat ve glisinin koparılmasından sonra
sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere dönüştürülür309.
Lökotrien C4 ün sentezi GST tarafından katalizlenmekte olup, GST’ler
prostaglandin sentezinde PG izomeraz etkisine de sahiptirler309.
2.4.4.1.2. Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar)
Lipit fazda bulunanlar antioksidanlar α, β, γ (-) tokoferoller (E vitamini) ve βkaroten’dir. Sıvı fazda (hücre sitozolü veya kan plazmasında) bulunanlar ise askorbik
asit, miyoglobulin, melatonin, hemoglobin, üre, ferritin, sistein, metionin, seruloplazmin,
albümin, laktoferrin, bilirubin ve glutatyondur.
2.4.4.1.2.1. Glutatyon (GSH): GSH, birçok hücrede bulunur ve bir tripeptiddir: γ-Lglutamil-L-sisteinilglisin (şekil 6). GSH L-glutamat, L-sistein ve glisinden iki basamakta
sentezlenir. Oluşan her peptid bağı için bir molekül ATP harcanır317.
O
-
SH
H
O
O
N
O
O
N
O
H
-
+ NH3
Şekil 4. GSH’nin molekül yapısı
L-Glutamat + L-Sistein + ATP
γ-Glutamilsistein
sentetaz
γ-Glutamil sistein + Glisin +ATP
Glutatyon
sentetaz
γ-Glutamil sistein + ADP +Pi
GSH + ADP + Pi
70
GSH, hemoglobin ve diğer eritrosit proteinlerinde bulunan sistein rezidülerini
indirgenmiş halde tutarak sülfhidril tamponu görevini görür. Eritrosit hücrelerinde
GSH/GSSG oranı yaklaşık 500’dür. Đndirgenmiş glutatyon yani GSH, aktif bölgesinde
selenyum iz elementini içeren bir enzim olan GPx enzimi katalizörlüğünde H2O2 ve
organik peroksitlerle reaksiyona girerek antioksidan etki sergiler ve H2O2’yi
alyuvarlardan uzaklaştırır. H2O2 birikmesi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon
hızını artırarak alyuvarların yaşama süresini azaltabildiğinden bu tepkime çok önemlidir.
Ayrıca alyuvarlarda hemoglobinin methemoglobine otooksidasyonu ile süperoksit
oluşurken diğer dokularda ise bu sitokrom P 450 redüktaz ve ksantin oksidaz gibi
enzimlerle oluşur304,317,318.
GSH, hidrojen peroksidi veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye
edebilir. GSH’yi peptid bağından dolayı düşük enerjili bileşikler arasında kabul
edebiliriz321. GSH, hücre proteinlerini indirgemiş şekilde tutan disülfit-sülfidril değişimi
tepkimelerinde etki gösterir. Belirli oksidaz tepkimeleriyle oluşan hidrojen peroksidi
uzaklaştıran enzim GPx’e substratlık yaparak proteinlerin sülfidril gruplarını da korur.
GSH yokluğunda hidrojen peroksit birikir. GSSG, GR tarafından sürekli GSH’ye
indirgenerek GSH miktarı düzenlenir319.
Moleküler oksijenden türeyen oksidatif radikaller iki mekanizmayla uzaklaştırılır.
Birincisi, toksik radikallerin enzimatik inaktivasyonudur. Örneğin GPx ve CAT, reaktif
oksijen ara ürünlerini suya indirger. Đkinci mekanizma ise oksijen radikallerini kimyasal
olarak inaktive eden vitamin C, E ve B-karoten gibi diyetle alınan antioksidanlarla
ilgilidir320.
Birçok enzimin şayet sistein tiyol grubu (–SH) oksitlenecek olursa inaktive ya da
inhibe olur. GSH, Gama-glutamilsisteinilglisin, duyarlı ve esansiyel –SH gruplarını
71
içeren enzimlerin doğal aktivatörüdür. Glutatyon hücrede bir ko-enzimden ziyade var
olan amino asit öncüllerinden kolayca sentezlenen doğal bir antioksidandır. Fenilalanin
ve tirozinin oksidatif yıkımında görev alan maleilasetoasetat izomeraz da dahil olmak
üzere glutatyon çok az sayıda enzim için spesifik bir koenzimdir. Glutatyonun hücre içi
derişimi kontrol edilerek birçok enzimin aktivitesi düzenlenebilir319.
2.4.4.1.2.2. Diğer Sekonder Antioksidanlar: Đnsan vücudunda oldukça az miktarlarda
bulunmasına karşın vitaminlerin vücuttaki etkinlikleri oldukça fazladır. Bunların bir
bölümü, besinlerle aldığımız karbonhidrat, yağ ve proteinden enerji ve hücrelerin
oluşması ile ilgili biyokimyasal olayların düzenlenmesine yardımcı olurlar. A, E ve C
vücut hücrelerinin hasarını önleyerek normal işlevlerini sürdürmeleri ve bazı zararlı
maddelerin
etkilerinin
azaltılmasında
(Antioksidan
etki)
yardımcı
olurlar.
Antioksidanlar, hücremizi, serbest radikalleri nötürleştirerek korurlar. Bunlar uyum
içerisinde çalışan bir takım gibi radikalik saldırılara karşı koyarlar. ß-Karotenin,
askorbik asitin ve tokoferolün antioksidan etkileri yıllardan beri bilinmektedir. ßKaroten organizmada A vitaminin parsiyal oksijen öncülü olmasının yanı sıra bir
antioksidan olarak görev yapar. Bununla beraber, 15 torr’da 150 torr’dan daha iyi
antioksidan olduğu, 760 torr’da ise prooksidan olarak davrandığı bildirilmiştir.
Hücrelerin dışında ß-Karoten nöbet tutarken; hücre duvarından, içeri girmek isteyen
saldırganlara karşı savunmayı ise eser elementlerden selenyumun da yardımıyla E
vitaminini üstlenmiştir. Suda çözünen vitaminlerden birisi olan askorbik asit yapı
itibariyle en basit vitaminlerden biridir. Bir şeker asidinin laktonundan ibarettir. Yüksek
yapılı hayvanların pek çoğu ve bitkiler kolayca askorbik asidi glukozdan
sentezleyebilmektedirler. Hücre içerisindeki C vitamini serbest radikallere son darbeyi
vurmakta ve bu şekilde radikallerin tesirleri ortadan kaldırılmaya çalışmaktadır. E
72
vitamini yağda çözünen bir vitamin olup temel görevi lipitleri oksidatif hasardan
korumaktır. Đnce barsaklardan kolayca emilir ve vücudun tüm dokularına taşınarak hücre
membranları etrafında depolanır. Böylece hücre membranında koruyucu bir tabaka
oluşturmuş olur321.
2.4.4.2. Ekzojen Antioksidanlar
1. Ksantin oksidaz inhibitörleri: Tungsten, allopürinol, oksipürnol, folik asit, pterin
aldehit
2. Soya fasulyesi inhibitörleri: Ksantin dehidrojenazın proteolitik etki sonucu ksantin
oksidaza dönüşümünü inhibe ederler.
3. NADPH oksidaz inhibitörleri: Adenozin lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri,
non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar, cetiedil, difenilin iyodoniyum
4. Recombinant süperoksit dismutaz
5. Troloks-c : E vitamini analoğu
6. Endojen antioksidan aktiviteyi artıran maddeler: Glutatyon peroksidaz aktivitesini
artırırlar. Bunlar; Ebselen ve Asetil sisteindir.
7. Diğer nonenzimatik serbest radikal toplayıcıları: Mannitol ve albümin
8. Demir redoks döngüsünün inhibitörleri: Desferroksamin ve seruloplazmin
9. Nötrofil adezyon inhibitörleri
10. Sitokinler: Tümör Nekroz Faktör (TNF) ve Interlökin - 1
11. Barbitüratlar
12. Demir şelatörleri
73
2.4.4.3. Gıda Antioksidanları
- Butillenmiş hidroksitoluen (BHT)
- Butillenmiş hidroksianisol (BHA)
- Sodyum benzoat
- Etoksiguin
- Propilgalat
- Fe - superoksid dismutaz
1.4.5. Antioksidan Etki Tipleri: Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler286.
1. Toplayıcı etki (scavenging etki) : Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma
veya reaktif olamayan yeni bir moleküle çevirme işlemine toplayıcı etki denir.
2. Bastırıcı etki (quencher etki) : Serbest oksijen radikalleri ile etkileşip onlara bir
hidrojen atarak aktivitelerini azaltan veya inaktif şekle dönüştüren etkiye bastırıcı etki
denir.
3. Onarıcı etki (repair etki) : Genellikle DNA’daki hasarların tamir edilmesinde bu etki
devamlı geçerlidir.
4. Zincir kırıcı etki (chain breaking etki ) : Serbest oksijen radikallerini kendilerine
bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etkiye zincir kırıcı etki denir.
Serbest radikaller ve bunları etkisizleştirmek için kullanılan veya üretilen
antioksidanlar hakkında mevcut bilgiler arttıkça bunlara olan ilgi de bilim adamları
tarafından her geçen gün artmaktadır. Bu bağlamda hemen her sahada yapılan
çalışmaların antioksidan özellikler ile birlikte değerlendirme çalışmaları da ön plana
çıkmaktadır.
74
3. MATERYAL VE METOD
3.1. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar
Deneylerde kullanılan bütün kimyasal malzemeler Sigma Chemicals Company
(Germany)’ den temin edilmiştir.
3.2. Deneylerde Kullanılan Cihazlar
Soğutmalı santrifüj
: Hettich Universal 32 R
UV-Visible Spektrofotometre
: Thermo Spectronic-HEλIOS β
pH metre
: Schott CG 842
Hassas terazi
: Scaltec SPB 31
Derin dondurucu
: Sanyo MDF - 235
Magnetik karıştırıcılar
: Boeco MSH 300
Otomatik pipetler
: Eppendorf
Buzdolabı
: Profilo
Saf su cihazı
: GFL 2012
Çalkalayıcılı su banyosu
: Memmert
Homojenizatör
: Ika-Werke
Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör)
: BSI
Kompresör
: Milipore
UV Lambası 254nm - 366nm
: Model Mineralight.
75
3.3. Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları
1. CAT homojenat tamponu (50 mM pH 7.8, %1 Triton x-100 içeren Fosfat Tamponu):
1.7 g KH2PO4 ve 2.5 ml Triton x-100 alınarak 200 ml saf suda çözüldü. pH 7.8’e
ayarlanarak son hacim saf su ile 250 ml’ye tamamlandı.
2. CAT ölçüm karışımı (40 mM pH 7.0’de H2O2 içeren 50 mM Fosfat Tamponu): 1020
µl H2O2 ve 1.7 g KH2PO4 200 ml saf suda çözüldü ve pH 7.0’ye ayarlandıktan
sonra son hacim 250 ml’ye tamamlandı.
3. GPx homojenat tamponu (50 mM pH 7.8, 30 mM KCI içeren Fosfat Tamponu):
0,6804 g KH2PO4 ve 0.2236 g KCI alınarak 1-2 damla 5 M NaOH ile 90 ml saf
suda çözüldü ve pH 7.8’ye ayarlandıktan sonra son hacim saf su ile 100 ml’ye
tamamlandı.
4. GPx ölçüm karışımı :
A - 50 mM Fosfat tamponu: 0,6804 g KH2PO4 alınarak hacmi saf su ile 100
ml’ye tamamlandı.
B - 1 mM EDTA: 0.0029 g EDTA alındı ve hacmi 10 ml’ye tamamlandı. (1
damla 5 M NaOH ile çözünür)
C – 1 mM GSH: 0.0031 g GSH alınarak 10 ml saf suda çözüldü.
D – 0,2 mM B-NADPH: 0.0016 g alınarak 10 ml saf suda çözüldü.
E – 1 mM NaN3: 0.0065 g tartıldı ve 100 ml saf suda çözüldü.
F – 1 EU/ml Glutatyon Redüktaz: 5.2 µl Glutatyon Redüktaz alındı ve 10 ml saf
suda çözüldü.
5. GPx enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 0.25 mM H2O2 ):
25.53 µl H2O2 alınarak ve hacmi 1000 ml’ye distile su ile tamamlandı.
76
6. SOD homojenat tamponu (50 mM pH 7.8, 10 mM EDTA içeren Fosfat Tamponu): 1.7
g KH2PO4 ve 0.73 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve pH 7.8’e
ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml’ye tamamlandı.
7. SOD ölçüm karışımı:
A – 0.3 mM Ksantine: 0.0018 g ksantine alınarak hacmi distile su ile 40 ml’ye
tamamlandı.
B – 0.6 mM EDTA: 0.0035 g EDTA alındı ve hacmi distile su 20 ml’ye
tamamlandı.(2 damla 5 M NaOH ile çözünür)
C – 150 µM NBT (Nitro blue tetrazolium): 0.0024 g NBT alınarak 20 ml distile
suda çözüldü.
D – 0.4 M Na2CO3: 0,5088 g alınarak 12 ml distile suda çözüldü.
E – 1.2 g / L BSA (Bovine Serum Albumine): 0.0061 g tartıldı ve 6 ml distile
suda çözüldü.
8. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (167 U/L Xanthine oksidaz):
Orijinal ambalajından (1 ml’sinde 32 mg protein ve 0.3 U enzim ihtiva eden
enzim) 34.79 µl alındı ve üzerine 2 ml soğuk 2 M (NH4)2SO4 çözeltisi eklendi.
9. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 2 M (NH4)2SO4):
0.7928 g (NH4)2SO4 alındı ve 3 ml distile suda çözüldü. (bu çözelti her seferinde
taze olarak hazırlandı ve soğuk olarak kullanıldı).
10. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (0.8 mM CuCl2): 0.0108 g
CuCl2 alındı ve 100 ml distile suda çözüldü.
11. GSH Homojenat Tamponu ( 50 mM pH 7.4, Tris - HCI Tamponu ):
1.514 g Tris-HCI alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve pH 7.4’e ayarlandıktan
sonra son hacim distile su ile 250 ml’ye tamamlandı.
77
12. GSH ölçüm tamponu (200 mM pH 8.2, 0.2 mM EDTA içeren Tris-HCI Tamponu):
6.05 g Tris-HCI ve 0.0146 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve pH
8.2’ye ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml’ye tamamlandı.
13. GSH miktarını ölçmek için gereken çözelti ( 10 mM DTNB ):
0.03963 g DTNB alındı ve 10 ml’ye metanol ile tamamlandı.
14. LPO homojenatı tamponu ( % 10 KCI ):
10 g KCI alınarak 100 ml saf suda çözüldü.
15. LPO ölçüm karışımı:
A - % 8 Sodyum lauril sülfat (SLS): 0.8 gr SLS alınıp distile su ile 10 ml’de
çözüldü.
B - % 0.08 Tiyobarbütirik (TBA): 0.48 gr TBA alınarak 1-2 damla 1 M NaOH
ilavesi ile hacmi 60 ml’ye tamamlandı.
C – % 20 Asetik asit: 13 ml glasiyel asetik asit alındı üzerine 65 ml distile su
eklendi.
3.4. Deney Bitkileri
Bu araştırmada çalışma materyali olarak bölgemizde yeterli düzeyde elde
edebileceğimiz bir liken türü olan Peltigera rufescens (Weis) Humb. tercih edildi. Liken
örnekleri, Erzurum Oltu Đnci köyü Masirik çevresinden 40˚ 34’ enlem, 41˚ 50’
boylamda 1800 m yükseklikte 2002 tarihinde Dr. Ali ASLAN tarafından toplandı ve
uluslar arası teşhis yöntemleri kullanılarak tür teşhisi yapıldı22.
Türün herbaryum örneği Atatürk Üniversitesi, Kazım Karabekir Eğitim Fakültesi
Herbaryumu’nda muhafaza edilmektedir.
78
3.5. Bitki Ekstresinin Hazırlanması
Liken örnekleri toplandıktan sonra yabancı maddelerden temizlendi ve oda
sıcaklığında, gölgede kurutuldu. Kuru örnekler bir havanda sıvı azot ile öğütülerek toz
haline getirildi. 100 g öğütülmüş liken örneği çalkalayıcılı bir su banyosunda iki gün
süreyle devam ettirilerek metanol ile ekstrakte edildi ( 50 °C, 250 ml x 4). Metanol
döner buharlaştırıcıda düşük basınç ve düşük sıcaklıkta uzaklaştırıldı. Metanolun
uzaklaştırılması ile elde edilen metanol ekstresi suda çözüldü ve su 5 µm-Hg basınç
altında liyofilize edilerek uzaklaştırıldı ve (% 1.77 verimle) 1.77 g liyofilizat elde edildi.
Elde edilen liyofilizat deneyler yapılıncaya kadar -20 oC’ta muhafaza edildi. Elde edilen
ekstre PRME olarak isimlendirildi.
3.6. Deney Hayvanları
Tez çalışmamızda 180-200g ağırlıktaki Sprague-Dawley erkek ratlar kullanıldı.
Akut enflamasyon deneyleri ve biyokimyasal analizler için toplam 48 adet, kronik
enflamasyon deneyleri için ise toplam 24 adet olmak üzere toplam 72 rat kullanılmıştır.
Deney hayvanları (Şekil 7), Atatürk Üniversitesi, Tıbbi Deneysel Uygulama ve
Araştırma Merkezi Laboratuvarlarından temin edildi. Tez kapsamındaki farmakolojik
analizler ve deneyler Tıp Fakültesi, Farmakoloji A.B.D. laboratuvarlarında yapıldı.
Hayvanlar deneye alınmadan önce gruplara ayrıldı ve standart şartlar altında muhafaza
edildi322.
79
Şekil 5. Araştırmada kullanılan ratları gösteren fotoğraf.
3.7. Cotton pelletler kullanılarak kronik enflamasyon oluşturulması
Deneylerin bu serisinde PRME’nin 200 mg/kg’lık dozunun ve pozitif kontroller
(diclofenac ve indometazin)’in 25 mg/kg’lık dozlarının enflamasyonun proliferasyon
fazına etkileri araştırıldı56. Sıçanların bir grubuna 200 mg/kg’lık dozda PRME, diğer iki
grubuna da 25 mg/kg’lık dozda diklofenak sodyum ve indometazin peroral yoldan sonda
ile verildi. Kontrol grubuna ise aynı hacimde çözücü olarak distile su verildi. Đlaçlar
verildikten 30 dakika sonra sıçanlar 25 mg/kg ketamin ile anestezi edildi ve steril şartlar
altında önceden hazırlanan 7 mg ±1 mg ağırlığında pamuk bilyeler (cotton pellet)
interskapuler bölgede cilt altına yerleştirildi. Đlaçlar yedi gün boyunca günde 1 kez
olmak üzere aynı yoldan uygulandı. 8. gün sıçanlar yüksek doz tiopentalla (50 mg/kg)
80
öldürülerek pamuk bilyeler etrafındaki granulom dokusuyla birlikte çıkartıldı. Đlaçların
antiproliferatif etkisi kontrol grubundan elde edilen sonuçlarla karşılaştırılarak tespit
edildi.
3.8. Karragenin kullanılarak akut enflamasyon oluşturulması
Deneylerin bu serisinde PRME’nin 50, 100, 200 ve 400 mg/kg’lık dozlarının ve
pozitif kontroller (diclofenac ve indometazin)’in 25 mg/kg’lık dozlarının antienflamatuvar etkileri karrageninle oluşturulan enflamasyonlu pençe ödeminde
araştırıldı56,323. Hayvan gruplarına 50, 100, 200 ve 400 mg/kg’lık dozlarda PRME sonda
ile oral yoldan uygulandı. Ekstrenin anti-enflamatuvar etkisi 25 mg/kg’lık dozlarda
uygulanan diklofenak sodyum ve indometazinin anti-enflammatuar etkisi ile
karşılaştırıldı. Kontrol grubuna ise aynı hacimde çözücü olarak distile su verildi.
Karragenin enjekte edilmeden önce hayvanların ayak hacimleri diz eklemine kadar
plethismometrede ölçüldü. Đlaçlar verildikten bir saat sonra bütün sıçanların ayak
pençesine 0.1 ml % 1’lik karragenin enjekte edildi. Karrageninin oluşturduğu
enflamasyonlu pençe hacim artışı (pençe ödemi), her saat başı beş kez ölçüldü.
Ekstraktların anti-enflamatuvar etkileri kontrol grubundan (sadece distile su verilen
grup) elde edilen sonuçlarla karşılaştırılarak tespit edildi.
3.9. Biyokimyasal Ölçümler
Anti-enflamatuvar etkilerin mekanizmalarının aydınlatılmasına ışık tutmak amacı
ile akut enflamasyon deneyleri sonrası rat pençelerinde bazı biyokimyasal incelemeler
yapıldı. Rat pençeleri plathismometriksel ölçümlerden hemen sonra biyokimyasal
incelemeler için -20 oC’de saklandı. Pençelerin enzim aktiviteleri ölçülmeden önce
pençelerin tırnakları hassas bir şekilde pençeden ayrıldı ve üç gün içerisinde pençe
81
homojenatları hazırlandı. Pençe homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda CAT,
GPx, SOD enzim aktiviteleri ve GSH ile LPO miktarları literatürlere dayalı, uygun
metotlar kullanılmak suretiyle tespit edildi. Tüm ölçümler oda sıcaklığında ve üç
tekerrür halinde gerçekleştirildi.
3.9.1. Biyokimyasal analizler için pençe doku homojenatlarının hazırlanması
Pençe dokuları bir havan içinde sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildikten
sonra 0.5 g tartılarak üzerine 4.5 ml tampon çözeltiler (her parametre için farklı bir
tampon sistemi kullanılarak) ilave edildi ve sonra da bir ultra-turraks homojenizatörde
10 dakika süreyle buz üzerinde homojenize edildi. Homojenatlar bir süzgeç kağıdından
süzüldükten sonra soğutmalı santrifüj kullanılarak her enzim için literatürlerde belirtilen
hızlarda 4 oC’de santrifüj edildi ve üstte kalan berrak kısım da (süpernatant) enzim
aktiviteleri tayin edildi324,325.
3.9.2. CAT aktivitesinin Ölçümü
Ölçüm prensibi: Aktivite ölçüm ortamındaki H2O2'in CAT vasıtasıyla H2O’ya dönüşümü
sağlanırken meydana gelen absorbans azalmasının 240 nm'de ölçülmesi esasına
dayanmaktadır. Harcanan H2O2 miktarından CAT aktivitesi aşağıda bahsedilen yönteme
göre hesaplanmıştır.
CAT ölçümü: CAT aktivitesi, Aebi (1984) 'nin belirttiği metoda göre ölçüldü322. 0,5 g
doku üzerine 4.5 ml 50 mM K-fosfat tamponu (pH 7.8) ilave edilerek homojenize
edildi326. Homojenatlar, 18000 g’de 60 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar CAT
aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti
içerisine son konsantrasyonu 20 mM olacak şekilde H2O2 çözeltisinden 1.5 ml konularak
82
numune çözeltisinden 1.5 ml ilave edilir edilmez kronometre çalıştırıldı. Alt üst etme
sonrası spektrofotometrede 240 nm dalga boyundaki absorbans azalması, 15 saniye
aralıklarla 3 dakika süreyle, köre karşı kaydedildi.
CAT aktivitesi’nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan
aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm,
ekstinksiyon katsayısı (