376\377\000E\000B\000V\000 \000R\000e\000a

IVD
Sadece in Vitro Diagnostic Kullanım için
EBV Real-TM Quant
El Kitabı
Kalitatif Tespiti için Real Time PCR kiti
Epstein Barr Virüs (EBV)
REF V9-50FRT
REF V9-100FRT
REF TV9-50FRT
REF TV9-100FRT
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
ADI
EBV Real-TM Quant
GİRİŞ
EBV bir DNA virüsü, herpes ailesinin üyesi ve mononükleozun nedeni olarak bilinmektedir. Daha
ciddi, nadir de olsa, EBV enfeksiyonu sonucu çeşitli şekillerde malign transformasyon ve kanser
gelişir, Burkitt lenfoma ve nazofarenks karsinomu, Çin'in en yaygın kanseri de dahil. Burkitt lenfoma
(BL) 100 000'de 6-7 vaka yıllık oran ile ve 6 ya da 7 yaşta yılda bir en yüksek oranı ile Afrika ve
Yeni Gine orta kesimlerinde endemik olan EBV ile ilişkili tümör malign şeklidir. Burkitt lenfoması
EBV epidemiyolojik tutulumu EBV viral kapsid antijene karşı bir yükseltilmiş antikor titresi (VCA) ile
ilişkili, tümör hücrelerinde EBV viral genomun tanınmasına dayanmaktadır.
Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonunun primer yeri orofaringeal boşluktur. Çocuklar ve
gençler genellikle, genellikle oral temas ettikten sonra tutulmuş bulunmaktadır, bu nedenle adı
"öpücük hastalığı". Serolojiye dayanarak, Dünya yetişkin nüfusunun yaklaşık% 95'i primer
enfeksiyon sonrasında EBV ile enfekte edilmiş ve virüsün yaşam boyu taşıyıcısı kalır. EBV
dinlenme insan B lenfositleri ve epitel hücreleri enfekte eder, ikincisinde çarpar ve bellek Blenfositlerinde gizli bir enfeksiyon oluşturur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aynı zamanda
Hodgkin lenfoma (HL) ve lemfoproliferatif hastalık bağışıklığı bastırılmış hastalarda, hem de bazı
T-hücre lenfoma ve gastrik kanser gibi diğer epitelyal tümörleri gibi B-hücresi habisliklerine ilişkili
olduğunu EBV göstermiştir. Bu tümörler, tümör hücrelerinde viral genomun birden fazla
kromozom dışı kopya varlığı ve EBV genomunun bir parçası ekspresyonu ile karakterize edilir.
KULLANIM AMACI
EBV Real-TM Quant kiti Epstein Barr Virüsün kalitatif ve kantitatif tespit için bir Real Time testidir.
Epstein Barr Virus.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
TAHLİL PRENSİBİ
EBV Real-TM Quant kiti biyolojik materyallaerde Epstein Barr Virüsün kalitatif ve kantitatif tespit için bir
Real Time testidir. DNA, numunelerden ekstre, amplifiye edilir ve EBV DNA Internal Kontrol IC ve
endojen IC glob (globin gen) için belirli bir flüoresan raportör boya probları kullanılarak tespit
edilir.
Globin gen DNA insan genomunun DNA parçasıdır ve bu hücrelerden elde edilen DNA örneğinde
yeterli miktarda mevcut olması gerekmektedir. En az 20 000 genom numune başına (10 000 hücre
DNA) olmalıdır. Internal Kontrol (IC), plazma salgı, amniyotik sıvı, balgam, bronşiyal yıkama ve diğer
hücre veya düşük DNA içeren materyaller örnek hazırlama sırasında ilave edilir. her biri tek tek işlenen
numune için bir amplifikasyon kontrol olarak hizmet vermektedir ve endojen IC (globin gen) süresinde
olası reaksiyon inhibisyonunu belirlemek için, sadece analiz adımların kontrollünü sağlamaz, elde
edilen tüm hücre örneklerinde (tam kan, lökosit, biyopsi ve otopsi malzeme, tükürük, bezlerden)
sunulmuştur, ama aynı zamanda örnek işleme saklama değerlendirilir. EBV LMP-gen DNA
amplifikasyonu JOE(Sarı)/HEX/Cy3 kanalında, IC glob (- globin gen) DNA amplifikasyon FAM (Yeşil)
kanal ve eksojen Internal Kontrol IC Rox (Turuncu)/TexasKırmızıkanalında algılandığında tespit edilir.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
SAĞLANAN MALZEMELER
Module No.1: Real Time PCR kit
İçindekiler
Ref. V9-50FRT
Ref. V9-100FRT
50 reaksiyon
100 reaksiyon
EBV Real-TM Quant Real Time Amplifikasyon
PCR-mix-1
0,6 ml
2 x 0,6 ml
PCR-buffer FRT
0,3 ml
2 x 0,3 ml
Hot Start DNA Polymerase
0,03 ml
2 x 0,03 ml
TE-buffer
0,5 ml
0,5 ml
Negative Control C-*
1,2 ml
1,2 ml
EBV DNA&IC Glob C+**
0,1 ml
2 x 0,1 ml
Internal Control IC***
0,6 ml
2 x 0,6 ml
o QSG1
0,1 ml
0,2 ml
o QSG2
0,1 ml
0,2 ml
Standard EBV DNA/IC glob
numune hazırlama prosedür sırasında kullanılmalı: etiketli Cneg için 100 µl C- (Negative Control),
ekleyin;
** CPOs etiketli tüpe 90 µl C- (Negative Control) ve 10 µl EBV DNA&IC Glob C ekleyin
*
*** 10 µl Internal (iç) Kontrol RNA'yı , RNA purifikasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına
ekleyin.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
Module No.2: DNA purification kiti ile Complete Real Time PCR testi
Ref. TV9-50FRT
Ref. TV9-100FRT
50 reaksiyon
100 reaksiyon
Lysis Solution
15 ml
2 x 15 ml
Washing Solution 1
15 ml
2 x 15 ml
Washing Solution 2
50 ml
2 x 50 ml
İçindekiler
DNA-Sorb-B: Klinik örneklerden DNA izolasyonu
Sorbent
DNA-eluent
1,25 ml
2 x 1,25 ml
5 ml
2 x 5 ml
EBV Real-TM Quant Real Time Amplifikasyon
PCR-mix-1
0,6 ml
2 x 0,6 ml
PCR-buffer FRT
0,3 ml
2 x 0,3 ml
Hot Start DNA Polymerase
0,03 ml
2 x 0,03 ml
TE-buffer
0,5 ml
0,5 ml
Negative Control C-*
1,2 ml
1,2 ml
EBV DNA&IC Glob C+**
0,1 ml
2 x 0,1 ml
Internal Control IC***
0,6 ml
2 x 0,6 ml
o QSG1
0,1 ml
0,2 ml
o QSG2
0,1 ml
0,2 ml
Standard EBV DNA/IC glob
numune hazırlama prosedür sırasında kullanılmalı: etiketli Cneg için 100 µl C- (Negative Control),
ekleyin;
** CPOs etiketli tüpe 90 µl C- (Negative Control) ve 10 µl EBV DNA&IC Glob C ekleyin
*
*** 10 µl Internal (iç) Kontrol RNA'yı , RNA purifikasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına
ekleyin.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
SAĞLANMAYAN GEREKLİ MALZEMELER
Alan 1 : Numune Hazırlama
DNA ekstraksiyon kiti (Modül No.
1) Biyolojik kabin
"eppendorf" tip tüpler için masaüstü mikrosantrifüj
60°C ± 5°C kuru ısı bloğu
Vorteks mikser
Pipetler (ayarlanabilir)
1,5 ml'lik polipropilen steril tüpler,
Tek kullanımlık eldiven, pudrasız
Biyolojik tehlike atık bidonu,
Buzdolabı, Dondurucu
Alan 2: RT ve amplifikasyon
"eppendorf" tip tüpler için masaüstü mikrosantrifüj
Vorteks mikser
Tek kullanımlık eldiven,
pudrasız Biyolojik tehlike atık
bidonu, Buzdolabı, Dondurucu
Real Time Thermal cycler
Çalışma İstasyonu
Pipetler (ayarlanabilir)
Filtreli steril pipet uçları
MUHAFAZA KOŞULLARI
EBV Real-TM Quant -20°C de saklanmal. EBV Real-TM Quant kiti sevkedilebilir
2-8°C de ama hemen alınması üzerine, -20 ° C'de
saklanmalıdır. DNA-Sorb-B 2-25°C de saklayın.
STABİLİTE
EBV Real-TM Quant etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı
kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır . Işık, ısı veya neme maruz kalma kitin bazı
bileşenlerinin raf ömrünü etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden,
reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır.
KALİTE KONTROL
Her lot , tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; Sacace ISO 13485-Sertifikalı Kalite Yönetim
Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
UYARILAR VE ÖNLEMLER
In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz
Sadece In Vitro Diagnostic Kullanım için
Kullanıcı her zaman aşağıdakilere dikkat etmelidir:
Lysis Solution ,guanidine thiocyanate* içerir. Guanidin tiyosiyanat solunduğunda veya
yutulduğunda veya deri ile temas halinde zararlıdır. Asit ile temasında toksik gaz oluşturur.
(Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39).
Aeresol bariyerli steril pipet ucuları kullanın ve her prosedür için yeni pipet ucu
kulanın.
Ekstrakte pozitif malzemeleri (numuneler, controller ve amplikonlar) diğer reaktiflerden uzak
tutun/mufaza edin ve bunları reaksiyon karışımına ayrı bir alanda ekleyin.
Bütün bileşenleri tahilile başlamadan önce oda sıcaklığında iyice çözün.
Bileşenler çözündüğünde karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin.
Reaktif ve örnekler ile çalışırken , atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu kullanın.
İşlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın.
Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi birşey yemeyin- içmeyin, kozmetik
uygulamayın veya kontakt lenslere elle dokunmayın. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri
kullanmayın.
Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri ,yerel yönetim kurallarına uygun olarak imha edin.
.
Örnekler potansiyel enfeksiyöz olabilir , işlemleri uygun biyogüvenlik uygulamaları ile bir güvenlik
kabini içerisinde gerçekleştirin.
Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya
diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin.
Numune veya reaktiflerin deri, göz veya mukoza zarları ile temasından kaçının. Deri, göz veya
mukoza zarları ile temas olması halinde, hemen su ile yıkayın ve acilen tıbbi yardım alın.
Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir.
Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı
olmalıdır.
Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı; Ekstraksiyon Alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit
alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı
bölgeye/alana geri döndürmeyin.
Bu kitteki bazı bileşenler koruyucu olarak sodyum azid içerir. Reaktif transferi için metal
tüp kullanmayın.
* Sadece Modül No.2
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
ÜRÜN KULLANIM SINIRLARI
Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostic kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu
(UNI EN ISO 18113-2:2012).teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım
kılavuzu ile sıkı uyum optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu ve tüm bileşenlerin etiketleri
üzerinde yazılı olan son kullanım tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanım tarihlerinden sonra
kitleri kullanmayın.
NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA EBV Real-TM
aşağıdakilerden ekstrakte DNA analizi yapabilir:
Tam kan,
buffy coat;
doku;
İdrar (sedimenti);
Swablar
;
tükürük;
plazma;
salgı
Örnekler 12 saatten fazla olmamak koşulu ile +2-8°C 'de muhafaza edilir ya da -20°C to 80°C'de donduurulur.
Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke , federal , eyalet ya da
yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır.
DNA İZOLASYON
Herhangi bir ticari RNA / DNA izolasyon kiti, burada belirtilen IVD-CE "NUMUNE TOPLAMA,
MUHAFAZA VE TAŞIMA" paragrafındaki örnek türleri için valide ise, kullanılabilir.
Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitleri kullanmanızı önerir:
⇒ DNA-Sorb-B (Sacace, REF K-1-1/B);
⇒ Ribo Virus 50– spin column extraction kit (Sacace, REF K-2-C);
⇒ SaMag Viral Nucleic Acids Extraction kit (Sacace, REF SM003) plazma,salgı için;
⇒ SaMag STD DNA Extraction kit (Sacace, REF SM007) idrar sedimenti, swablar
için. Lütfen, RNA ekstraksiyonunu, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirin.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
NUMUNE VE REAKTİF HAZIRLAMA (modül No.2 ile sağlanan reaktifler)
1. Lysis Solution ve Washing Solution (+2-8°C de muhafaza edildikleri için) buz kristalleri yok
olana kadar 6056°C' ye kadar ısıtılmalıdır.
2. 1.5 ml polipropilen tüplere gereken miktarda hazırlayın.
3. Her tüpe direkt 10 µl Internal Control ve 300 µl Lysis Solüsyon ekleyin.
4. Uygun tüpe 100 µl numunelerden ekleyin.
5. Kontrolleri aşağıdaki gibi hazırlayın :
Cneg etiketli tüpe 100 µl of C– (Negative Control) ekleyin.
CPOs etiketli tüpe 90 µl C- ve 10 µl EBV DNA&IC Glob C ekleyin
6. Tüpleri vorteksleyin ve 7-10 saniye santrifüjleyin.
7. Sorbenti kuvvetlice vorteksleyin ve her tüpe 25 µl ekleyin.
8. 5-7 sn. vorteksleyin ve bütün tüpleri, oda sıcaklığında 5 dk. inkübe edin.
9. Bütün tüpleri 1 dak. 5000 g'de santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak,
her tüpten pıhtıyı dağıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arasında pipet
uçlarını değiştirin.
10. Her tüpe 300 µl Washing Solution ekleyin. Sorbent tamamen tekrar süspanse edilene kadar
kuvvetlice vorteksleyin, 1 dak. 5000 g’de santrifüjleyin dikkatlice çıkarın ve pıhtıyı bozmadan
her tüpten atın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin.
11. Her tüpe 500 µl Washing Solution ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve 1 dak. 10000g'de
santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak, her tüpten pelleti
dağıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin.
12. Adım 11 i tekrarlayın.
13. Bütün tüpleri kapakları açık halde 65°C'de 10 dak. inkübe edin.
16. Pıhtıyı 100 µl DNA-eluent ile resüspanse edin.
65°C 'de 10 dak. inkübe edin ve periyodik
olarak vorteksleyin.
17. Maksimum hızda (12.000-16.000 g) 2 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. Süpernatant,
amplifikasyon için hazır DNA içerir.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
PROTOKOL
1. Gereken miktardaki tüpleri veya PCR plate'leri hazırlayın.
2. Yeni steril tüp içerisinde her numune için 10*N µl PCR-mix-1, 5*N µl PCR-mix-2 buffer ve
0,5*N µl Hot Start DNA Polymerase hazırayın.
3. Her tüpe 15 µl Reaction Mix ekleyin.
4. Reaksiyon karışım ile uygun tüplere 10 µl ekstrakte DNA örneği ekleyin.
5. Kalitatif çalışma için 1 pozitif kontrol ve 1 negatif kontrol hazırlayın.
Cpos etiketli tüpe 10 µl QS2 ekleyin;
Cneg etiketli tüpe 10 µl TE-buffer ekleyin;
6. Kantitatif analiz için 4 tüp hazırlayın ve QS1 ve QS2 standardları çift uygulayın.
Tüpleri kapatın ve onları bu sıraya göre cihaza aktarın: numune, negatif kontroller, pozitif kontrol,
Standartlar
Real time cihaza aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun:
Rotor-tip Enstrümanlar1
Sıcaklı
k,
°С
Beklem
95
e
95
Cycling
60
72
95
Evre
Cycling 2
Süre
60
15 dk.
5
sn.
20 sn.
15 sn.
5
sn.
20 sn.
72
15 sn.
Floresan
Tespiti
FAM (Yeşil)
JOE(Sarı),
Rox
(Turuncu)
-
Plaka türü veya modüler cihazlar2
Cycle
tekrarla
rı 1
5
40
Sıcaklı
k,
°С
95
95
60
72
95
60
72
Süre
Floresan
Tespiti
15 dk.
5
sn.
20 sn.
15 sn.
10 sn.
FAM
40 sn. JOE/HEX/Cy3,
Rox/TexasKırm
ızı
_
15 sn.
Cycle
tekrarla
rı 1
1
Örneğin; Rotor-Gene™ 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen)
TM
örneğin, SaCycler-96™ (Sacace), CFX96 /iQ5™ (BioRad); Mx3005P™ / Mx3000P™ (Agilent), ABI®
7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler® (Cepheid)
2
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
5
40
SONUÇLARIN YORUMLANMASI
Sonuçlar, eşik hattı ile floresan eğrinin geçiş varlığı sayesinde yorumlanır. Eşik çizgisini
ayarlamak için, floresan eğrilerinin linear olduğu seviyede çizgiyi yerleştirin.
EBV LMP-gen DNA amplifikasyonu JOE(Sarı)/HEX/Cy3 kanalında tespit edilir;
DNA amplifikasyonu ( -globin gen) IC glob FAM (Yeşil) kanalda algılanır (sadece hücre
süspansiyonun toplam DNA ekstraksiyonunda (tam kan, lökositler, biyopsi ve otopsi
materyal, swablar)
Eksojen Internal Kontrol IC Rox (Turuncu)/TexasKırmız kanalda algılanır.
Kalitatif analiz
Sonuçlar, amplifikasyon ve ekstraksiyon pozitif ve negatif kontrolleri geçmişse, ilgilisi olan için
geçerli kabul edilir.
Kontrol Sonuçları
Kontrol
CEBV C+
TE-buffer
QS2
Evresi
Ct FAM
Ct
Ct Rox
(Yeşil)
JOE (Yellow)/HEX/Cy3
Yorumlama
_
_
(Turuncu)/TexasKır
mızı
Pos (< 30)
Pos (< 25)
Pos (< 30)
Pos (< 30)
OK
PCR
_
_
_
OK
PCR
Pos (< 31)
Pos (< 31)
Pos (< 31)
OK
Kontrol
DNA
izolasyon
DNA
İzolasyon
, PCR
OK
JOE(Sarı)/HEX/Cy3 kanaldaki Ct değeri sıfırdan farklı ise (Ct<35), numune EBV için
pozitif olarak dikkate alınır.
Numunesi Ct değeri JOE(Sarı)/HEX/Cy3 kanalında birden fazla 35 ise, EBV için kesin
olarak kabul edilmektedir. Bu örnek için Ek çift çalışma yapılmalıdır;
(Sadece hücre süspansiyonu için) kanal FAM içinde Ct <33 (Yeşil) ile numuneler, Kanal
Rox (Turuncu)/TeksasKırmızısında Ct <33 ve kanal JOE (Sarı)/HEX/Cy3 içinde floresan
sinyali olmayanlarda negatif olarak yorumlanır.
Sinyali olmayan numuneler (Sadece hücre süspansiyonu için) FAM (Yeşil) ve Rox
(Turuncu /Texas Red geçersiz olarak yorumlanır.
(Orange)/TexasRed are interpreted as invalid.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
Hücre süspansiyonundan elde edilen örneklerin kantitatif analizi (tam kan,
lökositlerin, biyopsi ve otopsi materyali, bezlerden)
Her kontrol ve hasta örneği için, 105 hücrede bulunan EBV DNA konsantrasyonunu asağıdaki formülü
kullanarak hesaplayın:
using the following formula:
EBV DNA kopya/reaksiyon
(JOE(Sarı)/HEX/Cy3 kanal)
IC Glob DNA kopya/reaksiyon
x 2*105 = kopya EBV DNA/105 hücre
(FAM/(Yeşil) kanal)
Her kontrol ve hasta örneği için, 105 hücrede bulunan EBV DNA konsantrasyonunu asağıdaki
formülü kullanarak hesaplayın:
105 cells using the following formula:
log [EBV DNA kopya/ IC Glob DNA kopya x 2*105] = log (kopya EBV DNA/105 hücre)
Sonuçlar elle hesaplanabilir veya Excel tabloları kullanarak. Bu kopya örneklerinin isimlerini
yapın ve ve ilk sütununa ekleyin (Sütun A). Kanal Joe(Sarı)/HEX/Cy3 ye EBV DNA
konsantrasyonlarını kopyalayın ve Excel tablosunun (Sütun B) ikinci sütununa yapıştırın. Kanal
Fam (Yeşil) e IC Glob konsantrasyonlarını kopyalayın ve Excel tablosu (Sütun C) üçüncü
sütununa yapıştırın. Sütun D formül D = LOG (B / C * 200000) yerleştirin: log değerleri
görünecektir. E sütununa formül E=B/C*200000 koyun: kopya değerler/105 hücre görünecektir.
Adı
A
1
2
3
4
5
QS1
QS1
QS2
QS2
Neg PCR
Kal.
Konsantra
syon
(kopya/reaksiyon)
B
Joe(Sarı)/HEX/Cy3
8742
253
Sacace™ EBV Real-TM Quant
648
9962
10011
98
102
Kal.
Konsantra
syon
(kopya/reaksiyon
C
) Fam(Yeşil)
125640
87787
65765
16354
76865
9793
10143
103
97
Log EBV/10
5
5
kopya EBV/10
D
4,1
2,8
E
13916
576
3,9
7925
VER 21.03.2013
Plazma, likör, amniyotik sıvı, bronş lavajı, bezlerden ekstraksiyon örneklerin kantitatif
analizi
Her kontrol ve hasta örneği için EBV DNA/ml deki konsantrasyonunu asağıdaki formülü
kullanarak hesaplayın:
EBV DNA kopya/reaksiyon
(JOE(Sarı)/HEX/Cy3 kanal)
x IC katsayısı* = kopya EBV/ml
IC DNA kopya/reaksiyon
(Rox(Turuncu)/TexasKırmızı-kanal)
*katsayısı her parti için özel ve kit içindeki EBV TM Quant Veri Kart raporlandığı gibi.
Sonuçlar elle hesaplanabilir veya Excel tabloları kullanarak. Bu kopya örneklerinin isimlerini
yapın ve ve ilk sütununa ekleyin (Sütun A). Kanal Joe(Sarı)/HEX/Cy3 ye EBV DNA
konsantrasyonlarını kopyalayın ve Excel tablosunun (Sütun B) ikinci sütununa yapıştırın. Kanalı
Rox(Turuncu)/TexasRed IC DNA konsantrasyonlarını kopyalayın ve Excel tablosu (Sütun C)
üçüncü sütunnuna yapıştırın. Sütun D ye EBV Veri Kartının (değer her parti için özeldir) IC
katsayısının değerini raporunu yerleştirin. Sütun E ye formülü yerleştirin.
=B3/C3*D3:
görünücektir.
Adı
A
1
2
3
4
5
QS1
QS1
QS2
QS2
Neg PCR
kopya
değerleri
Kal.
Konsantra
syon
(kopya/reaksiyon)
Joe(Sarı)/HEX/Cy3
B
85
56
25
10210
9876
98
102
Sacace™ EBV Real-TM Quant
/ml
Kal.
Konsantra
syon
(kopya/reaksiyon)
Rox(Turuncu)/Texa
C
s Kırmızı
1138
1076
1288
1012
1184
10103
9964
99
104
IC katsayısı
D
14000
14000
14000
14000
14000
Kopya EBV DNA/ml
E
1045
728
345
VER 21.03.2013
PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Analitik
Özgünlük
Primerler ve probların analitik özgünlüğü negatif numuneler ile valide edilmiştir. Spesifik EBV
primerler ve problar ile herhangi bir sinyal oluşturmamışlardır. EBV Real – TM Quant özgüllüğü
100% idi. EBV Real – TM Quant kiti potansiyel çapraz reaktivite - TM Quant grup kontrolüne karşı
test edildi (CMV, HSV 1 & 2, HHV 6, HHV 8, VZV, Parvovirüs ve diğerleri). Diğer ptojenler ile
herhangi bir çapraz reaktivite gözlemlenmemiştir.
Analitik Hassasiyet
EBV Real – TM Quant kiti 200 kopya dan az olmayan/ml hassasiyet ile testlerin% 100 EBV DNA
algılamasını sağlar veya105 hücre başına EBV DNA 5 kopya.
EBV Real – TM Quant PCR kitin doğrusal aralığı 500-10.000.000 EBV DNA kopya/ml’dir. Eğer
sonuç 500 kopya ml az ise, sonuç "en az 500 EBV kopya / ml" olarak belirtilmelidir.
Hedef bölge LMP-gen
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
SORUN GİDERME
1. IC (Rox (Turunuc)/TexasRed kanal) zayıf veya hiç bir sinyal.
PCR inhibe edilmiştir.
⇒Önerilen DNA ekstraksiyon metodunu kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını
izlediğinizden emin olun.
⇒ Bütün tüpleri ekstrakte DNA pipetlenmesinden önce 2 dk. maksimum (1200016000 g) hızda yeniden santrifüjleyin ve
süpernatatntı dikkatlice alın. Pelleti dağıtmayın, sorbent reaksiyonu inhibe
eder.
Reaktif muhafaza koşulları talimatlara uygun değil.
⇒Muhafaza koşullarını kontrol edin.
PCR koşulları talimatlara uygun değil.
⇒Protokolde belirtilen IC tespit floresan kanalını seçin ve PCR koşullarını
kontrol edin.
2. Zayıf ya da olmayan Pozitif Kontrol sinyali.
PCR koşulları talimatlara uygun değil.
⇒ Manuelde belirtilen floresan kanalını seçin ve aplifikasyon prosedürünü
kontrol edin.
3. Ekstraksiyon Negatif Kontrol ile JOE(Yellow)/HEX/Cy3 sinyal.
DNA ekstraksiyon prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir.
⇒Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol ile dekontamine
edin.
⇒Ekstraksiyon prosedürü esnasında sadece filtre pipet uçlarını kullanın. Tüpler
arası pipet uçlarını değiştirin.
.
⇒Yeni reaktif setleriyle DNA ekstraksiyonunu tekrarlayın.
4. PCR Negatif Kontrol (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal yok.
PCR hazırlama prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir.
⇒Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol veya özel DNA
dekontaminasyon reaktifleri ile dekontamine edin.
.
⇒Yeni reaktif setleriyle PCR hazırlamayı tekrarlayın.
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
KULLANILAN SEMBOLLERİN ANLAMLARI
Liste Numarası
Dikkat!
<n> test için yeterli
içerik
Lot
Numarası
.
in Vitro Diagnostic
Kullanım için
.
Store at
Versiyon
NCA
Negative Control of
Amplifikasyon
Üretici
NCE
Ekstraksiyon Negatif
Kontrol
Kullanım için talimatlara bakınız
C+
Son Kullanım Tarihi
IC
Pozitif Kontrol
Amplifikasyon
Internal (iç) kontrol
* SaCycler™ Sacace Biotechnologiestescilli markasıdır.
* CFX96™ and iQ5™ Bio-Rad Laboratories tescilli markasıdır.
* Rotor-Gene™ Qiagen tescilli markasıdır.
* MX3005P® Agilent Technologies tescilli markasıdır.
* ABI® Applied Biosystems tescilli markasıdır.
* SmartCycler® Cepheid tescilli markasıdır.
Sacace Biotechnologies Srl
via Scalabrini, 44 – 22100 – Como – Italy Tel +390314892927 Fax +390314892926 mail:
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013
[email protected] web:
mail: [email protected] web: www.sacace.com
Sacace™ EBV Real-TM Quant
VER 21.03.2013