KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR BİYOSENSÖR

KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN
YENİ BİR BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI
Nevim BAŞAK
YÜKSEK LİSANS TEZİ
KİMYA
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
OCAK 2014
ANKARA
Nevim BAŞAK tarafından hazırlanan “KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR
BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI” adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak
uygun olduğunu onaylarım.
Prof. Dr. Ahmet YAŞAR
……………………………….
Tez Danışmanı, Kimya Anabilim Dalı
Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalında Yüksek
Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Prof. Dr. Mustafa KAVUTÇU
……………………………….
Biyokimya (Tıp) Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi
Prof. Dr. Ahmet YAŞAR
……………………………….
Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi
Doç.Dr. Fatma ARSLAN
……………………………….
Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi
Tez Savunma Tarihi: 28 / 01 / 2014
Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans
derecesini onamıştır.
Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU
Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü
……………………………….
ii
TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde
elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak
hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin
kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
Nevim BAŞAK
iv
KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI
(Yüksek Lisans Tezi)
Nevim BAŞAK
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Ocak 2014
ÖZET
Bu çalışmada, kolesterol tayini için yeni bir amperometrik biyosensör
geliştirildi. Bu amaçla, platin levha üzerinde pirolün polivinilsülfonatlı
ortamda
elektropolimerleşmesi
ile
filmi
polipirol-polivinilsülfonat
hazırlandı. Kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri, polipirolpolivinilsülfonat film içine tutuklama yöntemiyle immobilize edildi.
Kolesterol tayini, hazırlanan biyosensörün yüzeyinde gerçekleşen
enzimatik tepkime sonucu oluşan hidrojen peroksitin 0,40 V’da
yükseltgenmesine dayanarak yapıldı. Biyosensörün kolesterol tayini
için çalışma aralığı tayin edildi. Kolesterol biyosensörünün cevabına
pH’nın
ve
sıcaklığın
etkisi
araştırıldı.
Biyosensörün
tekrar
kullanılabilirliği ve raf ömrü tayin edildi. Hazırlanan biyosensör ile
biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini yapıldı. Biyolojik ortamlarda
olabilecek girişimlerin biyosensör cevabı üzerine etkileri incelendi.
Bilim Kodu
: 201.1.020
Anahtar Kelimeler : Kolesterol, Kolesterol oksidaz, Kolesterol esteraz,
biyosensör, polipirol, polivinilsülfonat
Sayfa Adedi
: 103
Tez Yöneticisi
: Prof.Dr. Ahmet YAŞAR
v
PREPARATION OF A NEW BIOSENSOR FOR THE DETERMINATION
OF CHOLESTEROL
(M. Sc. Thesis)
Nevim BAŞAK
GAZİ UNIVERSITY
GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
January 2014
ABSTRACT
In this study, new amperometric biosensor for determination of
cholesterol
was
developed.
For
this
reason;
polypyrrole-
polyvinylsulphonate films have been prepared on the platinum
electrode by the electropolymerization of pyrrole in the presence of
polyvinylsulphonate. Cholesterol esterase and cholesterol oxidase
enzymes have been immobilized in polypyrrole-polyvinylsulphonate via
the entrapment method. Cholesterol detection is based on the oxidation
of hydrogen peroxide at 0,4 V produced by the enzymatic reaction on
the biosensor surface. The linear working range of cholesterol
biosensor was determined. The effects of pH and temperature on the
response of the biosensor were investigated. Reproducubility and
storage stability were determined for the biosensor. The performance of
biosensor has been tested with human blood samples. The effects of
the interference occuring in biological environments on the response of
the biosensor were investigated.
Science Code : 201.1.020
Key Words
: Cholesterol, Cholesterol oxidase, Cholesterol esterase,
biosensor, polypyrrole, polyvinylsulphonate
Page Number : 103
Supervisor
: Prof. Dr. Ahmet YAŞAR
vi
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim süresince bilgisi ve deneyimleriyle bana yardım eden
ve yönlendiren, zamanını ve desteğini esirgemeyen değerli hocam, tez
danışmanım Sayın Prof. Dr. Ahmet YAŞAR’ a ;
Çalışmalarım boyunca bilgisi ve tecrübesi ile desteğini esirgemeyen çok
değerli
hocalarım
Sayın
Yrd.
Doç.
Dr.
Servet
ÇETE’
ye,
Sayın Doç. Dr. Fatma ARSLAN’ a ve Sayın Doç. Dr. Halit ARSLAN’ a ;
Özel yaşamım ve deneysel çalışmalarımda sabırla bana yardım eden ve
desteğini
esirgemeyen
sevgili
manevi
ablam
Özlem
ÇOLAK’a,
Arş. Gör. Dr. Demet UZUN’ a, Arş. Gör. Soner DÖNMEZ’e, Elif AYNACI’ ya,
Gökçen KARPUZ’a ve tüm çalışma arkadaşlarıma;
Hayatımın
her
döneminde
hiçbir
fedakarlıktan
kaçınmadan
beni
bugünlere getiren, maddi ve manevi destekleriyle her zaman yanımda olan
sevgili babam Şakir BAŞAK’a, annem Elmas BAŞAK’a, ablam Mine BAŞAK
ve kardeşim Merve BAŞAK’a;
Sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
vii
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET ............................................................................................................. iv
ABSTRACT ..................................................................................................... v
TEŞEKKÜR.................................................................................................... vi
İÇİNDEKİLER ............................................................................................... vii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ .............................................................................. xii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ .................................................................................. xiii
1. GİRİŞ ..........................................................................................................1
2. GENEL BİLGİLER.......................................................................................5
2.1. Enzimler ...............................................................................................5
2.2. Kolesterol esteraz (ChEt) enziminin özellikleri .....................................7
2.3. Kolesterol oksidaz (ChOx) enziminin özellikleri ...................................9
2.3.1. Tepkime mekaniznası .............................................................. 12
2.3.2. Kolesterol oksidaz ve kolesterol esterazın uygulama
alanları.................................................................................... 12
2.3.3. Analitik uygulamaları ............................................................... 14
2.4. Biyosensörler .................................................................................... 15
2.4.1. Biyosensörlerin yapısı ve fonksiyonları ................................... 17
2.4.2. Biyobileşenler ......................................................................... 18
2.4.3. Algılayıcılar (Transduserler) .................................................... 18
2.4.4. Biyosensörlerin uygulama alanları .......................................... 20
2.4.5. Biyosensör hazırlanmasında dikkat edilmesi gerekenler ........ 21
2.5. İletken Polimerler .............................................................................. 21
viii
Sayfa
2.5.1. Pirol ......................................................................................... 25
2.5.2. Elektrokimyasal polimerleşme mekanizması ........................... 25
2.6. İletken polimerlerle enzim immobilizasyonu ......................................28
2.6.1. Biyobileşen İmmobilizasyonu ..................................................29
2.6.2. Enzim immobilizasyon yöntemleri ...........................................29
2.7. Enzim Sensörleri ............................................................................... 39
2.7.1. Genel çalışma prensibi ............................................................ 40
2.7.2. Enzim sensörlerinin sınıflandırılması .......................................41
2.7.3. Amperometrik enzim elektrotlar ...............................................42
2.8. Performans Faktörleri ....................................................................... 44
2.8.1. Seçicilik ................................................................................... 44
2.8.2. Kullanım ömrü ......................................................................... 45
2.8.3. Kalibrasyon gereksinimleri. ..................................................... 45
2.8.4. Tekrarlanabilirlik ...................................................................... 45
2.8.5. Kararlılık .................................................................................. 45
2.8.6. Yüksek duyarlılık ..................................................................... 46
2.8.7. Yeterli düzeyde tayin sınır ....................................................... 46
2.8.8. Geniş ölçüm aralığı.................................................................. 46
2.8.9. Hızlı cevap zamanı .................................................................. 46
2.9.10. Basit ve ucuzluk..................................................................... 47
2.9. Kaynak Araştırması .......................................................................... 47
3. DENEYSEL KISIM .................................................................................... 56
3.1. Cihazlar ve Malzemeler..................................................................... 56
ix
Sayfa
3.1.1. Elektrokimyasal analiz cihazı .................................................. 56
3.1.2. Hücre ve elektrotlar ................................................................. 56
3.1.3. pH metre ................................................................................. 57
3.1.4. Su banyosu ............................................................................. 57
3.1.5. Mikro pipet .............................................................................. 57
3.1.6. Argon gazı ............................................................................... 57
3.1.7. Saf su ...................................................................................... 57
3.1.8. SEM cihazı .............................................................................. 57
3.1.9. AFM cihazı .............................................................................. 58
3.1.10. Yüzey temas açısı cihazı ...................................................... 58
3.1.11. Profilometre cihazı (Film Kalınlığının Ölçülmesi) ................... 58
3.2. Kullanılan Reaktifler ve Özellikleri ..................................................... 58
3.2.1. Kullanılan çözeltiler ................................................................. 59
3.3. Platin Yüzeye Polipirol-Polivinilsülfonat (PPy-PVS) Kaplanması ...... 61
3.3.1. Pt/PPy-PVS elektrodun SEM analizi ...................................... 62
3.3.2. Pt/PPy-PVS elektrodun AFM analizi ...................................... 63
3.3.3. Pt/PPy-PVS elektrodun yüzey temas açısı analizi ................. 63
3.3.4. Pt/PPy-PVS elektrodun profilometre (Film Kalınlığı
Ölçülmesi) ............................................................................ 63
3.4. Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat (Pt/PPy-PVS) Elektrodunun
Hidrojen Peroksite Duyarlılığının Belirlenmesi.. ................................ 63
3.5. Pt/PPy-PVS Film Elektrot ile Serbest Enzimin Çalışması ................. 64
3.6. Biyosensörün Hazırlanması .............................................................. 64
x
Sayfa
3.6.1. Çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyon .......................... 64
3.6.2. Tutuklama yöntemi ile immobilizasyon .................................... 65
3.6.3. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün SEM analizi .......... 65
3.6.4. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün AFM analizi .......... 65
3.6.5. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün yüzey temas
açısı analizi ............................................................................. 66
3.6.6. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün profilometre
(Film Kalınlığı Ölçülmesi)......................................................... 66
3.7. Biyosensörün Kolesterol Duyarlılığının Belirlenmesi ......................... 66
3.8. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx Biyosensörünün En İyi Koşullarının
Belirlenmesi ...................................................................................... 67
3.8.1. pH’nın etkisi ............................................................................. 67
3.8.2. Sıcaklığın etkisi ...................................................................... 67
3.8.3. Substrat derişiminin etkisi ........................................................ 68
3.8.4. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi ................ 68
3.8.5. Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi .................................. 69
3.9. Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler ....................................69
3.10. Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini....................................... 72
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA ..................................................................... 73
4.1. Pt/PPy-PVS Film Elektrodunun Hidrojen Peroksite
Duyarlılığının Belirlenmesi.. .............................................................. 74
4.2. Pt/PPy-PVS Film Elektrodunun Serbest Enzimin Bulunduğu
Çözeltide Kolesterol Palmitata Duyarlılığının Belirlenmesi ................ 75
4.3. Çapraz Bağlama ve Tutuklama Yöntemi ile İmmobilizasyon ............. 76
4.4. SEM Analizi ....................................................................................... 78
4.5. AFM Analizi ....................................................................................... 80
4.6. Yüzey Temas Açısı Analizi ............................................................... 81
xi
Sayfa
4.7. Profilometre spektrumu (Film Kalınlığının Ölçülmesi) ....................... 83
4.8. Biyosensörün En İyi Çalışma Koşullarının Belirlenmesi .................... 84
4.8.1. pH etkisi .................................................................................. 84
4.8.2. Sıcaklık etkisi .......................................................................... 85
4.8.3. Substrat derişiminin etkisi ....................................................... 87
4.8.4. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi ............... 90
4.8.5. Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi .................................. 91
4.9. Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler .................................... 92
4.10. Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini....................................... 93
4.11. Sonuç .............................................................................................. 94
KAYNAKLAR ............................................................................................... 95
ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................103
xii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 2.1. Biyosensör algılayıcıları ............................................................ 19
Çizelge 2.2. Biyosensörler için uygulama alanları ......................................... 20
Çizelge 2.3. İletken polimerler ve iletkenlikleri .............................................. 24
Çizelge 2.4. İletken polimerlerin kullanıldığı biyosensörler ............................ 28
Çizelge 2.5. Enzim immobilizasyon yöntemleri ............................................. 30
Çizelge 2.6. Enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar................. 31
Çizelge 2.7. Enzim sensörlerinin sınıflandırılması......................................... 42
Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık
dereceleri ve temin edildikleri firmalar ...................................... 59
Çizelge 4.1. Biyosensör üzerine (1,0x10-5 M kolesterol palmitat
derişiminde ) girişim yapan maddeler ve girişim
etkileri
.................................................................................. 92
Çizelge 4.2. Kan numunelerinde hesaplanan kolesterol derişimleri .............. 93
xiii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil
Sayfa
Şekil 1.1. Kolesterol’ün molekül yapısı ............................................................1
Şekil 1.2. İnsan vücudunda kolesterolün işlevi ................................................1
Şekil 2.1. Bir substrat molekülünü bağlayan enzimin şematik olarak
gösterilmesi ..................................................................................7
Şekil 2.2. Kolesterol esteraz enziminin üç boyutlu yapısı ................................8
Şekil 2.3. Kolesterol oksidaz enziminin üç boyutlu yapısı ............................. 10
Şekil 2.4. Kolesterol oksidaz enziminin tepkime mekanizması ..................... 12
Şekil 2.5. Bir biyosensörün şematik yapısı .................................................... 15
Şekil 2.6. Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi.................................... 18
Şekil 2.7. Pirolün aktif noktaları ..................................................................... 25
Şekil 2.8. Pirolün elektrokimyasal polimerleşme mekanizması ..................... 27
Şekil 2.9. Kovalent bağlama ......................................................................... 31
Şekil 2.10. Adsorpsiyon ................................................................................ 33
Şekil 2.11. İyonik bağlama ............................................................................ 34
Şekil 2.12. Çapraz bağlama .......................................................................... 36
Şekil 2.13. Polimer matrikste tutuklama ........................................................ 38
Şekil 2.14. Mikrokapsülleme ......................................................................... 39
Şekil 2.15. Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal
sıralamasında enzimlerin yeri .....................................................40
Şekil 2.16. Enzim sensörlerinin genel şematik gösterimi .............................. 41
Şekil 2.17. Amperometrik esaslı bir biyosensörün şematik gösterimi............ 43
Şekil 3.1. Kaplama ve ölçümde kullanılan hücre sistemi ............................... 56
Şekil 3.2. Pt/PPy-PVS film elektrodunun voltamogramı ................................ 62
xiv
Şekil
Sayfa
Şekil 4.1. Elektrot yüzeyinde gerçekleşen elektron aktarımı ......................... 74
Şekil 4.2. Pt/PPy-PVS elektrodun H2O2’ye duyarlılığı ................................... 75
Şekil 4.3. Pt/PPy-PVS film elektrodun serbest enzimli ortamda
kolesterol palmitata duyarlılığı ....................................................... 76
Şekil 4.4. a) Çapraz Bağlama b) Tutuklama ile immobilizasyon ................... 77
Şekil 4.5. Tekrarlanabilirlik (Tutuklama yöntemi ile) ...................................... 77
Şekil 4.6. Tekrarlanabilirlik (Çapraz bağlama yöntemi ile) ............................ 78
Şekil 4.7. Pt/PPy-PVS filminin SEM fotoğrafı ................................................ 79
Şekil 4.8. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün SEM fotoğrafı .............. 79
Şekil 4.9. Pt/PPy-PVS filminin AFM fotoğrafı ................................................ 80
Şekil 4.10. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün AFM fotoğrafı............. 81
Şekil 4.11. Pt/PPy-PVS filminin yüzey temas açısı fotoğrafı ......................... 82
Şekil 4.12. Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün yüzey temas
açısı fotoğrafı .............................................................................. 82
Şekil 4.13. Pt/PPy-PVS filminin profilometre spektrumu ............................... 83
Şekil 4.14. Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün profilometre
spektrumu ................................................................................... 83
Şekil 4.15. Biyosensörün aktivitesine pH’ nın etkisi ...................................... 84
Şekil 4.16. Biyosensörün aktivitesine sıcaklığın etkisi ................................... 86
Şekil 4.17. Biyosensörün amperometrik cevabına kolesterol palmitat
derişiminin etkisi (Michaels-Menten grafiği) ................................. 87
Şekil 4.18. Biyosensörün aktivitesi üzerine kolesterol palmitata
duyarlılığını gösteren Lineweaver-Burk grafiği ............................ 88
Şekil 4.19. Kolesterol biyosensörü için kalibrasyon grafikleri ........................ 89
Şekil 4.20. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi .................... 90
Şekil 4.21. Biyosensörün raf ömrünün incelenmesi ...................................... 91
1
1. GİRİŞ
Kolesterol (C27H46O, MA:386,65 g/mol), 3-hidroksi-5-dehidro kolestan olup,
hayvansal organizmalarda en çok bulunan bir steroldür [1].
Şekil 1.1. Kolesterol’ün molekül yapısı
Kolesterol biyolojik zarların yapısında bulunan ve yaşam için temel olan
yapısal bir bileşen olup mum kıvamında yağımsı bir maddedir. Beyin, sinirler,
kalp, barsaklar, kaslar, karaciğer başta olmak üzere tüm vücutta yaygın
olarak bulunur. Vücut kan plazmasında kolesterol, bazı hormonların (steroit
bileşikler), D vitamini ve yağları sindiren safra asitlerin çıkış maddesi olarak
kullanılır [2-3].
Şekil 1.2. İnsan vücudunda kolesterolün işlevi
2
Bu işlemler için kanda çok az miktarda kolesterol bulunması yeterlidir. Kanda
fazla
miktarda
kolesterol
bulunması
kolesterolün
kan
damarlarında
birikmesine, damarların daralmasına, sertleşmesine yol açar. Kolesterol
hangi organın damarlarında birikirse o organa ait hastalıklar ortaya çıkar [3].
Kolesterol normal koşullarda kanda çözünmez. Kanda çözünmesi için
karaciğerde bir proteinle birleşmesi gerekir. Bu kolesterol ve protein
birleşimine lipoprotein adı verilir. Çok çeşitli lipoprotein türleri vardır bunların
en önemlileri aşağıda verilmiştir ve 5’ e ayrılırlar:
• Şilomikronlar
• Çok düşük yoğunluklu lipoproteinler
• Ara yoğunluktaki lipoproteinler
• Düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL): Kan kolesterolünün yaklaşık %70’ini
taşımaktadırlar.
Kan
damarları
küçüktürler ve
damarlara
duvarlarına
zarar verirler.
girebilmek
Kötü
için
yeterince
tür kolesterol olarak
adlandırılırlar.
• Yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL): Vücudun kullanmadığı kolesterolü
karaciğerden safraya boşaltmak üzere taşır. Kolesterolün bir cins ters naklini
yaptığı için iyi tür kolesterol olarak adlandırılırlar.
Kanda toplam kolesterol ve LDL kolesterolün yüksek olması yüksek risk
oluşturmaktadır. Ayrıca HDL kolesterolün düşük olması da bir risktir. Normal
şartlarda sağlıklı bireyin kan plazmasında 200 mg/dL değerinin altında
kolesterol bulunur. İnsan vücudunda bulunan kolesterolün üçte ikisi yağ
asitleri ile esterleşmiş halde üçte biri ise sterol olarak mevcuttur [3-4]. Bunun
üzerindeki değerler yüksek kolesterol seviyesi olarak bilinir [3].
Kandaki veya serumdaki kolesterol seviyesi, koroner kalp hastalığı, damar
sertliği ve başka klinik hastalıkların teşhisinde ve tromboz risklerinin, miyokart
enfarktüsünün değerlendirilmesinde temel bir parametredir [5]. Bu nedenle
kanda kolesterol seviyesinin tayini önemlidir.
3
Kolesterol tayini için enzimatik ve enzimatik olmayan metotlar geliştirilmiştir.
Enzimatik olmayan metodlar, fazla zaman alan, uzman işgücü ve pahalı
kimyasal maddeler gerektiren ve serumdaki kolesterol analizlerinin hızlı ve
otomatik yapılmasına uygun olmayan metodlardır. Kolesterol tayini için
enzimatik metotlar ise karmaşık prosedürler gerektirir ve her bir analizdeki
enzimlerin pahalı olmasından dolayı yüksek maliyetlidir. Kolesterolün
serumdaki ve kandaki tayini için tasarlanan biyosensörler ile duyarlılık,
seçicilik, hız, kararlılık geliştirilmiş ve maliyet düşürülmüştür. Biyosensörler
için
enzimatik
elektrotların
uygulaması
enzimin
uygun
matrislerde
immobilizasyonu ile başarılmıştır. Kolesterol oksidaz immobilizasyonu değişik
matrislerde yapılmıştır: iletken polimerler, sol-gel, kendiliğinden toplanan
tabakalar (SAM), karbon pasta, selüloz asetat, nanopartiküller, grafit-teflon
bileşimi gibi [5].
Bu çalışmada kolesterole duyarlı yeni bir amperometrik biyosensör
hazırlandı.
Bunun
için,
Platin/Polipirol-polivinilsülfonat
(Pt/PPy-PVS)
elektrotları pirolün elektropolimerleşmesiyle hazırlandı [6]. Daha sonra
kolesterol esteraz (ChEt) ve kolesterol oksidaz (ChOx) enzimlerinin
tutuklama yöntemi ile immobilizasyonu sağlanarak Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx
biyosensörü elde edildi. Enzimlerin katalizlediği reaksiyonlar şöyledir:
Kolesterol esteraz
Kolesterol esteri + H2O
Kolesterol + Yağ asidi
Kolesterol oksidaz
Kolesterol + O2
Kolest-4-en-3-on + H2O2
Kolesterol tayini, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H2O2’in +0,40 V’da
yükseltgenmesi esasına dayanarak yapıldı. Biyosensörün en iyi çalışma
koşulları belirlendi ve performansını etkileyen faktörler incelendi. Film elektrot
ve biyosensörün yüzeyinin morfolojik yapısı SEM, AFM, yüzey temas açısı,
profilometre gibi yöntemlerle karakterize edildi. Biyolojik sıvılarda olabilecek
4
ve amperometrik cevap akımını etkileyeceği düşünülen muhtemel girişimler
incelendi. Hazırlanan biyosensör ile biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini
yapıldı.
Bu çalışma Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün hazırlanma koşulları;
immobilizasyon tekniği ve tayin yöntemi açısından diğer çalışmalardan
farklıdır.
5
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Enzimler
Enzimler canlı organizmalarda kimyasal reaksiyonları katalize eden ve hiçbir
yan ürün oluşmasına fırsat vermeden % 100’lük bir ürün verimi sağlayan
biyolojik katalizörlerdir. Katalitik RNA moleküllerinin (ribozimler) küçük bir
grubu dışında bütün enzimler protein yapısındadır. Proteinlerin en büyük ve
en çok özelleşmiş grubunu teşkil ederler [7-55].
Canlıları oluşturan moleküller, yani biyomoleküller kinetik yönden oldukça
kararlı olup kendiliğinden kolayca reaksiyon vermezler. Bir hücredeki tüm
kimyasal
olaylar
enzimler
aracılığıyla
gerçekleştirilir.
Biyomoleküllerin
kararlılığı şu önemli sonucu sağlamaktadır; hücre içinde enzimi olmayan
reaksiyon gerçekleşmesi hemen hemen mümkün değildir, kendiliğinden
reaksiyon meydana gelmez. Bunun anlamı, enzimlerin protein yapısında
oldukları ve DNA tarafından şifrelendikleri için, bir hücrede gerçekleşen bütün
olaylar DNA seviyesinde düzenlenip kontrol edilmektedir demektir. Buradan,
enzimleri sadece katalizör özelliği ile nitelemenin eksik bir tanımlama olacağı
anlaşılmaktadır.
Biyokimya tarihinde araştırmaların büyük çoğunluğunu enzimler üzerindeki
çalışmalar oluşturmuştur. Kataliz olayı ile ilgili önemli ilk çalışmalar 17601825 yılları arasında midedeki enzimatik sindirim üzerinde yapılmıştır. Belirli
bir enzim üzerindeki ilk çalışmayı 1835 yılında İsveçli kimyager S.S.
Berzelius gerçekleştirmiş ve diastazın nişastayı hücre içinde sülfürik asitten
daha yüksek verimle hidrolizlediğini göstermiştir. 1860 yılında L. Pasteur
fermentasyon olayının enzimler tarafından yürütüldüğünü deneylerle ispat
etmiş
olmasından
dolayı
enzimler
için
ferment
terimi
kullanılmaya
başlanmıştır. Fakat Pasteur enzimlerin yalnız canlı hücre yapısı içerisinde
görev yapabildiklerini zannetmiştir [8].
6
Enzimoloji alanında şüphesiz en önemli gelişme 1926 yılında, Summer’ın
üreaz enzimini “Jack Beané” bitkisinden elde edip kristallendirdikten sonra
protein yapısında bir bileşik olduğunu ortaya koymasıdır. Önceleri şüphe ile
karşılanan bu sonuç, 1930-1936 yılları arasında Northrop’un pepsin, tripsin
ve kimotripsin enzimlerini kristallendirmesi ve protein yapısında olduklarını
kesin olarak ortaya koymasıyla doğrulanmıştır. Bugün yaklaşık olarak 2000
kadar enzim tanımlanmış, birçoğu saf halde elde edilip kinetikleri incelenmiş
ve 200’den fazlası da kristallendirilmiştir. Ancak yapılan genetik çalışmalar
henüz tespit edilmemiş birçok enzim varlığının olduğunu göstermektedir [8].
Enzimlerde proteini oluşturan aminoasitlerin sayısı, diziliş sırası ve
moleküllerin yapısı belirli bir düzen içindedir. Bu düzen enzimin substrata
seçiciliğini sağlar. Enzimin protein yapısının yanında ona aktiflik kazandıran
gruplar vardır. Bazı enzimler yalnızca proteinden oluşurken bazıları protein
yanında protein olmayan bir kısım içerirler. Enzimin protein kısmına
“Apoenzim”, protein olmayan kısmına “Kofaktör ya da Koenzim” denir.
Sıklıkla karşılaşılan kofaktörler arasında metal iyonları (Zn2+, Fe2+ gibi) ve
organik yapıda olan (NAD+, FAD gibi) koenzimler yer alır. Apoenzim ve
kofaktörün oluşturduğu aktif yapıya da “holoenzim” denir [9]. Holoenzimin
büyük bir kısmını apoenzim oluşturur. Apoenzim tek başına katalitik aktivite
göstermez. Enzimin gerçek aktivitesi sadece koenzim ve apoenzim bir arada
olduğunda gözlenir [10].
Enzim molekülünün belirli bir bölgesinde belirli amino asitlerin oluşturduğu bir
kısım bulunur. Protein zincirinin bu bölgesi enzimin katalitik etkisinden
sorumlu olup “Aktif bölge” olarak tanımlanır. Substrat ve eğer varsa koenzim,
bu merkeze hidrojen bağları, hidrofobik etkileşimler, iyonik bağlar veya
kovalent bağlar ile bağlanır [11]. Aktif bölge substratı bağlayarak bir enzim –
substrat (ES) kompleksi meydana getirir. ES kompleksi, enzim-ürün (EÜ)
kompleksine dönüşür ve enzim üründen ayrılır (Şekil 2.1).
7
Şekil 2.1. Bir substrat molekülünü bağlayan enzimin şematik olarak
gösterilmesi
Enzim aktivitesine etki eden faktörler enzim miktarı, substrat konsantrasyonu,
pH, sıcaklık, iyonik şiddet, sahipse kofaktör derişimi, aktivatör ve inhibitör
derişimleri olarak sıralanabilir.
Enzimler yeterli koşulların sağlanması durumunda etkilerini gösterebiliyor
olmaları enzimlerden doğal ortamların dışındaki pek çok alanda da
yararlanabilme imkanını ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenle enzimlere ilişkin
tüm nitelik ve özellikleri bir bütün olarak inceleyen enzimoloji bilim dalı, başta
biyokimya ve moleküler biyoloji olmak üzere fizikokimya, bakteriyoloji,
mikrobiyoloji, genetik, botanik, tarım, farmakoloji, toksikoloji, patoloji, fizyoloji,
tıp, mühendislik ve biyoteknoloji gibi bilim dalları ile çeşitli endüstriyel alanlar
için büyük önem taşımaktadır.
2.2. Kolesterol Esteraz Enziminin Özellikleri
Kolesterol esteraz enziminin protein yapısında 579 tane amino asit kalıntısı
vardır. Aktif merkezdeki aminoasitler Ser194, His435, Asp320’dir [12].
8
Şekil 2.2. Kolesterol esteraz enziminin üç boyutlu yapısı
Vücutta fazla miktardaki kolesterol, hücre içinde kolesterol esterleri olarak
depolanır. Kolesterol esteraz enzimi kolesterolün yağ asidi esterlerini ve diğer
sterolleri hidrolize edebilen ve sentezleyebilen tersinir enzimdir [12]. Esas
olarak pankreas ve pankreas sıvısında bulunur ve aynı zamanda diğer
dokularda da meydana gelir.
Kolesterol esteraz
Kolesterol esteri
H3C
H3C
H 2O
Kolesterol
CH3
H3C
H3C
CH3
H
H3C
O
+
H
H
H3C
H
H
+ Yag asidi
CH3
CH3
O
R C OH
H
HO
R O
İlk olarak 1900 yıllarında enzimatik olarak katalize sentezi ve bazı dokuların
varlığında kolesterol esterlerin hidrolizi gözlenmiş ve tanımlanmıştır. 1949 ve
1950 yıllarında Yamamoto ve Treadwell tarafından kolesterol esteraz
üzerinde kapsamlı çalışmalar yapılmıştır [13]. 1950 yılında Korzenovsky
tarafından serum ve diğer çeşitli dokularda kolesterol esteraz enzimi
incelenmiştir. 1957 yılında Hernandez ve Chaikoff pankreas kolesterol
esteraz özellikleri ve enzimatik aktivite tahmini için bir turbidimetrik yöntem
9
geliştirmiştir [14]. İlerleyen yıllarda kalp-damar hastalığı ve yüksek serum
kolesterol arasındaki bilinen ilişki ile ilgili bir çalışma yapılmıştır. Kolesterol
esteraz
kullanılarak
toplam
serum
kolesterol
belirlenmesinde
klinik
uygulamalar yer bulmuştur [15].
Domuz pankresasından elde edilen kolesterol esterazın özellikleri [16]:
Sistematik adı: EC 3.1.1.13 kolesterol: steril - ester açilhidrolaz
Görünümü: Donmuş toz hali beyazdır.
Molekül kütlesi: Yaklaşık 167 kDa ( jel filtrasyonu ile )
İzoelektrik noktası: 5,95 ± 0,05
İnhibitörleri: İyonik deterjanlar, Hg ++ , Ag +
En iyi pH: 7,4
En iyi sıcaklık: 25 ° C
pH kararlılık aralığı: 6,5 – 8,5
2.3. Kolesterol Oksidaz Enziminin Özellikleri
Kolesterol oksidaz çeşitli mikroorganizmalardan saflaştırılan iki işlevli bir
enzimdir. Bu enzim merkezde iki tepkimeyi katalizler. İlk tepkimede
kolesterolün, yükseltgenmesini, ikinci tepkimede ise oluşan yükseltgenme
ürününün kolesterol-4- en-3-on’a dönüşümünü sağlar ve bu sırada aşağıda
da verildiği gibi H2O2 açığa çıkar [1-2, 18].
10
1975’ten beri kolorimetrik tayin ile serum içindeki serbest kolesterolün
hesaplanmasında bu enzim kullanılmaktadır [1-2, 18]. Serum içindeki toplam
kolesterolün hesaplanması klinik teşhisler için gereklidir. Kolesterolün yüksek
değeri bazı damarların çeperlerinde birikerek damarların tıkanmasına, tiroit
bezinin
az
çalışmasından
kaynaklanan
tiroit
bozukluğuna,
böbrek
tubuluslarının dejenerasyonun yol açtığı bir hastalığa, şeker hastalığına ve
sarılığa sebep olur. Düşük değeri ise boynun önünde bulunan tiroit bezinin
fazla çalışmasından ileri gelen bir bozukluğa ve kansızlığa sebep olur [2223].
Kolesterol oksidaz steroitlerin izomerizasyonunu ve oksidasyonunu sağlayan
koenzim FAD taşıyan bir enzimdir [18, 20]. Enzimin protein yapısında 492
tane amino asit kalıntısı vardır. Aktif merkezdeki amino asitler His447,
Glu361’dir. En önemli amino asit kalıntısı Glu361’dir. Glu361 mekanizmadaki
izomerizasyon basamağında bir proton alıcısı gibi görev yapar. Şekil 2.3’ de
Glu361 küçük sarı toplar olarak gösterilmiştir. Proteine bağlı FAD, enzimin
mavi renkte gösterilen α-sarmal ile çevrelenmiştir [22].
Şekil 2.3. Kolesterol oksidaz enziminin üç boyutlu yapısı
Kolesterol oksidaz farklı ortamlarda bulunan mikroorganizmalardan elde
edilmiştir. Bunların sınıflandırılması yıllar boyunca geliştirilmiştir. İlk defa
11
Turfitt, Nocardia erythropolis mikroorganizmasından enzimi saflaştırmış ve
kolesterolün yükseltgenmesi üzerine etkilerini incelemiştir. Stadtman ve
arkadaşları
ekstrakte
4-kolest-3-on‘u
elde
edilen
serbest
enzimin
etmişlerdir.
Bu
gelişmelerden
inkübasyonundan
sonra
birçok
mikroorganizmada bu enzim bulunmuştur. Kolesterol oksidazın elde edildiği
mikroorganizmalar aşağıda verilmiştir [24-25].
• Corynebactericum
• Arthrobacter
• Nocardia erythropolis ve Rhodococcus eryhcopolis
• Nocardia rhdochrous ve Rhodococcus rhdochrous
• Mycbacterium
• Pseudomonas
• Brevibacterium cholesterolicum
• Streptoverticillium cholesterolicum
• Streptomyces violascens
• Rhodococcus
Streptomyces bakterisinden elde edilen kolesterol oksidazın özellikleri [22]:
Sistematik adı: E.C.1.3.3.6 kolesterol: oksijen oksidoredüktaz
Görünümü: Donmuş toz hali sarıdır.
Molekül kütlesi: Yaklaşık 59 kDa ( jel filtrasyonu ile )
İzoelektrik noktası: 5,1 ± 0,1 ve 5,4 ± 0,1
İnhibitörleri: İyonik deterjanlar , Hg ++ , Ag ++
En iyi pH: 6,5 – 7,5
En iyi sıcaklık: 37 ° C
pH kararlılığı: 4,0 – 9,0
Termal kararlılığı: 70 ° C ‘ nin altında
Kararlılığı: 37 ° C de en az bir ay
12
2.3.1. Tepkime mekanizması
Kolesterol oksidaz enziminin katalizlediği tepkime mekanizması Şekil 2.4’de
gösterildiği
gibidir.
Katalizleme
iki
safhada
gerçekleşir.
İlk
tepkime
kolesterolün kolest-5-en-3-on’a yükseltgenmesi, ikinci tepkime ise kolest-5en-3-on’un kolest-4-en-3-on’a dönüşüm tepkimesidir [25].
Şekil 2.4. Kolesterol oksidaz enziminin tepkime mekanizması
2.3.2. Kolesterol oksidaz ve kolesterol esterazın uygulama alanları
• Gıda analizlerinde kolesterol tayini amacı ile kullanılır.
Kolesterol oksidaz
Kolesterol + O2
H2O2 + Metanol
Katalaz
Kolestenon + H2O2
Formaldehit + 2 H2O
13
Formaldehit + NH4+ + 2-asetilaseton
Lutidin Boyar maddesi+ 3 H2O
Katkı maddesi olarak yumurta sarısı içeren gıdalarda kolesterol tayini amacı
ile kullanılır [11].
• Klinik analizlerde kolesterolün belirlenmesi amacıyla kullanılır. Kolesterol
esteraz, kolesterol oksidaz ve peroksidaza bağlı enzimatik kolorimetrik
yöntem kolay duyarlı ve özeldir. Bu yüzden de rutin analizler için uygundur.
Bu da aşağıdaki kimyasal reaksiyonlara dayandırılmaktadır.
Kolesterol esteraz
Kolesterol + Yağ asidi
Kolesterol esteri + H2O
Kolesterol oksidaz
Kolesterol + O2
Kolest -4-en-3-on + H2O2
Peroksidaz
Kinonimin boyası
H2O2 + 4-aminofenazon + Fenol
Bu örnekteki ilk tepkimede kolesterol esterleri kolesterol esteraz tarafından
kolesterol ve yağ asitlerine hidrolizlenir. İkinci tepkimede kolesterol, kolesterol
oksidaz tarafından kolest-4-en-3-on ve H2O2’ ye yükseltgenir. H2O2,
peroksidaz katalizörlüğünde 4-aminofenazon ve fenol varlığında renkli 4-(pbenzokinon-monoimino)
fenazon
oluşumunu
sağlar.
İndikatör
ve
stokiyometrik olarak eşleşmiş tepkimeler yardımıyla kolesterol derişimine
ulaşılır [26].
• Etkin enzim güçlü bir böcek öldürücüdür [27].
14
2.3.4. Analitik uygulamaları
Analitik inceleme olarak kolesterol esteraz ve kolesterol oksidazın kullanımı
için birçok yeni uygulamalar vardır.
a) Farklı örnek türlerinde kolesterolün saptanması için kullanılır. Bu örnekler

Serumda toplam ve esterleşmiş kolesterol tayini

Yüksek ve düşük yoğunluklu (HDL-LDL) lipoprotein ölçülmesi
b) Hücrelerdeki kolesterol tayini ve enzimlerin yol açtığı hücre zarlarının
parçalanmasının tespit edilmesi
c) İnsan safrası ve safra taşlarındaki toplam kolesterol tayini
d) Kemilüminesans ve floresans yöntemleriyle kolesterol tayini
e) Biyosensör yapımı ve enzimin polimer matrikse immobilizasyonu
Genelde kolesterol tayini yöntemlerin çoğu H2O2 ölçümüne dayanır. Bu
sebeple bu yöntem dolaylı bir yöntemdir. Bunun sebepleri çeşitlidir. Birinci
olarak H2O2’ in renk oluşturan bileşenlerle eşleşmesi sonucunda yüksek
seviyede renk verici maddeler oluşur. Bu da daha hassas kolesterol
ölçülmesini sağlar. İkinci olarak, H2O2’ nin redoks tepkimesi açık bir şekilde
saptanır. Bu da kolay voltametrik ve amperometrik ölçme yapılmasını sağlar
[24].
15
2.4. Biyosensör
Canlılar teknologların hayal bile edemeyecegi duyarlılık performansı
gösterirler. Örnegin, bazı köpeklerin koku almaları insanlardan 100 000 kat
daha duyarlıdır. Yılan balıkları, tonlarca su içerisine ilave edilen birkaç damla
yabancı maddeyi hemen algılarlar. Kelebekler partnerlerinin yaydığı birkaç
molekülü bile hissederler. Algler ise zehirli maddelere karşı çok duyarlıdırlar.
İşte canlılara bu uyarıları algılamayı mümkün kılan biyolojik maddelerin analiz
sistemleri ile birleştirilmesi sonucunda biyosensörler ortaya çıkmıştır [28].
Biyosensör,
biyolojik
biyolojik
olayın
olaylardaki
teşhisine
biyokimyasal
imkan
tanıyan
bir
değişimleri
ölçme
algılayarak,
sistemi
olarak
tanımlanabilir. Biyosensörler, birbiri içine geçmiş biri biyokimyasal diğeri
elektrokimyasal
özellikteki
iki
çeviriciden
oluşmaktadır
(Şekil
2.5).
Biyokimyasal kısmın görevi analizlenecek madde ile etkileşerek onu
tanımaktır. Bu tanıma olayının sonucunda bir biyokimyasal ürün de
oluşabilmektedir. Biyosensörün ikinci kısmı olan elektrokimyasal kısım ise bu
tanıma olayını ölçülebilir bir sayısal değere dönüştürmekle görevlidir [28-29].
Şekil 2.5. Bir biyosensörün şematik yapısı
Biyosensörlerin tarihi 1950’li yılların ortalarında Clark’ ın Cincinnati
Hastanesinde (Ohio, ABD) ameliyat sırasında kanın O2 miktarını bir elektrotla
16
izlemesi ile başlamıştır. 1962 yılında Clark ve Lyons glukoz oksidaz enzimini
O2 elektrodu ile kombine ederek kanın glukoz düzeyini ölçmeye başlamışlar.
Böylece yeni bir analitik sistem oluşturmuşlar. Bu sistem bir yandan biyolojik
sistemin (enzim) yüksek spesifikliğini diğer taraftan ise fiziksel sistemin
(elektrot) tayin duyarlılığını belirlemiştir ve geniş spektrumlu uygulama
olanağı elde etmiştir.
Clark ve Lyons’ un geliştirdiği ilk biyosensörde elektron alıcısı olarak oksijen
kullanılırken, ikinci jenerasyon biyosensörlerde O2 yerine elektronları enzimin
redoks merkezinden elektron yüzeyine taşıyabilen bir redoks medyatörü
kullanılmaya başlanmıştır. Üçüncü jenerasyon biyosensörlerde enzimin
redoks merkezi ile elektrot yüzeyi arasında doğrudan elektriksel iletişim
sağlanmıştır ve redoks medyatörlerine gereksinim kalmamıştır [30].
Glukoz + O2
GOD
Glukonik asit + H202
GOD: Glukoz oksidaz
GOD-FADH2 + Mox
GOD-FAD + Mred + 2H2
Mred = Mox = redoks medyatörü
Biyosensörler, diğer adıyla biyospesifik elektrotlar, biyoajanları immobilize
halde kullanan, çeşitli gaz, iyon ve biyolojik maddelerin teşhisi, kantitatif tayini
ve
orijinal
sistemlerde
izlenmesi
amacıyla
geliştirilmiş
problardır.
Biyosensörler klinik tıpta teşhis ve tayin amacıyla, fermantasyon analizi ve
kontrolünde biyoloji, kimya, gıda endüstrisi, ziraat ve veterinerlikteki çeşitli
analizlerde, endüstriyel gaz ve sıvıların analizinde, çevre kirlenmesinin
izlenmesinde, patlayıcılar ve diğer askeri alanda kullanılmaktadır. En basit
tanımıyla biyolojik katalizör taşıyan sensörler olarak tanımlanır. Biyosensörler
canlılardaki
çeşitli
maddelerin
algılanmasını
mümkün
kılan
biyolojik
maddelerin birleştirilmesiyle ortaya çıkmıştır. Bu sistemler bir yandan biyolojik
17
sistemin yüksek seçimliliğini diğer yandan sensörlerin tayin duyarlılığını
birleştirmiş ve çok geniş uygulama alanı bulmuştur.
Biyosensörlerin yüksek spesifiklik yanında; renkli ve bulanık çözeltilerde
geniş bir konsantrasyon aralığında doğrudan ölçmeye olanak sağlamak gibi
üstünlükleri vardır. Fakat reseptör olarak adlandırılan biyobileşenlerin pH,
sıcaklık, iyon şiddeti gibi ortam koşullarından etkilenmesi biyosensörün raf
ömrünü azalttığından bir dezavantajdır [29].
2.4.1. Biyosensörlerin yapısı ve fonksiyonları
Biyosensör sistemi üç temel bileşenden meydana gelmektedir (Şekil 2.6).
Bunlar, seçici tanıma mekanizmasına sahip “biyomolekül, biyoajan” ve bu
biyoajanın incelenen madde ile etkileşimi sonucu oluşan fizikokimyasal
sinyalleri elektronik sinyallere dönüştürebilen “çevirici” ve “elektronik”
bölümlerdir. Bu bileşenlerden en önemlisi, tayin edilecek maddeye karşı son
derece seçimli fakat tersinir bir şekilde etkileşime giren, duyarlı biyolojik
ajandır. Bir başka deyişle biyosensörler, genellikle analizlenecek madde ile
seçimli bir şekilde etkileşime giren biyoaktif bir bileşenin, bu etkileşim sonucu
ortaya çıkan sinyali ileten bir iletici sistemle birleştirilmesi ve bunların bir
ölçüm sistemi ile kombinasyonuyla oluşturulurlar [28-29]. Şekilde bir
biyosensörün çalışma prensibi gösterilmiştir (Şekil 2.6).
18
Şekil 2.6. Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi
2.4.3. Biyobileşenler
Enzimler, mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar, nükleik
asitler ve biyolojik zarlar içine yerleştirilmiş kimyasal reseptörler sensörlerde
biyobileşen olarak kullanılırlar. Biyosensörlerin yapısında görev alan
biyobileşenler çoğu zaman biyoreseptör olarak adlandırılırlar. Biyoreseptörler
analizlenecek maddeyi dönüşüme uğratırlar ve bu dönüşüme eşlik eden
değişimler dönüştürücü tarafından algılanır. Yüksek spesifikliklerinden dolayı
enzimler en yaygın kullanılan biyoreseptörlerdir [29].
2.4.4. Algılayıcılar (Transduserler)
Transduserler, reseptörlerin biyolojik reaksiyonunu ölçülebilir fiziksel bir
sinyale dönüştürürler. Biyokimyasal reaksiyona göre algılayıcılar seçilir.
Elektrotlar amperometrik veya potansiyometrik ölçümlerde kullanılır ve
burada hedef analittir. (O2 elektrodunda çözünmüş O2, pH elektrodunda H+
iyonu gibi ) [29].
19
Algılayıcılar dört grupta toplanabilir;
1) Elektrokimyasal algılayıcılar
- Amperometrik esaslı
- Potansiyometrik esaslı
- Kondüktometrik esaslı
2) Optik algılayıcılar
- Absorbans ölçümünü temel alanlar
- Floresans veya fosforesans ölçümünü temel alanlar
- Kırılma indisini temel alanlar
3) Kütle değişimini temel alan algılayıcılar
4) Isı değişimini temel alan algılayıcılar
- Termistörler
Ölçülen madde türü, yayınlanan makale sayısı ve ticari olarak üretilen tür ve
sayılar dikkate alındığında, elektrokimyasal ölçüm bazlı sistemlerin diğer
sistemlere göre çok daha fazla ilgi gördüğü söylenebilir. Elektrokimyasal
algılayıcılardan
en
yaygın
olarak
kullanılanlar
amperometrik esaslı olanlardır [31].
Çizelge 2.1. Biyosensör algılayıcıları
ALGILAYICILAR
İyon seçimli elektrot
Gaz duyarlı elektrot
Alan etkili transistörler
Polarografik
Optoelektronik cihazlar
Termistörler
Kondüktometri
Piezoelektrik
ÖLÇÜM ESASI
Potansiyometrik
Potansiyometrik
Potansiyometrik
Amperometrik
Optik
Kalorimetrik
İletkenlik
Kütle değişimi
potansiyometrik
ve
20
2.4.5. Biyosensörlerin uygulama alanları
Biyosensörlerin,
klinik
teşhis,
tıbbi
uygulamalar,
süreç
denetleme,
biyoreaktörler, kalite kontrol, tarım ve veterinerlik, bakteriyel ve viral teşhis,
ilaç üretimi, endüstriyel atık su denetimi, madencilik, askeri savunma sanayi
gibi alanlarda yaygın olarak kullanımı söz konusudur [29].
Biyosensörler; gıda maddeleri, metabolitler, vitaminler, antibiyotikler, ilaçlar
gibi organik maddeler ile bazı anorganik bileşikler yanında enzimler, virüsler
ve mikroorganizmaların tayininde kullanılmaktadır [29].
Çizelge 2.2. Biyosensörler için uygulama alanları
Klinik teşhis, biyomedikal sektör
Proses kontrolü
Gıda üretim ve analizi
Biyoreaktör kontrolü
İlaç analizi
Tarım ve veterinerlik
Bakteri ve virüs teşhisi
Endüstriyel atık su kontrolü
Çevre koruma ve kirlilik kontrolü
Maden
Askeri uygulamalar
analizleri
işletmelerinde
zehirli
gaz
Hiç şüphesiz biyomedikal sektör biyosensörler için en iyi pazardır. Bu alanda
uygulama olanağı olan ilk biyosensörler enzim biyosensörleridir. Ticari olarak
üretilen ilk biyosensör ise şeker hastalığı teşhisi için kan ve idrarda glukoz
tayininde kullanılan glukoz oksidaz elektrodudur [29].
Son yıllarda tıbbi analizörlere enzim elektrodları takılarak yoğun bakım
ünitelerinde kullanılmaya başlanmıştır. Biyoteknoloji ve gıda endüstrisinde
başta glukoz olmak üzere birçok monosakkarit, aminoasitler, organik asitler
(laktik asit), üre ve alkol tayinlerinde enzim biyosensörleri kullanılmaktadır.
Ayrıca, gıdalardaki yabancı maddeler (pestisitler, toksinler ve hormonlar vb.)
yanında aroma ve tazelik gibi kompleks parametreler için de biyosensörler
kullanılabilir.
Toprak,
hava
ve
su
kirliliğinin
kontrolünde
mikrobiyal
21
biyosensörler ve enzim biyosensörleri kullanılmaktadır. İlaçların kötü amaçla
kullanımı ve uyuşturucu ile mücadelede biyosensörler kullanılabilecektir.
Böylece uyuşturucu madde arayan köpeklerin yerini biyosensörler alabilir ve
gümrüklerde, karakollarda zaman kazanılabilir [29].
2.4.6. Biyosensör hazırlanmasında dikkat edilmesi gerekenler
Biyosensör tasarımlarında önce biyosensörün hangi analiti tanıyacağı tespit
edilmelidir. Daha sonra aşağıda yer alan maddeler dikkate alınarak
biyosensörler dizaynı yapılmalıdır. Bunlar sırasıyla;
i.
Analite uygun biyoreseptörün seçimi,
ii.
Biyoreseptörü dönüştürücüye sabitlemede kullanılacak uygun ve
verimli immobilizasyon yönteminin belirlenmesi,
iii.
Biyoreseptörün analiti tanımasıyla oluşan kimyasal veya fiziksel sinyali
anlaşılabilir sinyal formuna dönüştürecek olan transduserin seçimi ve
dizaynı olarak sıralanabilir [32].
2.5. İletken Polimerler
Polimerik malzemeleri metallerden ayıran en önemli özellik yalıtkan
olmalarıdır. Bu özellik polimerik malzemelerin kullanımında birçok üstünlükler
sağlamaktadır. Fakat son yıllarda, elektrik akımını iletebilen yeni bir organik
polimer sınıfı geliştirilmiştir. Asetilen, pirol, tiyofen gibi çeşitli benzen
türevlerinden sentezlenen ve “organik metaller” olarak da bilinen bu
polimerler korozyon önleyici kaplama olarak, pillerde ve kararlılıklarına bağlı
olarak mikroelektronikte önemli bir potansiyele sahiptirler. Bu polimerler
arasında polipirol ve türevleri elektriksel özelliği, çevresel kararlılığı, kimyasal
ve elektrokimyasal sentezinin kolaylığından dolayı en yoğun şekilde
incelenen grubu oluşturur [33, 77].
22
İletken polimerler konusundaki
ilk çalışmalar 1950’lerde başlamıştır.
İletkenlikleri oda sıcaklığında 5-10 S/cm olan yarı iletken polimerler 19501960 yılları arasında üretilmiştir. Günümüzdeki anlayışa uygun iletken
polimerler 1970’lerin sonunda ortaya çıkmaya başlamıştır. Shirakawa
yöntemiyle elde edilen poliasetilenin bir yükseltgen ile dop edilmesi
sonucunda iletkenliğinin 108 kat arttığı görülmüştür [34].
İlk olarak elektrokimyasal polimerizasyon yöntemi 1900 yılında Szarvasy
tarafından yapılmıştır. İletkenlik konusunda en önemli adım 1979’da Diaz’ın
pirolü elektrokimyasal yöntemle yükseltgeyerek polipirolü elde etmesiyle
atılmıştır. Polipirol anot üzerinde üretilebilmiş ve güçlü bir film olarak
yüzeyden çıkarıldığında iletkenliği 100 S/cm’ye ulaşabilmiştir. Benzer şekilde,
elektroyükseltgenme
üretilebilmiştir.
yöntemiyle
Karbosol
elektrokimyasal
ve
iletken
indol
yöntemlerle
gibi
politiyofen,
aromatik
polimerler
üzerinde
anot
bileşiklerden
üretilmiştir.
de
Anilinin
elektroyükseltgenmesiyle anot yüzeyinde toz halde iletken polianilin elde
edilmiştir. Bazı iletken polimerler kimyasal yöntemlerle de üretilebilmektedir.
Örneğin pirol, Br2 veya AsF5 ile yükseltgendiğinde iletken polipirol elde
edilmiştir [34].
Polipirol
ve
türevleri
oksidasyonuyla
genellikle
hazırlanırlar.
pirolün
Pirolün
kimyasal
kimyasal
ve
elektrokimyasal
sentezi
yanı
sıra
elektrokimyasal sentezi de uzun yıllardan beri bilinen bir yöntemdir. Sulu ya
da susuz ortamda elektrokimyasal çalışma olasılığı kimyasal olarak
sentezlenen
polipirolden
daha
yüksek
iletkenlik
gösteren
filmler
sentezlenebilmesi ve elde edilen polimer filmin yarı iletkenlerin korozyonunu
azaltma avantajı elektrokimyasal senteze ilgiyi artırmıştır. Fakat elde edilen
polipirol sert ve kırılgandır ve bu zayıf mekanik özellikler onun uygulama
alanlarında kullanım potansiyelini de düşürmektedir. Polimerlerin iletkenliği
Çizelge 2.3’te verilmiştir. Poliasetilen yüksek iletkenliğe sahip olmasına
rağmen hava ve nem içerebilmesi nedeniyle ticari bir iletken polimer değildir.
23
Polipirol ve politiyofen, poliasetilene göre hava ortamında oldukça kararlı
olmaktadır [33].
İletken polimerlerin en önemli problemlerinden biri herhangi bir çözücüde
çözünememe problemidir. Son yıllarda bu çözünmeme problemi de bilinerek
yapısal modifikasyon olmadan polipirolün çözünebilme problemini çözmek
için sulu demirklorür çözeltisi, suda çözünebilen polimerizasyon sistemleri
araştırılmıştır. Fakat bu sistemlerde, metilselüloz, polivinilalkol, polivinil
pirolidon veya poliakrilamit gibi nötral polimerler kullanılarak polipirolün
kolloidal çözeltileri üretilmiştir [33].
İletken polimerlerin çözünme zorluğu onların antielektrostatik filmler,
elektronik pencereler, kimyasal sensörler,
şarj edilebilen piller gibi
uygulamalar için gerekli elektronik ve optik özelliklerini veren moleküler
karakteristikleri olan π-elektronik yapılarının delokalize π-elektronik yapı
onların yüksek elektronik polimerizasyonuna dolayısıyla zincir içinde yüksek
π-π etkileşmesine yol açmaktadır. Bu da polimerin çözünme yerine
agregasyonuna neden olmaktadır [33].
24
Çizelge 2.3. İletken polimerler ve iletkenlikleri
Polipirolün çözünmeme probleminin temeli bilindiğinden ilk akla gelen çözüm,
polimerin elektronik polarizebilitesini azaltmaktır. Bu yapısal modifikasyonla
yapılırsa polimer çözünebilir ama aynı zamanda tüm yararlı optik ve
elektronik özelliklerini kaybedebilmektedir. Bu nedenle son zamanlarda
üzerinde çalışılan çözüm, polimerin başka bir polimer ile kompleksini
oluşturmaktır [33,39].
25
Lineer polimerlerin intermoleküler kompleksleri zıt yüklerin etkileşmesi
hidrojen ve hidrofobik bağların oluşumu ya da metal iyonlar yoluyla
etkileşerek çözünen veya çözünmeyen çoklu kompleks oluşturmak üzere
sentez edilebilmektedirler [33].
2.5.1. Pirol
Pirol’ün kaynama noktası 130oC, yoğunluğu 0,948 g/mL ve kokulu renksiz bir
sıvıdır. Mineral asitleriyle hızlıca polimerleşmektedir. Pirol aromatik bileşiktir
ve deneysel rezonans enerjisi 22-27 kcal/mol’dür [33].
Şekil 2.7. Pirolün aktif noktaları
Pirol 2 veya 5 pozisyonunda gruplar atak yapabilir. Pirolün heterosiklik azot
grubu zayıf bazik özelliktedir. Pirol suda az çözünmektedir fakat organik
çözücülerde çok miktarda çözünmektedir. Pirol alkali iyonlarla çözünmez
polimerizasyonla birlikte asit içinde yavaş çözünme göstermektedir [33,39].
2.5.2. Elektrokimyasal polimerleşme mekanizması
Elektronik iletken polipirol filmlerinin oluşumu anodik olarak asetonitrilin
yükseltgenmesi ile ilk olarak Diaz tarafından yapılmıştır. Çözücü, elektrolit,
fonksiyonel gruplar, elektrot potansiyeli ve diğer özelliklerin değiştirilmesiyle
literatürde oldukça fazla miktarda çalışma bulunmaktadır ama polimerizasyon
mekanizmasını anlamak uzun sürmüştür [33,39].
26
Polipirolün
elektrokimyasal
polimerleşme
mekanizması
Şekil
2.8’de
verilmektedir. Reaksiyon sulu veya susuz çözeltilerde ve oksijensiz
ortamlarda anodik indirgenme ile başlamaktadır ve devam eder. Polipirol
kimyasal olarak da üretilebilir. Şekil 2.8’ de görüldüğü gibi radikal katyonlar
dimerleşip tekrar yükseltgenmekte veya başka monomere katılıp sonra
yükseltgenmektedir. Oluşan dikatyon iki proton kaybederek nötürleştikten
sonra yükseltgenme ile başlayan basamağa tekrar dönmekte ve bu
mekanizma polimerleşme duruncaya kadar tekrarlanmaktadır. Elde edilen
polimerin yapısı, mol kütlesi, iletkenliği ve fiziksel dayanıklılığı deney
koşullarına göre farklılık gösterir. Çözücü olarak genellikle dielektrik sabiti
yüksek olan ancak nükleofilik karakter göstermeyen organik çözücüler tercih
edilir. Anot olarak platin levha, camsı karbon veya indiyum kalay oksit (ITO)
camı kullanılır. Elektrolitlerin yüksek potansiyellerde bozunmaması istenir ve
tetra alkillerin BF4 - veya CIO4- tuzları tercih edilir. Bu anyonlar polimerler için
en uygun dopantlardır. Anot potansiyelinin de aşırı yükseltgenmeye sebep
olmayacak şekilde düşük tutulması gerekir. Aşırı yükseltgenen polimerin ana
zincirindeki konjuge çift bağlar kırılırsa konjugasyon kesintiye uğrar ve
iletkenlik düşer. Örneğin polipirol sulu çözeltide Ag/AgCl referans elektroduna
göre +0,8 volttan daha yüksek potansiyellerde aşırı oksitlenerek iletkenliğini
kaybedebilir [34,39].
27
Şekil 2.8. Pirolün elektrokimyasal polimerleşme mekanizması
Elektrokimyasal sentez, basitliği ve yeniden üretilebilmesinden dolayı, elektrik
iletken polimerlerin sentezi için hızla genel bir yöntem olarak kabul görmeye
başlamıştır. Elektrokimyasal sentezin oda sıcaklığında gerçekleşebilmesi de
onun önemli bir avantajıdır. Hem potansiyel hem de akım zamanla
değiştirilerek film kalınlığı da kontrol edilebilmektedir. İletken polimerlerin
elektrokimyasal polimerizasyonu genellikle şu yöntemler ile yapılmaktadır: (1)
Akıma karşı (galvanostatik), (2) Potansiyele karşı (potansiyostatik) ya da (3)
potansiyel taraması. Standart elektrokimyasal teknikte (hücre içerisinde
çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrotdan oluşan üçlü elektrot
sistemi) genellikle en iyi filmler elde edilmektedir. Elektrokimyasal sentez
28
homojen
bir
monomerle
yapılabildiği
gibi,
kopolimerizasyonla
da
yapılabilmektedir. Poliazulen, politiyofen, polianilin, polipirol gibi bazı filmler
bu yolla senetezenebilmiştir [35].
2.6. İletken polimerlerle enzim immobilizasyonu
Elektrokimyasal polimerizasyon teknikleri kullanarak işlevselleştirilmiş ve
değiştirilmiş elektrot yüzeyleri elde edilmesi yöntemi, elektrot yüzeylerinde
biyolojik tanımlama öğelerinin immobilizasyonu için uygulanabilmektedir [29].
İletken
polimerler
elektrotların
elektroanalitik
uygulamalarında,
enzim
immobilizasyonuna sıklıkla rastlanılmaktadır. Çizelge 2.4’de görüldüğü gibi
enzim kullanılan biyosensörlerin geniş bir uygulama alanı bulunmaktadır [34].
Çizelge 2.4. İletken polimerlerin kullanıldığı biyosensörler
Substrat
D-Alanin
Atrazin
Kolesterol
Kolin
Dopamin
Galaktoz
Glutamat
Fruktoz
Hemoglobin
Hidrojen peroksit
Lipitler
NADH
Ürik asit
Trigliseritler
Enzim
D-Aminoasit oksidaz
Tirozinaz
Kolesterol oksidaz
Kolesterol oksidaz ve
Kolesterol esteraz
Kolin oksidaz
Tirosinaz
Galaktoz oksidaz
Glutamat
Dehidrojenaz
Fruktoz dehidrojenaz
Pepsin
Peroksidaz
Lipaz
NADH dehidrojenaz
Ürikaz
Lipaz
Polimer
Polipirol
Polipirol
PPD
Polipirol
Tayin yöntemi
Amperometri
Amperometri
Amperometri
Amperometri
Polipirol
Polipirol
Polianilin
Polipirol
Polipirol
Polianilin
Polipirol
Polianilin
Polipirol
Polipirol
Polianilin
Polianilin
Amperometri
Amperometri
Amperometri
Amperometri
Kondüktometri
Amperometri
Amperometri
Amperometri
Amperometri
Kondüktometri
Kondüktometri
29
2.6.1. Biyobileşen İmmobilizasyonu
Biyosensörler farklı özellikteki iki elemanın (dönüştürücü ve biyobileşen)
kombinasyonu ile oluşmaktadırlar. Uygun biyoreseptör ve dönüştürücü
seçildikten sonra bunların birbirine bağlanması aşılması gereken en önemli
sorundur.
Bu
bağlama
tanımlanmaktadır.
işlemi
biyoreseptör
Bağlama
işleminde
immobilizasyonu
çok
değişik
olarak
yöntemler
kullanılabilmektedir. Hangi yöntemin kullanılacağı seçilen dönüştürücü ve
biyoreseptöre
göre
belirlenmektedir.
İmmobilizasyon,
biyoreseptörün
kararlılığı ve tekrar kullanımı açısından büyük avantaj sağlamaktadır [36].
2.6.2. Enzim immobilizasyon yöntemleri
Enzimin, elektrot yüzeyine yüksek aktivite ile ince tabaka içerisine fiziksel
olarak
yerleştirilmesi
kovalent
ve
kovalent
olmayan
yöntemlerle
gerçekleştirilir. Basitçe immobilizasyon, serbest haldeki enzimi elektrot
yüzeyinde
yarı
geçirgen
bir
membran
kullanarak
tutmak
suretiyle
gerçekleştirilir. Elde edilen elektrot, çoğunlukla kötü kararlılık gösterir ve fazla
miktarda enzime gereksinim duyar.
İmmobilize enzimlerin serbest enzimlere üstünlükleri şöyle sıralanabilir;
-Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifüjleme
gibi ) ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz.
- Çevre koşullarına (pH, sıcaklık vb.) karşı daha dayanıklıdır.
- Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir.
- Sürekli işlemlere uygulanabilir.
- Serbest enzime kıyasla daha kararlıdır.
- Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir.
- Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur.
- Bazı durumlarda, serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir.
- Enzimin kendi kendini parçalaması olasılığı azalır.
- Mekanistik çalışmalar için uygundur.
30
Çizelge 2.5’de enzim immobilizasyon yöntemleri şematik olarak gösterilmiştir.
Çizelge 2.5. Enzim immobilizasyon yöntemleri
Fiziksel veya kimyasal olarak immobilize edilen enzimler, daha iyi bir stabilite
gösterir
ve
diğer
maddelerle
etkileşimi
daha
azdır.
Tercih
edilen
immobilizasyon yöntemleri aşağıdaki gibidir;
Taşıyıcıya Bağlama Yöntemleri
Taşıyıcıya bağlamada bir protein olan enzim molekülünün yapısından
yararlanılır. Molekül yüzeyindeki fonksiyonel gruplar, iyonik gruplar ve
hidrofobik bölgeler bu bağlamada rol alırlar.
Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcılar reaktif değil ise yardımcı
bir reaktif ile aktivite edilmeleri gerekir. İmmobilizasyon işlemi, çok yumuşak
koşullarda (oda sıcaklığı, nötral pH vb.) gerçekleştirilmelidir. Taşıyıcı suda
çözünmemeli ama büyük ölçüde hidrofobik karakterli de olmamalı, suda
ıslanabilmeli ve ayrıca mekanik kararlı olmalıdır. Bu tür taşıyıcıların
seçiminde, enzim-taşıyıcı bağının aktivite için zorunlu gruplar üzerinden
31
olmaması
yanında,
taşıyıcının
enzim
tarafından
parçalanmaması,
mikroorganizma üremesine olanak vermemesi, pH ve çözücülere karşı
dayanıklı olması gibi özellikler taşımasına dikkat edilir.
Kovalent bağlama
Enzimlerin reaktif taşıyıcılara kovalent bağlanması genelde sulu ortamda
gerçekleştirilir. Reaktif taşıyıcıda ve enzimde bulunup enzimin bağlanmasını
sağlayan fonksiyonel gruplar Çizelge 2.6’ daki gibidir.
Çizelge 2.6. Enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar
Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanmasında dikkat edilecek önemli nokta,
bağlanmanın enzim aktivitesi için zorunlu gruplar üzerinden olmaması ve
bağlanma sırasındaki sterik engellemeler nedeni ile bu grupların rahatsız
edilmemesidir.
Taşıyıcıya
kovalent
bağlanma
enzimin
aminoasitlerin taşıdığı fonksiyonel gruplar üzerinden gerçekleşir.
Şekil 2.9. Kovalent bağlama
zincirindeki
32
Adsorpsiyon
Enzim immobilizasyonunda kullanılan en eski ve en basit yöntemdir.
Proteinler ve özellikle enzimlerin katı yüzeylerde adsorpsiyonu detaylı şekilde
araştırılmıştır. Adsorpsiyonun asıl amacı enzim immobilizasyonu olmayıp,
enzim saflaştırmaktı ancak suda çözünmeyen taşıyıcılarda adsorpsiyon
yönteminin enzim immobilizasyonunda oldukça sık kullanıldığını görmekteyiz.
Yöntem, yüzey aktif suda çözünmeyen bir adsorbanın enzim çözeltisi ile
karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice yıkanarak uzaklaştırılması temeline
dayanır. Taşıyıcıya bağlanmada etkin olan Van der Walls kuvvetleridir.
Adsorbanlar
çok
değişik
türde
olmakla
birlikte
iyi
bir
adsorpsiyon
sağlayabilmek için genellikle adsorbanın bir ön işlemden geçirilmesi gerekir.
Enzim immobilizasyonunda en sık kullanılan adsorbanlar; aktif karbon,
gözenekli cam, diatome toprağı, CaCO3, kül, silikajel, bentonit, hidroksiapatit,
nişasta, gluten ve kalsiyum fosfattır.
Bir enzimin suda çözünmeyen taşıyıcıda adsorpsiyonu pH, çözücü, iyon
şiddeti, enzim-adsorban oranı ve sıcaklık gibi faktörlere bağımlıdır. Bu
faktörlerin araştırılması, adsorpsiyon ve aktivitenin önemli ölçüde geri
kazanılması için en iyi koşulların saptanması çok önemlidir. Adsorpsiyon
mekanizması genellikle çok karışık olup, birçok olasılıktan hangisinin
gerçekleşeceğinin önceden saptanması güçtür.
Prensip olarak, bir proteinin aktif yüzeylerde adsorpsiyonu tersinir bir işlem
olmalıdır. Ancak bazı durumlarda (örneğin; kolenitte adsorplanmış üreaz)
tersinir olmayan adsorpsiyon söz konusu olabilmektedir. Eğer aktivite sabit
kalıyor ve immobilize enzim sürekli işlemlerde kullanılabiliyorsa bu tür
adsorpsiyon enzim immobilizasyonu için idealdir. Desorpsiyon, reaksiyon
ürünlerinin kirlenmesine ve aktivitede sürekli bir değişmeye neden olur.
Tersinir adsorpsiyonlar enzim immobilizasyonu için pek uygun değildir.
33
Bazı adsorbanlar bir enzimin farklı biçimlerini, aktif ya da inaktif biçimlerinden
birini adsorbe ederken diğerini desorbe etmektedir. Eğer enzimin aktif şekli
desorbe edilirse bazı durumlarda immobilize enzimin bağıl aktivitesi yüzde
100’den büyük değerler alır, tersi durumda bağıl aktivite sıfır olur yani
immobilizasyon ürünü hiç aktivite göstermemektedir.
Yöntemin yararları; enzimin immobilizasyon işleminin basit oluşu, değişik
biçim ve yükteki taşıyıcıları seçme olanağı vermesi ve bir yandan
immobilizasyonu gerçekleştirirken diğer yandan enzim saflaştırılmasına
olanak sağlamasıdır. Yöntemin sakıncaları; her ne kadar immobilizasyon
işlemi kolay olsada optimal koşulların saptanması çok güçtür. Eğer enzim ile
taşıyıcı arasında kuvvetli bir bağlanma yok ise bu durumda desorpsiyon
sonucu enzim serbest halde reaksiyon ortamına geçer ve ürünlerin
kirlenmesine neden olur.
Şekil 2.10. Adsorpsiyon
İyonik bağlama
Bu yöntem, iyon değiştirme yeteneğine sahip suda çözünmeyen taşıyıcılara
enzimin iyonik bağlanması temeline dayanır. Bazı durumlarda iyonik bağlama
yanında fiziksel adsorpsiyon da etkili olmaktadır.
İyonik
bağlama
çok
yumuşak
koşullarda
gerçekleştiğinden,
enzimin
konformasyonunda ve aktif merkezinde değişikliğe neden olmaz. Ancak;
34
enzim ile taşıyıcı arasındaki bağ kovalent bağ kadar güçlü olmadığından
enzim kaçısı söz konusudur.
Şekil 2.11.İyonik bağlama
Şelat bağlama
Bazı transizyon metallerinin şelat yapma özellikleri sayesinde enzimlerin
organik ve inorganik taşıyıcılara bağlanması mümkündür. Yöntem ilk kez
1971 yılında uygulanmaya başlamış daha sonra da kullanılmaya devam
edilmiştir.
Biyospesifik bağlama
Enzimler ile antikorlar ve lektinler arasındaki biyospesifik etkileşimden
yararlanılarak
enzim
immobilize
edilebilir.
Lektinler,
kendine
özgü
karbonhidrat atıklarını içeren enzimlere kuvvetlice bağlanırlar. Örneğin bu
yöntem ile immobilize edilen invertaz, sakkarozun kesiksiz inversiyonunda
kullanılmıştır. Spesifik monoklonal antikorları suda çözünmeyen materyale
bağlayarak hazırlanan taşıyıcılar enzim immobilizasyonunda başarılı biçimde
kullanılmaktadır.
35
Çapraz Bağlama Yöntemleri
Küçük moleküllü, bi veya multi fonksiyonel reaktifler enzim molekülleri
arasında kovalent bağlar yaparak sonuçta suda çözünmeyen komplekslerin
oluşmasını sağlarlar. Çapraz bağlanma derecesi ve immobilizasyon, protein
ve reaktif derişimine, pH ya da immobilize edilecek enzime çok bağımlıdır.
Moleküller arası bağlanmalar yanında, molekül içi bağlanmalar da söz
konusudur.
Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu 4 farklı şekilde gerçeklesir:
- Enzimin yalnız bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu
- Enzimin ikinci bir protein varlığında bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu
- Enzimin suda çözünen bir taşıyıcıda adsorpsiyonundan sonra bifonksiyonel
reaktif ile reaksiyonu
- Enzimin bifonksiyonel reaktif tarafından aktive edilmiş polimer taşıyıcı ile
reaksiyonu
En çok kullanılan çapraz bağlama reaktifleri; gluteraldehit, kloroformat ve
karbonildiimidazol, heterosiklik halojenürler, bioksiranlar, divinilsülfonlar,
pbenzokinon, transizyon metal iyonları ve epiklorhidrinlerdir.
Çapraz bağlama reaksiyonu çok yumuşak koşullarda gerçekleşmediğinden
bazı durumlarda önemli ölçüde aktivite kaybı söz konusudur. Enzimler bu
şekilde birbirlerine bağlandıklarında jelatinimsi bir yapı oluştururlar, bu
nedenle mekanik bakımdan çok kararsızlardır. Çok sayıda enzimin diğer
enzimler için matriks olarak davranmasından dolayı bu yöntem iyi bir
immobilizasyon yöntemi değildir.
36
Şekil 2.12.Çapraz bağlama
Kopolimerizasyon yöntemleri
Enzimler bir kopolimerizasyon reaksiyonunda monomerlerden biri gibi
davranır ve polimer matrikse bağlanmış olur. Yöntem, polimer matrikse
tutuklamaya benzemekle birlikte enzim kaçısının önlenmesi gibi üstünlüğü
vardır.
Tutuklama Yöntemleri
Tutuklama yöntemi prensip olarak enzim molekülünü belirli bir ortamda
durmaya zorlamaktır. Enzim bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Bu
işlem, polimer matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi yarı
geçirgen membranlar içinde mikrokapsülleme ile de gerçekleştirilebilir. Bu
yöntemi kovalent bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan ayıran
en önemli özellik; enzim molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi
bir taşıyıcıya bağlanmış olmamasıdır.
Polimer matrikste tutuklama
Polimerizasyon ve çapraz bağlamanın oluştuğu ortamda enzimin de
bulunduğu takdirde enzim, çapraz bağlama sonucu oluşan odacıklarda
(kafes) tutuklanmaktadır. Bu amaçla en çok kullanılan polimer; N,N’metilenbisakrilamid ile çapraz bağlanmış poliakrilamiddir.
37
Yöntem, yüksek derece çapraz bağlı bir polimerin enzim çözeltisi içinde
oluşturulması temeline dayanır. Polimerleşme sonucu enzim molekülleri
çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece ana çözeltiye geçmeleri
engellenmektedir.
Uygun çaplı substrat molekülleri polimer kafes içinde tutuklanmış enzim
moleküllerine ulaşır ve reaksiyon ürünleri de dışarı çıkar. Bu yöntemde
kullanılacak
substratın
küçük
moleküllü
olması
gerekir.
Bu
tip
immobilizasyon, ilk kez 1963 yılında tripsin, kimotripsin ve diğer enzimlerin
immobilizasyonunda kullanılmıştır.
Molekül
kütlesi
15
000’den
fazla
olan
enzimlerin
bu
yöntem
ile
immobilizasyonları oldukça kolaydır. Bu tür immobilizasyon işleminde en çok
kullanılan taşıyıcılar; hidrofilik temele dayalı poliakrilamid jeli ve jel oluşturan
polisakkaritlerdir. Ayrıca silikon lastiği ve silikajel de kullanılmaktadır.
Tutuklama yanında özellikle yüklü polimerlerde fiziksel adsorpsiyonun da
etkin olduğu saptanmıştır. Polimer zincirleri arasındaki çapraz bağlama
değişik bifonksiyonel veya multifonksiyonel reaktiflerle sağlanmaktadır.
Örneğin, bu yöntemle enzim immobilizasyonunda en çok kullanılan taşıyıcı
olan
poliakrilamidin
çapraşık
bağlanması
N,N’-metilenbisakrilamid
ile
gerçekleştirilir.
Çapraz bağlı taşıyıcıların hazırlanmasında, monomer ve çapraz bağlayıcı
reaktiflerin mol oranları çok önemlidir. Bu durum bir yandan enzim
moleküllerinin tutuklanacağı hücrelerin çapına etki ederken, diğer yandan
taşıyıcının fiziksel özelliklerinde önemli değişmelere de neden olacaktır.
Bu yöntem ile immobilize edilen enzimin asıl özelliklerinde bir değişme
beklenmez. Fakat taşıyıcının tipi ve enzimatik reaksiyonlar bölgesel mikro
çevre etkilerinin oluşmasına neden olurlar. Örneğin, taşıyıcının yüklü olması
önemli bir etkendir. Taşıyıcının yüklü olması immobilize enzimin özelliklerinde
serbest enzime kıyasla çok önemli değişmelere neden olmaktadır.
38
Bu yöntemin yararları; çok kolay uygulanması, gerçek bir fiziksel yöntem
olması ve çok az miktarlarda enzim kullanılarak gerçekleştirilmesidir. Nötral,
suda çözünmeyen taşıyıcılarla da immobilizasyon gerçekleştirilmekte ve
kimyasal
bir
bağlanma
olmadığından
yüklü
taşıyıcıya
gerek
duyulmamaktadır.
Yöntemin sakıncaları ise; immobilizasyon işlemi sırasında inaktivasyonun
deney koşullarına çok sıkı bağımlı oluşu ve immobilize enzimin ancak küçük
moleküllü substratlara karşı iyi bir aktivite göstermesidir.
Şekil 2.13. Polimer matrikste tutuklama
Mikrokapsülleme
Bu yöntem enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran içinde
tutuklanmasından ibarettir. Mikrokapsüllerin büyüklüğü 1-100 μm arasında
değişir. Enzimler daha çok kimyasal mikrokapsülleme ile immobilize edilir. Bu
yöntem ile enzim immobilizasyonu; sürekli ve sürekli olmayan yarı geçirgen
membran mikrokapsüllerde tutuklama olmak üzere iki grupta incelenebilir.
Sürekli mikrokapsüllerde çerçeve membran katı, süreksiz mikrokapsüllerde
lipozomlar ise bir sıvı tabakadır. İmmobilizasyonda kullanılan çerçeve
maddesinin (membran) yarı geçirgen olması zorunludur. Ayrıca bu yarı
geçirgen membranın gözenek çapları; substrat moleküllerinin kapsül içine
girişine ve ürün moleküllerinin dışarı çıkışına olanak verecek büyüklükte
olmalıdır. Substrat molekülleri ne kadar küçük ise bu yöntem ile immobilize
edilmiş enzimin verimliliği o ölçüde yüksek olacaktır [40].
39
Şekil 2.14. Mikrokapsülleme
2.7. Enzim Sensörleri
Enzim biyosensörleri hedef analit derişimi ile orantılı sinyal üreten analitik
cihazlara verilen genel addır. Enzim biyosensörleri söz konusu sinyali
üretirken enzim ve dönüştürücüleri birlikte kullanmaktadır. Bu sinyal
reaksiyonu katalizleyen enzim tarafından proton derişimindeki değişim,
oksijen veya amonyak gazı gibi gazların açığa çıkması ya da geri alınımı, ışık
emisyonu, absorpsiyon veya yansıtıcısı emisyonu ve benzer olaylar ile
oluşmaktadır. Dönüştürücü, bu sinyali akım, potansiyel, sıcaklık değişimi,
elektrokimyasal ışık absorpsiyonu, termal veya optik ölçülebilir cevaplara
dönüştürmektedir [38].
Biyosensör
teknolojisindeki
ilk
örnekler
özellikle
amperometrik
ve
potansiyometrik temelli enzim elektrotları şeklinde ortaya çıkmışlardır. Bu
durumun en önemli nedeni o tarihteki bilgi ve teknolojik birikimin söz konusu
çalışmalar için yeterli düzeye ulaşmış olmasıdır. Biyosensör teknolojisinde
kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri Şekil 2.15’de
verilmiştir [38].
40
Şekil 2.15. Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal
sıralamasında enzimlerin yeri
Biyosensör geliştirmek amacı ile oksidoredüktaz, hidrolaz ve liyaz grubuna ait
çeşitli enzimler dönüştürücülerle birleştirilerek sağlık hizmetlerinde, ilaçlarda,
gıda endüstrisinde, çevresel izlemelerde ve koruma gibi uygulama
alanlarında kullanılmaktadır [38].
2.7.1. Genel çalışma ilkesi
Enzim sensörleri, biyobileşen olarak enzimin kullanıldığı iletici ve ölçme
sisteminden
oluşmaktadır.
Diğer
biyosensörlerde
olduğu
gibi
enzim
sensörlerinde de biyoaktif tabakanın iç ve dış yüzeylerinde zarlar, sinyali
yükselticiler, mikro işlemciler, kaydedici veya bilgisayar sistemleri amaca
yönelik olarak kullanılabilmektedir. Bir enzim sensörünün genel gösterimi
Şekil 2.16’da verilmiştir [38].
41
Şekil 2.16. Enzim sensörlerinin genel şematik gösterimi
Bir enzim elektrodunda enzimi içeren biyoaktif tabaka, enzimin katalizlediği
reaksiyona uygun bir iletim ve ölçüm sisteminin uzantısı olan bir iletici ile
birleştirilmektedir. İletim sistemi biyoaktif tabakada gerçekleşen enzimatik
reaksiyon sonucu oluşan ürünün miktarındaki artışı tespit edebilecek şekilde
seçilmelidir. Biyoaktif tabakadaki ve biyoaktif tabaka iletici ara yüzeyindeki
derişimlerin hızlı bir şekilde dengeye ulaşabilmesi için difüzyon engelini en
aza indirmek amacıyla biyoaktif tabaka kalınlığının mümkün olduğunca ince
olması gerekmektedir. Bunun yanı sıra biyoaktif tabakada sabit bir substrat
derişimi sağlayabilmek için ölçme çözeltisinin yeterli bir sürede karıştırılması
gerekmektedir. İletici sistemin ölçme sistemine gönderdiği sinyal biyoaktif
tabaka ile iletici ara yüzeyindeki derişimlerdeki değişikliğe bağlıdır. Ancak söz
konusu derişimler denge halinde ölçme çözeltisindeki derişimlerle orantılı
olduğundan
dolayı
çoğunlukla
kalibrasyon
grafiği
çizilerek
sonuca
varılmaktadır [38].
2.7.2. Enzim sensörlerinin sınıflandırılması
Enzimatik sensörlerin sınıflandırılması en yaygın olarak, enzimatik reaksiyon
sonucu oluşan sinyalin belirlenme ilkesine göre yapılmaktadır (Çizelge 2.7)
[38].
42
Çizelge 2.7. Enzim sensörlerinin sınıflandırılması
1. Elektrokimyasal Esaslı Enzim Sensörleri
a. Amperometrik esaslı enzim sensörleri
-
Birinci nesil amperometrik enzim elektrotları
-
İkinci nesil amperometrik enzim elektrotları
-
Üçüncü nesil amperometrik enzim elektrotları
b. Potansiyometrik esaslı enzim sensörleri
-
Proton duyar potansiyometrik enzim elektrotları
-
Amonyum duyar potansiyometrik enzim elektrotları
-
Karbondioksit duyar potansiyometrik enzim elektrotları
-
Diğer iyon duyar potamsiyometrik enzim elektrotları
c. Yarı iletkenleri esas alan enzim sensörler,
-
Enzim alan etki transistörleri (ENFET)
2. Optik esaslı enzim sensörleri;
a.
Absorpsiyon esaslı optik enzim sensörleri
b.
Flouresans esaslı optik enzim sensörleri
c.
Biyoluminesans esaslı optik enzim sensörleri
3. Kalorimetrik esaslı enzim sensörleri
4. Piezoeleketrik esaslı enzim sensörleri
2.7.3. Amperometrik enzim elektrotlar
Amperometri sabit bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü esas alır.
Sinyal, elektrot yüzeyine kütle aktarım hızına bağlıdır. Elektroaktif bir ürünün
salınıvermesi veya reaktifin biyokatalitik reaksiyona bağlı olarak tüketimi
platin gibi inert bir çalışma elektrodunda doğrudan izlenebilir. İkinci elektrot
referans elektrot olarak iş görür. Şekil 2.17 ’de amperometrik esaslı bir enzim
sensörünün şeması verilmiştir.
43
Şekil 2.17. Amperometrik esaslı bir enzim sensörünün şematik gösterimi
İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda
potansiyometrik sensörden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün
elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar
aşağıda verilmiştir:
Katodik reaksiyon;
O2
+
2H2O + 2e -
H2O2 + 2e-
H2O2 + 2OH 2OH -
Anodik reaksiyon;
Ag(k ) + Cl-
AgCI(k) + e-
Toplam reaksiyon;
4Ag( k ) + O2 + 2H2O + 4Cl-
4AgCl(k) + 4OH-
Sinyal oluşturan türün sensör yüzeyinde tüketilmesi sebebiyle, iletici ile
biyoaktif tabaka ara yüzeyindeki ürün derişiminin sıfır olduğu varsayılır. Bu
44
nedenlerden dolayı, amperometrik enzim sensörlerinde denge durumundaki
reaksiyon hızı, enzim içeren biyoaktif tabakanın bir yarı geçirgen membranla
çevrelenmiş olduğu koşulda, substratın söz konusu membrandan difüzyon
hızına eşittir [29].
Bir elektrot tepkimesinin hızı;
i)
çözeltiden elektrot yüzeyine doğru akan kütle transfer (difüzyon)
hızına
ii)
tepkimeye girecek olan maddenin bir kimyasal tepkime ile oluştuğu
durumlarda çözelti tepkimesinin hızına
iii)
adsorplanan türler olması durumunda, yüzeye tutunma ve yüzeyden
koparak çözeltiye geçme hızına
iv)
elektrot yüzeyindeki madde ile elektrot arasındaki yük aktarımı yani
elektron aktarım hızına bağlıdır. Bu ise tepkimeye giren madde türüne,
derişimine, elektrot malzemesinin türüne ve uygulanan gerilime
bağlıdır.
2.8. Performans Faktörleri
Hazırlanan biyosensörün hedeflenen amaçlar çerçevesinde kullanılabilir olup
olmadığına
ancak
performans
faktörlerinin
ayrıntılı
bir
şekilde
belirlenmesinden sonra karar verilebilir.
2.8.1. Seçicilik
Biyosensörün kompleks bir matriks içerisinde tek başına analitik bir ölçüm
cihazı olarak kullanılabilmesini sağlamaktadır. Seçiciliğin yeterli olmadığı
durumlarda çalışma prosedürüne bu eksiği giderecek ek işlemler eklenmesi
gerekmektedir.
Seçiciliğin
zayıf
olmasından
biyosensörün kullanımını zorlaştırmaktadır.
kaynaklanan
sorunlar
45
2.7.2. Kullanım ömrü
Biyolojik çevirici olarak enzim kullanıldığı durumlarda enzim aktivitesindeki
azalma kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktördür. Enzimin yaşam
süresi, biyosensörün raf ömrü yanı sıra kalibrasyon sıklığı, kararlılık,
tekrarlanabilirlik gibi parametreleri de etkilemektedir.
2.7.3. Kalibrasyon gereksinmesi
İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması veya en az
kalibrasyona gerek duyması istenmektedir. Ancak teorikte planlanan bu
özellik pratikte günümüzde gerçekleştirilememiştir. Biyosensörlerin raf
ömürleri
boyunca
sıkça
veya
belirli
aralıklarla
kalibre
edilerek
duyarlılıklarından bir şey kaybedip kaybetmedikleri incelenmektedir.
2.7.4. Tekrarlanabilirlik
İdeal bir biyosensör elektrodunun aynı derişimde veya aynı özelliklere sahip
birden fazla örneğe daldırılmasıyla yapılan deneylerde aynı sonuçların
okunması gerekmektedir. Tekrarlanabilirlik değeri ne kadar iyi olursa o
biyosensör uygulaması da o kadar iyi olur.
2.7.5. Kararlılık
Elektrot kararlılığının yüksek olduğu durumlar ideal biyosensörler için
gereklidir. Kararlılık, kullanılan enzimin fiziksel dayanıklılığından etkilendiği
gibi; pH, ısı, nem, ortam O2 derişimi, enzimi immobilize etmek için kullanılan
polimerin
kimyasal
etkilenebilmektedir.
ve
fiziksel
karakteri
gibi
parametrelerden
de
46
2.7.6. Yüksek duyarlılık
Hazırlanan elektroda immobilize edilmiş olan enzim; yalnızca belirli
maddelere (substratlara) karşı duyarlı olmalıdır. Duyarlılık, akım-derişim
eğrisinin eğimi ile orantılıdır. Eğim değeri büyüdükçe duyarlılıkta da artış
gözlenmektedir. Kullanılan enzimin substratları dışında biyosensörlerin
girişim yapan maddelerden etkilenmemesi istenmektedir.
2.7.7. Yeterli düzeyde tayin sınırı
Tasarlanan biyosensörün ideal tanımına uyması için tayin sınırının belirli bir
derişim değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu tayin sınırı
elektrot yüzeyinin büyüklüğü, enzimin tayin edilecek maddeye karşı olan
ilgisi, immobilize edilen enzim miktarı, enzim immobilizasyonunda kullanılan
polimer tabakasının kalınlığı gibi faktörlerden etkilenmektedir.
2.7.8. Geniş ölçüm aralığı
Ölçüm aralığı denen bölge, biyosensörden elde edilen akım-derişim
eğrilerinin
doğrusal
olduğu
derişim
aralığıdır.
Tüm
biyosensör
uygulamalarında çalışma ortamında belirli bir derişim değerine ulaşıldıktan
sonra
akım-derişim
eğrilerinde
doğrusallıktan
sapma
gözlenmeye
başlamaktadır. Bu durum enzimatik eğrilerin en önemli ve karakteristik bir
özelliğidir. Doğrusallıktan sapmanın nedeni yanıt olarak okunan akım
değerlerindeki değişimin azalmasından kaynaklanmaktadır. Bunun nedeni ise
ortamda artan analizlenecek madde miktarının fazlası ile reaksiyona girecek
enzim olmamasıdır.
2.7.9. Hızlı cevap zamanı
Amperometrik uygulamalarda analizlenecek bir madde örneğini çalışma
ortamına eklemeden önce elektrot yüzeyinde oluşan akımın sabit kalması
47
istenmektedir. Akım sabit kaldıktan sonra analizlenecek madde ortama
eklenir ve akımdaki değişim kaydedilir. İkinci bir eklemeden önce akım
değerinin yine sabit kalması beklenmektedir. İşte ilk eklemeden sonra akımın
tekrar sabit kalmasına kadar geçen zamana ‘cevap zamanı’ denir. Cevap
zamanının kısa ya da hızlı olması ideal biyosensörlerin özelliklerindendir.
2.7.10. Basitlik ve ucuzluk
Kullanımı, tasarımı basit ve ucuz biyosensörler hazırlamak biyosensör
yapımında her zaman hedeflenmiş bir düşüncedir. Biyosensör yapılarının
basitleştirilmesine en iyi örnek ikinci kuşak biyosensörlerin yapılarında
bulunan
medyatörlerin
daha
gelişmiş
modeller
olan
üçüncü
kuşak
biyosensörlerde ortadan kaldırılmasıdır [41].
2.8. Kaynak Araştırması
Muhammet ve arkadaşları, kolesterol tayini için yeni bir biyosensör
geliştirmişlerdir. Bu amaçla sülfürik asit ortamında pirolün ve anilinin
elektropolimerleşmesiyle platin/polianilin-polipirol elektrot hazırlamışlar ve
kolesterol oksidazı hazırladıkları elektrot üzerine immobilize etmişlerdir.
Kolesterol tayinini, enzim elektrodun yüzeyindeki enzimatik tepkime sonucu
oluşan hidrojen
peroksidin
+0,70
V’da yükseltgenmesine dayanarak
yapmışlardır. Kolesterol biyosensörünün cevabına pH’nın ve sıcaklığın
etkisini incelemişlerdir. Biyosensörün kolesterol için doğrusal çalışma
aralığını 1,8 x 10-5 – 5,0 x 10-5 M olarak tespit etmişlerdir. İmmobilize enzimin
optimum pH değeri 7,0 ve optimum sıcaklık değeri 60oC bulunmuştur.
İmmobilize enzimin KM değeri 3,3 mM ve Vmaks değeri 5,26 mM/dakika olarak
hesaplanmıştır. Biyosensörün 30 ölçüm sonunda aktivitesini %82 oranında
koruduğu gözlemlenmiştir ve 23 gün sonunda başlangıç amperometrik
cevabının yaklaşık %40’ sini kaybettiği görülmüştür. Hazırlanan biyosensörle
biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini yapmışlardır [42].
48
Fadime ve arkadaşları yapılan bu çalışmada, kolesterol tayini için yeni bir
amperometrik
biyosensör
geliştirmişlerdir.
Bu
amaçla
pirol
elektropolimerleşirken polivinilsülfonat da elektrot yüzeyine taşınmıştır ve
aynı zamanda enzim de yüzeye taşınarak hapsetme yöntemiyle immobilize
edilmiştir ve platin/polipirol–polivinilsülfonat-enzim elektrot hazırlanmıştır.
Kolesterol tayini, hazırlanan enzim elektrodun yüzeyinde gerçekleşen
enzimatik
tepkime
sonucu
oluşan
hidrojen
peroksitin
+0,40V’da
yükseltgenmesine dayanarak yapmışlardır. Biyosensörün kolesterol için
doğrusal çalışma aralığı 4,0x10-5 – 2,0x10-4 M olarak tayin etmişlerdir.
İmmobilize enzimin optimum pH değeri 7,25 ve optimum sıcaklık değeri 35oC
bulunmuştur. İmmobilize enzimin KM değeri 1,16 mM ve Vmaks değeri 1,78
mM/dakika
olarak
hesaplanmıştır.
Biyosensörün
20
ölçüm
sonunda
aktivitesini %35 oranında koruduğu gözlemlenmiştir ve 78 gün sonunda
başlangıç amperometrik cevabının yaklaşık %73’ sini kaybettiği görülmüştür.
Biyolojik ortamlarda olabilecek girişimlerin biyosensör cevabı üzerine etkileri
araştırmışlardır. Hazırlanan biyosensörle biyolojik sıvıda (kan) kolesterol
tayini yapmışlardır [43].
Singh ve arkadaşları amperometrik kolesterol biyosensörünün yapımında,
elektrokimyasal tutuklama tekniğini kullanarak, kolesterol oksidaz ve
kolesterol esteraz enzimlerini birlikte iletken polipirol film üzerine immobilize
etmişlerdir. Elektrokimyasal polimerizasyonu 0,8 V’da iki elektrotlu hücre
kullanarak
gerçekleştirmişlerdir.
Amperometrik
biyosensörün
doğrusal
çalışma aralığını, optimum pH değerini, çalışma potansiyelini, sıcaklık ve raf
ömrünü kolesterol için deneysel olarak tayin etmişlerdir. Doğrusal çalışma
aralığını 1-8 mM, raf ömrünü +4°C’de 4 hafta, optimum pH’ yı 6,5-7,0,
sıcaklığı 45°C ve çalışma potansiyelini 0,50 V olarak bulmuşlardır.
Elektrodun hassasiyetini 0,15 μA/mM ve gözlenen KM değerini 9,8 mM olarak
hesaplamışlardır. Polimer filmin iletkenliğini 3,0x10-3 S/cm olarak tayin
etmişlerdir [1].
49
Katrlik ve arkadaşları yaptıkları çalışmada kolesterolün doğrudan tayini için
girişim etkisi olmayan biyosensör tasarlamışlardır. Biyosensör sistemi
düzlemsel altın elektroda modifiye edilmiş immobilize enzim peroksidaz,
çözünmeyen medyatör, asetat selülöz tabakaları ve tampon çözelti içinde
kolesterol oksidaz enziminden meydana gelir. Selüloz asetat tabakaları ve
düşük potansiyel uygulamalı referans elektrot, askorbat, üre, laktat, glukoz,
nitrit ve nitratın biyosensör cevabındaki girişimlerini engelleyerek, numuneye
ön işlem uygulamaya gerek kalmadan direk kolesterol tayinine imkan
sağlamıştır. Kolesterolü doğrusal çalışma aralığındaki derişimlerde (1,1- 40
μmol/L) tampon çözelti içinde analiz etmişlerdir. Biyosensörün iletme
sistemini (kolesterol oksidaz çözeltisi olmadan) 1-250 μmol/L derişim
aralığında
tampon
kullanmışlardır.
çözelti
içinde
Biyosensörün
hızlı
iletme
hidrojen
sistemi
iyi
peroksit
bir
tayini
saklama
için
süresi
göstermiştir, 50 gün sonra biyosensörün başlangıç aktivitesinin %77’sini
korumuştur [2].
Özer ve arkadaşları, serbest kolesterolün enzim elektrotla gerçekleştirilen
amperometrik ölçümlerini, polivinilferrosenyum perklorat içinde kolesterol
oksidaz immobilizasyonuyla gerçekleştirmişlerdir. Film platin elektrot üzerine
kaplanmıştır. Amperometrik ölçümler 0,7 V’da gerçekleştirilmiştir. Enzim
elektrodun cevap akımına, polimer film kalınlığının, çalışma sıcaklığının,
çözünmüş oksijen gazının, enzim konsantrasyonunun ve çözelti pH’sının
etkilerini incelemişlerdir. Enzim elektrot sisteminin gözlenen KM değerini ve
aktivasyon enerjisini hesaplamışlardır. Biyosensörün doğrusal çalışma
aralığını, hassasiyetini ve kararlılığını tayin etmişlerdir [44].
Solanki ve arkadaşları yaptıkları çalışmada kolesterol oksidazı polianilinpolipirol
kopolimeri
üzerine
kovalent
olarak
immobilize
etmişlerdir.
Elektrokimyasal kaplama cam indiyum kalay oksit (ITO) tabakaları üzerinde
yapılmış, çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanılmıştır. Filmlerin
özellikleri
sırasıyla,
UV-görünür
bölge
spektroskopisi,
kızılötesi
spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu, fotometrik ve amperometrik
50
teknikler
kullanarak
kullanılarak
bulunmuştur.
kolesterolün
doğrusal
Poli(An-ko-Py)/ChOx
çalışma
aralığını
biyoelektrodu
1-10mM
olarak
bulmuşlardır. Poli(An-ko-Py)/ChOx biyoelektrot içinde kolesterol oksidaz
aktivitesinin en yüksek olduğu pH değerini 7,0; sıcaklığı 25 °C olarak
bulmuşlardır. Poli(An-co-Py)/ChOx elektrodun hassasiyetini 93,35 μA/mM ve
kararlılığını +4 °C’ de 10 hafta olarak tayin etmişlerdir [5].
Singh ve arkadaşları kolesterol oksidaz ve kolesterol esterazı polianilin film
üzerine kovalent olarak immobilize etmişlerdir. Enzim filminin özelliklerini,
UV- görünür bölge spektroskopisi, kızılötesi spektroskopisi, taramalı elektron
mikroskobu kullanarak bulmuşlardır. Filmlerin elektrokimyasal davranışları
sırasıyla dönüşümlü voltametri (CV) ve amperometrik teknikler kullanılarak
çalışılmıştır. Elektrodun cevap süresini 40 s, kolesterol oleat derişimi için
doğrusal çalışma aralığını 50-500 mg/dL, optimum sıcaklığını 46 °C, optimum
pH aralığını 6,5- 7,5, hassasiyetini 7,5x10-4 μA/mM ve raf ömrünü 6 hafta
olarak tayin etmişlerdir [45].
Çırpan ve arkadaşları kolesterol oksidazı elektropolimerizasyon yoluyla
iletken kopolimerlere, tiyofen3-asetik asit kolesteril ester ile polipirole,
immobilize etmişlerdir. Destek elektrot olarak p-Toluen sülfonik asit
kullanılmışlardırr. Enzim elektrodun kinetik parametrelerini (Vmaks, KM) ve
tekrarlanabilirliğini incelenmişlerdir. Filmlerin yüzey morfolojisini taramalı
elektron mikroskobuyla incelemişlerdir [46].
Basu ve arkadaşları, gıda örneklerinde toplam kolesterol tayini için oksijen
elektrot yüzeyine kolesterol esteraz (ChEt) ve kolesterol oksidaz (ChOx)
enzimleri ko-immobilizasyon ile immobilize edilerek bir kolesterol biyosensör
geliştirmişlerdir. Elektrot altın katot ve Ag/AgCI anottan oluşmaktadır.
Enzimler, glutaraldehit ve sığır serum albumin (BSA) ile çapraz bağlama
yöntemi ile immobilize edilmiştir. Sensörün optimum pH’sı 6,0 ve optimum
sıcaklığı 25° C olarak tayin edilmiştir. Tasarlanan sensör kolesterol palmitat
için tayin sınırı 1-75 mg/dL ve doğrusal çalışma aralığı 2-50 mg/dL olarak
51
bulunmuştur. Kalibrasyon eğrisi farklı kolesterol palmitat konsantrasyonlarına
(mg/dL) karşı Vi (ppm/dakika ) çizilerek belirlenmiştir. Yumurta, et gibi farklı
gıda örneklerinde total kolesterol belirlemek için sensörün uygulaması
çalışılmıştır. İmmobilize enzim elektrodun raf ömrü 9 haftada incelenmiştir
[47].
Singh ve arkadaşları, kolesterol tayini için sol-jel filmleri üzerine kolesterol
esteraz ve kolesterol oksidaz enzimlerinin immobilize edilmesiyle kolesterol
biyosensörü tasarlamışlardır. Kolesterol oksidaz (ChOx) ve kolesterol esteraz
(ChEt) , tetraetilortosilikat (TEOS) sol-jel filmleri üzerine kovalent bağlama ile
immobilize
edilmiştir.
Bu
şekilde
hazırlanan
tetraetilortosilikat
sol-
gel/ChEt/ChOx enzim filmler, sırasıyla taramalı elektron mikroskobik (SEM),
UV-görünür spektroskopik, kızılötesi (FTIR) spektroskopik ve amperometrik
teknikleri
kullanılarak
karakterize
edilmiştir.
Tetraetilortosilikat
sol-
gel/ChEt/ChOx üzerinde yapılan fotometrik ölçüm sonuçları ile optimum
sıcaklık 55 0C, cevap süresi 180 s, raf ömrü 1 ay, tayin sınırı 12 mg dL-1,
duyarlılık 5,4 x 10-5 Abs. mg-1dL-1 olarak bulunmuştur [48].
Le Huy ve çalışma grubu amperometrik kolesterol biyoalgısı için polianilin
film üzerine poli(stiren-ko-akrilik asid) manyetik mikroküreler ve kolesterol
oksidaz enzimini kovalent olarak immobilize etmişlerdir. Çalışmada ilk olarak
manyetik Fe3O4 nanopartiküller sentezlemişler ve poli(stiren-ko-akrilik asid)
(PSA) tarafından yüzeye karboksilatlanmıştır. Daha sonra taramalı elektron
mikroskobu (SEM)
analiz teknikleri ile karakterize edilmiştir. Çapraz
bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanılarak, Fe3O4/PSA mikro-küreler üzerine
kolesterol oksidaz (ChOx)
enziminin immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir.
Platin/polianilin (PANİ) modifiye elektrot üzerine Fe3O4/PSA-ChOx başarılı bir
şekilde
sentez
dönüşümlü
edilmiştir.
voltametrik
ve
PANI/Fe3O4/PSA-ChOx
kronoamperometrik
algılama
teknikleri
özellikleri
kullanılarak
çalışılmıştır. Optimize edilmiş deneysel koşullar altında biyosensör; geniş
doğrusal çalışma aralığı 0,2-1,8 mM (R2 =0,9901), düşük tayin sınırı (0,02
mM), kısa cevap süresi (5-10 s) ve yüksek hassasiyet (8796 µA.mM-1.cm-2)
52
gibi mükemmel özellikleri göstermiştir. Biyosensör; glikoz, askorbik asit, ürik
asit ve asetaminofen gibi seçilen organik bileşikler ile girişim testinde yüksek
seçicilik göstermiştir [49].
Chauhan ve arkadaşları, serum kolesterol tayin etmek için kalem grafit çubuk
üzerine kolesterol oksidaz enzimini immobilize ederek amperometrik bir
biyosensör tasarlamışlardır. Optimum çalışma koşulları, pH 6,8, optimum
sıcaklık 25°C olarak bulmuşlardır. 1,29x10-3-10,33x10-3 M aralığında değişen
cevap akımı, kolesterol konsantrasyonu ile orantılı olarak ölçülmüştür. Cevap
süresi 30 s ve tayin sınırı 0,09x10-3 M olarak bulunmuştur. Metabolitler
tarafından hiçbir girişim etkisi gözlenmemiştir. Biyosensörün raf ömrü 25 gün
boyunca 200 kez tekrar edilmiştir ve kullanılmadığı zaman içinde +4 ° C'de
muhafaza edilmiştir [50].
Basniwal ve arkadaşları bir kolesterol biyoelektrot tasarlamak amacıyla
indiyum kalay oksit kaplı cam plaka üzerine polianilin-p-toluen sülfonik asitgümüş
(PANI-pTSA-Ag)
nanokompozit
film
hazırlanması
için
kronoamperometri tekniğini kullanmışlardır. Biyoelektrot yüksek hassasiyet
36,3 µAmg-1dL-1, hızlı cevap süresi 10 s, tayin aralığı 20–400 mg/dL olarak
bulunmuştur. Biyoelektrot soğutulmuş koşullar altında 50 gün aynı aktiviteyi
koruduğu tespit edilmiştir. Kan serum örneklerinde total kolesterol tayini için
bu biyoelektrot kullanılmıştır [51].
Khan ve arkadaşları indiyum kalay oksit (İTO) üzerine TritonX-100
[4 -(1,1,3,3-tetrametilbütil) fenil polietilen glikol] ,non-iyonik bir yüzey aktif
madde varlığında elektrokimyasal polimerizasyonla hazırlanmış polianilin
(PANI)
filmin üzerine glutaraldehit aracılığıyla kolesterol oksidaz (ChOx)
enziminin kovalent bağlama yöntemi ile immobilize edilerek kolesterol
biyosensörü tasarlamışlardır. Hazırlanan ChOx/PANITX-100/ITO biyoelektrot
kızılötesi spektroskopisi (FTIR), dönüşümlü voltametri (CV) ve taramalı
elektron mikroskobu (SEM) teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir.
Amperometrik ve fotometrik teknikler kullanılarak ChOx/PANI-TX-100/ITO
53
biyoelektrot üzerine ölçümlerin sonucu tayin sınırı 5 mg dL-1,
çalışma aralığı 5-400 mg dL
-1
doğrusal
−2
ve hassasiyeti 131 μA/(mg/dl cm ) olarak
bulunmuştur. Biyosensörüm optimum sıcaklığı 65 0C, raf ömrü 20 hafta
(+40C) olarak bulunmuştur [52].
Pundir ve arkadaşları serum kolesterol tayini için kolesterol esteraz,
kolesterol oksidaz ve peroksidaz enzim karışımlarını polivinil klorür (PVC)
üzerine ko-immobilizasyonu gerçekleştirilerek enzim şeridi tasarlanmıştır.
Hazırlanan enzim şeridin kinetik parametreleri; optimum pH 7,2 ve optimum
sıcaklığı 45oC, raf ömrü 4 ay, tekrarlanabilirliği 200 ölçüm olarak bulunmuştur
[53].
Türkaslan ve arkadaşları amperometrik kolesterol biyosensör matrisi için
uygun iletken polimeri belirlemişlerdir. İki iletken polimerler, poli (pirol) (PPy)
ve poli (3,4-etilendioksitiyofen) (PEDOT) kolesterol biyosensörü matrisleri
olarak kullanılmıştır. Her iki polimer yüzeyine kolesterol oksidaz (ChOx)
enzimi immobilize edilmiştir. Enzim elektrotların amperometrik cevapları
medyatör yokluğunda +0,70 V’da H2O2’nin oksidasyon akımı izleyerek
ölçülmüştür. Her iki matris için kinetik parametreler; Km, Imax, raf ömrü,
tekrarlanabilirlik, pH ve sıcaklık etkisi belirlenmiştir. Km değerleri sırasıyla
PPy ve PEDOT enzim elektrotlar için 7,9 ve 1,3 mM olarak bulunmuştur.
Sonuç olarak PEDOT enzim elektrodun subsrata karşı daha yüksek ilgi
gösterdiği rapor edilmiştir [54].
Khan ve arkadaşları Triton X-100 (TX-100) ince film ile elektrokimyasalpolimerleştirilmiş polianilin (PANI) üzerine kolesterol oksidaz (ChOx) enzimi
başarılı bir şekilde kovalent bağlama yöntemi ile immobilize edilerek
kolesterol biyosensör tasarlanmıştır. PANI-TX-100 ince filmine kolesterol
oksidaz (ChOx) immobilizasyonu sonucu yüzey morfolojisindeki değişim
atomik kuvvet mikroskobu (AFM) analizi kullanılarak incelenmiştir. UVgörünür absorpsiyon spektrumları ve kızıl ötesi (FTIR)
ile PANI-TX-100
54
matriksine kolesterol oksidaz (ChOx) enziminin immobilizasyon işlemininin
gerçekleşmiş olduğu teyit edilmiştir [55].
Solanki ve arkadaşları kolesterol tayini için indiyum kalay oksit (ITO) cam
plakalar üzerine poli (pirol-ko-N-metil pirol) katkılı p-toluen sülfonat üzerine
kolesterol oksidaz (ChOx) elektrokimyasal olarak hapsedilerek kolesterol
biyoelektrot tasarlanmıştır. Tasarlanan ChOx-kopolimer-PTS/ITO biyoelektrot
dönüşümlü voltametri (CV), kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, UV-görünür
spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) teknikleri kullanılarak
karakterize edilmiştir. Kolesterol biyoelektrodun cevap süresi 19 s, doğrusal
çalışma aralığı 50-400 mg /dL, en iyi pH aralığı 6,5 ve 7,5 arasında, raf ömrü
4 ° C' de 6 hafta olarak bulunmuştur. Biyoelektrot askorbik asit, ürik asit ve
glukoz gibi girişim yapan türlerin varlığında, neredeyse girişim etkisi
gözlenmemiştir [56].
Kumar ve arkadaşları bir indiyum kalay oksit (ITO) elektrot üzerine (3
glisidoksipropil ) trimetoksisilan ( GPTMS )‘nın biyo uyumlu tabaka üzerine
kolesterol oksidaz ve kolesterol esteraz ( ChOx ve ChEt ) enzimlerinin
kovalent
bağlama
yöntemiyle
immobilize
edilmesiyle
elektrokimyasal
kolesterol biyosensör tasarlanmıştır. ChOx / GPTMS / ITO bioelektrodu
kızılötesi spektroskopi (FTIR), temas açısı ölçümleri (CA), atomik kuvvet
mikroskobu (AFM), elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ve
dönüşümlü voltametri (CV) teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. ChOxChEt/GPTMS/ITO biyo-algılayıcı elektrot için elektrokimyasal çalışmaların
sonuçları, tayin aralığı 1,5-6,1 mM, hassasiyeti 0,351 µA (mg/dl)-1, raf ömrü
10 hafta ve tekrarlanabilirliği 10 ölçüm olarak bulunmuştur. Michaelis-Menten
sabiti (KM) değeri 0,43 mM gözlemlenmiştir. Ayrıca, Bu biyosensör serum
örneklerinde, toplam kolesterol konsantrasyonunu tahmin etmek için de
kullanılabileceği sonucuna varılmıştır [57].
Singh ve arkadaşları kolesterol tayini için p-toluen sülfonik asit (PTS)
kullanılarak indiyum kalay oksit (ITO) elektrot üzerine polipirol (PPy) ve
55
karboksi
fonksiyonalize
çok
katmanlı
karbon
nanotüp
elektropolimerizasyonu ile yeni bir biosensör tasarlanmıştır.
(MWCNT)
Esterleşmiş
kolesterol tahmini için N-hidroksi süksinimid ve N-etil-N-(3-dimetilaminopropil)
karbodiimid kullanarak PPY-MWCNT/ITO nanokompozit elektrot üzerine
kolesterol oksidaz (ChOx) ve kolesterol esteraz (ChEt) enzimleri immobilize
edilmiştir.
ChEt-ChOx/PPY-MWCNT/PTS/ITO
biyoelektrodu
kızılötesi
spektroskopi (FTIR) ve taramalı elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak
karakterize edilmiştir. ChEt-ChOx/PPY-MWCNT/PTS/ITO nanobiyoelektrot
cevap süresi 9 s, doğrusal çalışma aralığı 4×10-4 - 6,5×10-3 M /l, KM değeri
0,02 mM, ve en iyi sıcaklık 45°C olarak tayin edilmiştir. Bu elektrot
literatürdeki diğer total kolesterol elektrotlar ile karşılaştırıldığında gelişmiş
biyoalgı özellikleri sergilediği ve kan serum örneklerinde kolesterol tayin
etmek için kullanılabilir olduğu sonucuna varılmıştır [58].
.
56
3. DENEYSEL KISIM
3.1. Cihazlar ve Malzemeler
3.1.1. Elektrokimyasal analiz cihazı
Amperometrik
ölçme
işlemlerinde
BAS
Epsilon-EC-Ver
1.40.67
NT
elektrokimyasal analiz cihazı kullanıldı.
3.1.2. Hücre ve elektrotlar
Amperometrik ölçme işlemlerinde Şekil 3.1’ de verilen üç elektrotlu ölçme
sistemi kullanıldı. Referans elektrot olarak BAS RE-5B no’lu Ag/AgCl, karşıt
elektrot olarak MW-1032 no’lu platin tel ve çalışma elektrodu olarak 0,5 cm²
yüzey alanlı ve polipirol-polivinilsülfonat ile kaplanmış platin levha elektrotlar
kullanıldı.
Şekil 3.1. Kaplama ve ölçümde kullanılan hücre sistemi
57
3.1.3. pH metre
Tampon çözeltilerinin pH’larının ölçülmesinde ORION Model 720A pHiyonmetre cihazı kullanıldı.
3.1.4. Su banyosu
Isıtma, soğutma ve sabit sıcaklık çalışmaları için Grant W14 marka
termostatlı dolaşımlı su banyosu kullanıldı.
3.1.5. Mikro pipet
5 µL – 100 µL ve 100 µL - 1000µL çözelti ilaveleri için Brand marka ± 0,05 µL
hassasiyeti olan mikro pipetler kullanıldı.
3.1.6. Argon gazı
Çözeltide çözünmüş halde bulunan oksijeni uzaklaştırmak amacıyla Kargaz
firmasından temin edilen yüksek saflıktaki ( % 99,999 ) argon gazı kullanıldı.
3.1.7. Saf su
Çözeltinin hazırlanmasında kullanılan saf su; GFL marka saf su cihazından
sağlandı.
3.1.8. SEM cihazı
Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji bölümünde JEOL JSM-6060 LV
markalı cihazda elektrotların yüzey fotoğrafları elde edildi.
58
3.1.9. AFM cihazı
Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Fizik bölümünde Omicron AFM/STM kombine
sistem markalı cihazda elektrotların yüzey fotoğrafları elde edildi.
3.1.10. Yüzey temas açısı analiz cihazı
Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya bölümünde flaş kamera aksesuarlı
Kruss DSA100 markalı cihazda elektrotların yüzey fotoğrafları elde edildi.
3.1.11. Profilometre cihazı (Film kalınlığının ölçülmesi)
Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Fizik bölümünde Veeco dektak 150 markalı
cihazda elektrotların yüzey kalınlığı belirlendi.
3.2. Kullanılan Reaktifler ve Özellikleri
Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık dereceleri ve temin
edildikleri firmalar Çizelge 3.1’de verilmiştir.
59
Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık
dereceleri ve temin edildikleri firmalar
Pirol
Saflık Derecesi
% 98 δ=0,987
Temin Edildiği Firma
Aldrich
Polivinilsülfonat
%25
Aldrich
Sodyum Perklorat
% 98
Sigma-Aldrich
Hidrojen Peroksit
% 30 δ=1,13 kg/L
Sigma-Aldrich
Glutaraldehit (C5H8O2)
%25 d=0,78
Aldrich
Borik asit (H3BO3)
% 99,5
Merck
Ürik Asit
% 99
Sigma
Parasetamol (Asetaminofen)
% 99,4
-
L-(+)-Askorbik asit
% 99
Carlo Erba
Glukoz
-
Merck
Sodyum Hidroksit (NaOH)
% 99
Carlo Erba
Hidroklorik asit (HCl)
% 36,5
BDH
Lityum Karbonat
% 45
Merck
Monosodyum hidrojen fosfat
(NaH2PO4)
%99
Merck
Disodyum hidrojen fosfat
(Na2HPO4)
Kolesterol
%99
Merck
-
Merck
Kolesterol palmitat
-
Sigma
Nonaetilen glikol
monododesil ether
Triton-X-100
-
Sigma
-
Merck
Propan 2-ol
-
Merck
Kimyasal Madde
3.2.1. Kullanılan çözeltiler
Hidrojen peroksit: % 35’lik δ=1,13 kg/L olan hidrojen peroksitten belli bir
miktar alınarak derişimi 0,1 M olacak şekilde 25 mL stok çözelti hazırlandı.
25’er mL 1,0x10-3 M ve 1,0x10-5 M hidrojen peroksit çözeltileri de su ile
seyreltilerek hazırlandı.
60
Fosfat tamponu: Monosodyum hidrojen fosfat ve disodyum hidrojen fosfattan
sırasıyla 1,9096 ve 23,6030 gram tartılarak saf suda çözüldü, hazırlanan
çözeltinin pH’ sı 1,0 M NaOH ve 1,0 M HCl ile 8,0’e ayarlandı ve çözeltideki
analitik derişimi 0,1 M olacak şekilde seyreltildi. Farklı pH ve derişimlerdeki
tampon çözeltileri hazırlamak için aynı yol izlendi. Tampon çözelti
buzdolabında +4 °C’de muhafaza edildi.
Kolesterol oksidaz enzim çözeltisi: Toplam aktivitesi 100 ünite olan kolesterol
oksidaz enzimi alındı ve saf suda çözüldükten sonra hacim ölçülü balonda 5
mL’ ye tamamlandı (20 ünite/mL). Deney sırasında kullanılacak olan enzim
çözeltisi buzdolabında bekletildi. Uzun süre kullanılmadığı durumlarda çözelti
derin dondurucuda saklandı.
Kolesterol esteraz enzim çözeltisi: Toplam aktivitesi 30,8U/mg olan kolesterol
esteraz enzimi alındı ve saf suda çözüldükten sonra istenilen oranda hacim
ölçülü balonda tamamlandı (30 ünite/mL). Deney sırasında kullanılacak olan
enzim çözeltisi buzdolabında bekletildi. Uzun süre kullanılmadığı durumlarda
çözelti derin dondurucuda saklandı.
Kolesterol palmitat çözeltisi: Katı kolesterol palmitat belli bir miktar tartılarak
nonaetilen glikol monododesil ether ilave edilerek renksiz ve berrak çözelti
elde edilemeye kadar ısıtarak karıştırma işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra
derişimi 0,1 M pH’sı 8,0 olan fosfat tamponu ile 1,0x10-3 M 10 mL kolesterol
palmitat çözeltisi hazırlandı. Farklı pH ve derişimdeki kolesterol palmitat
çözeltilerini hazırlamak için aynı yol izlendi. Hazırlanan kolesterol palmitat
çözeltisi tazeliğini 10-15 gün korudu. Bu süre içinde kolesterol palmitat
çözeltisi buzdolabında muhafaza edildi.
Askorbik asit çözeltisi: Katı askorbik asitten 0,0440 gram tartılarak derişimi
0,1 M pH’sı 8,0 olan fosfat tamponunda 0,01 M 25 mL stok askorbik asit
çözeltisi hazırlandı. Farklı derişimlerdeki askorbik asit çözeltileri belli
hacimlerde alınarak fosfat tamponu ile seyreltilerek hazırlandı.
61
Ürik asit çözeltisi: Katı ürik asitten 0,0420 gram tartılarak 0,1 M Li2CO3
çözeltisinde çözüldükten sonra 0,1M pH’sı 8,0 olan fosfat tamponu eklenerek
1,0x10-2 M 25 mL stok ürik asit çözeltisi hazırlandı.
Parasetamol çözeltisi (asetaminofen): Katı parasetamolden 0,0378 gram
tartılarak, üzerine 0,1M pH’sı 8 olan fosfat tamponu eklenip 1,0x10-2 M 25 mL
stok parasetamol çözeltisi hazırlandı. Farklı derisimlerdeki parasetamol
çözeltileri stok çözeltiden belli hacimlerde alınarak fosfat tamponuyla
seyreltilerek hazırlandı.
Glukoz çözeltisi: Katı glukozdan 0,0990 gram tartılarak üzerine 0,1M pH’sı 8
olan fosfat tamponunda çözülerek 5,0x10-2 M 10 mL stok glukoz çözeltisi
hazırlandı.
Sodyum perklorat: Katı sodyum perklorattan belli bir miktar tartılıp saf suda
çözülerek 1 M 100 mL stok NaClO4 çözeltisi hazırlandı.
Sodyum hidroksit çözeltisi: Katı sodyum hidroksitten belli bir miktar alınıp saf
suda çözülerek 0,1 M 10 mL çözeltisi hazırlandı.
3.3. Platin Yüzeye Polivinilsülfonat ve Polipirol Kaplanması
Elektrot yüzeyinin temizlenmesi: Kaplama işleminden önce platin levhanın
yüzeyi mekanik, kimyasal ve elektrokimyasal olarak temizlendi. İlk başta
platin yüzeyi sıfır numara zımpara ile parlatıldı, daha sonra aleve tutuldu. 5
dakika süre ile aseton, etil alkol, derişik HCl ve derişik nitrik asit içinde
bekletildi. Tekrar saf suyla yıkandı, kurutuldu ve yüzeydeki su uzaklaştırıldı.
Her kaplama işleminden önce yüzey bu şekilde temizlendi [71].
Temizlenmiş Pt levha elektrodunun yüzeyi polipirol-polivinilsülfonat film ile
kaplandı.
Polipirol,
elektrot
yüzeyine
pirolün
elektropolimerleşmesiyle
biriktirildi. Elektropolimerleşmede üçlü elektrot sistemi kullanıldı. Çalışma
62
elektrodu olarak platin levha (0,5 cm²), karşıt elektrot olarak platin tel ve
referans
elektrot
olarak
ise
Ag/AgCl
elektrot
kullanıldı.
Polipirol-
polivinilsülfonat film elde etmek amacıyla pirolün hücre içi derişimi 0,1 M
olacak şekilde 71 µL pirol, 2,5 mL polivinilsülfonat (%25), 7,429 mL saf su
eklenmesiyle toplam 10 mL’lik bir çözelti hazırlandı. Bu çözeltiye temizlenmiş
platin elektrot daldırıldı ve 10 dakika argon gazı geçirilerek çözeltideki oksijen
gazı uzaklaştırıldı. Elektropolimerizasyon işlemi dönüşümlü voltametri
tekniğiyle
-1,0V – +2,0V potansiyelleri arasında, 50 mV/s tarama hızında ve
4 dönüşümde [78] yapıldı. Kaplama işleminden sonra elektrot yüzeyi saf
suyla yıkanarak kullanılmak üzere fosfat tamponu içinde bekletildi. Böylece
platin/polipirol-polivinilsülfonat (Pt/PPy-PVS) elektrot hazırlandı [72].
Şekil 3.2. Pt/PPy-PVS film elektrodunun voltamogramı
3.3.1. Pt/PPy-PVS film elektrodun SEM analizi
Bölüm 3.3’ de hazırlanan film elektrodun SEM analizi yapılması için değişik
yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun
olan görüntü seçildi (Şekil 4.7).
63
3.3.2. Pt/PPy-PVS film elektrodun AFM analizi
Bölüm 3.3’ de hazırlanan film elektrodun AFM analizi yapılması için değişik
yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun
olan görüntü seçildi (Şekil 4.9).
3.3.3. Pt/PPy-PVS film elektrodun yüzey temas açısı analizi
Bölüm 3.3’ de hazırlanan film elektrodun yüzey temas açısı analizi yapılmak
için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından
en uygun olan görüntü seçildi (Şekil 4.11).
3.3.4. Pt/PPy-PVS film elektrodun kalınlığının ölçülmesi (Profilometre)
Bölüm 3.3’ de hazırlanan film elektrodun kalınlığı profilometre cihazı ile
ölçüldü (Şekil 4.13).
3.4. Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat Elektrodunun Hidrojen Peroksite
Duyarlılığının Belirlenmesi
Bölüm 3.3’de belirtildiği gibi hazırlanan Pt/Polipirol-polivinilsülfonat elektrot,
Ag/AgCI referans elektrodu ve platin tel; 9 mL 0,1M fosfat tamponu ve 1 mL
1 M NaCIO4 çözeltisinin içine daldırıldı. Çalışma elektrodu 0,40 V sabit
potansiyelde dengeye getirildi [78] ve denge akımı kaydedildi. Denge
akımına ulaşan elektrot ile hücre içi derişimi 0,1 µM ile 5,0x10-2 M arasında
değişen hidrojen peroksit çözeltilerinden ilaveler yapıldı. Her ilave sonunda
hücre içerisi 300 s karıştırılıp, karıştırmanın bitiminden itibaren 200 s
sonrasındaki akım okundu [79]. Okunan akım değerleri ile denge akımı
arasındaki farklar alınarak her bir derişim için ∆i değerleri hesaplandı. Elde
edilen Δi değerleri hidrojen peroksit derişimine karşı grafiğe geçirildi (Şekil
4.2).
64
3.5. Pt/PPy-PVS Film Elektrot ile Serbest Enzim Çalışması
Bölüm 3.3’de belirtildiği gibi hazırlanan çalışma elektrodu 9 mL tampon
çözeltisi 1 mL destek elektrolit (NaClO4) bulunan çözeltiye daldırılarak 0,40 V
sabit potansiyelde dengeye getirildi. Ardından 50 µL kolesterol esteraz ve 50
µL kolesterol oksidaz enzimlerinden ilave edilerek enzimli ortamda dengeye
gelmesi beklendi ve denge akımı kaydedildi. Daha sonra hücre içi derişimi
0,1 µM – 1 mM arası artan derişimlerde kolesterol palmitat ilaveleri yapıldı.
Her ilave sonrasında reaksiyonun tamamlanabilmesi için 300 saniye
karıştırıldı ve karıştırmanın bitiminden itibaren 200 saniye sonrasındaki akım
okundu. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak
her bir derişim için ∆i değerleri hesaplandı. Elde edilen Δi değerleri kolesterol
palmitat derişimine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.3).
3.6. Biyosensörün Hazırlanması
3.6.1. Çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyon
Bölüm 3.3’de belirtildiği gibi hazırlanan Pt/PPy-PVS elektrodunun yüzeyi saf
su ile yıkandıktan sonra, 30 µL glutaraldehit (GA), 1 mg BSA, 50 µL pH 7,0
fosfat tamponu ve 50 µL kolesterol esteraz (ChEt) ve 50 µL kolesterol
oksidaz (ChOx) enzimlerini içeren çözeltiden elektrodun her iki yüzeyine de
eşit miktarda ilave edilerek kuruyana kadar bekletildi. Kuruyan Pt/PPy-PVSChEt-ChOx biyosensörü saf su ile yıkanıp tampon çözeltide bir süre
bekletildi. Tampon çözelti ve destek elektrolit ihtiva eden hücre sisteminde
dengeye
getirildi. Dengeye
gelen
sisteme
artan
kolesterol palmitat
konsantrasyonların da ilaveler yapıldı ve okunan akım değerleri ile denge
akımı arasındaki farklar alınarak her bir derişim için Δi değerleri hesaplandı.
Elde edilen Δi değerleri kolesterol palmitat derişimine karşı grafiğe geçirildi
(Şekil
4.4).
Çapraz
bağlama
yöntemiyle
hazırlanan
tekrarlanabilirliği incelenerek grafiğe geçirildi (Şekil 4.6).
biyosensörün
65
3.6.2. Tutuklama yöntemi ile immobilizasyon
İmmobilizasyon işlmeminden önce platin levhanın yüzeyi mekanik, kimyasal
ve elektrokimyasal olarak temizlendi. İlk başta platin yüzeyi sıfır numara
zımpara ile parlatıldı, daha sonra aleve tutuldu. 5 dakika süre ile aseton, etil
alkol, derişik HCl ve derişik nitrik asit içinde bekletildi. Tekrar saf suyla
yıkandı, kurutuldu ve yüzeydeki su uzaklaştırıldı. Platin levha için temizleme
işlemi bu şekilde tamamlandı. Daha sonra hücre içerisine 6,429 mL su, 71 µL
pirol, 2,5 mL polivinilsülfonat, 0,5 mL kolesterol esteraz (ChEt) ve 0,5 mL
kolesterol oksidaz (ChOx) ilave edilerek 10 mL’lik bir hücre hazırlandı.
Hücreden 10 dakika argon gazı geçirilerek oksijen gazı uzaklaştırıldı. Daha
sonra dönüşümlü voltametri tekniği kullanılarak -1,0V – +2,0V arasında 50
mV/s tarama hızında 4 dönüşümde pirolün polivinilsülfonatlı ortamda platin
elektrot yüzeyinde elektropolimerleşmesi sırasında kolesterol esteraz/
kolesterol oksidaz enziminlerinin yüzeye taşınması sağlandı. Elde edilen
Platin/polipirol-polivinilsülfonat-kolesterol esteraz-kolesterol oksidaz (Pt/PPyPVS-ChEt-ChOx) biyosensörün yüzeyi bol saf su ile yıkandı. Tutuklama
yöntemi
ile
incelenerek
hazırlanan
grafiğe
biyosensörün
geçirildi
(Şekil
kolesterol
4.4).
palmitata
Biyosensör
duyarlılığı
kullanılmadığı
zamanlarda buzdolabında +4oC’de fosfat tamponunda bekletildi.
3.6.3. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün SEM analizi
Bölüm 3.6.2 ‘deki gibi hazırlanan biyosensorün SEM analizi yapılmak için
değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en
uygun olan görüntü seçildi. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy-PVS-ChEtChOx biyosensörünün SEM fotoğrafları karşılaştırıldı (Şekil 4.8).
3.6.4. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün AFM analizi
Bölüm 3.6.2 ‘deki gibi hazırlanan biyosensorün AFM analizi yapılmak için
değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en
66
uygun olan görüntü seçildi. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy-PVS-ChEtChOx biyosensörünün AFM fotoğrafları karşılaştırıldı (Şekil 4.10).
3.6.5. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün yüzey temas açısı
analizi
Bölüm 3.6.2 ‘deki gibi hazırlanan biyosensörun yüzey temas açısı analizi
yapılmak için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları
arasından en uygun olan görüntü seçildi. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPyPVS-ChEt-ChOx biyosensörün yüzey temas açısı fotoğrafları karşılaştırıldı
(Şekil 4.12).
3.6.6. Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün film yüzey kalınlığının
ölçülmesi (Profilometre)
Bölüm 3.6.2 ‘deki gibi hazırlanan biyosensörün yüzey kalınlığı profilometre
cihazı ile ölçüldü. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx
biyosensörünün spektrumları karşılatırıldı ve film kalınlıkları hesaplandı
(Şekil 4.14).
3.7. Biyosensörün Kolesterol Duyarlılığının Belirlenmesi
Bölüm
3.6.2’deki
gibi
hazırlanan
biyosensörün
kolesterol
palmitata
duyarlılığının belirlenmesi için üçlü elektrot sistemi kullanıldı. Üçlü elektrot
sisteminde çalışma elektrodu olarak hazırlanan biyosensör, referans elektrot
olarak Ag/AgCl elektrot, karşıt elektrot olarak ise platin tel kullanıldı.
Elektrokimyasal hücreye pH’sı 8 olan fosfat tamponundan 9 mL ve 1 M’lık
sodyum perklorat çözeltisinden 1 mL konuldu. 0,40 V sabit potansiyelde
biyosensör dengeye getirildi ve denge akımı kaydedildi. Daha sonra artan
derişimlerde kolesterol palmitat ilaveleri yapıldı. Her ilavede çözelti 300
saniye karıştırıldı ve 200 saniye sonrasındaki akımlar okundu. Okunan akım
değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir derişim için ∆i
67
değerleri hesaplandı. Elde edilen ∆i değerleri Bölüm 3.6.1 ‘de elde edilen ∆i
değerleriyle birlikte grafiğe geçirilerek karşılaştırıldı (Şekil 4.4 ).
3.8. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx Biyosensörünün En İyi Çalışma Koşullarını
Belirlenmesi
Biyosensörün en iyi çalışma koşullarının belirlenmesi için pH’nın etkisi,
sıcaklığın
etkisi,
substrat
derişiminin
etkisi,
biyosensörün
tekrar
kullanılabilirliği ve raf ömrünün belirlenmesi çalışıldı.
3.8.1. pH’nın etkisi
Bölüm
3.6.2’de
anlatıldığı
gibi
hazırlanan
ve
kararlı
hale
getirilen
biyosensörün amperometrik cevap akımı üzerine pH’nın etkisini incelemek
için pH’sı 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 ve 9,0 olan 0,1 M fosfat tamponları
hazırlandı. Hücre içerisine pH değeri 6,0 olan fosfat tampon çözeltisinden 9
mL ve sodyum perklorat çözeltisinden 1 mL konuldu. Elektrot bu çözeltide
0,40 V’da dengeye getirildi ve denge akımı kaydedildi. Sonra pH değeri 6,0
olan fosfat tampon çözeltisiyle hazırlanan kolesterol palmitat çözeltisinden
hücredeki kolesterol palmitat derişimi 5,0x10-5 M olacak şekilde hücreye ilave
edildi. Kolesterol palmitat ilavesinden sonra hücre ortamı 300 s karıştırıldı,
200 s sonundaki akım kaydedildi ve denge akımıyla farkı alınarak pH 6,0 için
∆i değeri hesaplandı. Aynı işlemler pH değeri 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 ve 9,0
olan fosfat tamponları için de tekrarlandı. Okunan akım değerleri ile denge
akımı arasındaki farklar alınarak her bir pH ortamı için ∆i değerleri
hesaplandı. Elde edilen Δi değerleri pH’ya karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.15).
3.8.2. Sıcaklığın etkisi
Bölüm 3.6.2’de anlatıldığı gibi hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensörün
amperometrik cevap akımı üzerine sıcaklığın etkisini incelemek amacı ile
20 oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC, 50 oC, 55 oC, 60 oC, 65 oC ve 70 oC
68
sıcaklığındaki ortamlarda biyosensörün amperometrik cevap akımları ölçüldü.
Hücre içine pH’sı 8,0 olan 0,1 M 9 mL tampon çözeltisi ve 1 mL 1 M sodyum
perklorat çözeltisi konuldu ve biyosensör hücreye daldırıldı. Su banyosu
kullanılarak hücre içindeki çözeltinin sıcaklığı 20 o C olacak şekilde ayarlandı.
0,40 V sabit potansiyelde dengeye getirildi ve denge akımı kaydedildi. Sonra
hücre içi derişimi 5,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı.
İlave sonrasında 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu. Aynı
işlemler diğer sıcaklık değerlerinde de yapılarak okunan akım değerleri
kaydedildi. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak
her bir sıcaklık için ∆i değerleri hesaplandı. Elde edilen ∆i değerleri sıcaklığa
karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.16).
3.8.3. Substrat derişiminin etkisi
Bölüm 3.6.2’deki gibi hazırlanan biyosensör; içerisinde, pH’sı 8,0 olan 0,1 M
9 mL 0,1 M fosfat tamponu ve 1 mL 1,0 M sodyum perklorat bulunan
çözeltiye daldırıldı. 0,40 V sabit potansiyelde dengeye getirilerek denge akımı
kaydedildi. Daha sonra 0,1µM – 1 mM hücre içi derişim aralığında kolesterol
palmitat ilaveleri yapıldı. Her ilavede çözelti 300 saniye karıştırılıp, 200
saniye sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki farklar alınarak
her bir kolesterol palmitat derişimi için Δi değerleri belirlendi. Kolesterol
palmitat derişimlerine karşı Δi grafiği çizildi (Michaelis-Menten eğrisi) (Şekil
4.17). Çizilen bu grafikten yararlanılarak biyosensörün çalışma aralığı
belirlendi. Ayrıca elde edilen verilerden Lineweaver-burk grafiği çizildi ve bu
grafikten yararlanarak kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz enzimine özgü
KM(gözlenen) ve Vmaks(gözlenen) değerleri belirlendi (Şekil 4.18).
3.8.4. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi
Bölüm 3.6.2’de anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün en iyi çalışma
koşulları altında tekrar kullanılabilirliğini ölçmek amacıyla hücre içi 5,0x10-5 M
derişiminde kolesterol palmitat çözeltisi ile arka arkaya ölçümler yapıldı. Her
69
ölçüm için denge akımı ile okunan akım arasındaki farktan Δi değeri
belirlendi. Ölçüm sayısına karşı Δi değerleri grafiğe geçirildi (Şekil 4.20).
3.8.5. Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi
Bölüm 3.6.2’de anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün raf ömrünü belirlemek
için 60 gün boyunca değişik zaman aralıklarında toplamda 16 ölçüm olacak
şekilde 5,0x10-5 M sabit kolesterol palmitat derişiminde biyosensörün
amperometrik cevap akımı ölçüldü. Ölçüm işlemi tamamlanan biyosensör, bir
sonraki
ölçüm
işlemine
kadar
tampon
çözelti
içerisinde
+4
o
C’de
buzdolabında bekletildi. Her ölçüm sırasında denge akımı ile okunan akım
değeri arasındaki farklar alınarak ∆i değerleri hesaplandı. Elde edilen ∆i
değerleri saklama süresine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.21).
3.9. Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler
Bölüm 3.6.2’ye göre hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensörün en iyi
çalışma koşullarında 1,0x10-5 M kolesterol palmitat derişiminde elde edilen
amperometrik cevap akımı üzerine biyolojik sıvılarda var olan ve girişim etkisi
yapabilecek maddelerden askorbik asit, parasetamol (asetaminofen) , ürik
asit ve glukozun girişim etkileri incelendi. Bu çalışmada girişim yapan türlerin
derişimleri kanda bulunan derişimleri ile aynı olacak şekilde alındı.
Askorbik asidin girişim etkisinin incelenmesi
Bölüm 3.6.2’ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü,
içerisinde 9 mL pH’sı 8,0 olan 0,1 M fosfat tamponu ve 1 mL 1,0 M NaClO4
bulunan toplam 10 mL’lik hücrede 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye
getirilerek denge akımı kaydedildi. Hücre içi derişimi 1,0x10-5 M olacak
şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 s karıştırılıp 200 s
sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol
palmitat neden olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi
70
derişimi 1,0x10-4 M olacak şekilde askorbik asit eklendi. 300 s karıştırılıp 200
s sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak
kolesterol palmitat ve askorbik asitin neden olduğu toplam cevap akımı
kaydedildi. Bu toplam akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitattan kaynaklanan
cevap akımı çıkarılarak 1,0x10-4 M askorbik asidin cevap akımı bulundu.
Bulunan bu akım toplam cevap akımına oranlanarak 1,0x10-4 M askorbik
asidin yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1).
Parasetamol (Asetaminofen)’ün girişim etkisinin incelenmesi
Bölüm 3.6.2’ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü,
içerisinde 9 mL 0,1 M fosfat tamponu ve 1 mL 1,0 M NaClO4 bulunan toplam
10 mL’lik hücrede 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge
akımı kaydedildi. Hücre içi derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol
palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım
okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitatın
neden olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi derişimi
1,0x10-4 M olacak şekilde parasetamol eklendi. 300 s karıştırılıp 200 s
sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol
palmitat ve parasetamolün neden olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu
toplam akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitatın neden olduğu cevap akımı
çıkarılarak 1,0x10-4 M parasetamolün sebep olduğu cevap akımı bulundu.
Bulunan
bu
akım
toplam
cevap
akımına
oranlanarak
1,0x10-4
M
parasetamolün yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1).
Glukozun girişim etkisinin incelenmesi
Bölüm 3.6.2’ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü,
içerisinde 9 mL 0,1 M fosfat tamponu ve 1 mL 1,0 M NaClO4 bulunan toplam
10 mL’lik hücrede 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge
akımı kaydedildi. Hücre içi derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol
palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım
71
okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitatın
neden olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi derişimi
5,0x10-3 M olacak şekilde glukoz eklendi. 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki
akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitat
ve glukozun neden olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu toplam
akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitatın sebep olduğu cevap akımı
çıkarılarak 5,0x10-3 M glukozun sebep olduğu cevap akımı bulundu. Bulunan
bu akım toplam cevap akımına oranlanarak 5,0x10-3 M glukozun yüzde
girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1).
Ürik asidin girişim etkisinin incelenmesi
Bölüm 3.6.2’ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü,
içerisinde 9 mL 0,1 M fosfat tamponu ve 1 mL 1 M NaCIO4 bulunan, toplam
10 mL’lik hücrede, 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge
akımı kaydedildi. Daha sonra hücreye derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde
kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 saniye karıştırılıp, 200 saniye
sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak; 1,0x10-4
M kolesterol palmitatın sebep olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti
üzerine hücre içi derişimi 3,0x10-4 M olacak şekilde ürik asit ilavesi yapıldı.
Çözelti 300 saniye karıştırılıp, 200 saniye sonundaki akım okundu ve denge
akımı ile arasındaki fark alınarak; kolesterol palmitatın ve ürik asidin sebep
olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu akımdan 1,0x10 -5 M kolesterol
palmitatın sebep olduğu cevap akımı çıkarılarak 3,0x10-4 M ürik asidin sebep
olduğu cevap akımı bulundu. Bulunan bu akım toplam cevap akımına
oranlanarak 3,0x10-4 M ürik asidin yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1).
72
3.10. Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini
Biyolojik sıvıdaki kolesterol tayini için 5 kişiden kan örneği alındı. Örnek alma
işlemleri sağlıklı bireylerden yapıldı. Bu örnekler steril kaplara alındı ve analiz
yapılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi. Kan serumunda kolesterol
tayini için seyreltme işlemleri yapıldı. Seyreltme işlemi sayesinde kan
serumundaki kolesterol derişimi biyosensörün doğrusal çalışma aralığına
getirilmesi ve girişim yapan maddelerin biyosensörün tayin sınırının altındaki
bir derişime indirilmesi sağlandı.
Bölüm 3.6.2’deki gibi hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensör, kandaki
total kolesterol miktarınının belirlenmesi amacıyla elektrokimyasal hücreye
pH’sı 8,0 olan 9 mL 0,1 M fosfat tamponu çözeltisi ve 1 mL 1,0 M sodyum
perklorat çözeltisi konuldu. 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek
denge akımı kaydedildi. Serumlardan belli hacimler alındı ve 100 defa
seyreltme işlemi olacak şekilde biyosensörün bulunduğu hücreye eklendi.
Sonra 0,40 V sabit potansiyel uygulanıp hücreden geçen akım kaydedildi.
Daha sonra derişimi bilinen kolesterol palmitat çözeltilerinden ilave edilerek
okunan akım değerleri kaydedildi. Her bir denge akımı ile okunan akım
arasındaki farktan ∆i değeri belirlendi. Aynı işlemler alınan beş kan numunesi
için de gerçekleştirildi. Standart ekleme yöntemiyle kolesterol palmitat
derişimleri belirlendi (Çizelge 4.2).
73
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Bu çalışmada platin yüzey üzerine iletken bir polimer olan polipirol ve
polivinilsülfonat kaplandı. Hazırlanan bu film üzerine pirol ve polivinilsülfonat
elektropolimerleşme yöntemiyle elektrot yüzeyinde biriktirilirken kolesterol
esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri polimer içerisine tutuklama yöntemi
ile immobilize edildi. Hazırlanan biyosensörün analitik ve biyokimyasal
özellikleri incelendi. Film elektrot ve biyosensör yüzeyinin morfolojik yapısı
SEM, AFM, yüzey temas açısı ölçümü ve profilometre spektrumu (film
kalınlığı ölçümü ) gibi yöntemlerle karakterize edildi. Biyosensör üzerine pH,
sıcaklık, substrat derişimi, girişim etkisi incelendi. Ayrıca biyosensörün
tekrarlanabilirliği ve raf ömrü belirlendi. Enzimatik reaksiyonların bir kısmında
reaksiyon ürünü olarak H2O2 açığa çıkar. Hazırlanan biyosensörlerin çoğu,
uygulanan sabit potansiyelde çalışma elektrodunun yüzeyinde enzimatik
reaksiyon sonunda oluşan H2O2’in yükseltgenmesi esasına dayanmaktadır
[59-61]. H2O2 aşağıdaki reaksiyona göre oluşmaktadır:
Kolesterol esterleri + H2O
Kolesterol + O2
Kolesterol Esteraz
Kolesterol Oksidaz
Kolesterol + Yağ asidi
Kolest-4-en-3-on + H2O2
Oluşan bu hidrojen peroksit platin elektrot yüzeyinde sabit bir potansiyelde
aşağıdaki reaksiyona göre yükseltgenmektedir [59]:
H2O2
O2 + 2H+ + 2e-
Yükseltgenmenin meydana geleceği bir potansiyelde çalışıldığında devreden
geçen anodik akım oluşan hidrojen peroksitin derişimi, dolayısıyla kolesterol
derişimi ile orantılıdır. Bu çalışmanın prensibi de yukarıdaki prensiple aynı
olmakla beraber daha önce bu film ile kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz
74
enzimlerinin birlikte ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu yüzden yapılan bu
çalışma orjinal bir çalışmadır.
Bu çalışmada Platin/Polipirol-polivinilsülfonat-kolesterol esteraz- kolesterol
oksidaz (Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx) biyosensörü ile enzimatik reaksiyon
sonucunda oluşan hidrojen peroksidin dolayısıyla kolesterol ölçülmesinde
çözeltide ve elektrot yüzeyinde gerçekleşen olaylar şematik olarak aşağıdaki
şekilde gösterilmektedir:
Şekil 4.1. Elektrot yüzeyinde gerçekleşen elektron aktarımı
Bu çalışmada ise polipirol-polivinilsülfonat film elektrotla kolesterol esteraz /
kolesterol oksidaz enzimlerinin immobilize şekline ait analitik ve biyokimyasal
özellikler incelenmiş olup bunlarla ilgili sonuçlar ve yorumları aşağıda
verilmiştir.
4.1. Pt/PPy-PVS Film Elektrodunun Hidrojen Peroksite Duyarlılığının
Belirlenmesi
Kolesterolün, kolesterol oksidaz aracılığıyla kolest-4-en-3-on dönüşümü
sırasında reaksiyon ürünü olarak hidrojen peroksit açığa çıkar. Bu yüzden
hazırlanan biyosensörün temeli de reaksiyon sonucunda açığa çıkan hidrojen
peroksitin elektrot yüzeyinde yükseltgenmesi esasına dayanır. Bu nedenle
75
Bölüm 3.3 ’de belirtildiği gibi hazırlanan Pt/PPy-PVS elektrodun H2O2’ye
duyarlılığı incelendi. Artan H2O2 derişimine karşı elde edilen ∆i değerleri
grafiğe geçirildi. Elde edilen veriler sonucu elektrodun hidrojen peroksite
karşı duyarlı olduğu görüldü. Grafik incelendiğinde elde edilen eğrinin
doğrusallığının (R2=0,999) çok yüksek olduğu görüldü (Şekil 4.2).
400
350
300
R² = 0,999
∆i (µA)
250
200
150
100
50
0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
H2O2 Derişimi , mM
Şekil 4.2. Pt/PPy-PVS elektrodun H2O2’ye duyarlılığı
4.2. Pt/PPy-PVS Film Elektrodun Serbest Enzimli Ortamda Kolesterol
Palmitata Duyarlılığının İncelenmesi
Bölüm 3.5’de bahsedildiği şekilde hazırlanan hücrede serbest enzimin
substratı olan kolesterol palmitat ile reaksiyonu sonucu açığa çıkan H2O2’nin
elektrot yüzeyine difüzlenerek yükseltgenmesi sonucu oluşan anodik akımın
kolesterol palmitat derişiminin artmasıyla arttığı görüldü. Elde edilen ∆i
değerleri grafiğe geçirildi (Şekil 4.3).
76
0,14
0,12
∆i (µA)
0,10
R² = 0,991
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Kolesterol palmitat derişimi , mM
Şekil 4.3. Pt/PPy-PVS film elektrodun serbest enzimli ortamda kolesterol
palmitata duyarlılığı
Grafikte de görüldüğü gibi kolesterol palmitat derişiminin artışına paralel
olarak akımlarda da bir artış gözlenmiştir. Bu sonuç, kolesterol palmitatın
enzimatik reaksiyon sonucu oluşturduğu ürün olan H2O2’nin elektrokimyasal
olarak tespit edilebileceğinin bir göstergesidir.
4.3. Çapraz Bağlama ve Tutuklama Yöntemi ile İmmobilizasyon
Bu çalışmada kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz enzimleri için uygun
immobilizasyon tekniğinin seçilmesi hedeflendi. Bu amaçla Bölüm 3.6.1’de
anlatıldığı gibi çapraz bağlama ve Bölüm 3.6.2’de anlatıldığı gibi tutuklama
yöntemleri kullanılarak biyosensör hazırlandı ve artan kolesterol palmitat
ilaveleri
sonucu
amperometrik
cevap
akımları
kaydedildi.
Her
iki
immobilizasyon tekniği için de elde edilen ∆i değerleri kaydedilerek tek bir
grafikte toplandı (Şekil 4.4). Ayrıca her iki tekniğin tekrarlanabilirliği
kıyaslandı.
77
0,60
a
0,50
b
∆i ( µA )
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Kolesterol Palmitat Derişimi , mM
Şekil 4.4. a) Çapraz Bağlama b) Tutuklama ile immobilizasyon
Grafikte görüldüğü üzere tutuklama yöntemi ile immobilizasyon yapıldığında
çapraz bağlama yöntemine göre daha yüksek akımlar elde edildi. Bunun
nedeni; çapraz bağlama esnasında glutaraldehitin enzimin aktif merkezine
bağlanarak enzimi inhibe edebilmesidir [76]. Ayrıca her iki biyosensörün
tekrar kullanılabilirlikleri de karşılaştırıldı (Şekil 4.5 - 6 ).
0,08
∆i ( µA )
0,06
0,04
0,02
0,00
0
5
10
Ölçüm Sayısı
Şekil 4.5. Tekrarlanabilirlik (Tutuklama yöntemi ile)
15
20
78
0,10
0,08
∆i ( µA )
0,06
0,04
0,02
0,00
0
5
10
15
20
Ölçüm Sayısı
Şekil 4.6. Tekrarlanabilirlik (Çapraz bağlama yöntemi ile)
Tutuklama yöntemi ile hazırlanan biyosensörün 20 ölçme sonunda başlangıç
aktivitesinin yaklaşık % 82,3’sini koruduğu görülürken bağıl standart sapma
değeri %5,96 iken çapraz bağlama yöntemi ile hazırlanan biyosensörün ise
20 ölçme sonunda başlangıç aktivitesinin yaklaşık % 80,5’ ini koruduğu ve
bağıl standart sapma değeri %7,26 olarak bulunmuştur. Bağıl standart
sapma değerleri kıyaslandığında tutuklama yöntemin çapraz bağlama
yöntemine göre daha düşük çıktığı görülmektedir.
Yapılan değerlendirmeler sonucu düşük bağıl satandart sapma değeri ve
yüksek akım değerlerinden dolayı tutuklama yönteminin çapraz bağlama
yöntemine
göre
avantajlıdır.
Bu
nedenle
tutuklama
yöntemi
uygun
immobilizasyon tekniği olarak seçildi.
4.4. SEM (Taramalı Elektron Mikroskopu) Analizi
Bölüm 3.3’de anlatıldığı gibi hazırlanan film elektrot ve Bölüm 3.6.2’de
anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün taramalı elektron mikroskobu ile
çekilen yüzey fotoğrafları sırasıyla Şekil 4.7 ve Şekil 4.8’de gösterilmiştir.
79
Şekil 4.7. Pt/PPy-PVS filminin SEM fotoğrafı
Şekil 4.8. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün SEM fotoğrafı
80
Elektrotların enzimli ve enzimsiz SEM fotoğraflarına bakıldığında ikisinin
birbirinden farklı olduğu
görülmektedir.
PPy filmin
doğal görüntüsü
taneciklidir. Büyültme miktarı artırılarak SEM alındığında bu yapının
karnıbahar yapısına benzediği görülmektedir [74]. Ayrıca dopant miktarı
arttıkça PPy’nin tanecik boyutu artar. Tanecikli yapı artan dopant derişimi
sebebiyle daha sıkışık ve daha düşük gözeneklere sahiptir. Kolesterol
esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri immobilize edildikten sonra
karnabahar
yapısınının
bozulduğu
gözlenmektedir.
Enzimlerin
immobilizasyonu ile yeni bir morfolojik yapı oluşmuştur. Bu morfolojik yapı
bize enzimlerin başarılı bir şekilde Pt/PPy-PVS filme immobilize edildiğini
göstermektedir.
4.5. AFM (Atomik Kuvvet Mikroskopu) Analizi
Bölüm 3.3’de anlatıldığı gibi hazırlanan film elektrot ve Bölüm 3.6.2’de
anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün atomik kuvvet mikroskobu ile çekilen
yüzey fotoğrafları sırasıyla Şekil 4.9 ve Şekil 4.10’ da görülmektedir.
Şekil 4.9. Pt/PPy-PVS filminin AFM fotoğrafı
81
Şekil 4.10. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün AFM fotoğrafı
Enzimli ve enzimsiz yapılar için alınan sonuçlar iki boyutlu ve üç boyutlu
olarak düzenlenmiş olup görüntülerdeki farklılık birbirinden açık bir şekilde
ayırt
edilebilmektedir.
Yapıya
kolesterol
esteraz/kolesterol
oksidaz
enzimlerinin immobilizasyonu işlemiyle yapıda oluşmuş olan rastgele
dağılmış tanecikli yapılar enzimli yapıya atfedilmektedir. Enzimsiz (PPy-PVS)
yapısının yüzey morfolojisi, yapıya kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz
enzimlerinin eklenmesiyle yüzeyde yeni bir morfolojik yapılanma oluşmuştur.
Buna
bağlı
olarak
kolesterol
esteraz/kolesterol
oksidaz
enzimlerinin
immobilizasyon işlemi yüzeyi daha pürüzsüz yapmıştır. Bu sonuç, yüzey
pürüzlülük değeri olan Root Mean Square (RMS) (karekök ortalama)
değerleri ile desteklenmektedir. Enzimli görüntü için RMS değeri 717 nm ve
enzimsiz yapının RMS değeri 884 nm dir.
4.6. Yüzey Temas Açısı Analizi
Bölüm 3.3’ de anlatıldığı şekilde hazırlanan film elektrot ile Bölüm 3.6.2’de
anlatıldığı şekilde hazırlanan biyosensörün yüzey temas açısı fotoğrafları
sırasıyla Şekil 4.11 ve Şekil 4.12’ de görülmektedir.
82
Şekil 4.11. Pt/PPy-PVS filminin yüzey temas açısı fotoğrafı
Şekil 4.12. Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün yüzey temas açısı
fotoğrafı
Yüzeylerin hidrofobik-hidrofilik özelliklerinin belirlenmesi birçok biyokimyasal
uygulamada büyük önem taşımaktadır. Yüzeylerin hidrofilik-hidrofobik
karakterlerinin belirlenmesi için yüzeylerin su değme açısı ölçümleri
alınmaktadır. Her iki şekilde incelendiğinde enzim immobilize edilen filmin
diğer filmden daha yayvan olduğu gözlenmiştir. Bu da bize enzim immobilize
edilen filmin hidrofilik, enzim olmayan filmin ise hidrofobik olduğunu
göstermektedir. Zaten enzimler protein yapısında olduğundan hidrofilik
olması beklediğimiz bir sonuçtur ve buda bize enzimin polimer yüzeye
başarılı bir şekilde immobilize edildiğini göstermektedir. Ayrıca temas açıları
ölçüldüğünde PPy-PVS film elektrodunun temas açısı 51°, PPy-PVS-ChOxChEt biyosensörünün temas açısı ise 22° bulunmuştur. Yüzeyin su değme
açısının 22° olması yüzeyin hidrofilik gruplarca zengin hale geldiğini ve
hidrofilik karakter kazandığını göstermektedir. Bulunan sonuçlar literatür
sonuçları ile de desteklenmektedir [63,75].
83
4.7. Profilometre (Film kalınlığı ölçülmesi)
Bölüm 3.3’ de anlatıldığı şekilde hazırlanan film elektrot ile Bölüm 3.6.2’de
anlatıldığı şekilde hazırlanan biyosensörün film kalınlıkları ölçüldü ve
profilometre spektrumları sırasıyla Şekil 4.13 ve Şekil 4.14’ de görülmektedir.
Şekil 4.13. Pt/PPy-PVS film elektrodun Profilometre spektrumu
Şekil 4.14. Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün Profilometre spektrumu
84
Bunun için yüzeyin üç farklı yerinden ölçüm alındı ve bu üç değerin
ortalaması alınarak film kalınlıkları hesaplandı. Sonuçlar incelendiğinde platin
levha ile PPy-PVS film arasındaki kalınlık farkının ortalaması 20,7 ± 0,33 µm
olarak bulunmuştur. Platin levha ile PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün
yüzeyi arasındaki kalınlık farkının ortalama değeri ise 37,06 ± 0,81 µm olarak
bulunmuştur. Bu sonuçlara bakıldığında biyosensörün film kalınlığının daha
büyük olması sebebiyle yüzeye protein ve enzim moleküllerinin başarılı bir
şekilde immobilize edildiğinin göstermektedir [63].
4.8. Biyosensörün En İyi Çalışma Koşullarının Belirlenmesi
4.8.1. pH etkisi
Biyosensörlerin aktivitesini etkileyen en önemli faktörlerden biri de pH’dır.
Çünkü enzimlerin aktivitesi pH’ya bağlı olarak değişmektedir. Biyosensörün
en iyi çalışma pH’sını belirlemek amacıyla hazırlanan biyosensör ile Bölüm
3.8.1’e göre yapılan deneyler sonucunda elde edilen amperometrik cevap
akımları pH’ya karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.15).
0,24
0,2
∆i (µA)
0,16
0,12
0,08
0,04
0
5
6
7
8
9
10
pH
Şekil 4.15. Biyosensörün aktivitesine pH’ nın etkisi ( 0,1 M fosfat tamponu,
25 ⁰C )
85
Grafik incelendiğinde pH 6,5 ve pH 8,0’de olmak üzere iki maksimum nokta
gözlenmektedir.
Birinci
maksimumdan
sonra
akımların
düşüp
tekrar
yükseldiği ve ikinci maksimumun daha yüksek akım değerine sahip olduğu
görülmektedir. Bundan sonra ise akım değerleri azalmaktadır. Bu sonuç en
iyi çalışma pH değerinden uzaklaştıkça enzimin aktivitesi azalacağından
beklenen bir durumdur. Enzim ve kolesterol molekülleri asidik ve bazik
gruplar olduğundan (E-S) aktifleşmiş kompleksinin en kolay bir şekilde
oluşması yani tepkime hızının maksimum olması için bu grupların belirli bir
iyonlaşma durumunda olması gereklidir. Bunun dışındaki iyonlaşmalarda
(E-S) kompleksinin oluşumu zorlaşacak ve reaksiyon hızı düşeceğinden
akımlardaki
azalma
beklenen
bir
durumdur
[73].
Bundan
sonraki
çalışmalarda en yüksek akım değerinin gözlendiği pH 8,0 değeri seçildi.
Literatürler de ise değişik destek materyallere ikili veya tek olarak immobilize
edilmiş kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz için pH değerleri 7,0; 7,25;
7,4; 7,0; 6,5-7,5 olarak bulunmuştur [42, 43, 1, 54, 45]. Bu veriler
değerlendirildiğinde yapmış olduğumuz çalışma sonucu elde edilen pH
değerinin literatür değerlerine yakın olduğu ancak kullanılan polimerin farklı
olmasından dolayı enzimin en iyi aktivite gösterdiği pH değerinin farklı olduğu
görüldü.
4.8.2. Sıcaklık etkisi
Sıcaklık, enzimlerin kararlılığını ve enzimatik reaksiyonların hızını etkileyen
önemli bir faktördür. Her enzimin maksimum aktivite gösterdiği bir sıcaklık
vardır [36]. Bu nedenle, hazırladığımız biyosensörün cevabının sıcaklıkla
nasıl değiştiğinin incelenmesi önemlidir. Biyosensörün en iyi çalışma
sıcaklığını belirlemek amacıyla hazırlanan biyosensör ile Bölüm 3.8.2’ye göre
yapılan deneyler sonunda elde edilen amperometrik cevap akımları sıcaklığa
karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.16).
86
1
∆i (µA)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Sıcaklık , OC
Şekil 4.16. Biyosensörün aktivitesine sıcaklığın etkisi (0,1 M pH=8,0 fosfat
tamponu)
Grafik incelendiğinde düşük sıcaklık değerlerinde enzimin düşük aktivite
gösterdiği ve amperometrik cevap akımlarının sıcaklık arttıkça arttığı
görülmektedir. Maksimum cevap akımının 60°C’ da olduğu gözlenmiştir.
Ancak maksimum cevap akımının gözlendiği 60°C oldukça yüksek bir
sıcaklıktır ve literatür değerlerinden biraz yüksektir. Ancak bölümümüzde
aynı film ile yapılan tez çalışmalarında da benzer durumlarla karşılaşılmıştır
[62]. Pirolün elektropolimerleşmesiyle elde edilen polipirol(PPy) filmin, aktif
enzimleri
korumak
için
iyi
bir
mikro
çevre
sağlaması
sonucu;
enzimlerin(kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz), 60 oC’de dahi aktifliğini
kaybetmemiştir [80].
Literatürlerde de değişik destek materyallere immobilize edilmiş kolesterol
esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri için 60 °C, 35 °C, 49 °C, 37 °C gibi
sıcaklıklar bulunmuştur [35, 48, 1, 54]. Enzimler protein yapısında
olduklarından
dolayı
yüksek
sıcaklıklarda
enzimin
protein
yapısı
denatürasyona uğrar ve böylelikle aktivitesini kaybeder [73]. Uzun süreli
çalışma durumlarında yüksek sıcaklıkta çalışılması enzim yapısını bozacağı
için bundan sonraki çalışmalar oda sıcaklığında yapılmıştır.
87
4.8.3. Substrat derişiminin etkisi
Enzim derişimi ve diğer bütün şartların sabit olduğu bir ortamda enzimatik
tepkimenin hızı, substrat derişiminin arttırılmasıyla başlangıçta doğrusal bir
artış gösterir; fakat substrat ilave edildikçe enzimin aktif merkezinin dolması
sebebiyle hız giderek daha az artar ve belirli bir düzeyde sabit kalır.
Bölüm 3.8.3’de açıklandığı gibi, Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü ile
0,40 V elektrot potansiyelinde; enzimin substrat doygunluğuna kadar ölçüm
alınmıştır. Elde edilen sonuçlara göre çizilen Michaelis-Menten grafiğine
(Şekil 4.17) bakıldığında, 1,0x10-4 M kolesterol palmitat ilavesinden sonra
cevap akımları sabit kalmaya başlamıştır.
0,3
0,25
∆i (µA)
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Kolesterol Palmitat Derişimi (mM)
Şekil 4.17. Biyosensörün amperometrik cevabına kolesterol palmitat
derişiminin etkisi (Michaels-Menten grafiği) (0,1M pH 8,0 fosfat
tamponu, 25°C)
Michaelis-Menten denklemi bir hiperbolik eğrinin denklemidir ve hiperbolik bir
eğrinin karakteristik noktalarını belirlemek zordur. Bu durumu kolaylaştırmak
için Michaelis-Menten denkleminin tersine çevirilip çarpanlarına ayırılmasıyla
elde edilen denklemin Lineweaver-Burk grafiği (Şekil 4.18) çizildi. Doğrusal
88
olan bu grafikten yararlanılarak çift enzimli elektrot sistemi için KM(gözlenen)
değeri 7,91×10-3 mM, Vmaks(gözlenen) ise 0,21 μA olarak hesaplanmıştır.
Literatürlerde değişik destek materyallere tek ya da birlikte immobilize edilmiş
farklı kaynaklardan saflaştırılmış kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz
enzimleri için KM değerleri 3,3; 1,16; 0,41; 2,72; 9,8 mM [42, 43, 1, 3, 64],
Vmaks ise 5,26; 1,78; 0,908; 1,495 mM/dakika [42, 43, 3, 65] olarak
bulunmuştur. KM değeri enzimin substrata karşı olan ilgisini gösterir. Bulunan
KM değeri literatür değerleri ile karşılaştırıldığında çok düşük değer olarak
bulunmuştur. Bu sonuç kullanılan polipirol-polivinilsülfonat film ile enzimsubstrat ilişkisinin artığını göstermektedir.
14
12
1/∆i (µA-1)
10
y = 0,0376x + 4,7537
R² = 0,9755
8
6
4
2
0
-150
-100
-50
0
50
100
1/ [ Kolesterol palmitat ] (mM
150
-1
200
250
)
Şekil 4.18. Biyosensörün kolesterol palmitata duyarlılığını gösteren
Lineweaver-Burk grafiği (0,1M pH 8,0 fosfat tamponu, 25°C)
Belirli bir miktardaki enzimin reaksiyon hızı ile substrat derişimi arasındaki
ilişki başlangıçta doğrusal olarak devam ederken daha sonra hiperbolik bir
şekil almaktadır. İlişkinin doğrusal olarak devam ettiği aralıkta enzim birinci
dereceden bir kinetik gösterir. Bu aralığın en düşük ve en yüksek derişim
değerleri biyosensörün çalışma aralığını belirlemektedir.
89
Biyosensörün cevap akımları ile artan kolesterol palmitat derişimleri
arasındaki ilişkinin doğrusal olduğu kalibrasyon grafiklerine (Şekil 4.19)
bakıldığında 1,0 x 10-6 M - 1,0 x 10-5 M ve 1,0 x 10-5 M - 1,0 x 10-4 M
aralığında doğrusallığın çok iyi olduğu ve bu aralıkların kantitatif analizlerde
kullanılabileceği söylenebilir.
∆i (µA)
0,06
y = 1,05x + 0,0308
R² = 0,9932
0,04
0,02
0
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,1
0,12
Kolesterol Palmitat Derişimi (mM)
(a)
0,25
y = 0,8619x + 0,1238
R² = 0,975
∆i (µA)
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
Kolesterol Palmitat Derişimi (mM)
(b)
Şekil 4.19. Biyosensörün kalibrasyon grafikleri (a) 1,0 x 10-6 M -1,0 x 10-5 M
(b)1,0 x 10-5 M - 1,0 x 10-4 M çalışma aralığında (0,1M pH 8,0
fosfat tamponu, 25°C)
90
4.8.4. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi
Bölüm 3.8.4’e göre yapılan deneyler sonunda elde edilen amperometrik
cevap akımları ölçme sayısına karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.20). Şekil
incelendiğinde ölçme sayısı arttıkça akımlarda azalma olduğu görülmektedir.
Akımlardaki bu düşmelerin zamanla enzim aktivitesindeki değişmeden
kaynaklandığı söylenebilir. Biyosensörün 30 ölçüm sonunda başlangıç
aktivitesinin yaklaşık % 85,2 ’sını koruduğu görülmektedir. Bağıl standart
sapma 5,0x10-5 M kolesterol palmitat derişimi için % 8,25 olarak
hesaplanmıştır. Biyosensörün zamanla aktivitesinin çok fazla değişmemesi
kullanılan
immobilizasyon
tekniğinin
iyi
olduğunu
göstermektedir.
Tekrarlanabilirlik biyosensör için çok önemli olup hazırlanan biyosensörle
arka arkaya fazla sayıda analiz yapabileceğimizi göstermektedir. Rutin
analizlerde tek ölçmede kullanılan kitler maliyet açısından pahalı olduğu için
bu şekilde hazırlanan bir biyosensör daha avantajlıdır. Bulunan sonuç
literatür değerleri ile karşılaştırıldığında hazırlanan biyosensörün tekrar
kullanılabilirliğinin iyi olduğu söylenebilir [42, 43].
0,06
0,05
∆i (µA)
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Ölçüm Sayısı
Şekil 4.20. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi (0,1M pH 8,0
fosfat tamponu, 25°C)
91
4.8.5. Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi
Bölüm 3.8.5’e göre yapılan deneyler sonunda elde edilen amperometrik
cevap akımları ölçüm yapılan gün sayısına karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.21).
Şekil incelendiğinde 60 gün sonunda biyosensörün aktivitesinin %68‘lik
kısmının kaybedildiği gözlenmiştir. Yani biyosensörün başlangıç aktivitesinin
yaklaşık %32’sini koruduğu görülmektedir. Enzimin aktif merkezinde
sıcaklığın, havanın ve bazı kimyasal maddelerin etkisi ile değişiklikler
meydana gelmesi ya da aktif merkezdeki grupların çevresindeki diğer
gruplarla etkileşmesi sonucu biyosensörün aktivitesinde zamanla meydana
gelen azalma beklenen bir sonuçtur. Bulunan sonucun literatür değerlerinde
ise ilk on gün, ilk altı hafta, ilk onbir gün hafta stabilitesini koruyan
biyosensörler olduğu gibi yirmiüç günde aktivitesini %40 kaybeden ve
yetmişsekiz günde aktivitesinin %73’ini kaybeden biyosensörler de vardır [4243].
0,06
Akım Farkı, ∆i (µA)
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Gün
Şekil 4.21. Biyosensörün raf ömrünün incelenmesi (0,1M pH 8,0 fosfat
tamponu, 25°C)
92
4.9. Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler
Hazırlanan biyosensörün amperometrik cevap akımına askorbik asit,
parasetamol, glukoz ve ürik asidin girişim etkileri Bölüm 3.9’da belirtildiği gibi
incelenmiş ve elde edilen sonuçlar Çizelge 4.1’de verilmiştir.
Çizelge 4.1. Biyosensör üzerine (1x10-5 M kolesterol palmitat derişiminde )
girişim yapan maddeler ve girişim etkileri
Çalışılan
derişim
(M)
Toplam
cevap
akımı (μA)
Girişim yapan
maddenin
cevap akımı
(μA)
Girişim yapan
maddenin cevap
akımının toplam
akıma oranı (%)
Ürik Asit
3,0x10-4
1,873
1,773
94,66
Ürik Asit
1,0x10-5
0,080
0,038
47,32
Ürik Asit
1,5x10-6
0,066
0,011
16,67
5,0x10-6
0,079
0,037
46,84
5,0x10-7
0,058
0,004
6,89
5,0x10-6
0,079
0,037
46,83
Parasetamol
5,0x10-7
0,059
0,004
6,78
Glukoz
5,0x10-3
0,048
0,007
14,58
1,0x10-4
0,043
0,001
2,32
Girişim
Yapan
Maddeler
Askorbik
Asit
Askorbik
Asit
Parasetamol
Glukoz
Çizelge 4.1 incelendiğinde ürik asit, askorbik asit, parasetamol ve glukozun
biyosensörün amperometrik cevap akımına girişim etkileri sırasıyla % 94,66,
%46,84, %46,83 ve % 14,58 olarak bulunmuştur. Bu girişim değerleri oldukça
yüksektir. Askorbik asidin ciddi girişimlere sebep olduğu ve bu girişim
etkisinin büyük oranlarda seyreltme, salatalık suyu ilavesi ve doğrudan
askorbik asidi yükseltgeyen
askorbat
oksidaz ilavesi
yöntemleri ile
giderilmeye çalışıldığı literatürlerde belirtilmektedir [66-69]. Parasetamolün
93
girişim etkisi ise büyük oranda seyreltmeler yapılarak giderilebildiği
literatürlerde belirtilmiştir [70].
4.10. Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini
Biyolojik sıvıda yapılan kolesterol analizi sonunda ölçülen amperometrik
cevap akımlarına karşı gelen derişim değerleri standart ekleme yöntemiyle
hesaplandı ve elde edilen sonuçlar Çizelge 4.2’de verildi.
Çizelge 4.2. Kan numunelerinde hesaplanan kolesterol derişimleri
1
Sonuçlar
(Biyosensör ile)
(mg/dL)
188±0,71
Hastane Sonuçları
(Enzim esaslı spektrofotometrik
yöntem ile) (mg/dL)
180
2
141±4,59
123
3
213±4,24
189
4
154±1,06
145
5
170±3,54
162
Kan Numunesi
94
4.11. Sonuç
Hazırlanan kolesterol biyosensörün;

Doğrusal çalışma aralığı oldukça geniştir. 1,0 x 10-6 M -1,0 x 10-5 M ve
1,0 x 10-5 M - 1,0 x 10-4 M arasında bulundu. İki farklı aralığında
doğrusallığın çok iyi olduğu ve bu aralıkların kantitatif analizlerde
kullanılabileceği söylenebilir.

Biyolojik sıvıda (kanda) kolesterol tayini 1,0 x 10-5 M - 1,0 x 10-4 M
çalışma aralığında yapıldı.

En iyi çalışma pH’sı 8,0 olarak bulundu.

En iyi çalışma sıcaklığı 60°C olarak bulundu.

Hazırlanan
Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx
biyosensörü
için
Km(gözlenen)
değeri 7,91×10-3 mM ve Imaks(gözlenen) ise 0,21 μA olarak bulundu.
Km değeri literatür değerleri ile karşılaştırıldığında çok düşük değer
olarak
bulundu.
Bu
sonuç
kullanılan
polipirol-polivinilsülfonatın
medyatör kullanılmasına gerek olmaksızın enzimin substratına olan
ilgisini arttırdığı görülür.

Tekrar
kullanılabilirliği
oldukça
yüksektir.
(30
ölçüm
sonunda
biyosensörün aktivitesini %85,2 oranında koruduğu görülmüştür). Bu
elektrot çok miktarda kolesterol ölçümleri için uygundur.

60 günün sonunda başlangıç amperometrik cevabının yaklaşık % 68
‘ini
kaybettiği
tutunmasının
görülmüştür.
zayıf
yitirmesinden dolayıdır.
Bu
olmasından
durum
enzimlerin
yüzeydeki
enzimin
zamanla
aktivitesini
95
KAYNAKLAR
1. Singh, S., Chaubey, A., Malhotra, B.D., “Amperometric cholesterol
biosensor based on immobilized cholesterol esterase and cholesterol
oxidase on conduction polypyrrole films”, Analytica Chimica Acta,
502: 229-234 (2004).
2. Isobe, K., Shoji, K., Nakanıshı, Y., Yokoe, M., Wakao, N., “Purification
and some properties of cholesterol oxidase stable in detergents frod γprobacterium Y-134”, Journal of Biosicience and Bioengineering,
95(3): 257-263 (2003).
3. Wang, H., Mu, S., “Bioelectrochemical characteristics of cholesterol
immobilized in a polyaniline film”, Sensor and Actuators, 56: 22-30
(1999).
4. Li, G., Liao, J. M., Hu, G. Q., Ma, N. Z., Wu, P. J., “Study of carbon
nanotube modified biosensor for monitoring total cholesterol in blood”,
Biosensors Bioelectronics, 20: 2140-2144 (2005).
5. Solanki, R.P., Singh, S., Prabhakar, N., Pandey M.K., Malhotra,
B.D.,“Application of conducting poly(aniline-co-pyrrole) film to
cholesterolbiosensor”, Journal of Applied Polymer Science, 105:
3211-3219 (2007).
6. Khan, R., Kaushik A., Mishra, A.P., “Immobilization of cholesterol
oxidase onto electrochemically polymerized film of biocompatible
polyaniline-Triton X-100”, Materials Science and Engineering C,
29:1399–1403 (2009).
7. Söyler, M., “Van kedisi eritrositlerinden karbonik anhidraz enziminin
saflastırılması ve karakterizasyonu”, Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü, Van, 1(2006).
8. Keha E., Küfrevioğlu Ö.İ., “Biyokimya”, Aktif Yayınevi, 91-139 (2009).
9. Tüzün, C., “Biyokimya”, Palme Yayıncılık, Ankara, 485 (2002).
10. Fennema, O.R., “Food Chemistry,2nd ed.”, Macel Dekker Inc., New
York, 994 (1985).
11. Telefoncu,
A.,
”İmmobilize
Enzimler
ve
İmmobilizasyon
Yöntemleri”,Temel ve Uygulamalı Enzimoloji Biyokimya Lisans
Üstü Yaz Okulu, İzmir, 1-16, 193-249 (1986).
12. Hui, D.Y., and Howles, P.N., “Carboxyl ester lipase:structure-function
relationship and physiological role in lipoportein metabolism and
atherosclerosis”, Journal of Lipid Research , 43: 2017-30 (2002).
96
13. Vahouny, G.V., Weersing, S., and Treadwell, C.R., “Taurocholate
protection of cholesterol esterase against proteolytic inactivation” ,
Biochem.and Biophys. Res. Commun., 15(3): 224-229 (1964).
14. Hernandez, H., and Chaikoff, I., “Purification and properties of
pancreatic
cholesterol
esterase”,
Journal
of
Biological
Chemistry, 228(1): 447-457 (1957).
15. Allain, C.C., Poon, L.S., Chan, C.S.G., Richmond, W., and Fu,
P.C., Enzymatic determination of total serum cholesterol , Clinical
Chemistry, 20: 470-475 (1974).
16. Rudd, E., Mizuno, N., and Brockman, H.; “Isolation of two forms of
carboxylester lipase (cholesterol esterase) from porcine pancreas”,
Biochimica. Biophys. Acta, 918: 106-114 (1987).
17. Bailey, J.E., Ollis, F.D., “Biochemical Engineering Fundementals 2nd
ed.”, McGraw Hill International Editions, 984 (1986).
18. Fujishiro, K., Uchida, H., Shimokawa, K., Nakano, M., Sano, F., Ohta,
T.,Kayahara, N., Aisaka, K., Uwajima, T., “Purification and propperties
on a newbrevibacterium sterolicum cholesterol oxidase produce by
e.coli mm294/pnh10”,FEMS Microbiology Letters, 215: 243-248
(2002).
19. Yin, Y., Liu, P., Anderson, G.W.R., Sompson, S.N., “Construction of a
catalytical inactive cholesterol oxidase mutant: inversigation of the
interplay between active side-residues glutamate 361 and histidine
447”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 402: 235-242
(2002).
20. Akgöl, S., Bayramoğlu, G., Kacar, Y., Denizli, A., Arıca, M.Y.,
“Poly(hdyroxyethyl methacrylate-co-glycidly methacylate) reactive
membrane utilised for cholesterol oxidase immobilisation”, Polymer
International, 51: 1316-1322 (2002).
21. Nishiya, Y., Hirayama, N., “Alteration of substrate affinity of
streptomyces cholesterol oxidase application to the rate assay of
cholesterol serum”, Clinica Chimica Acta, 287: 111-122 (1999).
22. Coulombe, R., Yue, K.Q., Ghisla, S., Vrielink, A., “Oxygen access to
the active side of cholesterol oxidase through a narrow channel ıs
gated by an arg-glupair”, The Journal Of Biological Chemistry,
276(32): 30435-30441 (2001).
97
23. Suman, Pundir, C.S., “Co-immobilization of cholesterol esterase,
cholesteroloxidase and peroxidase onto alcylamine glass beads for
measurement of totalcholesterol in serum”, Current Applied Physics,
3: 129-133 (2003).
24. MacLachlan, J., Wotherspoon, A.T.L., Ansell, R.O., Brooks, C.J.W.,
“Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical
applications”, Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology,
72: 69-195 (2000).
25. Bokoch, M.P., Devadoss, A., Palencsar, M.S., Burgess, J.D., “Steadystate oxidation of cholesterol catalyzed by cholesterol oxidase in lipid
bilayer membranes on platinum electrodes”, Analytica Chimica Acta,
519: 47-55 (2004).
26. Raghavan, V., Ramanathan, K., Sundaram, P.V., Danielsson, B., “An
enzyme thermistor-based assay for total and free cholesterol”, Clinica
Chimica Acta, 289: 145-158 (1999).
27. Shen, Z., Corbin, D.R., Greenplate, T.J., Grebenok, R.J., Galbraith,
D.W., Purcell, J.P., “Studies on the mode of action of cholesterol
oxidase on ınsect midgut membranes”, Archives of Insect
Biochemistry and Physiology, 34: 429-442 (1997).
28. Turner, A. P. F., Biosensors fundamental and applications , Çeviri
Editörleri, Turner, A. P. F., Karube, I. And Wilson, G. S., Oxford
University Press, Oxford, 5-7 (1987).
29. Telefoncu, A., “Biyosensörlere genel bakış”, Biyosensörler,
Biyokimya Lisans Üstü Yazokulu, Kuşadası, 1-9 (1999).
30. Mulchandani, A.,“Enzim and microbial biosensors tecniques and
protocols”,Methods in Biotechnology ,Ed: Mulchandani, A., Rogers, K.
R., Humana press Inc, Totowa, 3-11 (1998) .
31. Topçu, M., “Altın biriktirilmis polivinil ferrosen modifiye Pt
elektrodunutemel alan glukoz biyosensörünün gelistirilmesi”,
Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 2122(2003).
32. Gooding, J.J., “Biosensor technology for detecting biological warfare
agents: Recent progress and future trends”, Analytica Chimica Acta,
559: 137–151(2006).
33. Ateş M. “Polimerizasyon ve polimerler hakkında genel bilgi”, Orta
Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara, 7-18 (1998).
98
34. Akbulut U., “İletken polimerlerle transduser hazırlanması”,
Biyosensörler, Telefoncu A, Biyokimya Lisans Üstü Yazokulu,
Kuşadası, 10-16 (1999).
35. Gerard, M., Chaubey, A., Malhotra, B.D., “Application of conducting
polymers to biosensors”, Biosensors & Bioelectronics, 17: 345–359
(2002).
36. Telefoncu, A., “Biyoreseptör immobilizasyonu”, Biyosensörler,
Biyokimya Lisans Üstü Yazokulu, Kuşadası, 42-61 (1999).
37. Mulchandani, A., “Enzim and microbial biosensors tecniques and
protocols”, Methods in Biotechnology ,Ed: Mulchandani, A., Rogers, K.
R., Humana press Inc., Totowa, 143-147 (1998) .
38. Dinçkaya, E., Telefoncu, A., “Enzim sensörleri”, Biyosensörler,
Biyokimya Lisans Üstü Yazokulu, Kuşadası, 81-139 (1999).
39. Arslan, F., “Ksantin tayini için polipirol filme ksantin oksidaz enziminin
immobilizasyonu ile yeni bir enzim elektrot hazırlanması”, Doktora
Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 31-42
(2004).
40. Chiang, C.K., Fincher, C.R., Park, Y.W., Heeger, A.J., Shirakawa, H.,
Louis, E.J., Gau, S.C. ve Macdiarmid, A.G., “Electrical conductivity in
doped polyacetylene”, Phys. Rev. Lett., 39,1098-1101 (1977).
41. Ustabaş, S., “Glukoz tayini için yeni bir biyosensör hazırlanması”, Gazi
Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara,1-35 (2010).
42. Muhammet, S.M., “Kolesterol tayini için biyosensör hazırlanması”,
DoktoraTezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 4462 (2008).
43. Yıldırımoğlu, F., “Kolesterol tayini için yeni bir biyosensör
hazırlanması”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Ankara, 51-60 (2009).
44. Özer, C.B., Özyörük, H., Çelebi, S.S., Yıldız, A., “Amperometric
enzyme electrode for free cholesterol determination prepared with
cholesterol oxidase immobilized in poly(vinylferrocenium) film”,
Enzyme and Microbial Technology, 40: 262-265 (2007).
45. Singh, S., Solanki, P.R., Pandey, M.K., Malhotra, B.D., “Covalent
immobilization of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on
polyaniline films for application to cholesterol biosensor”, Analytica
Chimica Acta, 568:126-132 (2006).
99
46. Çırpan, A., Alkan, S., Toppare, L., Cıanga, I., Yağcı, Y.,
“Immobilization of cholesterol oxidase in a conducting copolymer of
thiophene-3-yl acetic acid cholesteryl ester with pyrrole”, Designed
Monomers and Polymers, 6(3): 237-243 (2003).
47. Basu, A. K., Chattopadhyay, P., Roychoudhuri, U., Chakraborty, R.,
“Development of cholesterol biosensor based on immobilized
cholesterol esterase and cholesterol oxidase on oxygen electrode for
the determination of total cholesterol in food samples”,
Bioelectrochemistry, 70: 375–379 (2007).
48. Singh, S., Singhal, R., Malhotra, B.D., “Immobilization of cholesterol
esterase and cholesterol oxidase onto sol–gel films for application to
cholesterol biosensor”, Analytica Chimica Acta, 582: 335–343(2007).
49. Huy, N.L., Thuy, N.T., Binh, N.H., Thinh, N.N., Lam, T.D., “Covalent
immobilization of cholesterol oxidase and poly(styrene-co-acrylic acid)
magnetic microspheres on polyaniline films for amperometric
cholesterol biosensing”, Anal. Methods, 5: 1392–1398 (2013).
50. Chauhan, N., Narang, J., S. Pundir C., “Amperometric determination
of serum cholesterol with pencil graphite rod”, American Journal of
Analytical Chemistry, 2: 41-46 (2010).
51. Basniwal, R.K., Pratap R., Chauhan , S., Parvez, S., “Development
of a cholesterol biosensor by chronoamperometric deposition of
polyaniline-Ag nanocomposites”, International Journal of Polymeric
Materials and Polymeric Biomaterials, 62(9), 493-498 (2013).
52. Khan, R., Kaushik, A., Singh, S. P., Malhotra, B. D., “Cholesterol
biosensor based on electrochemically prepared polyaniline conducting
polymer film in presence of a nonionic surfactant”, J Polym Res
,16:363–373 (2009).
53. Chauhan, N., and Pundir, C. S., “Co-immobilization of cholesterol
esterase, cholesterol oxidase and peroxidase on PVC strip for serum
cholesterol determination”, Anal. Methods, 3 :1360–1365 (2011).
54. Türkarslan,Ö., Kayahan, S.K., Toppare L., “Poly(pyrrole) versus
poly(3,4-ethylenedioxythiophene): amperometric cholesterol biosensor
matrices”, J Solid State Electrochem., 13:657–663 (2009).
55. Arnold, S., Donnert, C., “Directed evolution of industrial enzymes”,
Trens in Biotechnology, 17:135-136(1999).
100
56. Singh, K., Basu, T., Solanki , P.R., Malhotra, B.D., “Poly (pyrrole-coN-methyl pyrrole) for application to cholesterol sensor”, Journal of
Materials Science, 44:954–961(2009).
57. Kumar, S., Singh, J., Agrawal, V. V., Malhotra B. D., “Biocompatible
self-assembled
monolayer
platform
based
on
(3glycidoxypropyl)trimethoxysilane for total cholesterol estimation”,
Anal. Methods, 3:2237–2245 (2011).
58. Singh, K.,
Solanki, P.R.,
Basu, T., and Malhotra, B. D.,
“Polypyrrole/multiwalled carbon nanotubesbased biosensor for
cholesterol estimation”, Polymers Advanced Technologies, 23
:1084–1091 (2012).
59. Hoshi, T., Saiki, H., Anzai, J., “Amperometric uric acid sensors based
on polyelectrolyte multilater films” ,Talanta, 61: 363-368 (2003).
60. Kuwabata, S., Nakaminami, T., Ito, S., Yoneyama, H., “Preparation
and properties of amperometric uric acid sensors”, Sensors and
Actuators., 52: 72-77 (1998).
61. Suzuki, M., Takayanagi, T., Yashiro, T., “Use of the o-Phenilendiamine
fluorescence system in the enzymatic assay of serum uric acid”,
Chem.Pharm.Bull., 39: 2745-2747 (1991).
62. Özdemir, M., “Kolin tayini icin polpirol-polivinilsülfonat filme kolin
oksidaz enzimlerinin immobilizasyonu ile biyosensör hazırlanması”,
Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,
Ankara, 75-77 (2012).
63. Bal, Ö., “Biyolojik sıvıda glukozun tayini icin polipirol filme glukoz
oksidaz enziminin immobilizasyonu ile yeni bir biyosensör
hazırlanması”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Ankara, 72-73 (2012).
64. Tan, X., Li, M., Cai, P., Luo, L., Zou, X., “An amperometric cholesterol
biosensor based on multiwalled carbon nanotubes and organically
modified solgel/ chitosan hybrid composite film”, Analytical
Biochemistry, 337: 111-120 (2005).
65. Vidal, J.C., Garcia, E.R., Castillo, J.R., “Development of a platinized
and ferrocene-mediated cholesterol amperometric biosensor based on
electropolymerization of polypyrrole in a flow system”, Analytical
Sciences, 18: 537-542 (2002).
66. Hoshi, T., Saiki, H. and Anzai, J., “Amperometric uric acid sensors
based on polyelectrolyte multilater films”, Talanta, 61:363-368 (2003).
101
67. Junior, L. R., Fernandes, J. R. and Kubota, L. T., “Determination of
salicylate in blood serum using an amperometric biosensor based on
salicylate hydroxylase immobilized in a polypyrorole-glutaraldehyde
matrix”, Talanta, 51:547-557 (2000).
68. Gilmartin, M. A. T. and Hart, J. P., “ Novel, reagentless, amperometric
biosensor for uric acid based on a chemically modified screen-printed
carbon electrode coated with cellulose acetate and uricase”, Analyst.,
119:833-840 (1994).
69. Motonaka, J., Miyata, K. and Faulkner, L. R., “Micro enzyme-sensor
with osmium complex and a porous carbon for measuring uric acid”,
Analytical Letters, 27 (1): 1-13 (1994).
70. Yao, D., Vlessidis, A. G. and Evmiridis, N. P., “Microdialysis sampling
and monitoring of uric acid in vivo by a chemiluminescence reaction
and an enzyme on immobilized chitosan support membrane”, Anal.
Chim. Acta, 478: 23-30 (2003).
71. Qiong, C., Tuzhi, P., “Silk fibroin/cellulose asetate membrane
electrodes incorporating xanthine oxidase for the determination or fish
freshness”, Analytica Chimica Acta., 369:245-251 (1998).
72. Chaubey, A., Gerard, M., Singhal, R., Singh, V.S., Malhotra, B.D.,
“Immobilization of lactate dehydrogenase on electrochemically
prepared polypirrole-polivinylsulfonate somposite films for application
to lactate biosensors”, Electrochemica Acta., 46:723-729 (2000).
73. Çete, S., “ Ürik Asit Tayini İçin Biyosensör Hazırlanması” Doktora Tezi,
Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, (2005).
74. Chetna D., S.P. Singh., Sunil K. Arya., Monika Datta.,B.D. Malhotra.,
Cholesterol biosensor based on electrophoretically deposited
conducting polymer film derived from nano-structured polyaniline
colloidal suspension’ Analytica Chimica Acta., 602:244-251( 2007 ).
75. Abbasian, A., Ghaffarian, S.R., Mohammadi, N., Fallahi, D., “The
contact angle of thin-uncured eopxy films: Thickness effect ”, Colloids
and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects,
236:133-140(2004).
76. Karpuz, G., “Polipirol–paratoluensülfonat (ppy-pts) filme ürikaz
enziminin immobilizasyonu ile yeni bir biyosensör hazırlanması”,
Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,
Ankara, 57-58 (2013).
77. Trojanowicz, M., Krawczyk, T.K., “Electrochemical biosensors based
on enzymes immobilized in electropolymerized films”, Mikrochim.
Acta, 121,167-181 (1995).
102
78. Çalışkan, S., “Kreatin tayini için yeni bir amperometrik biyosensör
hazırlanması”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Ankara, 54-56 (2012).
79. Dolmacı, N., “Balık eti tazeliğinin tespiti için ksantin oksidaz enziminin
polipirol-polivinilsülfonat filme immobilizasyonu ile amperometrik
biyosensör hazırlanması”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 48-50 (2009).
80. Chen, C., Jiang, Y., Kan, J., “A noninterference polypyrrole glucose
biosensor”, Biosensor and Bioelectronics, 22:639-643(2006).
103
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Soyadı, Adı
: BAŞAK, Nevim
Uyruğu
: T.C.
Doğum tarihi ve yeri : 24.10.1988 ANKARA
Medeni hali
: Bekar
e-mail
: [email protected]
Eğitim
Derece
Eğitim Birimi
Lisans
Gazi Üniversitesi/ Kimya Bölümü
2011
Lise
Polatlı (Y.D.A) Lisesi
2006
Yabancı Dil
İngilizce
Mezuniyet Tarihi