helena

helena
www.helena-biosciences.com
BioSciences
Europe
Kullanım Talimatları
SAS-1 URINE SDS
Katalog No: 201400
KULLANIM AMACI
SAS-1 İdrar SDS kiti, SDS agaroz jel elektroforezi ile idrar numuneleri kullanılarak
böbrek hastalığının tespiti için tasarlanmıştır. Üriner proteinleri böbrek yoluyla filtre
edilen plazma proteinlerinden türetilmiştir. İdrarda anormal plazma proteinlerinin
varlığı renal fonksiyon değerlendirmesinde büyük değere sahiptir.
Proteinüre’in uygun çalışması boşaltılan proteinlerin miktarı ve türünün kantitatif ve
kalitatif değerlendirmesini içermelidir1-5. Glomerüler kapiller hücre yoluyla plazma
filtrasyonu bir sıvı olan idrarı verir. Normal idrar, bazı fizyolojik albümin ve transferrin
ve moleküler ağırlığı 50.000 Dalton’dan daha az olan mikroproteinler içerir. Bu
mikroproteinler böbrek kanalları tarafından katabolizma yapılarak tübüler hücreleri ile
tekrar absorbe edilirler.
İdrarda proteinin fizyolojik konsantrasyonu normal olarak yaklaşık 100mg/24 saattir
ve albümin ve transferrin jel profili üzerinde ışık bantları olarak bulunur. Normal bir
proteinüri konsantrasyon(<0.1g/24h) ile anormal bir bandın varlığı immunofiksasyon
tarafından tespit edilebilmelidir(Bence Jones veya diğerleri). Proteinüre’nin yüksek bir
düzeyi ile ilgili olan farklı bantların varlığı tamamlayıcı bir kimlik gerektirir. SDS jel
elektroforezi idrarda anormal proteinlerin tespiti için mükemmel bir metodolojidir.
SAS-1 İdrar SDS jeli bir anyonik deterjan ile Tris / HEPES bufferında agarozun
yüksek bir konsantrasyonunu içerir (SDS - sodyum dodesil sülfat). SDS’in varlığında
proteinler bir SDS protein kompleks oluşturur. Bağlayıcı SDS’de doğal yük
önemsizleştirilir ve tüm proteinler aynı yüklü kütle oranına sahip olurlar.
SDS-protein kompleksleri, bir eleme jel agarozunda molekül ağırlığını ayırabilirler.
20.000 ile 50.000 Dalton alanında bantların varlığı immunofiksasyon ve özel
antiserumlar tarafından tespit edilmelidir.
UYARILAR VE ÖNLEMLER
Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini
ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin.
Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım
bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun.
BİLEŞENLER
1. SAS-1 İdrar SDS Gel
Anyonik bir deterjan SDS ve koruyucu olarak sodyum azid ile bir Tris/HEPES
buffer içeren agaroz. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır.
2. Konsantre İdrar Protein Boya
Konsantre coomassie mavi boya içerir. 1 litre fiksative/boya arındırıcı solüsyonu
şişe içeriği ile dilüe edin. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir
şişede saklanır.
3. SDS Dilüent
Bromophenol mavi ile Tris/HEPES bufferda SDS içerir. Sodyum azid bir koruyucu
olarak kullanılır. Dilüent paket halinde kullanıma hazırdır.
4. Diğer Kit Bileşenleri
Her kit kullanım için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda C, SDS
kurutma kağıtları ve kurutma tarağı içerir.
SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ
1. SAS-1 İdrar SDS Jel
Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma
tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin
bozulması : 1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması,
çatlama ve kuruluğu veya 3) bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun
kontaminasyonunu belirtir.
2. İdrar Protein Boya
Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son
kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solusyonu 15-30 derecede 6 ay
stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın
alınması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun
bozulduğunu belirtebilir.
3. SDS Diluent
SDS dilüent 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son
kullanma tarihine kadar stabildir. Bulanıklık dilüent solüsyonun bozukluğunu
belirtebilir.
SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER
i) SAS-1 Plus kullanıcıları:
Katalog No.3100 REP Prep
50-60 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını
Sabitleme/Boya arındırıcı Solüsyon: 1300ml saf su ile 300ml metanolu karıştırın.
400ml buzlu asetik asit ekleyin.
Saf su
ii) SAS-3 kullanıcıları:
Katalog No.3100 REP Prep
Katalog No.311200 SAS-3 Electrode Adaptors for IEF
50-60 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını
Sabitleme/Boya arındırıcı Solüsyon: 1300ml saf su ile 300ml metanolu karıştırın.
400ml buzlu asetik asit ekleyin.
Saf su
iii) SAS-M1 kullanıcıları:
Katalog No.3100 REP Prep
Katalog No.211000 SAS-M1
Katalog No.1525 EPS600 Power Supply
50-60 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını
Sabitleme/Boya arındırıcı Solüsyon: 1300ml saf su ile 300ml metanolu karıştırın.
400ml buzlu asetik asit ekleyin.
Saf su
NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI
Tercih edilen numune taze toplanan serumdur. Numuneler 2...6°C de 72 saate kadar
ya da -20°C de 2 haftaya kadar buzdolabında saklanmalıdır. Total protein
1000mg/L’ın üstünde olmazsa numuneler konsantrasyon veya dilüsyon olmadan
başlangıçta kullanılmamalıdır.
Eğer numune protein konsantrasyonu 100mg/L’den daha azsa, aşağıdakiler gibi
konsantre edilmelidir:
Protein Konsantrasyonları
<100mg/L
<50mg/L
<20mg/L
Konsantrasyon
5 kez
10 kez
30 kez
Engelleyici faktörler: 1) numunelerden elde edilen yanlış sonuçlar buharlaşmadan
dolayı ortaya çıkabilir.
SAS-M1 kullanıcıları için not: Soğutma bloğu kullanmadan önce 2 ... 6 ° C’de gece
boyunca ve çalışma arasında en az 30 dakika soğutmalıdır.
ADIM-ADIM PROSEDÜR
1.80μl idrara 20μl SDS dilüent ekleyin. Yaklaşık 100°C’de 3-5 dakika boyunca
numuneyi ısıtın. 6000rpm’de 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.
2. Ambalajdan jeli çıkarın ve kağıt havlu üzerine koyun. Kurutucu C ile jel yüzeyini
kurutun ve kurutucuları alın.
3. Jelin köşesindeki oklarla numune uygulama kalıbını hizalayın. Kalıbın üstüne
bir SDS kurutucuyu koyun ve iyi temastan emin olmak için çatlaklar arasına
parmağınızı sürtün. Kurutucuları alın ve Adım 5’te kullanmak için saklayın.
4. Her yarık için 5 μl numune uygulayın ve 12 dakika boyunca absorbe etmesini
sağlayın.
5. Numune absorpsiyonunun ardından, adım 3 de saklanan SDS kurutucular ile
kalıpları kurutun ve hem kurutucu hem de kalıpları çıkarın.
6. i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Soğutucu üzerine 400 μL REP Prep boşaltın.
Soğutucu üzerine jeli, agarozu düzgün ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde
yerleştirin, uygun elektrot çubukları pozitif ve negatif kısımlara yerleştirin.
ii) SAS-3 kullanıcıları: Pinlere ayarlama kılavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep
kalıbın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, kılavuzu
kullanın, uygun elektrot uçları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava
kabarcığından kalmamasına dikkat edin.
iii) SAS-M1 kullanıcıları: Soğutma bloğunun içine 400μl Rep Prepi boşaltın. Jel
altında hava kabarcıklarını önleyerek ve agarozu toplayarak jeli soğutma bloğunun
merkezine koyun.
7. i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Elektrot kollarının içine KARBON elektrotları eklenir
böylece jel blokları ile temasa girerler.
ii) SAS-3 kullanıcıları: Elektrot kollarının içine KARBON elektrotları eklenir böylece
jel blokları ile temasa girerler.
iii) SAS-M1 kullanıcıları: İlgili buffer blokları ile her iki elektrotun temasını sağlamak
için iyice basın ve SAS-M1 üzerine kapağı yerleştirin.
8. İdrar SDS elektroforezi yapılır:
i)SAS-1 kullanıcıları: 80 volt, 30 dakika, 15°C. NB: Numune tepsini veya jel
kapağı kullanmayın.
ii)SAS-3 kullanıcıları:
Adım
Elektroforez
zamanı (mm:ss)
24:00
Sıcaklık (°C)
18
Voltaj
100
Diğer
iii) SAS-M1 kullanıcıları:
Elektroforez jel: 80 volt, 30 dakika.
9. Elektroforezin ardından, elektrotları alın ve temizleyin.
BOYAMA PROTOKOL
10. Gel Block Remover kullanılarak her iki jel bloklarını çıkarın.
11. Sabitleştirici/boya arındırıcı solüsyonda 5 dakika jeli bırakın.
12. 50...60°C’de jeli kurutun. NOT: Eğer jel 60°C altındaki sıcaklıkta kurutulursa, jelin
bulanıklığına neden olan problemler gözlenebilir.
13. 10 dakika boyunca boya solüsyonu içinde kuru jeli bırakın.
14. Arka plan temizlenene kadar yada sabitleştirici/boya arındırıcı solüsyonun
yıkayarak 2 x 5 dakika içinde jeli boyadan arındırın.
15. Saf su içinde jeli kısa süre yıkayın ve kurutun.
SONUÇLARIN YORUMLANMASI
Glomerüler proteinüri.
Glomerüler proteinüri, yaklaşık 50kDa’den daha büyük molekül ağırlığına sahip
proteinler ile karakterizedir (albumin, transferrin, IgG gibi). Bu jel üzerinde, albümin
glomerüler ve tübüler proteinler arasındaki bariyer yapar.
Tübülar Proteinüri.
Tübüler proteinüri yaklaşık 50kDa’den daha küçük molekül ağırlığına sahip proteinler
ile karakterizedir (α1-mikroproteinler, retinol bağlayıcı protein, β2-mikroglobulin gibi)
Bence Jones Proteinuria.
Bunlar microprotein alanında, jel sonunda albümin ve
anodal arasında
bulunmaktadır. Moleküler ağırlığın varyasyonundan dolayı, Bence Jones proteinleri
jel üzerinde biraz değişken konumda olabilir. Şüpheli Bence Jones protein varlığı
immunofiksasyon tarafından onaylanmalıdır. Proteinler moleküler ağırlığına göre
ayrılırlar.
Katottan anota, aşağıdaki proteinler görülebilir:
α2-Macro ve IgM
Haptoglobins
IgA
IgG
Transferrin
~800
kDa
~250-350 kDa
~160-170 kDa
~150-160 kDa
~80
kDa
Albumin
Dimers Kappa veLambda
α1-Microproteins
Bence Jones κ or λ
Retinol Binding Protein
Lysozyme
β2-Microglobulin
~70
~50
~30-35
~18-25
~20
~15
~12
kDa
kDa
kDa
kDa
kDa
kDa
kDa
Kalitatitif Değerlendirme.
İdrar SDS jel sadece kantitatif değerlendirme içindir. Jeller ilgili belirli bantların varlığı
veya yokluğu için görünür şekilde incelenebilir. Jel 595nm’de taranabilir.
Tamamlanan jel bir zaman süresiz olarak stabildir.
SINIRLAMALAR
Tüm elektroforez yöntemleri doğrusal olmadığı için, tekrarlanabilir sonuçlar ve
opsiyonel kararlılıktan emin olmak için kullanım kılavuzunu takip etmek önemlidir.
Kullanım talimatı izlenirken oluşabilecek hatalar elde edilen sonuçları etkileyebilir.
PERFORMANS ÖZELLİKLERİ
Tekrarlanabilirlik
Aynı numune 3 farklı jel üzerinde test edildi ve her jel üzerindeki bantlar aynı modeli
gösterir.
Hassasiyet
Yöntem, tamamlanmış jel üzerinde ayrık bir bant gibi proteinin en düşük
konsantrasyonu olarak belirlendi ve bant başına 10mg/L lik hassasiyete sahiptir.
BİBLİYOGRAFİ
1. Fauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred Fournier
Institute, Paris, France, 1988.
2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in Urine’
Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75.
3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A
Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein
Concentrations’ Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.
4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. ‘Determination of Urinary Protein Fractions by Different
Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.
5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S.
‘A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin.
Biochem., 1997, 34 : 371-374.