ANTĠDĠYABETĠK ĠLAÇ ETKEN MADDESĠ METFORMIN`ĠN IN

ANTĠDĠYABETĠK ĠLAÇ ETKEN MADDESĠ METFORMIN’ĠN IN
VITRO GENOTOKSĠK ETKĠLERĠ
JALANK H. MAHMOUD
YÜKSEK LĠSANS TEZĠ
BĠYOLOJĠ
GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
OCAK 2013
ANKARA
JALANK H. MAHMOUD tarafından hazırlanan ANTĠDĠYABETĠK ĠLAÇ ETKEN
MADDESĠ METFORMIN‘ĠN IN VITRO GENOTOKSĠK ETKĠLERĠ adlı bu tezin
Yüksek Lisans Tezi olarak uygun olduğunu onaylarım.
Doç. Dr. Deniz YÜZBAġIOĞLU
……………………………
Tez DanıĢmanı, Biyoloji Anabilim Dalı
Bu çalıĢma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek
Lisans tezi olarak kabul edilmiĢtir.
Doç. Dr. Zehranur YÜKSEKDAĞ
……………………………
Biyoloji, Gazi Üniversitesi
Doç. Dr. Deniz YÜZBAġIOĞLU
………………………….....
Biyoloji, Gazi Üniversitesi
Doç. Dr. Serkan YILMAZ
……………………………
Sağlık Bilimleri, Ankara Üniversitesi
Tez Savunma Tarihi: 23/01/2013
Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini
onamıĢtır.
Prof. Dr. ġeref SAĞIROĞLU
Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü
…………………………….
TEZ BĠLDĠRĠMĠ
Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranıĢ ve akademik kurallar çerçevesinde elde
edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu
çalıĢmada bana ait olmayan her türlü kaynağa eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
JALANK H. MAHMOUD
iv
ANTĠDĠYABETĠK ĠLAÇ ETKEN MADDESĠ METFORMIN’ĠN IN VITRO
GENOTOKSĠK ETKĠLERĠ
(Yüksek Lisans Tezi)
JALANK H. MAHMOUD
GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
Ocak 2013
ÖZET
Metformin Diabetes Mellitus tedavisinde kullanılan bir antidiyabetik ilaç
etken maddesidir. Bu çalıĢmada, Metformin’in in vitro genotoksik etkileri,
insan periferal kan lenfositlerinde, kromozom anormalliği (KA), kardeĢ
kromatid
değiĢimi
(KKD),
mikronükleus
(MN)
ve
komet
testleri
kullanılarak belirlenmiĢtir. Ayrıca, Metformin’in mitotik indeks (MĠ),
replikasyon indeksi (RĠ) ve nükleer bölünme indeksi (NBĠ) üzerine etkileri
de incelenmiĢtir. Metformin’in 12,5; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 ve 125,0
µg/mL’lik
konsantrasyonları
kullanılmıĢtır.
Metformin
kromozomal
anormallik (Metformin’in 24 saatlik uygulaması hariç) ve kardeĢ kromatid
değiĢimi frekansını negatif kontrole göre önemli düzeyde artırmıĢtır. MN
frekansı 125,0 μg/mL’lik konsantrasyon haricinde hiçbir konsantrasyonda
etkilenmemiĢtir. Tüm uygulamalarda mitotik indeks anlamlı oranda
düĢmüĢtür, ancak bu düĢüĢ doza bağlı değildir. Nükleer bölünme indeksi en
yüksek iki konsantrasyon olan 100,0 ve 125,0 μg/mL’de düĢerken, diğer
dozlarda herhangi bir etki gözlenmemiĢtir. Replikasyon indeksinde ise
herhangi bir değiĢiklik gözlenmemiĢtir. Komet testi sonuçlarına göre
Metformin kuyruk yoğunluğu (125,0 µg/mL hariç) ve kuyruk momentini
etkilememiĢtir. Buna karĢılık Metformin komet kuyruk uzunluğunu dört
konsantrasyonda (25,0; 75,0, 100,0 ve 125,0 µg/mL) önemli oranda
arttırmıĢtır.
In
vitro
insan
lenfositlerinde
Metformin’in
yüksek
v
konsantrasyonlarının özellikle uzun süreli maruziyette klastojenik ve
anojenik etkili olabileceği sonucuna varılmıĢtır.
Bilim Kodu
: 203.1.048
Anahtar Kelimeler : Genotoksik etki, antidiyabetik ilaç etken maddesi,
Metformin, insan lenfosit kültürü, kromozomal
anormallik (KA), kardeĢ kromatid değiĢimi (KKD),
mikronukleus (MN) , komet testi.
Sayfa Adedi
: 64
Tez Yöneticisi
: Doç. Dr. Deniz YÜZBAġIOĞLU
vi
IN VITRO GENOTOXIC EFFECTS OF THE ACTIVE INGREDIENTS OF
ANTIDIABETIC DRUG, METFORMIN
(M.Sc. Thesis)
JALANK H. MAHMOUD
GAZĠ UNIVERSITY
INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
January 2013
ABSTRACT
Metformin is an active ingredient of antidiabetic drug which is used in the
treatment of Diabetes Mellitus. In this study, the in vitro genotoxic effects of
Metformin has been determined in human peripheral blood lymphocytes by
using chromosome aberrations (CAs), sister chromatid exchanges (SCEs),
micronuclei (MN) and comet assays. In addition, the effects of Metformin on
mitotic index (MI), replication index (RI) and nuclear division index (NDI) were
also investigated. 12.5; 25.0; 50.0; 75.0; 100.0 and 125.0 µg/mL concentrations of
Metformin were used. Metformin significantly increased the frequency of
chromosome aberrations (except treatment of Metformin for 24 h) and sister
chromatid exchanges compared with the negative control. MN frequency was
not effected at any concentrations except 125.0 μg/mL. Mitotic index was
significantly decreased at all treatments but this decrease is not dose dependent.
Nuclear division index was reduced at two highest concentrations (100.0 and
125.0 μg/mL) and no significant effect observed at other concentrations. No
difference observed in replication index. According to the comet assay results
Metformin did not effect tail moment and tail intensity (except to 125.0 µg/mL)
at all concentrations. In contrast, Metformin significantly increased the comet
tail length at four concentrations (25.0; 75.0, 100.0 and 125.0 µg/mL). It is
concluded that higher concentrations of Metformin have clastogenic and
vii
aneugenic effects especially at long time exposure on human lymphocytes in
vitro.
Science Code : 203.1.048
Key Words : Genotoxic effect, active ingredient of antidiabetic drug,
Metformin, human lymphocytes culture, chromosomal
aberration (CA), sister chromatid exchanges (SCE), micronuclei
(MN), comet test
Page Number : 64
Adviser
: Assoc. Prof. Dr. Deniz YÜZBAġIOĞLU
viii
TEġEKKÜR
ÇalıĢmalarım boyunca yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren DanıĢmanım Doç. Dr.
Deniz YüzbaĢıoğlu‘na, Yüksek Lisans eğitimim boyunca bilgi ve görüĢlerinden
yararlandığım hocam Prof. Dr. Fatma Ünal‘a, her zaman yanımda olan ve manevi
katkılarıyla beni destekleyen hocam Prof. Dr. Yavuz Beyatlı‘ya saygılarımla
teĢekkür ederim. Ayrıca laboratuvarda çalıĢan Yüksek Lisans ve Doktora öğrencisi
tüm arkadaĢlarıma teĢekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim boyunca maddi, manevi
destekleri ile her zaman yanımda olan aileme de sonsuz teĢekkürlerimi sunarım.
ix
ĠÇĠNDEKĠLER
Sayfa
ÖZET........................................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................................ vi
TEġEKKÜR ............................................................................................................... vii
ĠÇĠNDEKĠLER ........................................................................................................... ix
ÇĠZELGELERĠN LĠSTESĠ ......................................................................................... xi
ġEKĠLLERĠN LĠSTESĠ ............................................................................................. xii
RESĠMLERĠN LĠSTESĠ ........................................................................................... xiii
SĠMGELER VE KISALTMALAR ........................................................................... xiv
1. GĠRĠġ ....................................................................................................................... 1
2. GENEL BĠLGĠLER ................................................................................................. 3
2.1. Diyabet ve Tarihçesi ......................................................................................... 3
2.2. Ġnsülin ............................................................................................................... 3
2.3. Diyabetin Sınıflandırılması .............................................................................. 4
2.3.1. Tip 1 diyabet .......................................................................................... 4
2.3.2. Tip 2 diyabet .......................................................................................... 5
2.3.3. Gestasyonel diyabet ............................................................................... 6
2.3.4. Diğer diyabet tipleri ............................................................................... 6
2.4. Diyabet ve Kanser ............................................................................................ 6
2.4.1. Diyabette kanser riskini arttıran mekanizmalar ..................................... 7
2.4.2. Diyabet ve oksidatif stres ..................................................................... 10
2.5. Diyabette Tedavi ............................................................................................ 11
2.5.1. Oral antidiyabetik tedavi ...................................................................... 12
2.5.2. Biguanidler ........................................................................................... 13
x
Sayfa
2.6. Genotoksisite Testleri .................................................................................. 15
2.7. Metformin ve Farklı Antidiabetik Ġlaçlarda YapılmıĢ Genotoksisite
ÇalıĢmaları ................................................................................................... 19
3. MATERYAL VE METOT .................................................................................... 22
3.1. Materyal.......................................................................................................... 22
3.1.1. Kromozom incelemesi için materyal .................................................... 22
3.1.2. Test materyali ....................................................................................... 22
3.2. Metot .............................................................................................................. 23
3.2.1. Ġnsan lenfosit kültüründe gerçekleĢtirilen çalıĢmalar ........................... 23
3.2.2. Ġzole lenfositlerindeki çalıĢmalar ......................................................... 26
4. ARAġTIRMA BULGULARI ................................................................................ 28
4.1. Kromozomal Anormallik (KA) Testi Sonuçları ............................................. 28
4.2. KardeĢ Kromatid DeğiĢimi (KKD) Testi Sonuçları ....................................... 31
4.3. Mikronukleus (MN) Testi Sonuçları .............................................................. 33
4.4. Komet Testi Sonuçları .................................................................................... 35
5. TARTIġMA VE SONUÇ ...................................................................................... 38
KAYNAKLAR .......................................................................................................... 52
ÖZGEÇMĠġ ............................................................................................................... 64
xi
ÇĠZELGELERĠN LĠSTESĠ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.1. Metformin‘in insan lenfositlerinde kromozomal anormallikle
ve frekansları üzerine etkisi…………………………………….…......29
Çizelge 4.2. Metformin‘in insan lenfositlerinde KKD, RĠ ve MĠ
üzerine etkisi.…………………………………………………….........31
Çizelge 4.3. Metformin‘in insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve
nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi..................................................34
Çizelge 4.4. Metformin uygulanması ile insan lenfositlerinde oluĢan DNA
hasarı………………………………………………………………......36
xii
ġEKĠLLERĠN LĠSTESĠ
ġekil
Sayfa
ġekil 2.1. Genotoksinlerin DNA üzerindeki etki mekanizması ve sonuçları……….16
ġekil 3.1. Metformin‘in moleküler yapısı.…………………………………………..22
ġekil 4.1. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki
anormal hücre frekansı…………………………………...………............29
ġekil 4.2. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki kardeĢ
kromatit değiĢimi frekansı..........................................................................32
ġekil 4.3. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki
mitotik indeks frekansı...............................................................................32
ġekil 4.4. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki
mikronükleus frekansı………………………………………………...….34
ġekil 4.5. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerinde oluĢan komet
kuyruk yoğunluğu, kuyruk uzunluğu ve kuyruk momenti……..…...........36
xiii
RESĠMLERĠN LĠSTESĠ
Resim
Sayfa
Resim 2.1. Galega officinalis......................................................................................13
Resim 4.1. Metformin ile muamele edilen insan lenfositlerinde gözlenen
kromozom anormallikleri…....................................................................30
Resim 4.2. Metformin ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde
gözlenen kardeĢ kromatid değiĢimleri…...……………………………..33
Resim 4.3. Metformin ile muamele edilen insan lenfositlerinde gözlenen
mikronükleuslu binukleat hücreler…………………………………......35
Resim 4.4. Metformin ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluĢan
DNA hasarlarının komet testi ile görünümü.…………………………..37
xiv
SĠMGELER VE KISALTMALAR
Bu çalıĢmada kullanılmıĢ bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte
aĢağıda sunulmuĢtur.
Simgeler
Açıklama
%
Yüzde
µL
Mikrolitre
C
Santigrat derece
g/mL
Mikrogram/ Mililitre
mg/kg
Miligram/kilogram
mol/litre
Mikromolar/litre
mL
Mililitre
mg
Miligram
rpm
Devir sayısı
V
Volt
mA
Miliamper
Kısaltmalar
Açıklama
BrdU
Bromodeoksiüridin
CHL
Çin hamsteri akciğer hücreleri
CHO
Çin hamsteri ovaryum hücreleri
Cyt-B
Sitokalasin-B
DMSO
Dimetil sülfoksit
DNA
Deoksiribonükleikasit
DPX
Depex
EDTA
Etilendiaminotetra asetik asit
H2O2
Hidrojen Peroksit
HPLC
Yüksek performanslı sıvı kromotografisi
H2O2
Hidrojen Peroksit
HPLC
Yüksek performanslı sıvı kromotografisi
KA
Kromozomal anormallik
xv
Kısaltmalar
Açıklama
KCl
Potasyum klorür
KKD
KardeĢ kromatid değiĢimi
MĠ
Mitotik indeks
MMC
Mitomycin-C
MN
Mikronükleus
NaCl
Sodyum Klorür
NaOH
Sodyum Hidroksit
NBĠ
Nükleer bölünme indeksi
PBS
Fosfat Tamponu
RĠ
Replikasyon indeksi
SSC
Salin sitrat tamponu
1
1.GĠRĠġ
Pankreas, vücudun temel sindirim bezi olan ekzokrin pankreas ve insülin, glukagon,
somatostatin ile pankreatik polipeptidin (PP) kaynağı olan endokrin pankreas olmak
üzere iki farklı organdan oluĢur. Ekzokrin pankreasın salgıladığı ürünlerin (sindirim
enzimleri) temel rolü gıdaların sindirimini sağlayarak, emilimlerini sağlamak iken;
endokrin
pankreas
hormonları
tüm
gıdaların
emilme
düzeyini,
hücresel
depolanmasını ve besinlerin metabolizmasını ayarlar. Endokrin pankreasın
disfonksiyonu veya hormonlarına hedef dokuların bozuk yanıtı diyabeti de içeren
besin metabolizması hastalığına neden olur [Masharani, 2008].
Diabetes Mellitus (DM) ortak özelliği hiperglisemi olan ve baĢta karbonhidratlar
olmak üzere birçok metabolik bozukluğu içine alan heterojen bir hastalıktır. BaĢlıca
3 çeĢit diyabet vardır. Bunlar: Tip 1 Diyabet, Tip 2 Diyabet ve Gestasyonel diyabet
(gebelikte görülen) diyabettir [Ankara Diyabet, 2012; Turkdiab, 2012]. Bu tiplerin
oluĢmasında genetik temel, çevresel faktörler ve hayat tarzı etkilidir [Masharani,
2004].
Tip 1 diyabet, genellikle genç yaĢlarda görülen, pankreasta insülin salgılayan
hücrelerin harabiyeti sonucu mutlak insülin eksikliği ile ortaya çıkan diyabet olup
ömür boyu sürmektedir. Tip 1 diyabetin otoimmün nedenli olduğu düĢünülmektedir.
BağıĢıklık sistemi pankreasa saldırmakta ve insülin yapan hücreleri tamamen yok
etmektedir. Bu saldırının nedeni kesin olarak bilinmemektedir. Tip1 diyabetli olan
hastaların pankreasları insülin üretmediğinden tedavi Ģekli ömür boyu insülin
kullanımıdır [Turkdiab, 2012].
Tip 2 diyabet, diyabetin sık görülen türüdür. Genellikle ileri yaĢlarda görülen diyabet
tipidir. Pankreastan insülin salgılanmaktadır. Ancak salgılanan insülin miktarı ya
vücudun normal fonksiyonlarını yerine getirmek için gerekenden azdır ya da insülin
çeĢitli nedenlerden dolayı gereken etkiyi gösterememektedir. Kas ve doku hücreleri
insüline dirençli hale gelmektedir. Esas olarak genetik temellidir. Bir kiĢide Tip 2
diyabetin ortaya çıkmasında ailesel yatkınlığın rol oynadığı düĢünülmektedir.
2
Tedavisinde antidiyabetik ilaçlar veya bazı vakalarda insülin iğnesi kullanılmaktadır
[Turkdiab, 2012].
Gestasyonel diyabet, gebelikte baĢlayan veya ilk kez gebelikte tanısı konulan
karbonhidrat tolerans bozukluğudur. Bir diğer tanımlamaya göre ise gebelikte
görülen hiperglisemidir. Gestasyonel diyabet gebelerin yaklaĢık % 3-5‘inde
görülebilir [Russel ve ark., 2007].
Gestasyonel diyabet hiperglisemi ile birlikte insülin direncine neden olur ve
karbonhidrat metabolizmasının bozulmasına yol açar. Bu da anne ve bebeğin sağılığı
açısından risk taĢır. Gebelik süresince düzenli beslenme ile karbonhidrat
metabolizması dengede tutularak, gebelik sonrasında etkisini yitiren bir hastalıktır
[Blayo, 2004].
AraĢtırmamızda genotoksik etkilerini incelediğimiz etken madde Metformin,
biguanidler grubundan olup Tip 2 diyabetin tedavisinde ilk baĢvurulan antidiyabetik
ilaçtır. Karbohidrat metabolizmasına, lipid profiline ve kilo dengesine etkileri ve
diğer ilaçlara göre daha ucuz olması geliĢmekte olan ülkelerde sıkça kullanılmasını
sağlamaktadır. Ayrıca Metformin baĢka antidiyabetik ilaç etken maddeleri ile
kombine olarak yeni ilaçlarda sıkça kullanılmaktadır.
Metformin‘in farklı test sistemlerinde yapılmıĢ genotoksisite çalıĢmaları oldukça
sınırlıdır. Diyabet tedavisi ömür boyu süren bir tedavi Ģeklidir. Bu nedenle tedavide
kullanılan ilaçların genotoksik risk teĢkil edip etmediklerinin belirlenmesi insan
sağlığı bakımından son derece önemlidir.
Bu çalıĢmanın amacı, antidiyabetik etken madde olan Metformin‘in genotoksik
etkilerinin dört farklı genotoksisite testi; kromozom anormallikleri, kardeĢ kromatid
değiĢimi, mikronukleus ve komet testi ile in vitro olarak incelenmesidir.
3
2. GENEL BĠLGĠLER
2.1. Diyabet ve Tarihçesi
Diyabet tanımı ilk kez 2. yy‘da Kapadokyalı Aretaeus tarafından kullanılmıĢtır.
Diyabetlilerin idrarlarının tatlı olduğu 17. yy‘da Ġngiliz Thomas Willis tarafından
belirtilmiĢtir. Berlinli Paul Langerhans 1869‘da pankreasta özel küçük hücre
kümeleri olduğunu tespit etmiĢ ve 1893‘de Edouard Laguesse tarafından onun ismine
itafen, bu hücre gruplarına ―Langerhans adacıkları‖ denmiĢtir. Ġnsülin ise 1921
yılında keĢfedilmiĢtir. Frederick Sanger insülinin primer yapısını 1955‘de tanımlamıĢ
ve Nobel ödülü almıĢtır [Yönem, 2011].
Diyabette aĢırı glikoz metabolizmasına neden olan hiperglisemi uzun vadede
disfonksiyona neden olur ve özellikle gözleri, böbrekleri ve sinirleri etkiler, kalp ve
damar hastalıklarıyla kendini gösterir. ÇeĢitli patojenik süreçler diyabet geliĢimini
hızlandırmaktadır. Bunun sonucunda insülin eksikliği ile pankreasın β-hücrelerinin
yıkımından doğan anormallik sonucu insüline karĢı direnç oluĢur. Diyabette
karbonhidrat, yağ ve protein metabolizmasındaki hasarların temelinde yetersiz
insülin etkilidir [Ada, 2009].
Kanda normalden daha az glikoz bulunması ise hipoglisemiye neden olur. Plazma
glikozunun bulunması gereken değer 72-144 mg/dl‘dir. Plazma glikozunu bu aralıkta
tutmaya yarayan sistemlerin bozulması hipoglisemiye yol açar. Plazma glikozu
normal seviyenin altına düĢtüğünde plazma glikozunu arttırıcı mekanizmalar devreye
girer [Service, 2010].
2.2. Ġnsülin
Ġnsülin pankreas β-hücrelerinden salgılanan, 51 aminoasit tarafından oluĢturulan bir
hormondur. Ġnsülinin biyolojik aktivitesi % 7-8‘i kadardır. Karaciğer ve böbrekte
insülinaz enzimlerince yıkılır [Yönem, 2011].
4
Ġnsülin salgısının en güçlü uyaranı glikozdur. Glikoz aracılığı ile insülin salgısının
olması için glikozun pankreasın β-hücreleri içine alınması gerekir. β-hücresinden
dolaĢıma salgılanan insülinin hedef dokuları karaciğer, kas ve yağ dokusudur. Ġnsülin
bu dokularda bulunan özel insülin reseptörlerine bağlanarak etkisini gösterir
[Yönem, 2011].
2.3. Diyabetin Sınıflandırılması
Diyabetin giderek artmasıyla hastalığın sınıflaması sürekli yenilenmektedir.
Diyabetin tüm tiplerinde temel özellik hiperglisemi olmakla beraber, hiperglisemiye
neden olan mekanizmalar farklıdır. Diyabetin bazı formlarında insülin eksikliği veya
bozuk insülin salgılanmasına neden olan genetik bir hasar varken, diğer bazı
tiplerinde temel özellik insüline karĢı direnç olmasıdır. Diyabet genel olarak, Tip 1
diyabet, Tip 2 diyabet, Gestasyonel diyabet ve Diğer Diyabet tipleri olarak
sınıflandırılır [Konca ve Ayvaz, 2011].
2.3.1. Tip 1 diyabet
Tip 1 Diabetes Mellitus (DM) çocukluk yaĢ grubunda sık görülen insülin üretiminde
görev alan pankreasın beta hücrelerinin süre gelen otoimmün veya otoimmun dıĢı
nedenlerle harabiyeti sonucu geliĢen insülopeni ve hiperglisemi ile karakterize kronik
metabolik bir hastalıktır [Abacı ve ark., 2007].
Bu otoimmün olayın enfeksiyonlar ve diğer çevresel etkenlerle tetiklendiği ve beta
hücrelerine özgü moleküllerce sürdürüldüğü sanılmaktadır. Bundan sonra beta
hücreleri azalmaya baĢlar ve insülin salgısı giderek düĢer ama henüz glikoz toleransı
bozulmamıĢtır. Bu noktadan sonra beta hücrelerinin sayısı normal glikoz toleransının
sürdürülmesine yetmez. Bu olayla beta hücrelerinin yıkımı devam ettiğinden Tip 1
diyabet kalıcı olarak yerleĢir [Deyneli, 2011].
5
2.3.2. Tip 2 diyabet
Tip 2 diyabet (ya da insüline-bağımlı olmayan Diabetes Mellitus), kronik ve
kompleks etiyolojiye sahip olan bir metabolik bozukluktur. Yükselen kan glikoz
düzeyleri nedeniyle, periferal dokularda meydana gelen insülin rezistansı (insülin
duyarlılığının azalması) en karakteristik özelliğidir [Gür, 2010].
Ġnsülin Direnci
Ġnsüline direnç olması, insüline duyarlı dokularda glikoz kullanımını azaltır ve
karaciğerde glikoz yapımını arttırır. Bu her iki durum da hiperglisemiye katkıda
bulunur [Bergamini ve ark., 2007].
Ġnsülin Salgısında Azalma
Tip 2 diyabetin baĢlangıcında insülin direncini yenerek normal glikoz tolereansını
devam ettirmek için insülin sekresyonu artar. Ancak Tip 2 diyabette insülin salgı
kapasitesinin azalma nedenleri tam olarak bilinmemekle birlikte bir genetik kusurun
beta hücrelerinin yıkımına yol açtığı varsayılmıĢ ise de yapılan çalıĢmalarda bir
mutasyon varlığı gösterilememiĢtir [McCulloch ve ark., 2010].
Karaciğerde Glikoz Yapımında ArtıĢ
Karaciğer glikojenoliz ve iskelet kası ile yağ dokusundan gelen substratları
kullanarak plazma glikozunu belirli sınırlarda tutmaya çalıĢır. Ġnsülin, glikozun
karaciğerde glikojen halinde depolanmasını uyarır ve glikoneogenozi baskılar. Tip 2
diyabette hiperinsülinemiye rağmen karaciğerde insüline karĢı direnç vardır. Bu
durum da hiperglisemiye ve karaciğerde glikojen depolanmasına neden olur [Yönem,
2011].
6
2.3.3. Gestasyonel diyabet
Gestasyonel diyabet (GDM) ilk kez gebelikte ortaya çıkan ya da gebelik sırasında
tanı konulan glikoz tolerans bozukluğudur [Karakurt ve ark., 2009].
Gebelikte glikoz kontrolünü sağlamak için annenin pankreatik beta hücreleri insülin
direncini yenmek amacıyla daha çok insülin salgılar. Bir Ģekilde insülin direncine
karĢı insülin salgılama yetersiz kalır. Gebelikte iki türlü insülin direnci görülür. Ġlk
olanı gebeliğin geç döneminde görülen, insülin direncine neden olan postreseptör
düzeyindeki değiĢikliklerin neden olduğu insülin direncidir. Ġkinci tür insülin direnci
de gebelik öncesi var olan ve sonra kronikleĢen türüdür. Bu durum gebelik sırasında
fizyolojik değiĢiklikler nedeniyle ortaya çıkar [Yılmaz ve Yürekli, 2011].
2.3.4. Diğer diyabet tipleri
Diğer diyabet tiplerinin sebepleri arasında insülin salgısı veya insülinin etkisindeki
genetik kusurlar, insülin etkisini bozan metabolik anormallikler ve glikoz intoleransı
yapan birçok sebep yer alır. Bu durum gençlerin eriĢkin tipi diyabeti (MODY),
olarak adlandırılır. Erken yaĢta baĢlayan hiperglisemi ve insülin sekresyon
bozukluğuyla karakterize edilir [Yönem, 2011].
2.4. Diyabet ve Kanser
Diyabet ve kanser arasındaki iliĢki 19. yy‘ın baĢlarında araĢtırılmaya baĢlanmıĢtır ve
uzun süre bu iki hastalığın patojenik mekanizma bilgileri incelenmiĢtir. Yapılan
epidemiyolojik çalıĢmalar ıĢığında diyabetli hastalarda birçok kanserin görülme
sıklığının arttığı gözlenmiĢtir. Bu durum her iki hastalığın risk faktörlerinin ortak
olmasından kaynaklanıyor olabilir. Bu risk faktörleri yanlıĢ beslenme, fiziksel
hareketsizlik ve obezitedir [Cannata ve ark., 2010].
7
2.4.1. Diyabette kanser riskini arttıran mekanizmalar
Hiperglisemi
GeniĢ populasyonlarda yapılan birçok çalıĢma bozuk açlık glikoz konsantrasyonunun
birçok kanserde risk faktörü olduğu göstermiĢtir [Jee ve ark., 2005; Rapp ve ark.,
2006; Stattin ve ark., 2007; Stocks ve ark., 2009]. Kanser hücrelerinin çoğalması
çeĢitli substratlar ve enerji gerektirir. Glikoz, GLUT1, GLUT2, GLUT3 gibi glikoz
membran taĢıyıcılarının ekpresyonunu arttırır ve glikoz hücre içine girer [Macheda
ve ark., 2005; Airley ve Mobasheri, 2007]. Sağlıklı hücrelerde glikoz piruvata ve
diğer ATP formlarına dönüĢürken kanser hücreleri piruvatı laktik aside çevirir ve
glikozu DNA, RNA ve protein sentezi için kullanarak hücre yapımını hızlandırır
[Kim ve Dang, 2006; DeBerardinis ve ark., 2008]. Kanser hücrelerinin bu farklı
metabolizması oksijen varlığına rağmen laktat üretiminin artmasına yol açmıĢtır ve
buna 1927‘de Warburg etkisi denmiĢtir [Airley ve Mobasheri, 2007; Yeluri ve ark.,
2009]. Laktik asit üretiminin fazlalığı hücre dıĢı matriksin pH‘ını düĢürür ve normal
dokularda hücre ölümüne neden olarak tümör hücrelerinin geçiĢini kolaylaĢtıran
kolejanozların aktivitesini arttırır [DeBerardinis ve ark., 2008].
Glikoz metabolizmasındaki farklı enzimlerin değiĢik aktiviteleri neoplastik
hücrelerdeki Warburg etkisinden sorumludur. Bunlardan yoğun bir Ģekilde çoğalan
kanser hücrelerinin normal hücrelere nazaran 200 kat daha büyüme aktivitesini
sağlayanlardan biri hekzokinaz-2 dir [Pedersen, 2007; Mathupala ve ark., 2009].
Ayrıca glikolizasyon son ürünleri hücre içi boĢluklara katılır ve o hücreye birçok
hücrenin membranında bulunan ilgili reseptörler aracılığı ile bağlanırlar. Bu durum,
dokularda ve immün hücrelerde (makrofaj ve nörtofil) inflamasyon süreçlerinin
aktivasyonuna neden olur [Sparvero ve ark., 2009; Alexiou ve ark., 2010].
Glikoz fazlalığı hücrede glikolizasyon son ürünü birikimi ve oluĢumu nedeniyle
hücre hasarlarına neden olur. Bu bileĢikler hücrelerde dejeneratif değiĢikliklere
8
neden olur, hücrelerin metabolizmasının sinyal yollarını değiĢtirebilir ve karsinojenik
etkiye neden olabilir [Yamagishi ve ark., 2005; Wuenschell ve ark., 2010].
Obezite ve Adipoz dokuların fonksiyonel bozuklukları
Adipoz dokular sadece enerji depolama ve termal tampon değil ayrıca immün
sistemin hormon salgılatıcılarıdır. Peptid hormonları adipositler tarafından salgılanır
ve adipokinez olarak adlandırılır. Adipokinezler glikoz metabolizmasında, immün
reaksiyonlarda ve inflamatuar yanıt gibi fizyolojik süreçleri düzenler. Bu
hormonlardan en iyi bilineni adinopektinler ve leptinlerdir [Diez ve Iglesias, 2003].
Adinopektin, yağ asidi metabolizmasını kuvvetlendirir, insülin yoğunluğunu arttırır.
Adinopektinin düĢük düzeyi obezitede oluĢur ve Tip 2 diyabet riskinin artmasıyla
iliĢkilidir [Diez ve Iglesias, 2003].
Leptin, tokluk hissi veren ve gıda alınımını düzenleyen bir hormondur. Adipoz
dokularda lipolizisi ve insülin yoğunluğunu arttırır. Obez hastalarında düzenleyici
eylemlerin yokluğunda leptin seviyelerinin arttığı gözlenmiĢ, bunun da leptin
direncinden kaynaklandığı görülmüĢtür [Gorska ve ark., 2009]. Leptin lökosit
reseptörleriyle proinflamatuvarı; endotel hücreleri ve trombosit aktivasyonu yoluyla
protrombolikleri etkiler. Bu hücre membranında ve DNA hasarlarına neden olan
serbest oksijen radikalleri üreten endoteliyal hücreleri uyarır ve sitokin tümör
nekrozis faktor (TNF-a)
proinflumatuarını salgılatan monositleri uyarır. Bu da
kanser hücrelerinin çoğalmasını tetikler. Adipositlerin sitoplazmasındaki retikulum
bozukluğu, anormal protein ve aĢırı yağ asiti birikimine, anormal intraselüler
sinyallere, insülin direncine, serbest radikal üretiminin artmasına ve adiposit
aktivasyonuna neden olur [Boden, 2009].
Sonuç olarak; adipoz hücrelerinin metabolizmasındaki anormallik ve karındaki yağ
birikimi insülin direncine ve kronik inflamasyona neden olur [Barbarroja ve ark.,
2010]. Bunlar uygunsuz yaĢam tarzı, zararlı çevresel faktörler ve genetik yatkınlığın
etkisi olmasına rağmen kanserin geliĢmesinin koĢullarıdır.
9
Ġnsülin direnci ve Hiperinsülinemi
Ġnsülin, yaĢam için zorunludur. Protein ve yağların yanı sıra karbonhidrat
metabolizmasını düzenler. Ġnsülin, kas ve karaciğerde glikojen sentezini arttırır,
adipositlerde serbest yağ asitlerinin esterleĢtirir, lipolizis ve glikoneogeneisisi,
protein parçalanmasını engeller ve hücre içine potasyum taĢınmasını kolaylaĢtırır.
Hücreler içindeki amino asit taĢımasının artmasıyla ve çeĢitli hücre sinyal
yolaklarının aktivasyonunu düzenleyerek, DNA ve protein sentezini etkiler
[Bergamini ve ark., 2007].
DüĢük konsantrasyonlarda insülinin metabolik aktivitesi dominanttır, buna karĢın
yüksek dozlarda insülin anti-apoptotik ve Ģiddetli mitojenik etki gösterir [De Meyts,
1994]. Ġnsülin insülin/IGF ekseni olarak bilinen, birbirleriyle iliĢkili bağlayıcı
proteinler, reseptörler, hormonların kompleks sistemleri içinde hareket eden
farklılaĢmayı ve büyümeyi uyarır. Bu sisteme insülin, insülin-benzeri büyüme
faktörleri (IGF-1, IGF-2), büyüme faktörü reseptörleri (IGF-1R, IGF-2R), insülin
reseptörlerinin iki farklı formu (IR-A, IR-B), hibrit reseptörleri ve insülin-benzeri
büyüme faktörü bağlayıcı proteinleri (IGFBPP-1 6) dahildir [Holly ve Perks 2006].
IGF-1, büyüme hormonunun etkisi altında karaciğer tarafından salgılanır ve
sentezlenir. Bu reseptör aracılığıyla hareket ederek (IGF-1R) apoptozisi engeller ve
hücre proliferasyonunu arttırır. IGF-II fetal geliĢimde önemli rol oynar ve bazı
organların geliĢimi için esastır. IGF-II IGF reseptörüne bağlanarak büyüme etkisi
gösterir. IR ve IGF-IR reseptörleri tirozin kinaz reseptörü grubuna aittir. Ġnsülin
reseptör aktivasyonları ile insülin bağlamanın iki yolu vardır: mitojeni aktive edici
kinaz yolağı ve fosfaidiloinositol 3 kinaz (PI3K) yolağı [Robey ve Hay, 2009;
Courtney ve ark., 2010].
Kanser terapilerinde PI3K sinyal yollarının engellenmesi üzerine çok sayıda
makaleler bulunmaktadır [Robey ve Hay, 2009; Courtney ve ark., 2010]. Kanser
hücrelerinde insülin reseptörlerinin, IGF-I ve bunun reseptörlerinin aĢırı ekspresyonu
görülür ve hücre geliĢimi içinde bu mekanizmalar kullanılabilir [Kim ve ark., 2009;
Werner ve Bruchim, 2009].
10
2.4.2. Diyabet ve oksidatif stres
Serbest Radikaller
Serbest radikaller için birçok tanım yapılmasına rağmen otoritelerin üzerinde
birleĢtiği tanım; bir serbest radikalin moleküler ya da atomik yörüngesinde bulunan
ve genelde çok reaktif olan çiftleĢmemiĢ elektron bulunduran bir kimyasal ürün
olduğu Ģeklindedir. Atomlardaki elektronlar yörünge olarak bilinen boĢluklarda
hareket ederler. Her yörüngede birbirine zıt yönde hareket eden en fazla iki elektron
bulunur [AkkuĢ, 1995].
Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbohidratlar gibi tüm önemli
bileĢiklerine etki ederler ve de yapılarının bozulmalarına neden olurlar. Biyolojik
sistemlerdeki reaktif oksijen türleri (ROS), süperoksit anyonu (2O2-), hidroksil
radikali (HO-), nitrik oksit (NO-), peroksil radikali (ROO-) ve radikal olmayan
hidrojen peroksit (H2O2) gibi serbest radikaller oksidatif stresin en önemli
nedenlerinden birini oluĢtururlar [Babior, 2000].
ROS‘ların oluĢumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta
bazı savunma mekanizmaları geliĢtirilmiĢtir. Bunlar ―antioksidan savunma
sistemleri‖ olarak bilinirler.
Oksidatif Stres
Oksidatif stres, serbest radikal oluĢumu ile antioksidan savunma mekanizması
arasındaki ciddi dengesizliği göstermekte olup, sonuçta doku hasarına yol açmaktadır
[Serafini ve ark., 2004].
Diyabette reaktif oksijen türlerinin rolü 1980‘li yıllardan beri geniĢ çapta tartıĢılan
bir konu olmuĢtur. Diyabet ve diyabet komplikasyonlarının reaktif oksijen türleri ile
olan
iliĢkisini
gösteren
çalıĢmalarda,
nonenzimatik
glikasyon,
enerji
metabolizmasındaki değiĢikliklerden kaynaklanan metabolik stres, sorbitol yol
11
aktivitesi, hipoksi ve iskemi-reperfüzyon sonucu oluĢan doku hasarının serbest
radikal üretimini
arttırdığı
ve
antioksidan savunma sistemini
değiĢtirdiği
vurgulanmaktadır [Elmalı ve ark., 2004].
Oksidatif strese en duyarlı yapılardan biri olduğu da bilinen beta hücrelerinde
gözlenen hasarın, hipergliseminin toksik etkilerinden kaynaklandığı düĢünülmektedir
[Robertson ve ark., 2004]. Hidrojen peroksidin, yüksek reaktiviteye sahip bir ROS
ürünü olan OH radikaline dönüĢmesi sonrası insülin reseptör sinyal sistemi üzerinde
etkili olduğu ve insülin tarafından reseptör aracılığı ile düzenlenen sinyal
transdüksiyon yollarında anahtar bir rol oynayabileceği görüĢü araĢtırmacıların
savları arasında bulunmaktadır [Donalth ve ark., 1999].
Diyabet oluĢturulan rat deney modellerinde oksidatif stres belirteci olarak 8-OHdG
(8-hidroksi deoksiguanozin) düzeylerinde de artıĢ gözlenmiĢtir [Ihara ve ark., 1999].
Hiperglisemi ile oksidatif stres arasında yakın iliĢki olduğu görüĢü in vivo çalıĢmalar
ile
de
desteklenmiĢtir
[Ceriello,
1997].
Deneysel
hayvan
çalıĢmalarında
insanlardakine benzer diyabet oluĢturmak için kullanılan N- nitroso türevi Dglikozamin yapısındaki streptozotosin, oksidan maddeler meydana getirerek
langerhans adacıklarını selektif olarak tahrip etmekte ve uygun olmayan cevapları
vererek diabeti baĢlattığı düĢünülmektedir [Das ve ark., 2001].
Sonuç olarak; diyabetik hastaların uzun süreli yüksek kan glikoz konsantrasyonlarına
maruz kalmaları oksidatif stresi arttırabilir. Anti-oksidanlar, büyük bir olasılıkla
diyabette
bozulan
oksidatif
stresin,
protein
glikasyonunun
ve
glukoz
metabolizmasının düzeltilmesinde önemli etkiler oluĢturabilirler.
2.5. Diyabette Tedavi
Diyabet tedavisinde insülin ve/veya oral antidiyabetikler kullanılmaktadır. Tip 1
diyabette tedavi yöntemi insülin alımı iken; Tip 2 diyabette tedavi yöntemi kandaki
glikoz
miktarını
düĢürmek
için
oral
anti-diyabetik
ilaçların
alınmasıdır.
12
Hipergiliseminin kontrolü için çeĢitli sınıflara ait oral antidiyabetikler çoğu kez de
bunların kombinasyonları kullanılmaktadır.
2.5.1. Oral antidiyabetik tedavi
Tip 2 diyabet tedavisinde yaĢam tarzı değiĢiklikleri ile plazma glikozu ayarlanmazsa
tedaviye oral antidiyabetik ajanlar eklenir. Bu antidiyabetik ajanlar genellikle insülin
sekresyonunu
arttırma,
insülin
duyarlılığını
arttırma
veya
karbonhidrat
absorpsiyonunu azaltma yoluyla etki edebilir. Plazma glikozunu ayarlama amacıyla
kullanılan oral antidiyabetik ilaçlar (OAD=Oral Antidiabetic Drugs) Ģöyle
sınıflandırılabilir [Konca ve Ayvaz, 2011];
1. Ġnsülin Salgılatıcı Ġlaçlar
a) Sülfonilüreler
-
Glipizid
-
Gliklazid
-
Glibenklamid
-
Glibornurid
-
Glimeprid
b) Meglitinidler
2.
-
Repaglinid
-
Nateglinid
Ġnsülin duyarlaĢtırıcı ilaçlar
a) Biguanidler
-
Metformin
b) Tiazolidinedionlar
-
Rosiglitazon
-
Pioglitazon
3. Alfa- Glikozidaz Ġnhibitörleri
-
Akarboz
13
4. Ġnkretin Mimetik Ġlaçlar
a) GLP-1 Analogları
-
Exenatid
-
Liraglutid
b) DPP-4 Ġnhibitörleri
-
Sitagliptin
-
Vildagliptin
-
Saxagliptin
2.5.2. Biguanidler
Yetersiz insülin varlığında hücrelere glikoz giriĢini arttırır, karaciğerde glikoz
yapımını ve barsaklardan glikoz emilimini azaltırlar. ĠĢtahı da dolaylı olarak
azaltırlar. Ülkemizde piyasada biguanid grubundan Metformin bulunmaktadır
[Özcan, 2005].
Metformin
Metformin, Tip 2 diyabet tedavisinde 1960‘lı yıllardan beri kullanılmakta olan bir
biguaniddir [Lebovitz, 2005]. Ġki molekül guanidin içerir. Doğada Galega officinalis
(Fransız leylağı ya da sedef otu) olarak bilinen bitkide bulunur (Resim 2.1).
Resim 2.1. Galega officinalis [EcemiĢ ve Atmaca, 2012]
14
Diyabet Birliği (ADA) ve Avrupa Diyabet ÇalıĢma Birliği (EASD)‘nin uzlaĢmasına
göre; diyabet tanısı konulduğunda diyet ve yaĢam tarzı değiĢiklikleri ile birlikte
kullanımı için herhangi bir kontrendikasyon yoksa Metformin tedavisine baĢlanması
önerilmiĢtir [EcemiĢ ve Atmaca, 2012].
Metforminin hücre içi hedefi AMP (Adenozin monofosfat) tarafından aktive olan
protein kinaz, anahtar proteinlerin fosforilasyonu yolu ile AMP-aktive protein kinaz
(AMPK) glikoz ve lipid metabolizmasında ve hücresel enerji regülasyonunda rol
oynar [Krentz ve Bailey, 2005]. Metformin yalnızca insülin varlığında etkilidir ve
esas etkisi hepatik glikoz çıkıĢını azaltmaktır. Ayrıca kas ve karaciğer gibi periferik
dokularda özellikle yemeklerden sonra insülin aracılı glikoz utilizasyonunu arttırır.
Antilipolitik etki ile serum serbest yağ asidi konsantrasyonunu düĢürür [Bailey ve
Turner, 1996]. Plazma trigliserid, yağ asidi, düĢük dansiteli lipoprotein (LDL)
kolesterol düzeylerinde azalmaya, yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) kolesterol
düzeyinde artıĢa neden olur [EcemiĢ ve Atmaca, 2012].
Metforminin pankreatik β hücreleri üzerinde direkt etkisi yoktur ve insülin
sekresyonunu direkt olarak etkilemez. Sadece plazma glikoz seviyelerinin
değiĢtirilmesi üzerinden etkileri mevcuttur. Bu nedenle hipoglisemik değil
antihiperglisemiktir [Lebovitz, 2005]. Deneysel hayvan çalıĢmalarında non-oksidatif
metabolizma yolu ile intestinal glikoz kullanımını arttırdığı gösterilmiĢtir. Bu
iĢlemde laktat üretilmektedir. Laktatın büyük kısmı glikoneogenez için substrat
oluĢturur ve karaciğerde metabolize edilir. Bu durumun hipoglisemiyi önleyici
etkileri olduğu düĢünülmektedir [Çorakçı ve ark., 2009].
Ġnsülin ve insülin benzeri büyüme faktörleri (IGF) birçok normal ve transforme hücre
tiplerinde proliferasyonu uyardığı gibi bu reseptörler aracılığıyla sinyalizasyonu
stimüle eden ajanların da proliferasyonu arttırması beklenmektedir [Nyenwe ve ark.,
2011]. Son yapılan populasyon çalıĢmalarından elde edilen bilgilere göre
Metformin‘in bazı kanserlerin insidansını azalttığı ve prognozda iyileĢmeye yol
açtığı görülmüĢtür. Bir çalıĢmada Metformin kullanan diyabetik hastalarda diğer
tedavileri alan diyabetik hastalara göre kanser riskinin daha az olduğu görülmüĢtür
15
[Evans ve ark., 2005]. Yine bir baĢka çalıĢmada Metformin kullanan diyabetik
hastalarda sülfonilüre ve insülin tedavisi alan hastalara göre kansere spesifik
mortalitede azalma gözlenmiĢtir [Bowker ve ark., 2006].
Metformin‘in genotoksisitesi ile ilgili FDA (2008) raporunda in vitro testlerde (S.
typhimirium
- Ames testi, fare lenfoma hücreleri – Gen mutasyon testi, insan
lenfositleri – Kromozomal anormallik testi) ve farelerde yapılan in vivo
mikronükleus testinde negatif sonuç verdiği açıklanmıĢtır [FDA, 2008]. Ancak bu
raporda
kullanılan
dozlar,
uygulama
süreleri
ve
sonuçların
detayları
bulunmamaktadır. Metformin‘in FDA raporunda uzun vadeli karsinojenite
çalıĢmasına rastlanmıĢtır. Bu çalıĢmada ratlara Metformin‘in 104 hafta boyunca
günde 900 mg/kg‘lık dozu ve farelere de 91 hafta boyunca günde 1500 mg/kg‘lik
dozu verilmiĢtir. Bu dozlar insanda uygulanan 2000 mg‘lık doza göre seçilmiĢtir.
Sonuçta ratlarda ve farelerde Metformin‘in karsinojenik etkisiyle karĢılaĢılmamıĢtır
[FDA, 2008].
2.6. Genotoksisite Testleri
Genetik toksisite ya da genotoksisite; çekirdek, kromozom ve DNA yapısında
meydana gelen DNA eklentileri, DNA kırıkları, gen mutasyonları, kromozom
anormallikleri, klastojenite ve anöploidi gibi hasarları kapsayan genel bir terimdir.
DNA veya genomun kopyasının çıkarılmasını sağlayan enzimlerle etkileĢime giren
ve mutasyona neden olan genotoksik maddelerin DNA‘da hasar meydana getirmesi
veya bazı değiĢimlere yol açması ise genotoksik etki olarak tanımlanmaktadır [Atlıġekeroğlu ve ġekeroğlu, 2011].
DNA molekülünde mutasyonlara yol açan ajanlar ya da mutajenler, DNA üzerindeki
etkilerini ya doğrudan, ya da genomik bilgilere göre sentezlenen proteinlere
bağlanarak dolaylı yolla gösterirler. DNA hasarında rol alan kilit moleküllerde ve
yollardaki bozukluklar ise doku hasarı, yaĢlanma, kanser, infertilite ve bazı genetik
ve multifaktoryal hastalıklara yol açmaktadır (ġekil 1) [Mateuca ve ark., 2006; Atlıġekeroğlu ve ġekeroğlu 2011].
16
Ġlaçların genotoksisite testleri ile ilgili olarak Ekonomik ĠĢbirliği ve Kalkınma
Örgütü (OECD)‘nün kimyasalların test edilmesi için hazırladığı yönergeler dikkate
alınmaktadır. Buna göre etken madde piyasaya sürülmeden önce
-
Bakterilerde gen mutasyon testi
-
Memeli
hücrelerinde
in
vitro
kromozomal
hasarın
sitogenetik
değerlendirmesi veya in vitro memeli hücrelerinde gen mutasyonu testi
-
Rodent hematopoietik hücreleri kullanılarak in vivo kromozomal hasar testi
yapılmalıdır [OECD, 2008].
Ġnsanların maruz kaldığı çeĢitli kimyasal maddelerin (pestisit, gıda katkı maddeleri,
kozmetikte kullanılan kimyasallar vb.) ve ilaçların potansiyel genotoksisitelerinin
belirlenmesinde çeĢitli testler yapılmaktadır. Bu testlerden in vitro insan lenfosit
kültürlerinde en yaygın uygulananlar kromozomal anormallik (KA), KardeĢ kromatid
değiĢimi (KKD), mikronukleus (MN) ve Komet testleridir.
ġekil 2.1. Genotoksinlerin DNA üzerindeki etki mekanizması ve sonuçları
[Atlı-ġekeroğlu ve ġekeroğlu, 2011]
17
Kromozomal anormallik testi DNA düzeyindeki hataların yansıması olarak
kromozomlarda meydana gelen anormalliklerin tespitine dayanan bir testtir.
Kromozomal anormallikler hasar görmüĢ kromozomların tamir edilememesi veya
yanlıĢ tamirinden kaynaklanır. Bu hasarlara fiziksel ve kimyasal ajanlar neden
olmaktadır. Yaygın görülen anormallik tipleri kromatid kırığı, kromozom kırığı,
fragment, disentrik kromozom, halka kromozom, kardeĢ kromatidlerde birleĢme gibi
yapısal ve poliploidi gibi sayısal kromozom anormallikleridir. ÇeĢitli çalıĢmalar,
insanlarda kromozomal anormallik frekansındaki artıĢ ile kanser oluĢumu arasında
pozitif bir korelasyon olduğunu göstermektedir [Bolognesi, 2003; Doak ve ark.,
2012].
KKD, kardeĢ kromatitlerin homolog lokusları arasında DNA replikasyon ürünlerinin
simetrik değiĢimidir. DNA çift zincir kırıklarının homolog rekombinasyon yoluyla
onarılmasını göstermektedir. Ayrıca KKD‘ler nokta mutasyonların indüksiyonu, gen
amplifikasyonu ve sitotoksisite ile yakından iliĢkilidir [Latt ve ark., 1980; Wilson ve
ark., 2007]. Bir maddenin KKD frekansında artıĢa neden olması, o maddenin
hücredeki replikasyon mekanizmasını etkilediğinin ve DNA hasarı oluĢturabildiğinin
göstergesidir. KKD testi bir çok çalıĢmada kimyasalın
klastojenik aktivitesinin
belirlenmesinde kullanılmaktadır [Santoro ve ark., 2008; Beg ve ark., 2009; Montoro
ve ark., 2012]. Bununla birlikte KKD frekansındaki artıĢ ile kanser arasında bir iliĢki
kurulamamıĢtır. Bu nedenle KKD frekansındaki artıĢ genotoksik bir kimyasala
maruz kalmanın biyolojik bir göstergesi olarak kabul edilmelidir [Preston ve ark.,
2010].
Mikronukleus testi çeĢitli ajanların hem klastojenik hem de anöjenik etkilerini
belirlemek için uygulanan yöntemlerden biridir. Bu nedenle insanlarda genotoksik
kimyasallara maruziyetin belirlenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır [Cho ve ark.,
2009]. Bu yönteme Sitokinezi BloklanmıĢ Mikronükleus (Cytokinesis-Blocked
Micronucleus Assay=CBMN Assay) metodu da denmektedir. Sitokinezi durdurmak
amacıyla bir aktin polimeraz inhibitörü olan sitokalasin B (Cyt B) kullanılmakta ve
bu sayede ilk bölünmesini geçirmiĢ mitotik hücrelerin binükleer görüntüleri elde
edilmektedir [Fenech, 2007]. Mikronükleuslar, asentrik kromozomal fragmentlerinin
18
ya da bütün kromozomların hücre bölünmesi sırasında ana çekirdek dıĢında
kalmasıyla ayrı bir yavru çekirdek Ģeklinde oluĢmaktadır [Fenech, 2007; Poletta ve
ark., 2008].
Farklı çalıĢmalara göre insan periferal lenfositlerinde artmıĢ MN
frekansı ile kanser insidansı arasında önemli bir korelasyon vardır [Bonassi ve ark.,
2007; Parry ve Kirsch-Volders, 2010; Preston ve ark., 2010].
Son yıllarda geliĢen Komet tekniği, çeĢitli ajanların yol açtığı DNA tek ve çift zincir
kırıklarının ve onarımının tespiti için kullanılan hassas, hızlı ve güvenilir bir
yöntemdir. Tek hücre jel elektroforez (Single cell gel electrophoresis) tekniği olarak
da adlandırılan Komet yöntemi, birçok memeli hücresinde çeĢitli ajanların
indüklediği DNA hasarı ve onarım bozukluğunun tayinini amaçlayan çalıĢmalarda
kullanılmaktadır [Garry ve ark., 2003; Poletta ve ark., 2008; Hoelzl ve ark., 2009].
Bu yöntemin temelinde kırıklar sonucu oluĢan küçük DNA parçalarının kırılmamıĢ
bütün haldeki DNA moleküllerine göre elektroforez Ģartlarında daha hızlı hareket
etmesi vardır. Hücreler önce bir agaroz jele gömülür daha sonra lize edilir ve
elektroforezde küçük DNA molekülleri, ana çekirdeği geride bırakarak ileri doğru
hareket eder [Singh ve ark., 1988; Shaposhnikov ve ark., 2009]. DNA, floresan bir
boya ile boyanmakta ve floresan mikroskop altında incelenmektedir. Görüntüler
kuyruklu yıldıza benzediği için teknik ‗komet‘ olarak adlandırılmıĢtır. Ġleriye
gidebilen DNA miktarı ve göçün mesafesi, bu hücrede bulunan DNA ipliğindeki
kırıkların sayısı ile orantılıdır. DNA hasarı yüksek olan hücrelerde, kromozomal
DNA, hücre çekirdeğinden anoda doğru büyük göç göstermektedir [Singh ve ark.,
1988]. Genotoksinleri ilk etki ettikleri bölgelerde değerlendirebilmesi, hemen hemen
tüm ökaryotik hücrelere uygulanabilmesi, düĢük hasar seviyesini ölçebilmesi, az
sayıda hücre örneği gerektirmesi, hızlı, basit ve ucuz bir yöntem olması gibi
avantajlarından dolayı geniĢ bir kullanım alanına sahiptir [Choy, 2001, Atlıġekeroğlu ve ark., 2011].
19
2.7.
Metformin ve Farklı Antidiabetik Ġlaçlarda YapılmıĢ Genotoksisite
ÇalıĢmaları
Metformin‘in insan lenfositlerinde genotoksik etkilerinin incelendiği yayınlanmıĢ bir
çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bununla birlikte farklı test sistemlerinde gerçekleĢtirilmiĢ
bazı genotoksisite testleri mevcuttur.
Tek ya da çoklu oral Metformin alımının genotoksik ve sitotoksik potansiyelin
araĢtırıldığı bir çalıĢmada normal ve diyabetik ratlarda mikronükleus, kromozom
anormallikleri, kemik iliği hücrelerinin mitotik aktivitesi, sperm- baĢ anomalisi ve
bazı oksidatif stres markerları sitogenetik yöntemler aracılığıyla incelenmiĢtir.
Ratlarda diyabet oluĢumu streptozotosin enjeksiyonu ile indüklenmiĢtir. Diyabetik ve
diyabetik olmayan ratlarda tek doz olarak Metformin 100, 500 ve 2500 mg/kg
uygulaması yapılmıĢ ve 24 saatlik etkisi incelenmiĢtir. Ayrıca, çoklu doz
çalıĢmasında diyabetik ve diyabetik olmayan ratlar günlük 100 ve 500 mg/kg
Metformine 4 ve 8 hafta maruz bırakılmıĢ ve sonrasında kemik iliği ve sperm
hücreleri toplanarak değerlendirilmiĢtir. Her deney için eĢ zamanlı kontrol grupları
da bulundurulmuĢtur. Kemik iliği hücrelerinde kromozomal anormallik ve
polikromatik ile normokromatik eritrositlerde MN testi yapılmıĢtır. Elde edilen
veriler Metforminin ratlarda test edilen dozların hiçbirinin genotoksik veya sitotoksik
bir etkisinin olmadığını göstermiĢtir. Sperm örneklerinde ise Metformin‘in her hangi
bir hasara neden olmadığı hatta iyileĢtirici etkisi olduğu açıklanmıĢtır [Attia ve ark.,
2009].
Rabbani ve arkadaĢlarının 2009 yılında yaptığı bir çalıĢmada, Pioglitazone ve
Metformin kombinasyonunun erkek ratlarda polikromatik ve normokromatik
eritrositlerde MN frekansını azalttığı gözlenmiĢtir [Rabbani ve ark. 2009]. Ancak
Rabbani ve arkadaĢlarının (2010) yaptıkları bir baĢka araĢtırmada Metformin,
Glimepirid ve Pioglitazone‘nin sıçanlarda üreme toksisitesi üzerine etkilerini
incelenmiĢ ve Metformin ile Pioglitazone‘nin sperm anomalilerini ve oksidatif stresi
azalttığı; ancak Metformin ile Glimepirid‘in sperm anormalliğini indüklediği
bulunmuĢtur.
20
Amador ve arkadaĢları tarafından 2012 yılında yapılan bir çalıĢmada, Metformin‘in
genotoksisitesi Çin hamster yumurtalık hücrelerinde (CHO-K1) in vitro koĢullarda
kromozom anormallikleri ve komet testi ile, farelerde ise in vivo mikronükleus testi
ile değerlendirilmiĢtir. In vitro testlerde kromozom anormalliği gözlenmezken,
komet testi ile DNA hasarı gözlenmiĢtir. MN testinde ise genotoksik etki
sergilemediği
açıklanmıĢtır.
In
vitro
test
sonuçlarının
kronik
Metformin
maruziyetinin genotoksik olabileceği ihtimalini gösterebileceğini açıklamıĢlardır
[Amador ve ark., 2012].
Metformin‘in oksidatif stresle indüklenen DNA hasarı karĢısındaki olası koruyucu
etkileri in vitro koĢullarda incelenmiĢtir. Metformin‘in ve N-asetilsisteinin (NAC)
etkileri birbiri ile karĢılaĢtırılmıĢtır. Bu amaçla 20 donör kullanılmıĢ ve bireylerden
toplanan periferal kan lenfositleri 10- 50 µM arası değiĢen konsantrasyonlarda
Metformin ve NAC ile muamele edilmiĢtir. Bundan 1 saat sonra 48 saatlik 15 µM
kümen hidroperoksit muamelesi yapılmıĢtır. Komet testi ve mikronükleus tekniği
kullanılarak oksidatif DNA hasarına karĢı koruyucu etkileri değerlendirilmiĢtir.
Metformin‘in lenfostilerde kümen hidroperoksitin indüklediği DNA hasarını
azaltmamıĢtır.
Ancak 50 µM NAC‘ın koruyucu etki gösterdiği belirlenmiĢtir
[Onaran ve ark., 2006].
Farklı anti-diyabetik ajanların genotoksik etkileri de araĢtırılmıĢtır. Thiazolidin
sınıfına ait bir anti-diyabetik ajan olan Rosiglitazone (RSG)‘un ratlarda periferal kan
ve akciğer hücrelerinde DNA hasarına neden olup olmadığı Komet testi ile
incelenmiĢtir. Ratlara 14 gün boyunca günlük 0; 0,5; 1 ve 2 mg/kg‘lık dozlar gavaj
yoluyla verilmiĢtir. Hepatositlerde DNA hasarında doza bağlı olarak bir artıĢ
meydana geldiği gözlenmiĢ; buna karĢın periferal kan lenfositlerinde sadece en
yüksek dozda DNA hasarı saptanmıĢtır [Bedir ve ark., 2006].
Thiazolidin sınıfından diğer bir anti-diyabetik ajan olan Pioglitazone (PIO)‘nin de
ratlarda akciğer ve periferal kan lenfositleri kullanılarak Komet testiyle genotoksik
etkileri incelenmiĢtir. Ratlara 14 gün boyunca günlük 0, 10, 20 ve 40 mg/kg‘lık
dozlar gavaj yoluyla uygulanmıĢtır. Sonuç olarak; PIO‘nun hem akciğer hem de
21
lenfosit hücrelerinde doza bağlı olarak oksidatif lezyonlar nedeniyle DNA hasarını
arttırdığı gözlenmiĢtir [Bedir ve ark., 2008].
BeĢ ya da daha fazla yıl Pioglitazone ve Glimepirid kombinasyonu kullanan Tip 2
diyabetli hastalarda mikronükleus sıklığı incelenmiĢtir. Bu antidiyabetik ilaç
kombinasyonunu kullanan Tip 2 diyabetli 127 hasta ve 140 sağlıklı birey (kontrol
grubu) çalıĢmaya dahil edilmiĢ, oral ve yanak mukoza hücrelerinde Mikronukleus
frekansı incelenmiĢtir. Ġlaç kombinasyonunu kullanan hastalarda kontrol grubuna
göre yüksek oranda MN bulunduğu belirlenmiĢtir [Ahmed Shaik ve ark., 2010].
22
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
3.1.1. Kromozom incelemesi için materyal
Bu çalıĢmada antidiyabetik ilaç etken maddesi olan Metformin‘in olası genotoksik
etkilerinin incelenmesi amacıyla kültüre edilmiĢ insan periferal lenfositleri ve izole
lenfositler kullanılarak dört farklı genotoksisite testi uygulanmıĢtır. Periferik kan, 2425 yaĢlarında iki bayan donörden temin edilmiĢtir. Donörlerin sigara, alkol ve ilaç
kullanmamasına, herhangi bir hastalığı olmamasına ve genotoksik ajanlara maruz
kalma öyküsü bulunmamasına dikkat edilmiĢtir.
3.1.2. Test materyali
Metformin
Metformin‘in kimyasal adı 1,1-Dimetilbiguanid hidroklorid Ģeklindedir. CAS NO:
1115-70-4, moleküler ağırlığı 165,62 g/mol olup kimyasal formülü C4H11N5 ·
HCl‘dür. ġekil 3.1‘de Metformin‘in moleküler yapısı verilmiĢtir.
ġekil 3.1. Metformin‘in moleküler yapısı
23
3.2. Metot
3.2.1. Ġnsan lenfosit kültüründe gerçekleĢtirilen çalıĢmalar
Kromozom anormalliği (KA) ve kardeĢ kromatid değiĢimi (KKD) testleri
Bu çalıĢmada kromozomal anormallik (KA) testi için Evans ve arkadaĢlarının (1984)
metodu bazı değiĢikliklerle [YüzbaĢıoğlu ve ark., 2006; Evans ve ark., 1984], KardeĢ
Kromatid DeğiĢimi (KKD) testi için ise Perry ve Wolff‘un (1974) ve Speit ve
Haupter‘in (1985) yöntemleri uygulanmıĢtır [Perry ve Wolff, 1974; Speit ve Haupter,
1985]. ÇalıĢmada lenfosit kültür ortamına (Chromosome medium B) donörlerden
alınan 1/10 oranında heparinize edilmiĢ periferik kan (0,2 mL) steril Ģartlarda
ekilmiĢtir. Sartorius membran filtre ile steril edilerek hazırlanan BrdU (5-Bromo-2deoksiuridin=Bromodeoksiüridin) solüsyonu (10 µg/mL) tüplere ilave edilmiĢtir.
Ardından kültür tüpleri 37ºC‘deki inkübatörde 72 saat inkübasyona alınmıĢtır. Kültür
süresinin baĢlangıcından 24 ve 48 saat sonra Metformin‘in 12,5; 25,0; 50,0; 75,0;
100,0 ve 125,0
µg/mL‘lik konsantrasyonları kültür tüplerine ilave edilmiĢtir.
Deneyde eĢ zamanlı olarak bir negatif kontrol ve bir de pozitif kontrol (MMC, 0,2
µg/mL) kullanılmıĢtır. Kültürün 70. saatinde her tüpe kolkisin çözeltisinden (0,06
µg/mL) eklenmiĢtir.
Ġnkübasyon süresi sonunda (72. saatte) tüpler etüvden çıkarılarak 1200 rpm‘de 10
dakika santrifüj edilmiĢ ve süpernatant atılmıĢtır. Daha sonra tüplere 0,075 M KCl
çözeltisinden ilave edilmiĢ ve 30 dakika inkübasyona bırakılmıĢtır. Ardından tüpler
1200 rpm‘de 10 dakika santrifüj edilmiĢ ve süpernatant atılmıĢtır. Tüplere, fiksasyon
iĢlemi için 3:1 metanol:asetik asitten ilave edilmiĢ ve 45 dakika bekletilmiĢtir. Tespit
iĢlemi 2 kez daha tekrarlanmıĢtır. Süpernatant atıldıktan sonra kalan kısım pipetaj
yapılarak hücre süspansiyonu elde edilmiĢ ve önceden temizlenmiĢ lamlar üzerine
farklı alanlara gelecek Ģekilde damlatılmıĢtır. Hazırlanan preparatlar, oda
sıcaklığında 24 saat kurumaya bırakılmıĢtır.
24
Mikronükleus testi
Mikronukleus (MN) testi Fenech ve arkadaĢlarının (2000) metodu bazı
değiĢikliklerle [Palus ve ark. 2003] uygulanarak yapılmıĢtır [Fenech ve ark., 2000;
Palus ve ark., 2003]. Kültür iĢlemi Kromozom anormalliği (KA) ve kardeĢ kromatid
değiĢimi (KKD) testlerindeki gibi gerçekleĢtirilmiĢtir.
Kültürdeki hücreler Metformin‘in 12,5; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 ve 125,0 µg/mL‘lik
konsantrasyonları ile 48 saat muamele edilmiĢtir. 44. saatte Cytochalasin-B (5,2 µL)
eklenerek sitokinezin durması sağlanmıĢtır. 72. saatte tüpler, 1000 rpm‘de 10 dakika
santrifüj edilmiĢ ve süpernatant atılmıĢtır. Daha sonra tüplere 0,075 M KCl
solüsyonundan ilave edilmiĢtir. Tüpler 1000 rpm‘de (10 dakika) santrifüj edilip
süpernatant atılmıĢ ve fiksasyon 3:1 metanol:asetik asitte gerçekleĢtirilmiĢtir.
Fiksasyon iĢlemi 3 kez tekrarlanmıĢ ve 3. fiksatife sitoplazmanın korunması
amacıyla % 1‘lik formaldehit eklenmiĢtir. Tüpler son kez santrifüj edilmiĢ ve
süpernatant atılmıĢ, geriye kalan hücre süspansiyonu pipetle homojenize edilmiĢtir.
Daha önceden temizlenmiĢ lamlar üzerine, farklı alanlara birer damla damlatılarak
süspansiyonun yayılması sağlanmıĢ ve kuruması için preparatlar 24 saat oda
sıcaklığında bırakılmıĢtır.
Preparatların boyanması
Kromozomal anormalliklerin, mikronükleusların ve mitotik indeksin belirlenmesi
amacıyla preparatlar homojen olarak boyanmıĢtır. Bu amaçla preparatlar % 5‘lik
Giemsada (pH 6,8) 20-25 dakika boyanmıĢtır. KardeĢ kromatit değiĢimlerinin
gözlenmesi için ise, floresan+Giemsa boyaması, Speit ve Haupter‘in (1985)
metoduna göre bazı modifikasyonlarla uygulanmıĢtır [Speit ve Haupter, 1985]. Buna
göre preparatlar düz bir tepsiye konularak üzerleri ince bir tabaka halinde fosfat
tamponu (pH 6,8) ile kaplanıp 254 nm dalga boyunda 10-13 dakika ıĢınlanmıĢtır.
Preparatlar, 60ºC‘de 1xSSC (Sodyum klorür+Tri-Sodyum sitrat) solüsyonunda 1 saat
inkübasyona bırakılmıĢtır. Daha sonra % 5‘lik Giemsa ile (pH 6,8) 20-25 dakika
25
boyanmıĢtır. Oda sıcaklığında kurutulan preparatlar DEPEX ile daimi hale getirilerek
mikroskobik incelemeye alınmıĢtır.
Kromozom anormalliklerinin ve mitotik indeksin saptanması
Kromozomal anormalliklerin belirlenmesi için her bir uygulama grubunda, iki
donöre ait preparatlarda kromozomları iyi dağılmıĢ olan 100‘er metafaz (toplam 200
metafaz) incelenmiĢtir. Ġncelenen toplam hücre sayısı içindeki anormal hücrelerin
yüzdesi ve hücre baĢına düĢen kromozom anormalliği sayısı belirlenmiĢtir. Ayrıca bu
preparatlarda mitotik indeks de (MI) saptanmıĢ ve bu amaçla tüm uygulamalar için
hazırlanan preparatlardan her bir donör için 1000‘er hücre (toplam 2000 hücre)
değerlendirilmiĢtir. Mitotik indeks, bölünen hücre sayısının toplam hücre sayısına
oranı yüzde cinsinden hesaplanarak belirlenmiĢtir.
KardeĢ kromatid değiĢiminin ve replikasyon indeksinin saptanması
KardeĢ kromatid değiĢimi (KKD) sayısının belirlenmesinde, her iki donöre ait
preparatların her birinde, kromozomları iyi dağılmıĢ ve ikinci mitoz bölünme geçiren
25‘er hücre (toplam 50 hücre) incelenmiĢtir. KardeĢ kromatitlerin farklı boyanması
için kültür ortamına, timin bazının analoğu olan BrdU ilave edilmiĢtir. Böylece hücre
DNA‘sı replike olduğunda yeni sentezlenen polinükleotid ipliği içine timinin yerine
ortamda bulunan BrdU geçmiĢtir. BrdU‘i içine almıĢ DNA UV ıĢınlanmaya maruz
bırakıldığında, boyama sonucunda bu bölgeler açık renkli gözlenmiĢtir. Boyanma
farkı sayesinde DNA‘da kardeĢ kromatidler arasındaki değiĢimler belirlenmiĢtir.
Replikasyon indeksini (RI) hesaplamak için, her iki donörden hazırlanan
preparatların her birinden 100 hücre (toplam 200 hücre) incelenmiĢtir. Ġncelenen
hücreler arasında birinci (M1), ikinci (M2) ve üçüncü (M3) mitoz evresindeki hücreler
sayılmıĢ ve replikasyon indeksi (RI) = [1x(M1)+ 2x(M2)+ 3x(M3)]/N (N= incelenen
toplam hücre sayısı) formülüyle hesaplanmıĢtır.
26
Mikronükleus (MN) frekansının ve nükleer bölünme indeksinin (NBI) saptanması
Mikronükleus frekansını saptamak için; karyokinezi gerçekleĢtirmiĢ, fakat sitokinezi
engellenmiĢ çift çekirdekli (binükleat) hücreler değerlendirilmektedir. Binükleat
hücreleri elde etmek için, kültüre 44. saatte Sitokalasin-B ilave edilmekte ve
sitoplazma bölünmesi engellenmektedir. ÇalıĢmada her iki donöre ait her bir
preparattan 1000 tane, toplam 2000 tane çift çekirdekli hücre incelenmiĢ ve
mikronükleus içeren hücreler belirlenmiĢtir. Mikronukleus taĢıyan çift çekirdekli
hücreler 1 mikronükleuslu, 2 mikronükleuslu, 3 mikronükleuslu olmak üzere
sayılmıĢ ve [1x(1MN)+2x(2MN)+3x(3MN+4MN)]/N (N; incelenen toplam hücre
sayısı) formülü kullanılarak hücre baĢına düĢen MN sayısı (MN/hücre)
belirlenmiĢtir. Nükleer bölünme indeksi belirlenirken her bir uygulama grubunda iki
donörden 500‘er adet (toplam 1000) hücre değerlendirilmiĢtir. Hücreler 1 çekirdekli
(1N), 2 çekirdekli (2N), 3 çekirdekli (3N) ve 4 çekirdekli (4N) Ģeklinde sayılmıĢ,
nükleer bölünme indeksi [1x(1N)+2x(2N)+3x(3N+4N)]/n (n; incelenen toplam hücre
sayısı) formülünden yararlanılarak hesaplanmıĢtır.
3.2.2. Ġzole lenfositlerindeki çalıĢmalar
Komet testi
Bu çalıĢmada Komet testi için Singh ve arkadaĢlarının (1988) kullandıkları metot
bazı modifikasyonlarla uygulanmıĢtır [Singh ve ark., 1988]. Donörlerden alınan
kandan biocoll kullanılarak lenfositler izole edilmiĢtir. Ġzole lenfositlerde hücre
canlılığı trypan blue kullanılarak ≥%98 olarak belirlenmiĢtir. Lenfositler test
maddesinin konsantrasyonları (12,5; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 ve 125,0 µg/mL) ile bir
saat 37°C‘de inkübasyona alınmıĢtır. Pozitif kontrol olarak H2O2 (100 µM) ve
negatif kontrol olarak da saf su kullanılmıĢtır. Bir saat inkübasyon süresi sonunda
santrifüj iĢlemi ile süpernatant atılmıĢ ve PBS (Fosfat tamponu) ile resüspanse
edilmiĢtir. DüĢük erime ısılı agar ile lenfositler karıĢtırılmıĢ ve daha önceden yüksek
erime ısılı agar ile kaplanmıĢ lamların üzerine bu karıĢım yayılmıĢtır. Preparatlar
buzdolabında bekletildikten sonra lysing (çözünme) solüsyonuna alınmıĢtır. Daha
27
sonra elektroforez tamponunda bekletilmiĢ ve 25 V, 300 mA‘de 20 dakika
elektroforeze tabi tutulmuĢtur. Ardından nötralizasyon tamponunda (0,4 M Tris, pH
7,5) bekletilen lamlar Etidyum Bromid (EtBr) ile boyanarak incelemeye alınmıĢtır.
Her bir konsantrasyon için 200 hücre (her iki donörden 100‘er hücre) floresan
mikroskopta ―Comet Assay IV‖, Perceptive Instruments Ltd., UK analiz sistemi
kullanılarak incelenmiĢtir. Hücrelerin hasar dereceleri % kuyruk yoğunluğu, kuyruk
uzunluğu ve kuyruk momenti cinsinden değerlendirilmiĢtir.
Ġstatistiksel analizler
Uygulama ve kontrol gruplarından elde edilen mitotik indeks (MI), replikasyon
indeksi (RI), anormal hücre frekansı, hücre baĢına düĢen kromozom anormalliği ve
mikronükleus frekansı sonuçları z-testi ile, kardeĢ kromatid değiĢimi ve komet testi
sonuçları t-testi ile analiz edilmiĢtir.
Ayrıca doz-etki iliĢkisini ortaya koymak amacıyla mitotik indeks, replikasyon
indeksi, KKD/Hücre sayısı, anormal hücre frekansı, KA/Hücre sayısı, MN/Hücre
sayısı, nükleer bölünme indeksi, % kuyruk yoğunluğu, kuyruk uzunluğu ve kuyruk
momenti için SPSS 13.0 bilgisayar programıyla regresyon analizi uygulanmıĢtır.
28
4. ARAġTIRMA BULGULARI
4.1. Kromozomal Anormallik (KA) Testi Sonuçları
Metformin anormal hücre oranını ve hücre baĢına düĢen anormallik miktarını 24
saatlik uygulamada anlamlı düzeyde etkilememiĢ ancak 48 saatlik uygulamada en
düĢük konsantrasyon (12,50 µg/mL) hariç tüm konsantrasyonlarda kontrole göre
önemli oranda ve konsantrasyona bağlı olarak arttırmıĢtır (Anormal hücre oranı için
r= 0,81, hücre baĢına düĢen anormallik miktarı için r= 0,80) (Çizelge 4.1, ġekil 4.1).
Metformin kromozomlarda beĢ farklı yapısal anormalliğe neden olmuĢtur. Bunlar
kromatid ve kromozom kırıkları, disentrik kromozomlar, kardeĢ kromatidlerde
birleĢme ve fragment oluĢumudur (Çizelge 4.1). Tek bir uygulamada (75 µg/mL) ve
çok düĢük oranda (% 0,38) rastlanmak üzere sayısal kromozom anormalliği olan
poliploidi de gözlenmiĢtir (Çizelge 4.1). Resim 4.1‘de Metformin uygulaması ile
belirlenen kromozomal anormallikler verilmiĢtir. En yaygın görülen yapısal
anormallik kromatid kırıklarıdır (% 64,29). Daha sonra kromozom kırıkları (%
17,67) ve kardeĢ kromatidlerde birleĢme (% 9,39) gelmektedir. Daha düĢük oranda
olmakla birlikte diğer yapısal anormalliklerin sıralaması Ģu Ģekildedir; % 5,64
oranında fragment ve % 2,63 oranında disentrik kromozomlar.
29
Çizelge 4.1. Metformin‘in insan lenfositlerinde kromozomal anormallikler ve
frekansları üzerine etkisi
Test maddesi
Uygulama
Süre
Kons.
(saat) (μg/mL)
Anormal
hücre ± SH
(%)
Anormallikler
kzk
kkb
1
4
1
1
1
1
2
Kontrol
MMC
Metformin
24
24
24
0,0
0,2
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
ktk
1
20
1
4
8
4
5
1
Kontrol
MMC
Metformin
48
48
48
0,0
0,2
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
5
30
14
12
20
15
13
18
2
19
2
3
1
4
10
64,29
17,67
Kromozomal
anormallik
yüzdesi
1
1
2
3
4
5
2
2
KA/Hücre ± SH
ds
1
1
ktd
1
-
f
3
1
1
p
1
-
1,0±0,70
13,5±2,42
0,5±0,49
3,5±1,30
3,5±1,30
3,5±1,30
3,0±1,21
3,0±1,21
0,010±0,010
0,140±0,260
0,005±0,050
0,035±0,010
0,040±0,014
0, 035±0,013
0,030±0,012
0,030±0,012
1
1
1
1
1
3
-
1
2
2
3
1
1
-
4,5±1,47
24,5±3,02
8,5±1,97
9,5±2,07*
13,0±2,38**
11,5±2,26**
10,0±2,12*
15,5±2,56***
0,045±0,015
0,280±0,030
0,085±0,020
0,100±0,021*
0,140±0,025**
0,120±0,022**
0,100±0,021*
0,160±0,026***
-
5,64
0,38
9,39 2,63
Kons.: Konsantrasyonlar, ktk: kromatid kırığı, kzk: kromozom kırığı, kkb: kardeĢ kromatidlerde
birleĢme, ds: disentrik kromozom, ktd: kromatid değiĢimi, f: fragment, p:poliploidi
* Kontrole göre P< 0,05 düzeyinde anlamlı (z testi)
** Kontrole göre P< 0,01 düzeyinde anlamlı (z testi)
*** Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi)
Anormal Hücre (%)
25
20
15
10
24 saat
5
48 saat
0
Konsantrasyonlar
ġekil 4.1. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki anormal hücre
frekansı
30
(a)
(c)
(b)
(d)
(e)
(f)
Resim 4.1. Metformin ile muamele edilen insan lenfositlerinde gözlenen kromozom
anormallikleri a) Kromozom kırığı b) Kromatit kırığı c) KardeĢ
kromatidlerde birleĢme d) Disentrik kromozom e) Fragment f) Poliploidi
31
4.2. KardeĢ Kromatid DeğiĢimi (KKD) Testi Sonuçları
Metformin KKD oranını 24 saatlik uygulamada en düĢük doz olan 12,5 µg/mL‘lik
konsantrasyon hariç tüm konsantrasyonlarda kontrole göre önemli oranda ve
konsantrasyona bağlı olarak arttırmıĢtır (r= 0,90). 48 saatlik uygulamasında ise KKD
frekansı tüm konsantrasyonlarda kontrole göre anlamlı düzeyde artmıĢtır. Bu artıĢ
konsantrasyona bağlıdır (r= 0,64). (Çizelge 4.2, ġekil 4.2, Resim 4.2). ÇalıĢmada
tespit edilen en az KKD sayısı 2, en fazla KKD sayısı ise 18‘dir.
Mitotik indeks değerleri incelendiğinde Metformin‘in 24 saatlik uygulamasında 12,5
ve 50,0 µg/mL‘lik konsantrasyonlar hariç tüm konsantrasyonların mitotik indeksi
kontrole göre düĢürdüğü gözlenmiĢtir. Ancak bu düĢüĢ konsantrasyona bağlı
değildir. 48 saatlik uygulamada ise tüm konsantrasyonlar mitotik indekste kontrol
grubuna göre anlamlı oranda ve konsantrasyona bağlı olmayan bir azalmaya neden
olmuĢtur (Çizelge 4.2, ġekil 4.3). Metformin‘in replikasyon indeksi üzerine herhangi
bir etkisinin olmadığı belirlenmiĢtir (Çizelge 4.2).
Çizelge 4.2. Metformin‘in insan lenfositlerinde KKD, RI ve MI frekansları üzerine
etkisi
Test maddesi
Süre
(saat)
Uygulama
Konsantrasyon
(μg/mL)
Kontrol
MMC
Metformin
24
24
24
0,0
0,2
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
Minmax
KKD
2-6
13-45
1-8
2-7
3-18
3-10
4-11
4-10
Kontrol
MMC
Metformin
48
48
48
0,0
0,2
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
2-8
17-48
2-9
3-10
3-10
3-10
3-10
3-11
KKD/hücre ±
SH
M1
M2
M3
RĠ ± SH
MĠ ± SH
3,16±1,17
28,70±1,22
3,10±0,20
4,12±0,19*
5,30±0,34*
5,32±0,22*
6,20±0,23*
6,04±0,23*
62
71
49
55
45
35
49
56
24
40
32
22
33
36
34
25
114
89
119
123
122
129
117
119
2,26±0,06
2,09±0,06
2,35±0,06
2,34±0,06
2,39±0,06
2,47±0,05
2,34±0,06
2,32±0,06
6,25±0,54
3,90±0,43
5,50±0,51
3,65±0,42a3
6,00±0,53
4,60±0,47a1
4,30±0,45a2
3,45±0,41a3
3,76±0,21
30,16±1,18
5,20±0,26*
5,66±0,24*
5,16±0,22*
5,90±0,23*
5,98±0,27*
5,26±0,27*
42
66
64
66
52
67
38
58
35
61
46
39
41
55
52
58
123
73
90
95
107
78
110
84
2,41±0,06
2,04±0,06
2,13±0,05
2,15±0,06
2,28±0,06
2,06±0,06
2,36±0,06
2,13±0,06
4,75±0,48
2,40±0,34
2,75±0,37 a3
2,95±0,38 a2
3,25±0,40 a1
3,20±0,39 a1
3,10±0,39 a2
3,50±0,41 a1
* Kontrole göre p<0,05 düzeyinde anlamlı (t-testi)
a1 Kontrole göre p<0,05 düzeyinde anlamlı (z testi)
a2 Kontrole göre p<0,01 düzeyinde anlamlı (z testi)
a3 Kontrole göre p<0,001 düzeyinde anlamlı (z testi)
32
35
30
KKD/Hücre
25
20
24h
15
48h
10
5
0
Kontrol
MMC
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
Konsantrasyonlar
ġekil 4.2. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki kardeĢ kromatit
değiĢimi frekansı
8
7
Mitotik indeks (%)
6
5
4
24h
3
48h
2
1
0
Kontrol
MMC
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
Konsantrasyonlar
ġekil 4.3. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki mitotik indeks
frekansı
33
Resim 4.2. Metformin ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde gözlenen
kardeĢ kromatid değiĢimleri
4.3. Mikronukleus (MN) Testi Sonuçları
MN testi sonuçlarına göre Metformin mikronükleus frekansında kontrole göre en
yüksek üç konsantrasyonda artıĢa neden olmuĢtur. Ancak, yalnızca en yüksek
konsantrasyon olan 125,0 µg/mL‘lik konsantrasyonda anlamlı düzeyde artıĢ
belirlenmiĢtir. MN frekansında konsantrasyona bağlı bir artıĢ tespit edilmiĢtir (r=
0,90) (Çizelge 4.3, ġekil 4.4).
Bu çalıĢmada Metformin uygulaması sonucunda yoğun olarak bir mikroçekirdekli
binükleatlara rastlanmıĢtır (Resim 4.3). Üç mikroçekirdekli binükleatlara hiç
rastlanmazken, iki mikroçekirdekli binükleata yalnızca en düĢük konsantrasyonda
(12,5 µg/mL) rastlanmıĢtır. Metformin Nükleer bölünme indeksini (NBI) tüm
konsantrasyonlarda düĢürmüĢtür. Ancak bu düĢüĢ zayıf oranda konsantrasyona bağlı
(r= 0,49) ve yalnızca en yüksek iki konsantrasyon olan 100,0 ve 125,0 µg/mL‘lik
konsantrasyonlarda kontrole göre anlamlıdır (Çizelge 4.3).
34
Çizelge 4.3. Metformin‘in insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer
bölünme indeksi üzerine etkisi
Uygulama
Test maddesi
Süre
Konsantrasyon
(saat)
(μg/mL)
Sayılan
BN hücreler içinde
binükleat
mikronükleus frekansları
hücre
(1)
(2)
(3)
Nükleer Bölünme
MN ± SH
Ġndeksi ± SH
(%)
(NBI)
sayısı
Kontrol
48
0,0
2000
7
-
-
0,35 ± 0,13
1,82 ± 0,42
MMC
48
0,2
2000
34
-
-
1,70 ± 0,28
1,77 ± 0,41
Metformin
48
12,5
2000
5
1
-
0,35 ± 0,13
1,82 ± 0,42
25,0
2000
5
-
-
0,25 ± 0,10
1,81 ± 0,42
50,0
2000
6
-
-
0,30 ± 0,12
1,80 ± 0,42
75,0
2000
8
-
-
0,40 ± 0,14
1,76 ± 0,41
100,0
2000
13
-
-
0,65 ± 0,17
1,74 ± 0,17**
125,0
2000
20
-
-
1,00 ± 0,22**
1,48 ± 0,38*
* Kontrole göre p<0,05 düzeyinde anlamlı (z testi)
** Kontrole göre p<0,01 düzeyinde anlamlı (z testi)
***Kontrole göre p<0,001 düzeyinde anlamlı (z testi)
1,8
1,6
1,4
MN (%)
1,2
1
0,8
48h
0,6
0,4
0,2
0
Kontrol
MMC
12,5
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
Konsantrasyonlar
ġekil 4.4. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerindeki mikronükleus
frekansı
35
(a)
(b)
Resim 4.3. Metformin ile muamele edilen insan lenfositlerinde gözlenen
mikronükleuslu binukleat hücreler a) bir mikronükleuslu binükleat
b) iki mikronükleuslu binükleat
4.4. Komet Testi Sonuçları
Komet
testi
sonuçlarına göre Metformin
tüm
konsantrasyonlarda kuyruk
yoğunluğunu kontrole göre konsantrasyona bağlı artırmıĢtır (r=0,65). Ancak bu artıĢ
yalnızca en yüksek konsantrasyonda (125,0 µg/mL) anlamlı düzeydedir. Metformin
kuyruk uzunluğunu ise 12,5 ve 50,0 µg/mL‘lik konsantrasyonlar hariç tüm
konsantrasyonlarda anlamlı oranda artırmıĢtır. Bu artıĢ konsantarsyona bağlıdır (r=
0,71). Bununla birlikte Metformin kuyruk momentini etkilememiĢtir (Çizelge 4.4,
ġekil 4.5, Resim 4.4).
36
Çizelge 4.4. Metformin uygulanması ile insan lenfositlerinde oluĢan DNA hasarı
Test Maddesi
Uygulama
Süre
Konsantrasyon
Kuyruk
Kuyruk
Kuyruk
Yoğunluğu
Uzunluğu
Momenti
(saat)
Negatif Kontrol
1
8,69 ± 1,03
55,63 ± 0,95
2,14 ± 0,35
Pozitif Kontrol (H2O2)
1
100 μM
0,0 µg/mL
20,68 ± 1,68
145,62 ± 7,07
12,25 ± 1,36
Metformin
1
12,5 µg/mL
11,29 ± 1,10
54,83 ± 1,13
2,57 ± 0,31
25,0 µg/mL
11,09 ± 0,97
61,94 ± 1,52*
2,53 ± 0,28
50,0 µg/mL
9,35 ± 1,02
55,28 ± 1,13
2,38 ± 0,36
75,0 µg/mL
9,82 ± 0,95
62,35 ± 1,64*
2,43 ± 0,28
100,0 µg/mL
11,48 ± 1,01
62,35 ± 1,34*
2,77 ± 0,30
125,0 µg/mL
12,02 ± 1,16*
65,28 ± 1,91*
3,16 ± 0,39
* Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi)
160
140
DNA Hasarı
120
100
80
Kuyruk uzunluğu
60
Kuyruk yoğunluğu
40
Kuyruk momenti
20
0
Konsantrasyonlar
ġekil 4.5. Metformin ile muamele edilmiĢ insan lenfositlerinde oluĢan komet kuyruk
yoğunluğu, kuyruk uzunluğu ve kuyruk momenti
37
(a)
(b)
(c)
Resim 4.4. Metformin ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluĢan DNA
hasarlarının komet testi ile görünümü a) hasarsız DNA b) orta
hasarlı DNA c) çok hasarlı DNA
38
5. TARTIġMA VE SONUÇ
Diyabet kalp damar hastalığı, nöropati, nefropati ve retinopati gibi ciddi makro ve
mikrovasküler komplikasyonlara neden olan ilerleyici kronik bir hastalıktır [Satman
ve ark., 2011]. Diyabet hastalığının dünyada 285 milyon insanı etkilediği tahmin
edilmektedir [IDF, 2009]. 2002 yılında gerçekleĢtirilen Türk Diyabet Prevalans
ÇalıĢmasında [TURDEP] 20 yaĢ ve üzerinde olanlarda diyabet prevalansının %7,2
olduğu açıklanmıĢtır. On yıl sonra aynı çalıĢma güncelleĢtirilmiĢ ve bilinen diyabet
prevalansının %7,5 olduğunu, tanı konmamıĢ diyabet prevalansının ise %6,2 olduğu
belirtilmiĢtir [Satman ve ark., 2011]. Diyabet tipleri içinde en yaygın görüleni Tip 2
diyabettir. Bu diyabet tipinin tedavisinde çoğunlukla ilk baĢvurulan ilaçlar
Metformin etken maddesini içeren ilaçlardır [Turkdiab, 2012].
Metformin, hem karaciğerin hem de periferik dokuların insüline duyarlılığını arttırır.
Karaciğerde hem glukoneogenezi hem de glukojenolizi baskılar. Daha belirgin
olarak açlık, kısmen de tokluk kan Ģekerini düĢürür. En uygun doz günde 2 gramdır.
En önemli yan etkileri bulantı, kusma, gaz, karın ağrısı, diyare gibi gastrointestinal
Ģikâyetlerdir. Metformin ayrıca ağızda metalik tat hissine ve uzun süreli kullanımda
vitamin B12 eksikliğine neden olabilir. Biguanidlerin laktik asidoza neden
olabileceği bilinmektedir. Fakat Metformin‘e bağlı laktik asidoz insidansı 100 000
hastada 1‘den azdır. Yine de laktik asidozu kolaylaĢtırabilecek durumlar varlığında
kullanılması önerilmez [Ayvaz ve Kan, 2010].
Potansiyel karsinojeniteyi tahmin etmek için genotoksisite verilerinin kullanılması,
tüm kanserlerde genetik değiĢikliklerin bulunması prensibine dayanmaktadır.
Genotoksisite kimyasalların hücre bölünmesi esnasında genetik materyalde
değiĢikliğe neden olabilme yetenekleridir [Gwinn ve ark., 2011]. Bir kimyasalın
genotoksik riske sahip olduğunu söyleyebilmek için birbirini tamamlayan
genotoksisite testlerinin yapılmıĢ olması gerekir. Uluslar arası Kimyasal Güvenlik
Programı [IPCS] tarafından yapılan açıklamada ―Tek bir mutajenite testinde elde
edilen bariz pozitif sonuca karĢın çoklu negatif sonuçların belirlenmesinin bu
kimyasalın mutajen olmadığını söylemek için yeterli olmayabileceği‖ belirtilmiĢtir
39
[Eastmond ve ark., 2009]. Bu nedenle insanların yaĢamları boyunca maruz kaldıkları
çeĢitli
kimyasalların
genotoksisitelerinin
belirlenebilmesi
amacıyla
birçok
araĢtırmacı tarafından çalıĢmalar yapılmaktadır [Bedir ve ark., 2006; 2008;
YüzbaĢıoğlu ve ark., 2008; Timoroğlu ve ark. 2012; Doak ve ark., 2012; Montoro ve
ark., 2012]. Ġnsan lenfositlerinin kullanıldığı in vitro testlerden en yaygın kullanılan
ve güvenilirliği yüksek olan testler ise kromozomal anormallik, kardeĢ kromatid
değiĢimi, mikronukleus ve Komet testleridir [YüzbaĢıoğlu ve ark., 2006; Zengin ve
ark., 2011; Doak ve ark., 2012].
Metformin‘in insan lenfositlerinde genotoksik etkilerinin incelendiği yayınlanmıĢ bir
çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Ancak bazı genotoksisite testleri farklı test sistemlerinde
gerçekleĢtirilmiĢtir.
Bu
çalıĢmaların
sonuçları
çeliĢkilidir.
Bazı
çalıĢmalar
Metformin‘in genotoksik olmadığını ve DNA hasarına karĢı koruyucu olabileceğini
gösterirken,
bazıları
da
özellikle
kronik
uygulamalarda
genotoksik
risk
oluĢturabileceğini vurgulamaktadır [Onaran ve ark., 2006; Leigh ve ark., 2010;
Amador ve ark., 2012].
Bu çalıĢmada, çok yaygın kullanılan bir antidiyabetik etken maddesi olan ancak daha
önce insan lenfositlerinde genotoksisiteleri ile ilgili herhangi bir çalıĢması
bulunmayan Metformin‘in in vitro genotoksik etkileri kromozom anormallikleri
(KA), kardeĢ kromatid değiĢimi (KKD), mikronükleus (MN) ve Komet testleri
kullanılarak incelenmiĢtir.
Metformin özellikle 48 saatlik uygulamalarda hem kromozomal anormallik oranını
hem de kardeĢ kromatid değiĢimi oranını artırmıĢtır. 24 saatlik uygulamada ise
kromozomal anormallik oranı artmazken kardeĢ kromatid değiĢimi frekansı artmıĢtır.
Mikronukleus frekansı yalnızca en yüksek konsantrasyonda (125,0 µg/mL) anlamlı
düzeyde artmıĢtır. Komet testi sonuçları incelendiğinde ise kuyruk yoğunluğu (en
yüksek konsantrasyon hariç) ve kuyruk momentinde bir değiĢiklik saptanmamıĢ
ancak kuyruk uzunluğunda artıĢ belirlenmiĢtir. Mitotik indeks hemen hemen tüm
uygulamalarda düĢmüĢtür. Aynı zamanda en yüksek iki konsantrasyonda (100,0 ve
40
125,0 µg/mL) nükleer bölünme indeksi de düĢmüĢtür. Replikasyon indeksinde
herhangi bir değiĢim belirlenmemiĢtir.
Kromozomal anormallik testi kromozomların yapılarında ve sayılarında meydana
gelen değiĢikliklerin belirlenmesi temeline dayanan bir testtir. Kromozomal
anormallik oranındaki artıĢ, genetik hastalıkların ve kanser riskini arttıran
klastojenitenin bir göstergesi olarak kabul edilmektedir [Hagmar ve ark., 1998; Ji ve
ark, 2001; Bolognesi, 2003; Bozkurt ve ark., 2004; Doak ve ark., 2012]. Bu nedenle
kromozomal anormallik testi güvenilirliği yüksek olan bir testtir.
Genotoksik potansiyeli olan ajanlar ya doğrudan DNA üzerinde hasar meydana
getirirler ya da dolaylı yoldan etkili olurlar. Dolaylı yoldan etki edenler hücre
bölünmesinde görev yapan çeĢitli biyomolekülleri etkileyerek genetik hasar
oluĢtururlar. Etkiledikleri biyomoleküller arasında hücre bölünmesi esnasında
kromozomların hareketinde görev yapan proteinler (mikrotüpcükler, kinetokorlar,
sentrioller),
DNA
replikasyonunda
görev
alan
proteinler
(polimerazlar,
topoizomeraz), DNA tamir mekanizmalarında ve hücre döngüsünün kontrol
noktalarında rol oynayan proteinler sayılabilir. Bu tip dolaylı etki sonucunda da
kromozomların yapısında ve sayısında anormallikler oluĢabilmektedir [Doak ve ark.,
2012].
Kromozomlarda tek bir kardeĢ kromatitdeki çift zincir kırıkları veya her iki kardeĢ
kromatitdeki kırılmalar sırasıyla kromatid ve kromozom kırıklarına neden olmaktadır
[Savage, 1975]. Bu anormalliklerin ortaya çıkabilmesi için zincir kırıklarının yanlıĢ
tamir edilmesi veya tamir edilememesi gerekmektedir. Eğer kırık G0 veya G1 fazında
oluĢursa ve tamir edilemezse kromozom tipi hasara neden olmaktadır. Ancak kırık S
fazında oluĢur ve tamir edilemezse tek zincir kırığı nedeniyle kromatit tipi kırıklar
gözlenecektir [Albertini ve ark., 2000; Hagmar ve ark., 2004]. Bu çalıĢmada,
Metformin en fazla kromatid kırıklarının oranını artırmıĢtır. Bu nedenle
Metformin‘in S fazında etkili olduğu ancak daha düĢük oranda olmakla birlikte
G0 ve G1 fazlarında da hasara neden olabildiği söylenebilir. Metformin‘in neden
olduğu bir diğer anormallik kardeĢ kromatidlerde birleĢmedir. Bu tip anormallik
41
kromozom uçlarının delesyononu ve iki kardeĢ kromatidin birbirleriyle
birleĢmesi sonucu oluĢmaktadır [Murli, 2003; YüzbaĢıoğlu ve ark., 2006].
Metformin ayrıca fragmentlere de neden olmuĢtur. Fragmentler, kromozom ya da
kromatitlerdeki
kırılmalar
ve
genellikle
terminal
delesyonlar
sonucu
oluĢmaktadır [Kayraldız ve TopaktaĢ, 2001; Yılmaz ve ark., 2008]. Metformin
sayısal anormallik olan poliplodiye de düĢük oranda neden olmuĢtur. Haploid
kromozom takımının ikiden fazla kat artması sonucu oluĢmaktadır.
Kromozomal anormallik testi sonuçları değerlendirildiğinde Metformin‘in
özellikle uzun süreli uygulamasının in vitro koĢullarda klastojenik aktivite
gösterdiği belirlenmiĢtir.
Metformin KKD oranında artıĢa neden olmuĢtur. KKD frekansında artıĢ tespit
edilmesi, ajanın hücredeki replikasyon mekanizmasını etkilediğini ve DNA
hasarı oluĢturabildiğini göstermektedir [Bozkurt ve ark., 2004; Santoro ve ark.,
2008; Beg ve ark., 2009; Montoro ve ark., 2012]. KKD ve kromatid tipi
anormalliklerin oluĢum mekanizması birbirine benzemektedir. Ancak yapılan bir
çalıĢmada insan lenfositleri hücre döngüsünün S veya G 2 evresinde, KKD ve
kromatid aberasyonu frekansında farklılıklar gözlenmiĢtir [Ishii ve Watatani
1984]. AraĢtırıcılar KKD oluĢumunun S fazında, kromatid aberasyonlarının
oluĢumunun ise S ve G 2 fazında meydana geldiği belirlemiĢlerdir. Bundan dolayı
iki sitogenetik testin birbiri için tamamlayıcı özellikte olduğunu açıklamıĢlardır
[Ishii ve Watatani, 1984; Bozkurt ve ark., 2004; Hagmar ve ark., 2004].
Mikronükleus testi kimyasalların potansiyel genotoksisitesini belirlemede yaygın
olarak kullanılan metotlardandır. Mikronükleuslar hücre bölünmesi esnasında
asentrik kromozom fragmentleri veya tüm bir kromozom kaybını göstermektedir.
Bundan dolayı MN testi ile kromozom kayıpları saptanmakta [Fenech 2000] ve
hem klastojenik hem de anöjenik etkiler belirlenebilmektedir [Parry ve KirschVolders, 2010]. Mikronukleuslar çeĢitli nedenlerle oluĢabilmektedir. Bunlar tamir
edilmemiĢ veya yanlıĢ tamir edilmiĢ DNA hasarlarından, iğ ipliği, kinetokor, ya da
diğer mitotik aparatların fonksiyon kaybından kaynaklanabilirler. Oksidatif stres,
42
klastojen veya anöjenlere maruz kalınması halinde, hücre bölünmesinde görev yapan
genetik kontrol noktalarında ve/veya DNA tamir genlerinde meydana gelen
hatalardan dolayı da MN frekansı artabilir. Çünkü bütün bu olaylar, kromozomlarda
yeniden düzenlenmeler, değiĢmiĢ gen ekspresyonları veya anöploidi gibi yollarla
MN oluĢtururlar [Fenech, 2000]. Bütün bu yapıların, farklı kanser tiplerinde ortaya
çıkan kromozom düzensizlikleri ile iliĢkili olduğu düĢünülmekte ve son yıllarda
yaygın olarak kanser takip ve önleme programlarında biyobelirteç olarak
kullanılmaktadır [Fenech ve ark., 2003; Bonassi ve ark., 2007; Cardinale ve ark.,
2012].
Metformin MN frekansını yalnızca en yüksek konsantrasyonda (125,0 µg/mL)
artırmıĢ diğer konsantrasyonlarda böyle bir etki göstermemiĢtir. Metformin‘in
KA ve KKD frekansında artıĢa neden olup MN frekansını etkilememesi anöjenik
etkisinden ziyade klastojenik etkisinin olabileceğini göstermektedir.
Bu çalıĢmada Metformin‘in DNA hasarı oluĢturup oluĢturmadığını belirlemek
için Komet testi de uygulanmıĢtır. Komet testinin birçok avantajı bulunmaktadır.
Bunlar arasında çok düĢük düzeydeki DNA hasarlarının dahi ayırt edilebilmesi,
az sayıda hücrenin yeterli olabilmesi, değiĢik hücre ve dokulara uygulanabilir
olması, hızlı sonuç vermesi ve DNA kırıklarının görsel olarak belirlenebilmesi
sayılabilir [Fairbairn ve ark., 1995; Tice ve ark., 2000]. Komet testinde kuyruk
uzunluğu, kuyruk yoğunluğu ve kuyruk momenti belirlenmektedir. Önceleri
kuyruk uzunluğunun doğrudan fragment büyüklüğü ile bağlantılı olduğu
düĢünülmekteydi. Ancak daha sonra bu görüĢün doğru olmadığı belirlenmiĢtir.
Çünkü kuyruk uzunluğunun deney koĢullarından (elektroforez Ģartları, kamera
özellikleri ve analiz programı farklılıkları vb.) etkilenebildiği belirlenmiĢtir.
Ayrıca düĢük DNA hasarında kuyruk uzunluğu artarken yüksek DNA hasarında
ise artmadığı görülmüĢtür. Kuyruk yoğunluğu ise yüksek DNA hasarında
artmaktadır ve aynı zamanda kırık frekansıyla da doğrudan iliĢkilidir. Kuyruk
yoğunluğu deney Ģartlarından etkilenmemekte ve laboratuvarlar arasında önemli
bir fark göstermemektedir [Tice ve ark., 2000; Collins, 2004]. Bu nedenlerle
Komet testinde en çok kabul gören parametre kuyruk yoğunluğudur. Kuyruk
43
momenti ise kuyruk uzunluğu ve kuyruk yoğunluğunun arasındaki iliĢkiyi veya
komet baĢ ve kuyruk merkezi arasındaki mesafeyi gösteren bir parametredir.
Kuyruk momenti doza bağlı bir iliĢki göstermemektedir. Ayrıca komet görünüĢü
ile ilgili bir izlenim vermemekte ve sonuçları laboratuvarlar arasında farklılıklar
göstermektedir [Fairbain ve ark., 1995; Collins, 2004].
Bu çalıĢmada da Metformin kuyruk uzunluğunda artıĢa neden olmuĢ kuyruk
yoğunluğunu ise yalnızca en yüksek konsantrasyonda artırmıĢtır. Kuyruk
momentini ise etkilememiĢtir.
Sitotoksisitenin ve hücre proliferasyonunun belirlenmesinde kullanılan önemli
göstergelerden biri Mitotik indekstir [Eroğlu, 2007]. Mitotik indeksteki düĢüĢ,
hücrelerin mitoza girmesini sağlayan G2 safhasının engellenmesinden, enerji üretim
merkezindeki bozukluktan ve ATP seviyesindeki azalmadan kaynaklanabilmektedir.
Ayrıca DNA sentezinin engellenmesi, DNA sentezi ve iğ oluĢumundan görev yapan
enzimlerin baskılanması ve G2 periyodunun uzaması da nedenler arasında
gösterilmektedir [Epel, 1963; Van‘t Hof, 1968; Jain ve Andsorbhoy, 1988; Hidalgo
ve ark., 1989; YüzbaĢıoğlu ve ark., 2006]. Mitotik indeksteki azalma hücre
döngüsünün baskılandığını ve hücrenin proliferasyon kapasitesindeki kaybı yansıtır
[Albert ve Magee, 2000; Lopez-Nigro ve ark., 2003]. Metformin mitotik indeksi
anlamlı oranda düĢürmüĢ ve sitotoksik etki sergilemiĢtir.
Ayrıca
çalıĢmada
Replikasyon
indeksi
ve
Nükleer
bölünme
indeksi
de
hesaplanmıĢtır. Metformin RI üzerinde etkili olmamıĢtır. Nükleer bölünme
indeksinin belirlenmesi, genotoksik maruziyete bağlı olarak oluĢan immün cevabın
belirlenmesinde kullanılan önemli bir biyomarkır olan mitojen cevabın ölçülmesini
sağlar. Dolayısıyla sitostatik etkinin göstergesidir [Fenech, 2007]. Metformin en
yüksek iki konsantrasyonda (100,0 μg/mL‘de 1,75 ve 125,0 μg/mL‘de ise 1,48)
NBI‘nin düĢüĢüne neden olmuĢtur. Bu durum hücrelerin sitokinez bloklanması
esnasında bölünmede baĢarısızlık yaĢadıklarını göstermektedir. Bu nedenle de çoğu
hücre mononukleattır.
44
Metformin, biguanid oral antihiperglisemik ajan olup, genel olarak Tip 2 Diabetes
Mellitus tedavisinde kullanılmaktadır. Metformin‘in hastalar için avantajlara sahip
bir ilaç olduğunu gösteren çeĢitli çalıĢmalar vardır. Örneğin ratlarla yapılan bir
çalıĢmada Metformin ve aynı gruptan olan fenformin etkileri karĢılaĢtırılmıĢtır.
Bigunaidlerden olan fenformin %50‘den daha yüksek ölüm oranı gösteren yüzlerce
laktik asidoz vakası sebebiyle 1977 yılında piyasadan çekilmiĢtir. Biguanidlerin
temel etki mekanizmasının laktik asit kullanımının azalmasına sebep olabilen hepatik
glukoneogenezin
inhibisyonu
olduğu
düĢünülmektedir.
Yapılan
çalıĢmada
Metformin hidrokloridin 50, 100 200 mg/kg/gün, fenformin hidrokloridin 100, 200,
400 mg/ kg/gün‘lük konsantrasyonları kullanılmıĢtır. Klinik bulguların tespiti ve
ölüm oranını günlük olarak değerlendirilmiĢ ve uygulama süresince ratların vücut
ağırlığı hafta iki kere ölçülmüĢtür. 1. ve 28. günlerde kan alımı gerçekleĢtirilmiĢtir.
Metformin‘in tekrarlı dozlarda bile insan terapötik seviyesinden daha yüksek
seviyelerdeki sistemik ilaç maruziyetinde laktik asit seviyesini artırmadığı
gözlenmiĢtir. Bunun tersine, fenforminin insan terapötik seviyesinin altındaki dozları
laktik asit seviyesini artırmıĢ, doz uygulanmasından 24 saat sonra çok yüksek
seviyelere ulaĢmıĢ ve aynı durum tekrarlı dozlarda da gözlenmiĢtir. Bu klinik
olmayan bulgular Metformin‘in fenformin gibi laktik asit seviyesini artırmadığı ve
bu sebepten insan terapötik maruziyet seviyesinde laktik asidoz için risk teĢkil
etmediğini göstermiĢtir [Bando ve ark., 2010].
Birçok çalıĢma Metformin‘in kanser önleyici etkileri olduğunu vurgulamaktadır.
Metformin‘in
anti-tümörijenik
potansiyelini,
proliferasyondaki
etkisini
ve
endometriyal kanser hücre hatlarındaki hücre sinyalizasyonundaki ana hedefinin
belirlenmesini amaçlayan bir çalıĢma Leigh ve arkadaĢları tarafından yapılmıĢtır.
ÇalıĢmada endometriyal kanser hücre hatları ECC-1 ve Ishikawa kullanılmıĢtır.
Hücreler Metformin‘in çeĢitli dozlarıyla ( 0.01; 1; 2; 5 mM) 24- 72 saat muamele
edilmiĢtir.
Hücre
proliferasyonu
Metformin
maruziyetinden
sonra
değerlendirilmiĢtir. Hücre döngüsü ilerleyiĢi flow sitometri ile belirlenmiĢtir. Sonuç
olarak Metformin‘in her iki hücre hattında da büyümeyi doza bağlı olarak
engellemiĢtir. Metformin ile muamele bölünmenin G1‘de durmasına sebep olmuĢtur
[Leigh ve ark., 2010].
45
Diğer bir çalıĢmada Metformin‘in tümör büyümesi üzerine etkisi izojenik HCT116
p53+/+ ve HCT116 p53_/_ kolon kanseri hücre hatlarında araĢtırılmıĢtır. Metformin
uygulamasının HCT116 p53_/_ ksenogreflerinde tümör büyümesini seçici olarak
baskıladığı gözlenmiĢtir [Buzzai ve ark., 2007].
Metformin‘in epitelyal yumurtalık kanserinin hücre hatları üzerindeki etkisi de
incelenmiĢtir. Bu amaçla OVCAR-3 ve OVCAR-4 hücre hatları cisplatinle birlikte
veya tek olarak Metformin‘e maruz bırakılmıĢtır. Hücre hatları Metformin ile 24- 96
arasında değiĢen sürelerde 1-100 mM arası farklı dozlarda muamele edilmiĢtir.
Cisplatin maruziyeti için 5-10 µg/mL arasında dozlar seçilmiĢ, 37°C‘de 4 saat
inkübasyona alınmıĢ ve sonrasında ortam değiĢtirilerek kontrol olarak DMSO ya da
Metformin ile muamele yapılmıĢtır. AMPK‘ nin (AMP‘nin aktive ettiği protein
kinaz)
rolünü değerlendirebilmek için 24 saat Metformin maruziyetini tabiken
hücreler AMPK inhibitörü olan C bileĢiği (Dorsomorphin) ile 30 dakika ön
uygulamaya tabii tutulmuĢtur. Sitotoksisite testleri Alamar kolorimetrik testi
kullanılarak 3 kez tekrarlı olarak uygulanmıĢtır. Metformin maruziyetini takiben
toplam ve fosforillenmiĢ AMPK, p70S6K ve S6K seviyeleri Western blotlama ile
ölçülmüĢtür. Sonuç olarak Metformin‘in OVCAR-3 ve OVCAR-4 hücre hattında doz
ve zamana bağlı olarak büyümede yavaĢlamaya sebep olduğu ortaya konulmuĢtur.
Metformin, cisplatinin yumurtalık kanseri hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisini
desteklemiĢtir. Metformin‘in büyümeyi engelleyici etkisi AMPK inhibitörü olan C
bileĢiği ile kısmen hafifletmiĢtir. Western blotlama Metformin‘in sitotoksik
konsantrasyonlarda,
AMPK
fosforilasyonunu
artırıp
p70S6K
ve
S6K
fosforilasyonunu azalttığını göstermiĢtir. Bunun anti-proliferatif mekanizması
olabileceği açıklanmıĢtır [Gotlieb ve ark., 2008].
Kanser görülme sıklığı ile Metformin kullanımı arasında bir iliĢki olduğunu ilk
olarak Evans ve arkadaĢları tarafından tespit etmiĢtir [Evans ve ark., 2005]. Daha
sonra 2006 yılında kanser ölüm oranının yılda 1000 kiĢiden sülfonilüreaz kullananlar
için % 4,9, Metformin için %3,5 ve insülin kullanıcıları için %5,8 olduğu
belirlenmiĢtir (Bowker ve ark., 2006). ZODIAC (The Zwolle Outpatient Diabetes
Project Integrating Available Care: Zwolle Diyabet Hastalarının Ayaktan Tedavisini
46
Sağlayan Entegre Projesi) denemelerinden elde edilen verilere göre, Metformin
kullanan hastalarda kansere bağlı ölüm oranının daha düĢük olduğu gözlenmiĢtir
[Landman ve ark., 2010]. 198 hasta üzerinde yapılan farklı bir çalıĢmada 36 aydan
daha uzun süre Metformin‘e maruziyetinin kanser oluĢum riskini önemli ölçüde
azalttığını göstermiĢtir [Monami ve ark., 2009]. Currie ve arkadaĢları 60 000‘ den
fazla diyabetik hastayı incelemiĢ ve insülin ya da insülin salgılatıcı kullananlarda
solid tümör geliĢme riskinin Metformin kullanan, sülfonilüre monoterapisi ve
insülin- bazlı diyet tedavisi görenlerdekinden yüksek olduğu tespit edilmiĢ ve
Metformin kullanımı kolon ya da pankreas kanserinin görülme sıklığındaki düĢüĢle
iliĢkilendirilmiĢtir. Bu çalıĢmada Metformin kullanımının göğüs ya da prostat kanseri
geliĢimini etkilemediği belirtilmiĢtir [Currie ve ark., 2009]. Yang ve arkadaĢları
[2010] ile Monami ve arkadaĢları [2011] Metformin ile azalmıĢ kanser görülme
sıklığı arasında bir bağlantı olduğunu ortaya koymuĢlardır. Farklı araĢtırmacılar
Metformin kullanımının farklı kanser tiplerinde kemoterapi sonrası daha iyi sonuçlar
elde edilip edilemeyeceği üzerinde çalıĢmıĢ, bu ilacı kullanan diyabetik hastalarda
kullanmayanlarla kıyaslandığında pankreatik kansere yakalanma riskinin önemli
ölçüde düĢük olduğu gözlenmiĢtir [Li ve ark., 2009]. Bodmer ve arkadaĢları [2010]
ise 5 yıldan daha uzun süre Metformin kullanan hastalarda göğüs kanseri görülme
sıklığının azaldığını ortaya koymuĢtur. Son olarak Bernstein ve arkadaĢları sadece
diyet tedavisi, sülfonilüre takviyesi, insülin terapisi ve monoterapi veya sülfonilüre
türevleri ile Metformin‘in kombinasyonunu içeren farklı antidiyabetik tedavileri
görmüĢ, ameliyatının üzerinden en az 1 yıl geçmiĢ Diabetes Mellitus Tip 2 hastası
menopoz sonrası 90 kadında göğüs kanseri reseptörlerinin durumunu incelemiĢlerdir.
Bu çalıĢmada farklı muamale gruplarının tümör dokularında östrojen reseptörü
varlığına rastlanmamıĢtır. Tek ya da sülfonilüre ile kombine olarak Metformin
tedavisi gören kadınlarda progesteron reseptör-pozitif meme karsinomunun
gözlenme sıklığı incelenmiĢtir. Sadece sülfonilüre (P= 0,043) ve sülfonilüre veya
insülinle kombine (P=0,41) uygulanan gruplarda bu sıklığın arttığı gözlenmiĢtir.
Metformin ve sülfonilürelerin göğüs kanser hücrelerinde reseptör durumu ile ilgili
mekanizmayı değiĢtirdiği söylenebilir [Berstein ve ark., 2011]. Ġskoçya‘ da yapılan
bir durum- kontrol çalıĢmasında daha fazla oranda Metformin kullanımının, kullanım
süresinin, reçete sayısının ve dağılan oranın kanserin daha az görülmesi ile arasında
47
doza bağlı bir iliĢki olduğunu ortaya konmuĢtur [Evans ve ark., 2005]. Yeni
Metformin kullanmaya baĢlayan Tip 2 diyabet hastalarıyla yapılan bir takip
çalıĢmasında 10 yıllık süreç sonrasında kanser görülme sıklığının %37 oranında
azaldığı tespit edilmiĢtir [Duncan ve ark., 2009; Libby ve ark., 2009].
Metformin‘in kanser kök hücrelerini seçici olarak öldürdüğünün keĢfedilmesi,
antineoplastik özelliklerine daha fazla ilgi gösterilmesi konusunda çalıĢmalar
yapılmasına yol açmıĢtır. Hirsch ve arkadaĢları insan göğüs epitelyal hücrelerini kök
hücre açısından zenginleĢtirmek amacıyla genetik olarak manipüle etmiĢ ve bunlarla
3 farklı göğüs tümör hücre hattını test etmiĢlerdir. Flow sitometri kullanılarak
Metformin‘in etkilerini değerlendirmiĢ ve araĢtırmacılar ilacın kanser kök
hücrelerine seçici olarak toksik olduğunu gözlemiĢlerdir [Hirsch ve ark., 2009].
Bodmer ve ark. [2011] yaptıkları bir çalıĢmada Metformin ve diğer antidiyabetik
ilaçların yumurtalık kanseri ile olan iliĢkisi incelemiĢlerdir. Bu çalıĢmada Ġngilterebazlı Genel Pratik AraĢtırma Veritabanı (UK-based General Practice Research
Database= GPRD) kullanılarak Metformin veya diğer antidiyabetik ilaçların
yumurtalık kanserine yakalanma riskini artırıp artırmayacağı 1611 hasta üzerinde
araĢtırılmıĢtır. Sülfonilüre olmadan uzun süreli Metformin kullanımının (≥30 reçete)
yumurtalık kanseri görülme riskini düĢürdüğü gözlenmiĢtir. Ġnsülinin uzun süreli
kullanımının ise (≥40 reçete) yumurtalık kanseri görülme riskini düĢük oranda
artırdığı gözlenmiĢtir [Bodmer ve ark., 2011]. Bodmer ve ark. [2012] yaptığı bir
çalıĢmada Metformin veya diğer antidiyabetik ilaç ile akciğer kanseri arasındaki
iliĢki Ġngiltere- bazlı Genel Pratik AraĢtırma Veritabanı (UK-based General Practice
Research Database= GPRD)‘ nın durum- kontrol analizi yapılarak incelenmiĢtir.
Sonuç olarak, uzun dönem Metformin kullanımının (≥40 reçete) akciğer kanseri
görülme sıklığında bir değiĢikliğe sebep olmadığı gözlenmiĢtir. Sülfonilüreazın uzun
süreli kullanımının ise akciğer kanseri gözlenme sıklığını çok az seviyede düĢürdüğü
tespit edilmiĢtir. Sadece diyabetik hastalarla sınırlandırılan bir değerlendirmede,
erkeklerde azalma belirginken, kadınlarda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma
gözlenmemiĢtir [Bodmer ve ark., 2012]. Mazzone ve ark. Metformin ve
tiazolidinedion (TZD)un akciğer kanseri geliĢimi üzerine olası koruyucu etkilerini
incelemiĢlerdir. ÇalıĢmada akciğer kanseri olup Metformin ve/ veya TZD kullanan
48
ve kullanmayan hastalar arasındaki kanser karakteristikleri karĢılaĢtırılmıĢtır. 93 939
kiĢi Diabetes Mellitus, 507 kiĢi akciğer kanseri hastası olarak tanımlanmıĢtır.
Metformin ya da TZD kullanmayan grupta, Metformin‘i tek olarak kullanan akciğer
kanserli gruptaki hastalara nazaran metastaz görülme riskinin daha yüksek olduğu
(%40,8, %28,2) ve teĢhis konulmasından itibaren hayatta kalma süresinin daha kısa
olduğu gözlenmiĢtir. Sonuç olarak Metformin ve/veya TZD kullanımının diyabetik
hastalarda akciğer kanser geliĢime riskinin daha düĢük olduğu ortaya koyulmuĢtur
[Mazzone ve ark., 2012].
Lee ve ark. aynı zamanda hem Diabetes Mellitus hem de CRC (kolorektal kanser)
hastası olan 595 hastayı incelemiĢlerdir. Hastalar 258 Metformin kullanan ve 337
Metformin kullanmayan hasta Ģeklinde 2 grupta incelenmiĢtir. YaklaĢık 41 aylık
tedavi sonrasında Metformin kullanan 258 hastadan 55‘i CRC- spesifik (% 21,3)
olmak üzere toplamda 71 ölüm ( %27,5) gözlenirken, Metformin kullanmayan 337
hastadan 104‘ü CRC- spesifik (%30,9) olmak üzere toplamda 136 ölüm ( %40,4)
gözlenmiĢtir. Metformin kullanımı tek değiĢkenli analiz ile genel ( p= 0,018) ve
CRC- spesifik (p= 0,042) ölüm oranının düĢmesi ile iliĢkilendirilmiĢtir [Lee ve ark.,
2012].
Metformin‘in kanser büyümesini in vitro ve in vivo olarak engellemesi için birkaç
farklı mekanizma öne sürülmektedir. Bu mekanizmalar: 1) LKB1/AMPK
(Metformin‘in biyolojik aktivasyon yolağı) aktivasyonu, 2) hücre döngüsünün
durdurulması ve/veya apoptozisin indüklenmesi 3) protein sentezinin inhibisyonu, 4)
insülin seviyesinin sirkülasyonunda azalma, 5) dağılmıĢ protein yanıtlarının (UPR,
unfolded protein response) inhibisyonu, 6) immün sistemin aktivasyonu ve 7) kanser
kök hücrelerinin yok edilmesi Ģeklindedir [Kourelis ve ark., 2011].
Metformin‘in kanser önleyici mekanizmalara sahip olduğu destekleyen genotoksisite
çalıĢmaları da bulunmaktadır. Metformin‘in FDA [2008] raporunda genotoksik
potansiyeli bulunmadığı bildirilmektedir. Bu rapora göre in vitro testlerde (Ames
testi, Gen mutasyon testi, Kromozomal anormallik testi) ve farelerde yapılan in vivo
testte (mikronükleus testi) negatif sonuç verdiği açıklanmıĢtır [FDA, 2008]. Ancak
49
raporda kullanılan dozlar, uygulama süreleri ve sonuçların detayları verilmemiĢtir.
Aynı raporda Metformin‘in uzun süreli karsinojenite çalıĢmasına ratlarda ve
farelerde karsinojenik etkisinin olmadığı açıklanmıĢtır [FDA, 2008].
Normal ve diyabetik ratlarda mikronükleus, kromozom anormallikleri, kemik iliği
hücrelerinin mitotik aktivitesi, sperm- baĢ anomalisi ve bazı oksidatif stres markerları
sitogenetik yöntemler aracılığıyla incelenmiĢtir. Diyabetik ve diyabetik olmayan
ratlarda tek doz olarak Metformin‘in (100, 500 ve 2500 mg/kg) 24 saatlik etkisi
incelenmiĢtir. Aynı çalıĢmada diyabetik ve diyabetik olmayan ratlar günlük 100 ve
500 mg/kg Metformin‘e 4 ve 8 hafta maruz bırakılmıĢ ve sonrasında kemik iliği ve
sperm hücreleri toplanarak değerlendirilmiĢtir. Kemik iliği hücrelerinde kromozomal
anormallik ve polikromatik ile normokromatik eritrositlerde MN testi yapılmıĢtır.
Elde edilen veriler Metformin‘in ratlarda test edilen dozların hiçbirinin genotoksik
veya sitotoksik bir etkisinin olmadığını göstermiĢtir. Metformin‘in somatik ve
germinal
hücrelerde
diyabetin
indüklediği
genomik
kararsızlık
ve
hücre
proliferasyon değiĢikliklerini doza bağlı Ģekilde azalttığı gözlenmiĢtir. Diyabet, lipid
peroksidasyonu ve indirgenmiĢ glutatyon seviyesinin düĢmesini içeren oksidatif
strese ait karakteristik biyokimyasal değiĢimleri artırmaktadır. Metformin muamelesi
bu biyokimyasal markerlarda iyileĢtirici etki göstermektedir. Sonuç olarak hiçbir
grupta genotoksik bir etkiye rastlamamıĢlardır. Çoklu doz çalıĢmasında alınan sperm
örneklerinde ise Metformin‘in her hangi bir hasara neden olmadığı hatta iyileĢtirici
etkisi olduğu açıklanmıĢtır. Bu verilere göre Metformin‘in genotoksik veya
sitotoksik olmayan bir bileĢik olduğu ve hiperglisemi tarafından indüklenen genomik
kararsızlığa karĢı koruyucu etkisinin olabileceği ortaya konulmuĢtur [Attia ve ark.,
2009].
Farklı bir çalıĢmada Pioglitazone ve Metformin kombinasyonunun erkek ratlarda
polikromatik ve normokromatik eritrositlerde MN frekansını azalttığı açıklanmıĢtır
[Rabbani ve ark., 2009].
Ancak Metformin‘in genotoksik risk teĢkil ettiğini açıklayayan çalıĢmalar da
mevcuttur. Rabbani ve arkadaĢlarının [2010] yaptıkları bir araĢtırmada Metformin ile
50
Pioglitazone‘nin sperm anomalilerini ve oksidatif stresi azalttığı; ancak Metformin
ile Glimepirid‘in sperm anormalliğini indüklediği açıklanmıĢtır.
Metformin‘in genotoksisitesi Çin hamster yumurtalık hücrelerinde (CHO-K1)
kromozom anormallik ve komet testi ile incelenmiĢtir. Aynı çalıĢmada mikronükleus
testi kullanılarak farelerde in vivo genotoksisitesi araĢtırılmıĢtır. In vitro testler için
114,4 µg/ mL ve 572 µg/ mL‘lik dozlar kullanılmıĢtır. In vivo MN testinde ise
farelere intraperitonel olarak 95,4; 190,8 ve 333,9 mg/kg‘lık dozlar enjekte edilmiĢ
ve 24 saatlik etki incelenmiĢtir. In vitro testlerde kromozom anormalliği
gözlenmemiĢ ancak her iki konsantrasyonla 24 saatlik muamele sonrasında komet
testi ile DNA hasarı gözlenmiĢtir. DNA hasarının 114,4 µg/ mL‘lik dozda daha
yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. In vitro testlerde hücre ölümü tespit edilmemiĢ ancak
Metformin‘in en yüksek dozu kemik iliği hücrelerini baskılamıĢtır. MN testinde ise
genotoksik etki belirlenmemiĢtir. In vitro test sonuçlarına göre kronik Metformin
maruziyetinin genotoksik olabileceği ihtimali vurgulanmıĢtır. AraĢtırıcılar bu
sonuçtan ötürü hamile bayanlara Metformin tedavisi uygulanmadan önce DNA
hasarına karĢı hassasiyetinin daha detaylı olarak çalıĢılmasını önermiĢlerdir [Amador
ve ark., 2012]. Bu çalıĢmanın MN sonuçları çalıĢmamızla uyumludur.
Metformin‘in oksidatif stresle indüklenen DNA hasarı karĢısındaki olası koruyucu
etkilerinin in vitro koĢullarda değerlendirildiği bir çalıĢmada Metformin‘in etkileri
N-asetilsisteinin (NAC) etkileri ile karĢılaĢtırılmıĢtır. Bu amaçla 10 yaĢlı ( yaĢları 7087 arasındaki 5 bayan, 5 erkek) ve 10 genç ( yaĢları 20-39 arasındaki 5 bayan 5
erkek) donör kullanılmıĢ, bireylerden toplanan periferal kan lenfositleri 10- 50 µM
arası değiĢen konsantrasyonlarda Metformin ve NAC ile muamele edilmiĢtir. Bu
uygulamadan 1 saat sonra 48 saat boyunca kümen hidroperoksit (15 µM)
maruziyetine bırakılmıĢtır. Oksidatif DNA hasarına karĢı koruyucu etki Komet testi
ve mikronükleus tekniği ile değerlendirilmiĢtir. Metformin‘in lenfostileri kümen
hidroperoksitin indüklediği DNA hasarından korumadığı buna karĢın 50 µM NAC‘ın
koruyucu etki gösterdiği açıklanmıĢtır. Aynı zamanda NAC, kümen hidroperoksitin
indüklediği DNA fragmentasyonunu engellerken, Metformin‘in engelleyemediği
belirtilmiĢtir.
Lenfosit
kültürlerinde
oksidatif
hasara
karĢı
koruyucu
etki
51
gösterememesine rağmen Metformin‘in her iki yaĢ grubunda hücreleri lipid
peroksidasyonundan önemli ölçüde koruduğu ancak bunun NAC‘nin peroksidatif
hasardan koruması kadar etkili olmadığı gözlenmiĢtir [Onaran ve ark., 2006].
Bu
çalıĢmada
Metformin‘in
özellikle
uzun
süreli
uygulama
ve
yüksek
konsantrasyonlarının klastojenik ve sitotoksik etki sergilediği gözlenmiĢtir. Her ne
kadar Metformin birçok antidiyabetik ilaca göre hastalara avantaj sağlıyor ve kanseri
önleyici mekanizmaları olabileceği açıklanıyorsa da genotoksik risk potansiyelinin
olabileceği göz ardı edilmemelidir. Özellikle in vivo ve epidemiyolojik genotoksisite
çalıĢmalarının yapılmasına ihtiyaç bulunmaktadır.
52
KAYNAKLAR
Abacı, A., Böber, E., Büyükgebiz, A., ―Tip 1 Diyabet‖, Güncel Pediatri, 5: 1-10
(2007).
Airley, R. E., Mobasheri, A., ―Hypoxic regulation of glucose transport, anaerobic
metabolism and angiogenesis in cancer: novel pathways and targets for anticancer
therapeutics‖, Chemotherapy, 53: 233–256 (2007)
AkkuĢ, Ġ., ―Serbest radikaller ve fizyopatolojik etkileri‖, Mimoza Yayınları, 1: 3-24
(1995).
Albert, R.E., Magee, P.S., ―The tumorigenicity of mutagenic contact sensitizing
chemicals‖, Risk Analysis, 20(3): 317-325 (2000).
Albertini, R.J., Anderson, D., Douglas, G.R., Hagmar, L., Hemminki, K., Merlo, F.,
Natarajan, A.T., Norppa, H., Shuker, D.E., Tice, R., Waters, M.D., Aitio, A., ―IPCS
guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans,
International Programme on Chemical Safety‖, Mutation Research, 463(2): 111–172
(2000).
Alexiou, P., Chatzopoulou, M., Pegklidou, K., ―RAGE: a multi-ligand receptor
unveiling novel insights in health and disease‖, Current Medicinal Chemistry ,17:
2232–2252 (2010).
Amador, R.R.,Longo, J.P.G.,Lacava, Z.G.,Dórea, J.G.,Santos, A.M., ―Metformin
(dimethyl-biguanide) induced DNA damage in mammalian cells‖, Genetics and
Molecular Biology, 35(1): 153-158 (2012).
American Diabetes Association Position Statement, ―Diagnosis and classification of
diabetes mellitus‖, Diabetes Care, 32(1): 62-67 (2009).
Atlı-ġekeroğlu, Z., ġekeroğlu, V., ―Genetik toksisite testleri‖, TÜBAV Bilim
Dergisi, 4(3): 221-229 (2011).
Attia, S.M., Helal, G.K., Alhaider, A.A., ―Assessment of genomic instability in
normal and diabetic rats treated with metformin‖, Chemico Biological Interactions,
180(2): 296-304 (2009).
Ayvaz G., Kan E., ―Tip 2 Diabetes mellitus Tedavisinde Oral Antidiyabetik Ġlaçlar,
Tip 2 diabetes mellitus Tedavisi‖, Mised, 23 (24): 8-13 (2010).
Babior, B.M., ―Phagocytes and oxidative stres‖, The American Journal of
Medicine, 109(1): 33-44 (2000).
53
Bailey, C.J., Turner, R.C., ―Metformin‖, The New England Journal of Medicine,
334: 574-579 (1996).
Bando, K., Ochiai, S., Kunimatsu, T., Deguchi, J., Kimura, J., Funabashi, H., Seki,
T., ―Comparison of potential risks of lactic acidosis induction by biguanides in rats‖,
Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58: 155–160 (2010).
Barbarroja, N., Lopez Pedrera, R., Mayas, M. D., ―The obese healthy paradox: is
inflammation the answer?‖, Biochemical Journal, 430: 141–149 (2010).
Bedir, A., Aliyazicioglu, Y., Bilgici, B., Yurdakul, Z., Uysal, M., Suvaci, D.E.,
Okuyucu, A., Kahraman, H., Alvur, M.K., ―Assessment of Genotoxicity in Rats
Treated With the Antidiabetic Agent, Pioglitazone‖, Environmental and Molecular
Mutagenesis, 49: 185-191 (2008).
Bedir, A., Aliyazicioglu, Y., Bilgici, B., Yurdakul, Z., Uysal, M., Suvaci, D.E.,
Okuyucu, A., Kahraman, ―Genotoxicity in Rats Treated With the Antidiabetic Agent,
Rosiglitazone‖, Environmental and Molecular Mutagenesis, 47: 718-724 (2006).
Beg, T., Siddique, Y. H., Ara, G., Gupta, M., Afzal, J., ―Protective action of EGCG
against anticancer drugs MMS and CP‖, The Internet Journal of Pharmacology,
6(2): 1-7 (2009).
Bergamini, E., Cavallini, G., Donati, A., ―The role of autophagy in aging: its
essential part in the anti-aging mechanism of caloric restriction‖, Annals of the New
York Academy of Sciences, 1114: 69–78 (2007).
Berstein, L.M., Boyarkina, M., Tsyrlina, E.V., Turkevich, E.A., Semiglazov, V.F.,
―More favorable progesterone receptor phenotype of breast cancer in diabetics
treated with metformin‖, Medical Oncology, 28(4): 1260-1263 (2011).
Blayo, A., Mandelbrot, L., ―Screening and Diagnosis of Gestational Diabetes‖,
Diabetes&Metabolism, 30: 575-580 (2004).
Boden, G., ―Endoplasmic reticulum stress: another link between obesity and insulin
resistance/inflammation?‖, Diabetes, 58: 518–519 (2009).
Bodmer, M., Meier, C., Krahenbühl, S., Jick, S.S., Meier, C.R., ―Longterm
metformin use is associated with decreased risk of breast cancer‖, Diabetes Care,
33(6): 1304–1308 (2010).
Bodmer, M., Becker, C., Meier, C., Jick, S.S., Meier, C.R., ―Use of metformin and
the risk of ovarian cancer: A case–control analysis‖, Gynecologic Oncology; 123:
200-204 (2011).
54
Bodmer, M., Becker, C., Meier, C., Jick, S., S.i Meier C., R., ―Metformin does not
alter the risk of lung cancer: A case–control analysis‖, Lung Cancer; 78: 133- 137
(2012).
Bolognesi, C., ―Genotoxicity of pesticides: a review of human biomonitoring
studies‖, Mutation Research, 543(3): 251-272 (2003).
Bonassi, S., Znaor, A., Ceppi, M., Lando, C., Chang, W.P., Holland, N., KirschVolders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, L., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., CebulskaWasilewska, A., Fabianova, E., Fucic, A., Hagmar, L., Joksic, G., Martelli, A.,
Migliore, L., Mirkova, E., Scarfi, M.R., Zijno, A., Norppa, H., Fenech, M., ―An
increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk
of cancer in humans‖, Carcinogenesis, 28: 625–631 (2007).
Bowker, S.L., Majumdar, S.R., Veugelers, P., Johnson, J.A., ―Increased cancerrelated mortality for patients with type 2 diabetes who use sulfonylureas or insulin‖,
Diabetes Care, 29: 254-258 (2006).
Bozkurt, G., Abay, E., AteĢ, Ġ., Karaboğaz, G., Türe, M., Savran, F.O., Palandüz, S.,
Temocin, K., AlgüneĢ, Ç., ―Clastogenicity of selective serotonin-reuptake
inhibitors‖, Mutation Research, 558: 137-144 (2004).
Buzzai, M., Jones, R.G., Amaravadi, R.K., ―Systemic Treatment with the
Antidiabetic Drug Metformin Selectively Impairs p53-Deficient Tumor Cell
Growth‖, Cancer Research, 67: 6745-6752 (2007).
Cannata, D., Fierz, Y., Vijayakumar, A., ―Type 2 diabetes and cancer: what is the
connection?‖, Mount Sinai Journal of Medicine, 77:197–213 (2010).
Ceriello, A., ―Acute hyperglycemia and oxidative stress generation‖, Diabetic
Medicine, 14(3): 45-49 (1997).
Cho, Y.H., Kim, Y.J., An, Y.S., Woo, H.D., Choi, S.Y., Kang, C.M., Chung, H.W.,
―Micronucleus-centromere assay and DNA repair gene polymorphism in
lymphocytes of industrial radiographers‖, Mutation Research, 680: 17-24 (2009).
Choy, W.N., ―Genetic toxicology and cancer risk assessment‖, Marcel Dekker, New
York, 29-187 (2001).
Collins, A.R., ―The comet assay for DNA damage and repair: principles,
applications, and limitations‖, Molecular Biotechnology, 26: 249–261 (2004).
Courtney, K.D., Corcoran, R.B., Engelman, J.A., ―The PI3K pathway as drug target
in human cancer‖, Journal of Clinical Oncology, 28: 1075–1083 (2010).
Currie, C.J., Poole, C., Gale, E.A., ―The influence of glucose-lowering therapies on
cancer risk in type 2 diabetes‖, Diabetologia, 52(9): 1766–1777 (2009).
55
Çorakçı, A., Azal, Ö., Beyhan, Z., ―Diabetes Mellitus‘ta Oral Ajan Tedavisi,
Diabetes Mellitus‖, Multidisipliner YaklaĢımla Tanı, Tedavi ve Ġzlem, Ed:
Ġmamoğlu, ġ, Özyardımcı, C, Deomed Yayıncılık, 9: 137-176 (2009).
Das, K., Chainy, G.B.N., ―Modulation of rat liver mitochondrial antioxidant defense
system by thyroid hormone‖, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular
Basis of Disease, 1537(1): 1-13 (2001).
De Meyts, P., ―The structural basis of insulin and insulin-like growth factor-I
receptor binding and negative co-operativity, and its relevance to mitogenic versus
metabolic signalling‖, Diabetologia, 37(2): 135–148 (1994).
DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., ―The biology of cancer: metabolic
reprogramming fuels cell growth and proliferation‖, Cell Metabolism, 7: 11–20
(2008).
Deynel i, O., ―Tip 1 diabetes mellitus‖, Endokrinoloji, Ed: Özata, M., İstanbul Tıp
Kitabevi Yayıncılık, 10(4): 566-569 (2011).
Dı´ez, J.J., Iglesias, P., ―The role of the novel adipocyte-derived hormone
adiponectin in human disease‖, European Journal of Endocrinology, 148: 293–300
(2003).
Doak, S.H., Liu, Y., Chen, C., ―Genotoxicity and cancer‖, Adverse Effects of
Engineered Nanomaterials, 14: 243-261 (2012).
Donalth, M. Y., Gross, D. J., Cesari, E., Kaiser, N., ―Hyperglycemia- induced β cell
apoptosis in pancreatic islets of Psammoys obesus during development of diabetes‖,
Diabetes, 48(4): 738-744 (1999).
Duncan, B.B., Schmidt, M.I., ―Metformin, cancer, alphabet soup, and the role of
epidemiology in etiologic research‖ , Diabetes Care , 32:1748 –1750 (2009).
Eastmond, D.A., Hartwig, A., Anderson, D.,Anwar, W.A., Cimino, M.C., Dobrev, I.,
Douglas, G.R.,. Nohmi, T., Phillips, D.H., Vickers, C., ―Mutagenicity testing for
chemicalrisk assessment: update of the WHO/IPCS Harmonized Scheme‖,
Mutagenesis, 24: 341–349 (2009).
EcemiĢ, G.C., Atmaca, H., ―Oral antidiyabetik ajanlar‖, Journal of Experimental
and Clinical Medicine, 29: 23-29 (2012).
Elmalı, E., Altan, N., Bukan, N., ―Effect of sulphonylurea glibenclamide on liver and
kidney antioxidant enzymes in streptozotocin- induced diabetic rats‖, Drugs R.D.,
5(4): 203-8 (2004).
Epel, D., ―The effects of carbon monoxide inhibition of ATP level and the date of
mitosis in sea urching egg‖, Journal of Cell Biology, 17: 315-319 (1963).
56
Eroğlu, Y., Eroğlu, H.E., Ilbas, A.I., ―Gamma ray reduces mitotik index in
embriyonic roots of Hordeum vulgare L.‖, Advances in Biological Research, 1(12): 26-28 (2007).
Evans, J.M., Donnelly, L.A., Emslie-Smith, A.M., Alessi, D.R., Morris, A.D.,
―Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients‖, British Medical
Journal, 330: 1304-1305 (2005).
Fairbairn, D.W., Olive, P.L., O‘Neill, K.L., ―The comet assay: a comprehensive
review‖, Mutation Research, 339: 37–59 (1995).
Fenech, M., ―Cytokinesis-block micronucleus cytome assay‖, Nature Protocols,
2(5): 1084-1104 (2007).
Food and Drug Administration, “Glucophage (Metformin Hydrochloride Tablets)
and Glucophage Xr (Metformin Hydrochloride Extended-Release Tablets)‖, NDA
20-357/S-031 New York, 3-32 (2008).
Garry, S., Nesslany, F., Aliouat, E., Haguenoer, J.M., Marzin, D., ―Assessment of
genotoxic effect of benzo[a]pyrene in endotracheally treated rat using the comet
assay‖, Mutation Research, 534(1-2): 33-43 (2003).
Gorska, E., Popko, K., Winiarska, M., ―Pleiotropic effects of leptin (in Polish)‖,
Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, 15: 45–50 (2009).
Gotlieb, W.H., Saumet, J., Beauchamp, M.C., Gu, J., Lau, S., Pollak, M.N., Bruchim,
I., ―In vitro metformin anti-neoplastic activity in epithelial ovarian cancer‖,
Gynecologic Oncology, 110: 246–250 (2008).
Gür, S., ―Antidiyabetik Aktivite AraĢtırma Yöntemleri‖, Ankara Üniversitesi
Eczacılık Fakültesi Dergisi, Farmakoloji Anabilim Dalı, 23 : 49-52 (2010).
Gwinn, M.R., Johns, D.O., Bateson, T.F., Guyton, K.Z., ―A review of the
genotoxicity of 1,2-dichloroethane (EDC)‖, Mutation Research, 727: 42-53 (2011).
Hagmar, L., Stromberg, U., Bonassi, S., Hansteen, I.L., Knudsen, L.E., Lindholm,
C., Norppa, H., ―Impact of types of lymphocyte chromosomal aberrations on human
cancer risk: results from Nordic and Italian cohorts‖, Cancer Research, 64(6): 2258–
2263 (2004).
Hidalgo, A., Gonzalez-Reyes, J.A., Navas, P., Garcia-Herdugo, G., ―Abnormal
mitosis and growth inhibition in Allium cepa roots induced by propham and
chlorpropham‖, Cytobios, 57: 7-14 (1989).
Hirsch, H.A., Iliopoulos, D., Tsichlis, P.N., Struhl, K., ―Metformin selectively targets
cancer stem cells, and acts together with chemotherapy to block tumor growth and
prolong remission‖, Cancer Research, 69:7507–7511 (2009)
57
Hoelzl, C., Knasmüller, S., Misic, M., Collins, A., Dusinska, M. Nersesyan, A., ―Use
of single cell gel electrophoresis assays for the detection of DNA-protective effects
of dietary factors in humans: Recent results and trends‖, Mutation Research, 681:
68-79 (2009).
Holly, J., Perks, C., ―The role of insulin-like growth factor binding proteins‖,
Neuroendocrinology, 83: 154–160 (2006).
Ihara, Y., Toyokuni, S., Uchida, K., Odaka, H., Tanaka, T., Ikeda, H., Hiani, H.,
Seino, Y., Yamada, Y., ―Hyperglycemia causes oxidative stress in pancreatic β cells
of GK rats, a model of type 2 diabetes‖, Diabetes, 48(4): 927-932 (1999).
International Diabetes Federation, ―Diabetes atlas‖, 4th edition, Brussels, IDF, 233(2009).
Ġnternet:
Ankara
Diyabet
Derneği
http://www.ankaradiyabet.org.tr/d2.aspx (2012).
―Diyabet
Tipleri‖
Ġnternet: Türkiye Diyabet Vakfı ―Diyabet Tedavisi‖ http://www.turkdiab.org (2012).
Jain, A.K., Andsorbhoy, R.K., ―Cytogenetical studies on the effects of some
chlorinated pesticides‖, Cytologia, 53: 427-436 (1988).
Jee, S.H., Ohrr, H., Sull, J.W., ―Fasting serum glucose level and cancer risk in
Korean men and women‖, Journal of the American Medical Association, 293: 194–
202 (2005).
Karakurt, F., Çarlıoğlu, A., Kasapoğlu, B., Ġnegöl GümüĢ, Ġ., ―Gestasyonel Diabetes
Mellitus Tanı ve Tedavisi‖, Yeni Tıp Dergisi, 26: 134-138 (2009).
Kayraldız, A.,TopaktaĢ, M., ―The in vivo Genotoxic effects of sodium metabisulfite
in bone marrow cells of rats‖, Russian Journal of Genetics, 43(8): 905-909 (2007).
Kim, J. W., Dang, C. V., ―Cancer‘s molecular sweet tooth and the Warburg effec‖t,
Cancer Research, 66: 8927–8930 (2006).
Kim, W. Y., Jin, Q., Oh, S. H., ―Elevated epithelial insulin-like growth factor
expression is a risk factor for lung cancer development‖, Cancer Research, 69:
7439–7448 (2009).
Konca, C., Ayvaz, G., ―Tip 2 diabetes mellitusun insülin dıĢı tedavisi‖,
Endokrinoloji, Ed: Özata, M., İstanbul Tıp Kitabevi Yayıncılık, 10(5): 575-580
(2011).
Kourelis, T.V., Siegel, R.D., ―Metformin and cancer: new applications for an old
drug‖, Medical Oncology, 29: 1314–1327 (2012).
58
Krentz, A.J., Bailey, C.J., ―Oral antidiabetic agents: Current role in type 2 diabetes
mellitus‖, Drugs, 65: 385-411 (2005).
Landman, G.W., Kleefstra, N., Van Hateren, K.J., Groenier, K.H., Gans, R.O., Bilo,
H.J., ―Metformin associated with lower cancer mortality in type 2 diabetes:
ZODIAC-16‖, Diabetes Care, 33(2): 322–326 (2010).
Latt, S. A., Sehrek, R. R., Loveday, K. S., Dougherty, C.P., Schuler, C.F., ―Sister
chromatid Exchange‖, Human Genetics, 10: 267-331 (1980).
Lebovitz, H.E., ―Management of hyperglycemia with oral antihyperglycemic agents
in Type 2 diabetes‖, Diabetes Mellitus, 41: 687-710 (2005).
Lee, j.H., Kim, T., Jeon, S.M., Hong, S.P., Cheon, J.C., Kim, W.H., ―The effects of
metformin on the survival of colorectal cancer patients with diabetes mellitus‖
Cancer, 131: 752- 759 (2012).
Leigh, A.C., Zhou, C., Mendivil, A., Malloy, K.M.,Gehrig, P.A., Bae-Jump, V.L.,
―Metformin is a potent inhibitor of endometrial cancer cell proliferation—
implications for a novel treatment strategy‖, Gynecologic Oncology, 116: 92-98
(2010).
Li, D., Yeung, S., Hassan, M.M., Konopleva, M., Abbruzzese, J.L., ―Antidiabetic
therapies affect risk of pancreatic cancer‖, Gastroenterology, 137(2): 482-488
(2009).
Libby, G., Donnelly, L.A., Donnan, P.T., Alessi, D.R., Morris, A.D., Evans, J.M.M.,
―New users of metformin are at low risk of incident cancer: A cohort study among
people with type 2 diabetes‖, Diabetes Care, 32:1620-1625 (2009).
Lopez-Nigro, M.M., Palermo, A.M., Mudry, M.D., Carballo, M.A., ―Cytogenetic
evaluation of two nitroimidazole derivatives‖, Toxicology In Vitro, 17: 35-40
(2003).
Macheda, M. L., Rogers, S, Best, J. D., ―Molecular and cellular regulation of glucose
transporter (GLUT) proteins in cancer‖, The Journal of Cellular Physiology, 202:
654–662 (2005).
Masharani, U, ―Pancreatic hormones & Diabetes amellitus‖, Basic & Clinical
Endocrinology, Ed: Greenspan, F.S., Gardner, D.G., Basic and Clinical
Endocrinology, 8: 658-660 (2008).
Masharani, U., Karam, J.H., German, M.S., ―Pancreatic hormones & Diabetes
amellitus‖, Ed: Greenspan, F.S., Gardner, D.G., Basic & Clinical Endocrinology, 7:
658-746 (2004).
59
Mateuca, R., Lombaert, N., Aka, P.V., Decordier, I., Kirsch-Volders, M.,
―Chromosomal changes: induction, detection methods and applicability in human
biomonitoring‖, Biochimie, 88(11): 1515–1531 (2006).
Mathupala, S.P., Ko, Y.H., Pedersen, P.L., ―Hexokinase-2 bound to mitochondria:
cancer‘s stygian link to the ‗‗Warburg Effect‘‘ and a pivotal target for effective
therapy‖, Seminars in Cancer Biology, 19: 17–24 (2009).
Mazzone, P.J., Hardeep, R., Beukemann, M., Xu, M., Jain, A., Sasidhar, M., ―The
effect of metformin and thiazolidinedione use on lung cancer in diabetics‖, BMC
Cancer, 12: 410 (2012).
McCulloch, D.K., Robertson, R.P., ―Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus‖,
UpToDate, 17: 3 (2010).
Monami, M., Lamanna, C., Balzi, D., Marchionni, N., Mannucci, E.,
―Sulphonylureas and cancer: a case-control study‖, Acta Diabetologica, 46(4): 279–
284 (2009).
Monami, M., Colombi, C., Balzi, D., Dicembrini, I., Giannini, S., Melani, C., Vitale,
V., Romano, D., Barchielli, A., Marchionni, N., Rotella, C.M., Mannucci, E.,
―Metformin and Cancer occurence in insulin-treated type 2 diabetic patients‖,
Diabetes care, 34 (1): 129-131 (2011).
Montoro, A., Soriano, J.M., Barquinero, J.F., Almonacid, M., Montoro, A., Verdu
G., Sahuquillo, V., Villaescusa, J.I., Sebastia, N., ―Assessment in vitro of cytogenetic
and genotoxic effects of propolis on human lymphocytes‖, Food and Chemical
Toxicology, 50: 216-221 (2012).
Murli, H., ―Screening assay for chromosomal aberrations in Chinese hamster ovary
(CHO) cells with argentyn 23‖, Final Report, (2003).
Nyenwe, E.A., Jerkins, T.W., Umpierrez, G.E., Kitabchi, A.E., ―Management of type
2 diabetes: Evolving strategies for the treatment of patients with type 2 diabetes‖,
Metabolism, 60: 1-23 (2011).
Onaran, Ġ.,Guven, G.S.,Ozdas, S.B.,¸Kanigur, G.,Vehid, S., ‖ Metformin does not
prevent DNA damage in lymphocytes despite its antioxidant properties against
cumene hydroperoxide-induced oxidative stress‖, Mutation Research, 611: 1–8
(2006).
Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), ―OECD
Guidelines for the Testing of Chemicals‖, Health Effects, 4: 471–486 (2008).
Özcan, ġ.,‖Oral antidiyabetik tedavisinin yonetimi‖, Diyabet Hemşireliği Derneği
Kitabı 6: 56-66 (2005).
60
Parry, J.M., Kirsch-Volders, M., ―Special issue on in vitro MN trial‖, Mutation
Research, 702: 132-134 (2010).
Pedersen, P.L., ―Warburg me and Hexokinase 2: multiple discoveries of key
molecular events underlying one of cancers‘ most common phenotypes, the
‗‗Warburg Effect‘‘, i.e., elevated glycolysis in the presence of oxygen‖, Journal of
Bioenergetics and Biomembranes, 39: 211–222 (2007).
Poletta, G.L., Larriera, A., Kleinsorge, E., Mudry, M.D., ―Caiman latirostris (broadsnouted caiman) as a sentinel organism for genotoxic monitoring: basal values
determination of micronucleus and comet assay‖, Mutation Research, 650(2): 202209 (2008).
Preston, R.J., Skare, J.A., Aardema, M.J., ―A review of biomonitoring studies
measuring genotoxicity in humans exposed to hair dyes‖, Mutagenesis, 25(1): 17-23
(2010).
Rabbani, S.I., Devi, K., Khanam, S., ―Inhibitory effect of glimepiride on the
nicotinamide–streptozotocin induced nuclear damages and sperm abnormalities in
diabetic Wistar rats‖, Indian Journal of Experimental Biology. 47(10): 804–810
(2009).
Rabbani, S.Ġ., Devi, K., Khanam, S., ―Role of Pioglitazone with Metformin or
Glimepiride on Oxidative Stress-induced Nuclear Damage and Reproductive
Toxicity in Diabetic Rat‖, Malaysian Journal of Medical Sciences, 17(1): 3–11
(2010).
Rapp, K., Schroeder, J., Klenk, J., ―Fasting blood glucose and cancer risk in a cohort
of more than 140,000 adults in Austria‖, Diabetologia, 49: 945–952 (2006).
Robertson, R.P., Harmon, J., Tran, P.O., Poitout, V., ―β-cell glucose toxicity,
lipotoxicity, and chronic oxidative street inn type 2 diabetes‖, Diabetes, 53(1): 119124 (2004).
Robey, R.B., Hay, N., ―Is Akt the ‗‗Warburg kinase‘‘?-Akt-energy metabolism
interactions and oncogenesis‖, Seminars in Cancer Biology, 19: 25–31 (2009).
Santoro, A., Bianco, G., Picerno, P., Aquino, R.P., Autore, G., Marzocco, S.,
Gazzerro, P., Lioi, M.B., Bifulco, M., ―Verminoside and verbascoside-induced
genotoxicity on human lymphocytes: Involvement of PARP-1 and p53 proteins‖,
Toxicology Letters, 178(2): 71-76 (2008).
Satman, I., Tutuncu, Y., Gedik, S., Dinccag, N., Karsidag, K., Yilmaz, T., Omer, B.,
Kalaca, S., Telci, A., Cakir, B., Tuomilehto, J., ―The TURDEP-II Study Group.
Diabetes epidemic in Turkey: results of the second population based survey of
diabetes and risk characteristics in Turkey (TURDEP-II)‖, In: Poster: A- 11-2498.
61
47th EASD annual meeting, 12–16 September 2011, Lisbon; Diabetologia, 54(1):
2498. (2011).
Savage, J.R.K., ―Classification and relationships of induced chromosomal structural
changes‖, Journal of Medical Genetics, 12: 103–122 (1975).
Serafini, M., Del Rio, D., ―Understanding the association between dietary
antioxidants, redox status and disease: is the total antioxidant capacity the right
tool?‖, Redox Report, 9(3): 145-152 (2004).
Service, F.C., ―Diagnostic approach to hypoglycemia in adults‖, UpToDate, 17: 3
(2010).
Shaik, N.A., Shaik, J.P., Ahamad, S.A., ―Increased frequency of micronuclei in
diabetes mellitus patients using pioglitazone and glimepiride in combination‖, Food
and Chemical Toxicology, 48: 3432–3435 (2010).
Shaposhnikov, S., Frengen, E., Collins, A.R., ―Increasing the resolution of the comet
assay using fluorescent in situ hybridization-a review‖, Mutagenesis, 24(5): 383-389
(2009).
Singh, N.P., McCoy, M.T., Tice, R.R., Schneider, E.L., ―A simple technique for
quantitation of low levels of DNA damage in individual cells‖, Experimental Cell
Research, 175: 184-191 (1988).
Sparvero, L. J., Asafu Adjei, D., Kang, R., ―RAGE (Receptor for Advanced
Glycation Endproducts), RAGE ligands, and their role in cancer and inflammation‖,
Journal of Translational Medicine, 7: 17 (2009).
Stattin, P., Björ, O., Ferrari, P., ―Prospective study of hyperglycemia and cancer
risk‖, Diabetes Care, 30: 561–567 (2007).
Stocks, T., Rapp, K., Bjørge, T., ―Blood glucose and risk of incident and fatal cancer
in the metabolic syndrome and cancer project (me-can): analysis of six prospective
cohorts‖. PLOS Medicine, 6:e1000201, (2009).
Tice, R.R., Agurell, E., Anderson, D., Burlinson, B., Hartmann, A., Kobayashi, H.,
Miyamae, Y., Rojas, E., Ryu, J.C., Sasaki, Y.F., ―Single cell gel/Comet Assay:
guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing‖, Enviromental and
Molecular Mutagenesis, 35: 206-221 (2000).
Timoroğlu, Ġ., YüzbaĢıoğlu, D., Ünal, F., Yılmaz S., Aksoy H., Çelik M.,
―Assessment of the genotoxic effects of organophosphorus insecticides phorate and
trichlorfon in human lymphocytes‖. Environmental Toxicology, DOI 10.1002/tox
21783 (2012).
62
Van‘t Hof, J., ―The action of IAA and kinetin on the mitotic cycle of proliferative
and stationary phase excised root meristems‖, Experimental Cell Research, 51(1):
167-176 (1968).
Werner, H., Bruchim, I., ―The insulin-like growth factor-I receptor as an oncogene‖,
Archives of Physiology and Biochemistry, 115: 58–71 (2009).
Wilson, D.M., Thompson, L.H., ―Molecular mechanisms of sister-chromatid
Exchange‖, Mutation Research, 616: 11–23 (2007).
Wuenschell, G.E., Tamae, D., Cercillieux, A., ―Mutagenic potential of DNA
glycation: miscoding by (R)- and (S)-N2-(1- carboxyethyl)-20-deoxyguanosine‖,
Biochemistry, 49: 1814–1821 (2010).
Yamagishi, S., Nakamura, K., Inoue, H., ―Possible participation of advanced
glycation end products in the pathogenesis of colorectal cancer in diabetic patients‖,
Medical Hypotheses, 64: 1208–1210 (2005).
Yang, X., So, W.Y., Ma, R.C., Kong, A.P., Lee, H.M., Yu, L.W., Chow, C.C.,
Ozaki, R., Ko, G.T., Chan, J.C., ―Low HDL cholesterol, metformin use and cancer
risk in Type 2 diabetes—the Hong Kong Diabetes Registry‖, Diabetes Care, 34(2):
375-380 (2010).
Yeluri, S., Madhok, B., Prasad, K. R., ―Cancer‘s craving for sugar: an opportunity
for clinical exploitation‖, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 135:
867–877 (2009).
Yılmaz, C., Yürekli, B.ġ., ―Gestasyonel diabetes mellitus ve pregestasyonel diyabet‖,
Endokrinoloji, Ed: Özata, M., İstanbul Tıp Kitabevi Yayıncılık, 10(12): 656-658
(2011).
Yılmaz, S., Aksoy, H., Ünal, F., Çelik, M., YüzbaĢıoğlu, D., ―Genotoxic action of
fungicide Conan 5FL on mammalian cells in vivo and in vitro‖, Russian Journal of
Genetics, 44 (3): 273-278 (2008).
Yönem, A., ―Diabetes mellitusa genel bir bakıĢ‖, Endokrinoloji, Ed: Özata, M.,
İstanbul Tıp Kitabevi Yayıncılık, 10(3): 547-548 (2011).
Yönem, A., ―Diabetes Mellitus fizyoloji, tanımlama, sınıflama, etiyopatogenez,
klinik özellikler‖, Endokrinoloji, Ed: Özata, M., İstanbul Tıp Kitabevi Yayıncılık,
10(3): 543-546 (2011).
Yönem, A., ―Diabetes Mellitus fizyoloji, tanımlama, sınıflama, etiyopatogenez,
klinik özellikler‖, Endokrinoloji, Ed: Özata, M., İstanbul Tıp Kitabevi Yayıncılık,
10(3): 551-553 (2011).
63
Yönem, A., ―Diabetes Mellitus fizyoloji, tanımlama, sınıflama, etiyopatogenez,
klinik özellikler‖, Endokrinoloji, Ed: Özata, M., İstanbul Tıp Kitabevi Yayıncılık,
10(3): 555-558 (2011).
YüzbaĢıoğlu, D., Çelik, M., Yılmaz, S., Ünal, F., Aksoy, H., ―Clastogenicity of the
fungicide afugan in cultured human lymphocytes‖, Mutation Research, 604 (1-2):
53-59 (2006).
YüzbaĢıoğlu, D., Ünal, F., Yılmaz, S., Aksoy, H., Çelik, M., ―Genotoxicity testing of
fluconazole in vivo and in vitro‖, Mutation Research, 649:155–160 (2008).
Zengin, N., YüzbaĢıoğlu, D., Ünal, F., Yılmaz, S., Aksoy, H., ―The evaluation of the
genotoxicity of two food preservatives: sodium benzoate and potassium benzoate‖,
Food and Chemical Toxicology, 49: 763–769 (2011).
64
ÖZGEÇMĠġ
KiĢisel Bilgiler
Soyadı, adı
: JALANK H. MAHMOUD
Uyruğu
: Irak
Doğum tarihi ve yeri : 13.02.1973, Kerkük
Medeni hali
: Bekar
e-mail
: [email protected]
Eğitim
Derece
Eğitim Birimi
Lisans
Musul Üniversitesi
1997
Lisesi
Kerkük Esdihar Kız Lisesi
1991
Mezuniyet tarihi
ĠĢ Deneyimi
Yıl
Yabancı Dil
Ġngilizce ve Türkçe
Yer
Görev