DNA`nın REPLİKASYONU ve REKOMBİNASYONU

DNA’nın REPLİKASYONU
ve REKOMBİNASYONU
Prof.Dr. Sacide PEHLİVAN
REPLİKASYON
(DNA’nın Eşlenmesi-Hangi DNA )
nükleer-mitokondrial
•Nerede ?
•Ne zaman ?
•Neden ?
DNA Replikasyon Mekanizmasının Özellikleri
• Özgül replikasyon başlama bölgeleri (Specific origin)
bulunur
• Yarı muhafazakardır (Semiconservative)
• İki yönlü (Bidirectional) ya da tek yönlüdür
(unidirectional)
• Semidiscontinuous (Bir iplikte kesintili sentez)
• Kısa RNA primerlerine ihtiyaç duyar
Replikasyon başlama bölgeleri
Her kromozom üzerinde DNA sentezinin başladığı tek
bir bölge bulunur (prokaryotik hücrede).
•Çok sayıda kısa tekrar bölgeleri içerir
•Çok sayıda protein tarafından tanınan ve bu proteinlerin
bağlanabildiği bölgedir
•A-T zengin 13 baz çiftlik tekar bölgelerdir
E. coli: ori C
Yeast: ARS
(autonomously replicating sequence)
Yarı Muhafazakar
(Semiconservative)
Replikasyon sonrası oluşan
her DNA molekülün bir
zinciri atasal iken diğer zincir
yeni sentezlenmiştir.
İki yönlü sentez (Bidirectional)
DNA molekülünde sentez 5´ 3´ yönünde olduğuna göre
anti-paralel iki zincirden oluşan DNA molekülünde
replikasyon nasıl olmaktadır?
mtDNA
???????
Semidiscontinuous
• DNA sentezi 5
3
• Çift heliks anti-paralel
Replikasyon zincirlerden birinde, lider zincirde (leading
strand) sentez kesintisiz devam ederken diğer zincirde
(lagging strand) kısa nükleotid zincirleri halinde devam eder.
Okazaki parçaçıkları (fragments)
• Sentezi eklenerek devam eden zincir (lagging
strand)’de görülür
• RNA primeri gerektirir
• Prokaryotlarda okazaki parçalarının uzunluğu 10002000 nükleotid iken, ökaryotlarda 100-200 nükleotid
uzunluğundadır.
NEDEN?
Primer ???
• DNA polimeraz enzimleri yeni bir zincirin
sentezini kendi kendilerine yapamazlar
(başlatamazlar).
• 3´-OH ucu serbest olan ve kalıp zincire
komplementer olan kısa nükleotid
zincirine ihtiyaç duyarlar.
DNA Replikasyonunda Primerler
• Kalıp DNA üzerinden RNA primeri sentezlenir
• DNA sentezi başlar
• RNA kısmı yok edilir
• Arada kalan boşluklar DNA ile doldurulur ve
nükleotitler birbirine bağlanır.
DNA replikasyonu
Replikasyon başlama bölgesine bağlanan proteinler
Helikaz
Tek zincire bağlanan proteinler (SSBs)
Primazlar
DNA polimerazlar
Telomeraz ??????
•Replikon; DNA üzerindeki replikasyon
üniteleridir.
• Replizom; multiprotein replikasyon kompleksidir
• DNA pol.
• Helikaz
• Primaz
• SSB protein
• Ligaz
Polimeraz Enzimleri
• DNA sentezi (replikasyon) DNA polimerazlar
tarafından katalizlenir.
• RNA sentezi (transkripsiyon) RNA polimerazlar
tarafından katalizlenir.
Replikasyon başlama bölgesine
bağlanan proteinler
(Origin-binding proteins)
DNA replikasyonun başlaması için özgül proteinlerin
replikasyon başlama dizilerini tanıması ve bağlanması
gerekmektedir.
•Ökaryotlardan mayalarda Orijin tanıma kompleksi
(ORC) ARS (autonomously replicating sequence)
dizilerine bağlanır.
•Prokaryotlardan E. coli ‘de DnaA proteini ori C
bölgesine bağlanır.
•SV40 (monkey virus: model replication system for
eukaryotes) orijinineT antigen bağlanır.
Replikasyonun OriC’de başlaması
• DnaA bağlanır ve çift heliks açılmaya başlar
• Helikaz (DnaB) diğer zincire bağlanır.
Helikaz
• DNA çift zincirini açar
• Enerjiye ihtiyaç duyar (ATP)
Replikasyon sırasında tek zincirli
DNA’ya bağlanan proteinlere (SSB=
Single-strand DNA-binding protein)
neden ihtiyaç var?
• Tek zincirli DNA’yı korumak için
• Çift sarmalın yeniden oluşumunu önlemek için tek
zincirli DNA molekülüne bağlanabilen proteinlere
(SSBP) proteinlere ihtiyaç vardır.
Primaz
• RNA primerlerinin sentezini yapar
• Her bir okazaki parçasının sentezi için gereklidir.
DNA polimerazlar
• Kalıba bağlı olarak DNA sentezini yaparlar
• Gerekenler:,
• Kalıp DNA
• dNTPs
• Primer
• Zincir uzaması sırasındaki fosfodiester bağlarını
katalizler
Prokaryotlarda DNA polimerazlar
E. coli’de 3 tip DNA polimeraz (en az…) bulunur.
DNA polimeraz I: RNA primerleri ayrıldıktan sonra
oluşan boşlukları doldurmak ve sentez yönündeki
hataların tamir edilmesinde görevlidir.
DNA polimeraz II: DNA tamirinde görevli. SOS
cevabına karşılık replikasyon çatalının açılmasını
durdurur. UV gibi dış etkenler sonucu oluşan DNA
hasarını onarır
DNA polimeraz III: 5 3 yönünde polimeraz
aktivitesi ile her iki zincirde de sentez yapar. 3 5
ekzonükleaz aktivitesi ile yanlış eşleşen bazları
çıkarır
Replikasyon orijini,
oriC
DNA Replikasyon Çatalı
İki DNA polimeraz molekülü replikasyon çatalında aktif pozisyonda (panel
a). Bunlardan biri lider zincirden yapılan sentezi katalizlerken, diğeri okazaki
DNA parçacıklarının sentezini katalizler. Her iki polimeraz enzimi de
aksesuar proteinlerle birlikte kalıp zincirlere tutunarak bu işi yaparlar.
DNA Pol III & RNA Primaz Fonksiyonu
DNA Pol I ve
primerin zincirden
çıkarılması
• 3’-5’ Ekzonükleaz
• 5’-3’ Polimeraz
DNA ligaz fonksiyonu
Topoizomerazların
rolü
Replikasyon sırasındaki hataların
düzeltilmesi (Proofreading)
• DNA polimerazların çoğu 3´ 5´ ekzoonükleaz
aktivitesine sahiptir. (reverse of polymerase activity)
• Sentez sırasında diziye giren yanlış nükleotidler bu
mekanizma ile düzeltilir ve böylece mutasyon önlenir.
• Bu replikasyon sadakati olarak anılır, sentez sırasında
109 nükleotidde bir rastlanan hatadır.
Replikasyon Sadakati
• 5´
3´ polimerizasyon; hata olasılığı 1/105
• 3´ 5´ ekzonükleaz proofreading: hata olasılığı 1/102
• Zincir hedefleyerek yanlış eşleşme tamiri: Hata
olasılığı: 1/102
Toplam;
9
1/10
DNA hataları baz değişimleri ile sınırlı değildir
• Helix geometrisinde değişimler olabilir
• Bazların nadir formları olan tautomerik formları
oluşabilir. 1/104-1/105
Ör; sitozinin tautomerik formu , adenin ile eşleşmeye neden
olur
*Tautomerik form: moleküler formül aynı atomlar arası bağ
konfigürasyonu farklı
A ve C; amino ve imino formlar
T ve G; Keto ve enol formlar
DNA molekülünün replikasyonu
3 türlü olur
•Teta (θ)şeklinde replikasyon
•Sigma (ρ) şeklinde replikasyon
•Doğrusal (linear) replikasyon
Teta şeklinde
replikasyon
Sigma şeklinde replikasyon
Doğrusal replikasyon
Doğrusal replikasyon
DNA ligaz
Prokaryotlarda replikasyonun
sonlanması
• Terminasyon bölgesine “tus”proteininin
bağlanması ile sonlanır. Replikasyon
enzimleri, tus ile etkileşince sentez sonlanır.
Özetle
• Replikasyon orijininin tanınması
• Sarmalın açılması ve öyle (sabit-tek zincir halinde)
kalması
• Primer sentezi
• Sentezin başlaması
• Üstün kıvrımların gevşemesi
• Hata onarımı
• Serbest uçların birleştirilmesi
bir seri protein molekülü ile gerçekleşmektedir
Ökaryotik DNA replikasyonu
Genel mekanizma olarak prokaryotlara benzer;
•Yarı muhafazakar (Semiconservative)
•İki yönlü (Bidirectional)
•Zincirlerden biri kesintisiz sentezlenirken
diğeri parçalar halinde sentezlenir
(Semidiscontinuous)
•Primer gereksinimi var
Ökaryotik DNA replikasyonu
Farklılık:
• Birden fazla replikasyon başlama bölgesi mevcuttur.
•daha fazla DNA var
•Ökaryotik DNA polimerazların hızı prokaryotlardan
20 kat yavaş
• Nükleozom yapısı ile ilişki var.
• Okazaki parçaçıkları daha kısadır.
• Sonlanma problemi var
•Doğrusal DNA
Ökaryotlarda DNA polimeraz
1.DNA polimeraz alfa ailesi; 3’e ayrılır
• Pol-alfa; primaz aktivitesi vardır, hem lider hem de kesikli zincir için RNA primeri
sentezler.
• Pol-delta; lider zinciri uzatan polimerazdır.
• Pol-epsilon; kesikli zinciri uzatan polimerazdır.
2.DNA Polimeraz Beta;
DNA polimeraz I gibi işlev görür, primeri çıkarıp bu bölgeyi tamamlar.
3.DNA polimeraz gama; mitokondriyal DNA’nın replikasyonunu
gerçekleştiren enzimdir.
*Beta, epsilon ve deltanın 3 5 ekzonükleaz aktivitesi
bulunmaktadır
Ökaryotik DNA
replikasyonunda sonlanma
-Telomeraz
-Telomerler
-sonlanma problemi
-telomeraz yapısı ve fonksiyonu
Telomerler
• DNA moleküllerinin uç kısımlarıdır.
• Kromozomun 3 ana kısmından
biridir (Sentromer ve iki uçta
telomerler)
• Replikasyon sırasında özel bir durum
yaratır
• GT zengin tekrar dizilerinden oluşur.
• Sentezleri telomeraz enzimi ile
katalizlenir.
• Yaşlılıkla birlikte telomer
zincirlerinde kısalma olur.
Telomerlerin fonksiyonu
• Replikasyon sırasında doğrusal kromozomal DNA
molekülünün son kısmının tamamlanmasında rol
oynar
• Kromozomları rekombinasyon, yıkım, ve füzyona
karşı korur.
• Kromozomların bütünlüğünü ve stabilitesini sağlar
• Kromozomların nükleus zarına tutunarak belirli bir
pozisyonu korumasını sağlar.
Replikasyonun
sonlanmasında neden problem var?
Telomer Kısalması
• “Semidiscontinuous” DNA replikasyonu
• RNA primerine ihtiyaç var
• RNA primeri geri çıkarılır
• Kesintili sentezlenen zincirin (lagging strand)
sonunda 5’ uçta bir boşluk oluşur.
Telomeraz
• RNA ve ona bağlanan protein moleküllerinden
oluşur (enzim + RNA kompleksi).
• Kesintili sentezlenen zincir (lagging strands)’in
replikasyon sırasında kısalmasını önler
• Telomer sentezini katalizler
• RNA alt üniteleri telomer zinciri için kalıp görevi
görür.
• Telomeraz aktivitesi insnlarda birçok somatik doku
hücrelerinde görülmez. Genellikle replikasyon
kapasitesi yüksek olan dokularda görülür.
Telomeraz mekanizması
Replikasyon Zamanı
• Hücre döngüsünün “sentez (S)” fazında gerçekleşir.
• Tüm hücrelerde aktif olan genler S fazının çok erken
evrelerinde replike olur.
• Yalnızca bazı hücrelerde aktif olan genler (dokuya
özgül olarak) S fazının geç dönemlerinde replike
olur.
• Geç replike olan kısımlar A-T’ce zengindir, erken
replike olan kısımlar G-C’den zengin dizilerdir.
Telomer tekrarlarının kısalmasına
bağlı olarak hastalık gelişebilmekte
• Dyskeratozis Congenita
• Telomeraz enzimleri doğuştan defektli olan
bireylerdir.
• Akciğer, karaciğer tırnak, saç deri gibi dokularda
hasarlar olur
• Kemik iliği hücrelerinin ölümünden dolayı …
REKOMBİNASYON
• Önemli oranda dizi homolojisi (benzerliği) içeren iki
kromozom boyunca, eşdeğer pozisyondaki genetik değiştokuşa, genel yada homolog rekombinasyon denir.
• Rekombinasyon, homolog kromozomlar arasında Mayoz
bölünme sırasında gerçekleşir.
• Rekombinasyon sırasında DNA molekülü kırılır, parçalar
değişir ve yeniden birleşir.
• Rekombinasyon DNA boyunca herhangi bir yerde olabilir.
• Cis (aynı DNA zinciri üzerinde) formunda DNA,
rekombinasyon sıklığına bakılarak genlerin birbirlerinden
uzaklığı, yani genlerin dizilişi saptanabilir.
• Birbirine yakın olan genlerin rekombinasyon olasılığı, uzak
olan genlere göre daha düşüktür.
• Genetik Rekombinasyonun
Holliday Modeli
Endonükleaz kesimi
(iplik değişimi ve
birleşme)
• (a) İki homolog DNA molekülü
(kardeş olmayan kromatitler) mayoz
sırasında yanyana uzanır.
Birleşme ilerlemesi
(b) Her iki DNA’nın bir ipliği kesilir.
(c) Kesik iplikler çapraz olarak
homolog ipliğe katılır. Holliday
yapısı (veya Holliday junction)
oluşur.
(d) Dallanma noktasında göç ile
Heteroduplex bölge oluşur.
(e) Holliday yapısının çözülmesi.
DNA iplikleri ya dikey yada yatay
olarak kesilebilir.
(f) Dikey kesim f-f' ve F-F'
bölgelerinde kros-over meydana
getirir.
• (g) Yatay kesim gen dönüşümüne
neden olur.
Teşekkürler……