Y MĐKRODELESYON 10 BÖLGE REAL TIME PCR KĐTĐ

advertisement
Y MĐKRODELESYON 10 BÖLGE REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPYD-R10
GĐRĐŞ
DNA ĐZOLASYONU
Y Kromozomu üzerindeki mikrodelesyonlar Klinefelter sendromundan sonra en
Kit genomik DNA ile çalışmaktadır. Kaynak olarak tam kan kullanılmalı, kanlar
sık görülen spermatogenesis eksikliği sebebidir. Y kromozomundaki Ydq11.23
EDTA’lı tüplere alınmalı, alındıktan hemen sonra bir kaç kez tüpü çevirmek
bölgelerinin
bölgeleri
suretiyle kanın pıhtılaşmadan tüp içeriğindeki EDTA ile karışması sağlanmalıdır.
bölgelerdeki
Kan tüpleri, bir iki hafta içinde DNA izolasyonu yapılacaksa + 4°C ‘de, daha uzun
(AZFa,
spermatogenesis
AZFb,
sorumlu
ve
AZFc)
genlerini
V
ve
VI
tekrarlanan
içermektedir.
Bu
mikrodelesyonlar azospermia’ ya neden olmaktadır.
süre bekletilecekse – 20°C de saklanmalıdır.
Kandan Genomik DNA izolasyonu, herhangi bir spin kolon yöntemiyle yapılabilir.
KĐT PRENSĐBĐ
DNA elde edildikten sonra – 20°C de saklanmalıdır. Y Mikrodelesyon 8 Bölge Real
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
Time PCR Kiti, MN NucleoSpin®Blood ve Axygen Blood Genomic DNA kitlerine
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
göre optimize edilmiştir.
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
TEST PROSEDÜRÜ
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
•
Her bölge ayrı strip tüplerde çalışılmalıdır.
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
•
Bir örnek için, her strip PCR tüpüne, 20,5 µl master miks ve 0.3 µl Hot
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
Start Taq DNA Polimeraz, konulur. Daha sonra 4,5 µl (~60-100 ng)
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
örnek DNA ‘sı ilave edilir.
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır.
edilmektedir.
•
Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan karışımdan 20,5 µl
Sistem, PCR için gerekli tüm bileşenleri içerisinde bulundurur. Y kromozomunun
tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları konulmalıdır.
ilgili bölgelerine ait spesifik primerler ve problarla analiz yapılmaktadır. Sistem
ayrıca HEX/JOE boyası ile işaretli internal kontrol içeriği ile PCR reaksiyonunuzun
PCR PROGRAMI
çalışmasını da kontrol etmektedir.
KĐT ĐÇERĐĞĐ
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Bileşen
SY14 (Kontrol) Real Time PCR Master Miks
ZFY (Kontrol) Real Time PCR Master Miks
SY84 (AZF-a) Real Time PCR Master Miks
SY86 (AZF-a) Real Time PCR Master Miks
SY127 (AZF-b) Real Time PCR Master Miks
SY134 (AZF-b) Real Time PCR Master Miks
SY254 (AZF-c/DAZ) Real Time PCR Master Miks
SY255 (AZF-c/DAZ) Real Time PCR Master Miks
SY153 (AZF-c/d) Real Time PCR Master Miks
SY277 (AZF-c/DAZ) Real Time PCR Master Miks
Hot Start Taq DNA Polymerase
Kontrol DNA
20 Test
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
80 µl
80 µl
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
SAKLAMA KOŞULLARI
Mx3000P/Mx3005P
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
Roche LightCycler® 480 System
kadar kullanılabilir.
•
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
35 Döngü
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile, AZF bölgeleri ise FAM
boyası ile analiz edilmelidir.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
DNA eksikliği,
Đnternal kontrol DNA eklediğiniz tüm kuyularda pik vermeli ve CT değeri 23 ≤ X
•
≤ 28 aralığında olmalıdır. Pik alamadığınız durumlar için “olası problemler”
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
bölümüne bakabilirsiniz.
•
Test’te inhibitör varlığı ,
söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Böyle durumlarda çalışma tekrar edilmeli eğer aynı problem devam ediyorsa
yeniden DNA izolasyonu yapılmalıdır.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
[email protected]
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
AZF bölgeleri için de FAM boyasında analiz yapmanız gerekmektedir. Bu boyada
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
görmeniz gereken CT değer aralığı ise 18 ≤ X ≤ 25 dir.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
Eğer pik yoksa
sözkonusu AZF bölgesi için “Delesyon vardır” yorumunu yapabilirsiniz.
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012
Download