T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
advertisement
EK-8 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Bazı Antiviral ve Antibakteriyel İlaçların Elektroanalitik İncelenmesi Prof.Dr. Sibel A. ÖZKAN Proje No: 20030803037 Proje Başlangıç: 11.04.2003 Proje Bitiş: 11.04.2005 Teslim Tarihi: 11.04.2005 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2005 RAPOR FORMATI I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Bazı Antiviral ve Antibakteriyel İlaçların Elektroanalitik İncelenmesi Bu proje kapsamında kinolon grubu antibiyotikler, nükleozid grubu ve nükleozid ters transkriptaz inhibitörü antiviral ilaçların hem elektrooksidasyonu hem de elektroredüksiyonu incelenmiştir. Bu çalışmada pH’ın, tampon çözelti bileşiminin, potansiyel tarama hızının, destek elektroliti cinsinin ve çeşitli parametrelerin etkisi araştırılmıştır. Katı ve civa elektrotlar kullanılarak seçilen maddelerin yükseltgenme veya indirgenme mekanizmaları aydınlatılmaya çalışılmıştır. Uygun ortam belirlendikten sonra, seçilen bu ortamda adsorptif sıyırma, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi/polarografisi teknikleri kullanılarak, katı ve civa elektrotlarla, duyarlı, hassas, tamamen valide edilmiş analitik yöntemler geliştirilmeye çalışılmıştır. Geliştirilen bu yöntemlerin farmasötik dozaj formlarına ve biyolojik sıvılara uygulanabilirliği gösterilmiştir. Electroanalytical Investigation of Some Antiviral and Antibacteriel Drugs In this project, the electrooxidation and electroreduction of quinolone group antibiotics, nucleozide and nucleozide revers transcriptase group of antiviral drugs were investigated . In this study, the effect of pH, buffer composition, potantial scan rate, supporting electrolyte type and other parameters were investigated. The electrooxidation and electroreduction mechanism of the selected compounds were trying to find using by solid and mercury electrodes. After obtaining the suitable media, the fully validated, selective and sensitive analytical methods were achieved using by adsorptive stripping, differential pulse and square wave voltammetric/polarographic techniques.The pharmaceutical dosage form and biological fluids experiments were realized for to show the applicability of the proposed methods. II. Amaç ve Kapsam Bu proje ile öngörülen araştırmada sistemik antiviral ilaçlardan nükleozid ve nükleozid ters transkriptaz inhibitör grupları ile floro kinolon grubu antibakteryel etkili ilaçlar üzerinde çalışılmıştır. Florokinolonlar, yapı olarak nalidiksik aside benzeyen 6-fluoro-4-kinolon karboksilik asid türevleridir. 7 numaralı karbon atomuna bağlanmış bir piperazin halkası içerirler. Bu grup ilaçlardan halen en fazla incelenenler siprofloksasin, ofloksasin, levofloksasin, enoksasin, pefloksasindir. Nalidiksik asid 1. Kuşak ve yukarıda adı geçen ilaçlar ise 2. Kuşak fluorokinolonlardır. Fluorokinolonlar suda az çözünen fazla lipofilik bileşiklerdir. Geniş spektrumlu, hızlı etkili ve bakterileri öldürücü (bakterisid) olmaları en önemli üstünlükleridir. Fluorokinolonlar geniş spekrumlu antibakteriyel ilaçlardır. Bakterilerin stoplazması içine girerek DNA’yı negatif supersarmal durumuna getiren DNA jiraz enzimini ve topoizomeraz IV’ü inhibe ederler. Böylece bakteri kromozomlarının birbirinden ayrılmasını, DNA replikasyonunu bozarlar; ayrıca DNA’yı zedelerler. Fluorokinolonlar lipofilik bileşiklerdir, mide-barsak kanalından genellikle iyi absorbe edilirler ve ağız yoluyla kullanılırlar. Bu ilaçların gastrointestinal absorpsiyon oranı % 60-80 civarındadır. Absorpsiyonları hızlıdır ve alındıktan 1-3 saat sonra plazmada tepe konsantrasyonuna ulaşır. Plazma proteinlerine fazla bağlanmazlar [1,2]. Virüsler yalın yapıda olan, sadece insan, hayvan, bitki, bakteri ve benzeri organizmalarda onların daha kompleks ve daha gelişmiş olan hücreleri içinde çoğalabilen en ufak infeksiyon etkenleridir. Virüsler kendi genetik materyallerini ve yeni viral proteinleri sentez etmek için bu hücrelerin biyokimyasal mekanizmalarını kullanmak zorundadırlar. Virüs, üzerine glikoprotein molekülleri saplanmış iki katlı bir lipid membran ile onun içindeki protein tabakalarından ve öz kısmını (çekirdek) teşkil eden genetik materyalden oluşur. Genetik materyal DNA ve RNA’dan ibarettir. Buna göre virüsler DNA ve RNA virüsleri diye 2 ana gruba ayrılırlar. Virüslerin insanlarda yaptığı temel infeksiyonlar 3 tiptir. 1. Litik tipte infeksiyonlar: DNA ve RNA virüslerinin çoğu (kızamık, polio, nezle vb) hücre içinde çok sayıda yavru virüs tanecikleri oluşturur. Sonuçta hücreyi patlatırlar. Bu tür infeksiyonlar elverişli hücrelerde hızlı bir şekilde yayılırlar. Bu tür infeksiyonların tedavisi için mümkün olduğu kadar erken ilaç verilmesi gereklidir. 2. Süregelen tipte infeksiyonlar: İnfeksiyonu oluşturan virüslerin konakçı hücreleri yaşamlarını yitirmezler, içlerinde virüs çoğalması yavaş olur. İnfeksiyon yavaş ilerler. Hepatit B infeksiyonu ve AIDS (HIV infeksiyonları ) örnektir. 3. Latent tipte infeksiyonlar: Bu tip infeksiyonlarda virüs çoğalmadan hücre içinde kalır. Vücutta farkına varılması ve tanı konulması zordur. Ayrıca latent virüsler varolan antiviral ilaçlardan etkilenmezler. Latent virüsün genetik materyali konakçı hücrenin kromozomuna spontan olarak yerleşir ve hücre bölündükçe, klonlanmış hücre sayısı giderek artar. Uygun bir anda da aktif hale geçebilir. Herpes infeksiyonları ( dudak herpesi, jenital herpes, zona) ve latent AIDS olguları örnektir. Proje kapsamında seçilen nükleozid grubunda yer alan asiklovir ve valasiklovir belirgin antiviral etkinliğinin yanı sıra konakçı hücreler üzerinde minimum toksik etkili en selektif ilaçlardır. Kimyasal yapı bakımından doğal guanin nükleozid’in asiklik bir analoğudurlar. Valasiklovir barsak mukozasından ve karaciğerden geçerken ilk geçişte hidroliz edilerek aktif asiklovire dönüşür. Asiklovir mide-barsak kanalından %10-20 oranında absorbe edilir.Büyük kısmı böbreklerden atılır.Valasiklovir’in ön ilaç gibi verilmesi oral biyoyararlanımı %50’ye çıkarır. Gansiklovir, asiklovir ve valasiklovir gibi asiklik guanin nükleozid analoğudur. Etkisi asiklovire göre yaklaşık 50 kez daha güçlüdür. Proje kapsamındaki üçüncü grup olan nükleozid ters transkriptaz inhibitörü ilaçlar klinik kullanıma yeni girmeye başlamışlardır. Zidovudin (azidotimidin) AIDS tedavisinde kullanılmaya başlanan antiviral ilaçtır. Kimyasal adı 3’-azido-3’ deoksitimidin’dir. AIDS etkeni olan HIV virüsünü inhibe eder. Ağız yolundan alınır ve mide-barsak kanalından % 60-70 dolayında absorbe edilir. Kan beyin engelini aşar. Beyin omurilik sıvısında da % 60-70 dolayında konsantrasyon oluşturur.Bazı durumlarda uzun sürede virüsün direnç kazanmasını engellemek için ikili, üçlü kombinasyonlarda verilebilir. Halen en sık kullanılan ikili kombinasyon lamivudin-zidovudin kombinasyonudur. Lamivudin, zalsitabin’in kükürtlü analoğudur. Etkisi zalsitabinden daha düşüktür. Ama yan etkileri azdır. Oral biyoyararlanımı %90’a yakındır. HIV çabuk direnç kazandığı için tek başına kullanılması pek tavsiye edilmez. Hepatit B virüsüne karşı etkili olduğu için Hepatit B virüsünün tedavisinde ve kronik Hepatit C vakalarında kullanılmaktadır. Zalcitabin ( 2’,3’-dideoksisitidin) bir sitozin (pirimidin) nükleozid analoğudur. Bu nükleozid analoğuda hücre içinde aktif trifosfat metabolitine dönüşerek etkinlik kazanır. In vitro testlerde en güçlü nükleozid analoğu antiretroviral ilaçlardandır. Terapötik etkinliği zidovudin’e oranla daha düşüktür. Biyoyararlanımı oral yolla alındığında yaklaşık %90’dır [1,2]. Abacavir (4-[2-amino-6-(siklopropil amino)-9-H-purine-9-yl]-2-siklopenten-1-metanol sülfat), aynı grubun en yeni üyesidir. Terapötik etkinliği oldukça iyidir. Biyoyararlanımı oral yolla alındığında çok yüksek olarak gözlenmiştir[1,2]. Bu antiviral ilaçlar virüsle infekte hücrelerin içinde timidin kinaz enzimi tarafından monofosfata, sonra da diğer kinazlarla trifosfata dönerek etkinlik kazanırlar. Bu proje kapsamında düşünülen ilk grup olan flourokinolonların yapısında bulunan R-C=O grubunun çok iyi indirgenme özelliğinden dolayı pek çok biyotransformasyon reaksiyonundan sorumlu olduğu bilinen bir gerçektir. Bu grubun fluorokinolonların in vivo redüksiyonuna da neden olduğu düşünülmektedir. Bu yapılar C=O grubunu elektron akseptörü olaeak kullanarak C-OH yapısını oluştururlar [3]. R-C=O + 2H+ + 2e- ----Æ R-CH-OH Flourokinolanların fiziksel ve farmakokinetik yapısındaki değişikliklerin hepsi, moleküllerin redoks davranışlarındaki değişikliklere bağlıdır, dolayısıyla bu değişikliklerin izlenmesinde elektrokimyasal teknikler (voltametri ve polarografi) önemli rol oynamaktadır. Proje kapsamındaki ikinci grup olan nükleozid grubu ve nükleozid ters transkriptaz inhibitörü antiviral ilaçların da yapılarında bulundurdukları aynı grup üzerinden (R-C=O) indirgenmeye uğrayabilecekleri düşünülmektedir. Bu türdeki çalışmalar bu proje kapsamında çalışılarak elektrokimyasal reaksiyon mekanizmaları aydınlatılmaya çalışılmıştır. Sonuç olarak yukarıda belirtildiği gibi bu ilaç etken maddelerinin fiziksel ve farmakokinetik yapısındaki değişikliklerin hepsi, moleküllerin yükseltgenme/indirgenme davranışlarındaki değişikliklere bağlıdır. Bu nedenle bu değişikliklerin izlenmesinde elektrokimyasal teknikler çok önem taşır. Ancak üzerinde çalışılması düşünülen bu 3 grup ilaç etken maddelerinin oldukça yeni olması nedeniyle literatür araştırmasında elektrokimyasal analizleri ile ilgili fazla sayıda çalışmaya rastlanmamıştır. Bu yöndeki araştırmalar ilaç olarak kullanımı daha eski olan ofloksasin üzerinde ve redüksiyon yönünde yoğunlaşmıştır [3-10]. Siprofloksasin [11-12], enoksasin [13] ve pefloksasin [14] için de sınırlı sayıda ve sadece redüksiyon yönünde çalışmalar yapılmıştır. Genel olarak fluorokinolonların elektrokimyasal incelenmesi civa elektrot üzerinde indirgenme yönünde yapılmıştır. Katı elektrotların, modifiye elektrotların ve döner elektrot sisteminin kullanıldığı voltametrik çalışmalara ise literatürlerde rastlanılmamıştır. Fluorokinolonlar yapısında bulunan piperazin halkası sayesinde çok kolaylıkla oksitlenebilecekleri düşünülmüş ve yapılan deneyler doğrultusunda bunu destekleyen bulgulara ulaşılmıştır. Ayrıca bu grup ilaçlarla yapılan çalışmalara bakıldığında biyolojik sıvılardan analizlerde yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, kapiler elektroforez yöntemleri [15-18] , ilaç dozaj formlarından tayinde ise spektrofotometrik [19-20], polarografik [6], yüksek basınçlı ince tabaka kromatografisi [21], kapiler elektroforez [22] yöntemleri kullanılmıştır. Nükleozid grubu antiviral ilaçlarla yapılmış olan çalışmalara bakıldığı zaman bu grubun ilk elemanlarından biri olan asiklovir ile yapılmış olan çalışmalar dışında bir elektrokimyasal çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmaların birinde asiklovir’in elektrokimyasal davranışları anodik yönde değişik pH aralıkları için incelenmiş [23], ikincisinde de aynı araştırmacılar tarafından anodik diferensiyel puls voltametrisi tekniği ile miktar tayini gerçekleştirilmiştir [24]. Asiklovir’in katodik yöndeki davranışı ise Kusmierek ve ark. tarafından incelenmiştir [25]. Bu grup ilaçlardan valasiklovir ve gansiklovir ile yapılmış herhangi bir elektrokimyasal çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu grup ilaç hammaddeleri için elektrokimyasal analiz yöntemleri ile ne oksidayon ne de redüksiyon yönünde ilaç dozaj formlarından yada biyolojik sıvılardan analiz yöntemlerine rastlanılmamıştır. Bu grup maddelerin dozaj formlarından yada biyolojik sıvılardan tayinleri için yüksek basınçlı sıvı kromatografisi [26-35], kapiler elektroforez [36-37], spektrofotometri [38] yöntemleri geliştirilmiştir. Bu proje kapsamında çalışılması düşünülen nükleozid ters transkriptaz inhibitörü antiviral ilaçlar üzerinde de ilk ilaçlardan olan zidovudin’in asılı civa damla elektrotla yapılan redüksiyon yönündeki çalışmalar dışında başka hiçbir elektrokimyasal çalışması literatür taraması sırasında bulunamamıştır [39-40]. Bu maddelerle ne oksidasyon nede redüksiyon yönünde yapılmış bir analiz yöntemine rastlanılmamıştır. İlaç dozaj formlarından ve biyolojik sıvılardan tayine yönelik çalışmalar da yüksek basınçlı sıvı kromatografisi [41-52], gaz kromatografisi [53], kapiler elektroforez [54-56] ve spektrofotometrik [57] yöntemler kullanılmıştır. Tüm bu bilgilerin ışığında açıkça görülmektedir ki her 3 grupta yer alan ilaç etken maddelerinin çeşitli ilaç dozaj formlarından analizinde katı veya döner elektrotlarla yükseltgenmelerine, katı, döner veya civa elektrotlarla indirgenmelerine dayalı çalışmalar oldukça sınırlı sayıda olup, bu grup ilaçların ilaç dozaj formlarından veya biyolojik sıvılardan elektrokimyasal yöntemlerle tayinleri gerçekleştirilmemiştir. Her 3 grup için ayrıca bu proje kapsamında DNA ile modifiye edilmiş elektrotlarla (camsı karbon, karbon pasta) deneyler gerçekleştirilmeye ve DNA ilaç etkileşmesi incelenmeye çalışılmıştır. Bu çalışmalar çok kapsamlı olduğu için halen devam etmektedir. Çalışmalar sonuçlandıkça yayına gönderilecek ve sonuçlar derhal bildirilecektir. Ayrıca her 3 grupta yer alan bu etken maddelerin mekanizmaları hakkında da literatürlerde çok açık bilgiye rastlanılmamıştır. Bu nedenle proje kapsamında yer alan bu maddelerin oksidoredüksiyon mekanizmaları üzerinde çalışmalar yapılmış ve analiz sonuçları ile birlikte değerlendirilip, yayına gönderilmiştirç Bu projede kullanılan yöntemler olan voltametri ve polarografi 1970’li yıllardan bu yana elektronikteki gelişmelere paralel olarak ilaç analizlerinde sağladığı bazı üstünlükler nedeni ile giderek artan bir uygulama alanına yayılmıştır (58-60). Özellikle sonradan geliştirilen tekniklerle çok düşük derişimlerde bile (10-10–10-12 M) farmasötik analizler yapılabilmektedir. (61-63). Modern elektroanaliz (puls-dalga formları, sıyırma teknikleri v.b.) sayesinde biyolojik sıvılardan ilacın ve metabolitinin direkt olarak analizinin yapılabilmesi sağlanmaktadır (58, 60, 64-66). Bu yöntemler diğer pek çok yönteme göre oldukça kolay olup, çoğu kez herhangi bir ayırmaya gerek kalmadan gerçekleştirilebilmektedir. Voltametri ve polarografinin üstün yanlarından biri de, ilaç etken maddelerinin indirgenme ve yükseltgenme reaksiyonlarındaki rolü ile moleküler biyoloji alanında ve dolayısıyla fizyolojik önem taşıyan pek çok bileşiğin farmakolojik etki mekanizmalarının açıklanmasında kullanılmasıdır. İlaç etken maddelerinin elektrot yüzeyindeki oksido-redüktif davranışları, ilaçların vücuda alındığı zaman vücutta uğradıkları invivo redoks davranışlarına benzetilmekte yada başka bir deyişle metabolizmaları hakkında bilgi verebileceği düşünülmektedir (60,67). Civa elektrotların kullanıldığı polarografi yönteminin en büyük avantajı ise çok geniş negatif potansiyel aralığına sahip olmasıdır. Damlayan civa ve asılı civa damla elektrotlarla, katı elektrotlarla (özellikle karbon elektrotlarla) inilemeyen negatif potansiyellerdeki olaylar kolaylıkla gözlenebilmektedir. Karbon yapılı elektrotların negatif potansiyel aralıkları oldukça sınırlıdır, oysa civa elektrotlarla karbon elektrotlarda gözlenemeyen olaylar kolaylıkla tesbit edilebilmektedir. Her deneyde yeni yüzey oluştuğu için de tekrar edilebilirlik güçlüğü ve yüzey kirliliği gibi sorunlar ortadan kalkmaktadır. Bütün bu elektrot çeşitleri çalışmalarımızda kullanılmıştır. Voltametrik analizde kullanılan katı elektrotlarla yapılan çalışmalardaki en önemli engel elektrot yüzeyinin, maddelerin yüzeyde tutulmaları nedeniyle kolayca temizlenememesi ve bu nedenle tekrar edilebilirliğin sağlanmasının olduça zahmetli parlatma veya biraz vakit alan elektrokimyasal ön işlemler gerektirmesidir. Bu tekrar edilebilirliğin sağlanabilmesi için son yıllarda bazı kimyasal, elektrokimyasal veya her ikisinin de bir arada kullanıldığı ön işlemlerle elektrot materyalinin aktive edilerek temizlenmesi (68) veya özellikleri değiştirilerek geliştirilmiş elektrot dizayn çalışmaları (69, 70) sayesinde yapılan analizlerde duyarlık ve seçicilik arttırılmış hattta elektroinaktif yapıdaki moleküllerin analizlerinin yapılabilmesi sağlanmıştır (71). Ayrıca DNA ile modifiye edilen elektrotlarla yapılan çalışmalarda DNA biosensörleri geliştirilmesi amaçlanmaktadır. Nükleik asit tanıma yöntemlerine dayanan elektrokimyasal DNA biyosensörleri, genetik ve bulaşıcı hastalıkların hızlı, basit ve ucuz yoldan tanımlanabilmesi, DNA hasarının izlenebilmesi amacıyla büyük hızla geliştirilmektedir. Ayrıca bu etkileşmeler sayesinde de geliştirilen elektrotlarla ilacın tayini biyolojik sıvılardan ve dozaj formlarından gerçekleştirilebilmektedir (72-76). Bu projenin amacı değişik elektrotlar (katı (karbon pasta, modifiye karbon pasta, camsı karbon, döner elektrotlar) ve asılı duran civa damla elektrotlar kullanılarak 3 ayrı grupta yer alan ilaç etken maddelerinin oksido-redüktif özelliklerini incelemek, elde edilen verilerden hareketle bileşiklerin mekanizmalarının aydınlatılması, dozaj formlarından ve biyolojik sıvılardan analizlerine olanak sağlayacak yöntemler geliştirmekti. DNA ile modifiye edilmiş elektrotlarla (DNA biyosensörleri) özellikle AIDS hastalığının tedavisinde kullanılan antiviral ilaçlarla DNA-ilaç etkileşmesinin incelenmesi amaçlanmıştı. Bu çalışmalar çok detaylı ve zaman alıcı çalışmalar olduğu için ön deneyleri gerçekleştirilmiş, detaylı çalışmalara yeni başlanabilmiştir. Çalışmalar sonuçlandıkça yayına yollanacak ve sonuç bildirilecektir. Yürütülen araştırmanın bilimsel katkısı ve pratik sonuçları şunlardır: - Seçilen maddelerin oksido-redüksiyon mekanizmaları aydınlatılmaya çalışılmış böylece bu maddelerin vücutta nasıl bir mekanizma ile metabolize olduğu hakkında in vitro olarak bilgi sahibi olunmaya çalışılmıştır. - Özellikle günümüzün modern analitik tekniklerinden olan adsorptif sıyırma, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi/polarografisi tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiş olan yöntemlerin duyarlı, seçici, basit ve hızlı bir biçimde ilaç dozaj formlarından ve biyolojik sıvılardan analizlerine uygulanabilirliği gösterilmiştir. - Bu araştırmada saptanmış olan anodik ve katodik davranışlar gelecekte elektrokimyasal dedektörlü HPLC yönteminin geliştirilmesinde de yardımcı olacaktır. III. Materyal ve Yöntem Üzerinde çalışılan ve çalışmaya devam edilen ilaç etken maddeleri: (Gurupların çıkış maddeleri ve detaylı olarak araştırılmış olan maddeler listeden çıkarılmıştır). A- Kinolon Grubu Antibakteriyel İlaçlar Enoksasin Siprofloksasin B- Sistemik Antiviral İlaçlar I- Nükleozid Grubu Valasiklovir Gansiklovir II- Nükleozid Ters Transkriptaz İnhibitörleri Zidovudin Lamivudin Zalsitabin Abakavir Bu çalışmalarda dönüşümlü, doğrusal taramalı voltametri, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi/polarografisi, adsorptif sıyırma voltametrisi/polarografisi teknikleri uygulanmıştır. Bu proje kapsamındaki etken maddelerin mekanizmalarının aydınlatılabilmesi için dönüşümlü voltametri ve döner elektrotların kullanıldığı sistem ile deneyler yapılmıştır. Bu proje kapsamında ana cihaz BAS 100W (Elektrokimyasal Analizör) ek parçaları konumundaki 2 modülü (BAS RDE-2 MODEL ROTATING DISC ELECTRODE ve BAS CGME CONTROLLED GROWTH MERCURY ELECTRODE) alınmış ve bu deneylerin gerçekleştirilmesinde kullanılmıştır. Geliştirilen yöntemler daha sonra farmasötik preparatlardan bu maddelerin duyarlı analizler için uygulanmaya çalışılmıştır. Ayrıca bu yöntemlerin vücut sıvılarına (tam kan, insan serumu ve idrarı vb.) uygulanması çalışmaları da gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler sırasında da adsorptif sıyırma, diferansiyel puls ve kare dalga tekniklerinden yararlanılmıştır. Özellikle adsorptif sıyırma deneylerinde civa elektrot sisteminden sıklıkla yararlanılmıştır. Araştırma Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı ve Merkez Laboratuvarında bulunan cihaz, madde ve malzeme desteği ile yürütülmüştür. Kullanılan temel ekipmanlar: Bu proje kapsamında satın alınan ve mevcut olanlar dahil: - BAS 100W Elektrokimyasal Analizör ve Katı ; Döner ve Civa Elektrot üniteleri - Hücreler ve elektrotlar - WTW marka pH metre - Ultrasonik banyo - UV-Vis Spektrofotometre (Shimadzu 1601) IV. Analiz ve Bulgular - Bu proje kapsamındaki maddelerden nükleozid grubu ve nükleozid ters transkriptaz inhibitörü antiviral ilaçların hem elektrooksidasyonu hem de elektroredüksiyonu incelenmiştir. Bu maddelerden üzerinde hemen hemen hiç çalışma bulunmayan Abakavir etken maddesi ile çalışmalara başlanmış ve kısa süre içerisinde sonuçlandırılarak SCI tarafından indekslenen “A” gurubu dergiler arasında yer alan impact faktörü yüksek bir dergi olan ELECTROCHIMICA ACTA’da yayınlanmıştır. Bu çalışmada Abakavir’in elektrooksidasyonu üzerine pH, tarama hızı, destek elektroliti cinsi, tampon çeşitleri gibi faktörlerin etkisi incelenmiş, maddenin yükseltgenme mekanizması açıklanmaya çalışılmış ve bir mekanizma önerilmiştir. Ayrıca maddenin kısa sürede, duyarlı ve doğru bir şekilde analizlenebilmesi için analiz yöntemleri geliştirilmiş ve bu yöntemler ilaç dozaj formlarına ve maddenin biyolojik sıvılardan analizine uygulanmıştır. - Daha sonraki aşamada proje kapsamındaki maddelerden nükleozid grubu antiviral ilaçlardan Gansiklovir’in elektrooksidasyonu incelenmiştir. Bu madde üzerinde hemen hemen hiç çalışma olmadığı için hızla çalışmalara başlanmış ve kısa süre içerisinde sonuçlandırılarak SCI tarafından indekslenen “A” gurubu dergiler arasında yer alan impact faktörü yüksek bir dergi olan ANALYTICA CHIMICA ACTA’da yayına kabul edilmiş ve düzeltilmiş prova halinde sciencedirect veri tabanında okumaya açık halde sunulmuştur. Bu çalışmanın düzeltilmiş provası ayrı baskı halinde ekte de sunulmuştur. Bu çalışmada Gansiklovir’in elektrooksidasyonu üzerine pH, tarama hızı, destek elektroliti cinsi, tampon çeşitleri gibi faktörlerin etkisi incelenmiştir. Ayrıca maddenin kısa sürede, duyarlı ve doğru bir şekilde analizlenebilmesi için analiz yöntemleri geliştirilmiş ve bu yöntemler ilaç dozaj formlarına ve maddenin biyolojik sıvılardan analizine uygulanmıştır. - Bir sonraki aşamada proje kapsamındaki maddelerden nükleozid ters transkriptaz inhibitörü antiviral ilaçlardan Lamivudın ve Zalsitabin’in elektroredüksiyonu incelenmiştir. Bu maddeler benzer karakter gösterdikleri için her iki çalışma birleştirilerek tek makale haline getirilmiş ve elde edilen sonuçlar SCI tarafından indekslenen “B” gurubu dergiler arasında yer alan impact faktörü yüksek bir dergi olan ELECTROANALYSIS’de yayına gönderilmiştir. Bu çalışmaya ait hakem incelenmesi elimize geçmiş gerekli düzeltmeler yapılarak makale tekrar dergiye yollanmıştır. Son cevap beklenmektedir. Bu çalışmada Lamivudin ve Zalsitabin’in elektroredüksiyonu üzerine pH, tarama hızı, destek elektroliti cinsi, tampon çeşitleri gibi faktörlerin etkisi incelenmiş, maddelerin indirgenme mekanizması açıklanmaya çalışılmış ve bir mekanizma önerilmiştir. Ayrıca Lamivudin’in kısa sürede, duyarlı ve doğru bir şekilde analizlenebilmesi için analiz yöntemleri geliştirilmiş ve bu yöntemler ilaç dozaj formlarına ve maddenin biyolojik sıvılardan analizine uygulanmıştır. - Proje kapsamındaki maddelerden nükleozid grubu antiviral ilaçlardan Valasiklovir’in elektrooksidasyonu incelenmiştir. Bu madde üzerinde hemen hemen hiç çalışma olmadığı için çalışmalar sonuçlandırılarak SCI tarafından indekslenen “A” gurubu dergiler arasında yer alan impact faktörü yüksek bir dergi olan ANALYTICA CHIMICA ACTA’da yayınlanmak üzere sunulmuş ve gelen hakem eleştirileri doğrultusunda yayın düzeltilerek tekrar dergiye gönderilmiştir. Son cevap beklenmektedir. Bu çalışmada Valasiklovir’in elektrooksidasyonu üzerine pH, tarama hızı, destek elektroliti cinsi, tampon çeşitleri gibi faktörlerin etkisi incelenmiştir. Ayrıca maddenin kısa sürede, duyarlı ve doğru bir şekilde analizlenebilmesi için analiz yöntemleri geliştirilmiş ve bu yöntemler ilaç dozaj formlarına ve maddenin biyolojik sıvılardan analizine uygulanmıştır. - Bu proje kapsamında yer alan ve floro kinolon grubu antibakteryel etkili ilaçlardan Pefloksasin üzerindeki çalışmalar hala deney aşamasında devam etmektedir. Çalışma sonuçlanınca derhal toparlanıp, yayın haline getirildikten sonra uygun bir dergiye gönderilecek ve souçlanınca da BAP’a bildirilecektir. - Bu dönem içerisinde bu proje kapsamında alınan cihazlarla proje kapsamı dışında yer alan maddelerle de çalışmalar gerçekleştirilmiş ve sonuçlananlar aşağıda yayın listesi kısmında sunulmuştur. Bu çalışmalar : - Sefalosporin gurubu antibiyotiklerden Cefiksim’in elektrooksidatif davranışlarının incelenmesi ve ilaç dozaj formları ile biyolojik sıvılardan analizi. Bu çalışma SCI tarafından indekslenen ve “B” gurubu dergiler arasında yer alan impact faktörü yüksek bir dergi olan TALANTA’da yayınlanmak üzere kabul edilmiş ve teşekkür kısmında BAP’a atıfta bulunulmuştur (Kabul yazısı eklendi). - Bir diğer çalışmada ise Flupentiksol etken maddesinin elektrooksidasyonu üzerinde çalışılmış ve hızlı analiz teknikleri geliştirlmeye çalışılmıştır. Bu çalışma da SCI tarafından indekslenen “B” gurubu dergiler arasında yer alan ANALYTICAL LETTERS dergisinde yayınlanmak üzere kabul edilmiştir. (Kabul yazısı eklendi). - Bu proje kapsamında alınan cihazla gerçekleştirilen ve künyesi “yayınlar ve tezler” bölümünde verilen Yüksek Lisans tezinden üretilen bir çalışma da değerlendirilmek üzere ilgili dergiye yollanmış ve ilk cevap beklenmektedir. V. Sonuç ve Öneriler İncelenen maddelerle ilgili elektrooksidasyon ve elektroredüksiyon çalışmalarına literatürde rastlanmamıştır. Bu çalışmada elde edilen analitik sonuçlar yanında mekanistik incelemeler de yapılarak maddenin elektrooksidasyonu ve/veya elektroredüksiyon mekanizmasına ışık tutmuştur. Ayrıca bu maddeler için duyarlı, seçici, tamamen valide edilmiş analiz yöntemleri geliştirilmiş ve bu yöntemlerin uygulanabilirliği ilaç dozaj formlarına ve biyolojik sıvılara uygulanabilirlik deneyleri ile kanıtlanmıştır. Sonuç olarak bulgular kısmından da görüldüğü gibi bu proje kapsamında alınan ekipman ve sarf malzemeleri ile oldukça yüksek impact faktörü olan ve SCI tarafından indekslenen dergilerde yayınlar yapılmış bu yayınların teşekkür kısmında BAP’a atıf yapılmıştır. Çalışmaların bir kısmı (özellikle DNA ile ilgili çalışmalar) halen sürmektedir ve sonuçlandıkça BAP’a gönderilecektir. Bu proje kapsamında aldığımız BAS 100 W elektrokimyasal Analizörü ve Döner elektrot ve Civa elektrot modülleri sayesinde modern elektrokimyasal yöntemleri uygulayabilme fırsatı bulduk. Bu cihaz ayrıca projede yer alan ve almayan pek çok araştırmacıya da çalışma olanağı sağlamış ve sağlamaya devam edecektir. Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğüne bu olanağı sağladığı bize sağladığı için teşekkür ederiz. VI. Kaynaklar İlgili çalışmalar projenin amacı kısmında anlatılmış ve ilgili literatürler aşağıda verilmiştir. 1-Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. Prof.Dr. S. Oğuz Kayaalp. Hacettepe TAŞ Kitapçılık, Ankara, 1.Cilt. 9. Baskı, s. 276, 347, 2000. 2-Goodman and Gilman’s. The Pharmacological Basis of Therapeutics. J.G.Hardman, L.E.Limbird, A.Goodman Gilman. 10. Baskı, Mc Graw-Hill Medical Publishing Division, New York, pp. 1179, 1349, 2001. 3- Rizk, M., Belal, F., Aly, F.A., El-Enany, N.M., Talanta, 46, 83-89, 1998. 4- Zhang, Z.Q., Yan-Fei, L., Xiao-Mei, H., Zhang, H., Talanta, 43, 635-641, 1996. 5- Warowna-Grzeskiewicz, M., Chodkowski, J., Fijalek, Z., Acta Polon. Pharm., 52, 441, 1995. 6- Warowna-Grzeskiewicz, M., Chodkowski, J., Fijalek, Z., Acta Polon. Pharm., 52, 187, 1995. 7- Kapetanovic, V., Milovanovic, Lj., Erceg, M., Talanta, 43, 2123, 1996. 8- Zhang, Z.Q., He, X.M., Li,Y.F., Qin, S., Acta Pharm. Sinica, 31, 695, 1996. 9- Zhou,G., Pan, J., Anal. Chim.Acta, 307, 49, 1995. 10-Tamer, A., Anal. Chim.Acta, 231, 129, 1990. 11- Navalon, A., Blanc, R., Reyes, L., Navas, N., Vilchez, J.L, Anal. Chim.Acta, 454, 83, 2002. 12- Rizk, M.S., Belal, F., Ibrahim, F.A., Ahmed, S.M., Sheribah, Z.A., Electroanalysis, 12, 531, 2000. 13- Zhang, Z.Q., Li,Y.F., He, X.M., Zhang, H., Talanta, 43, 635, 1996. 14- Gratteri, P., Cruciano, G., Analyst, 124, 1683, 1999. 15- Hernandez, M., Borrull, F., Calull, M., J. Chromatogr. B., 742, 255, 2000. 16- Hamel, B., Audran, M., Costa, P., Bressole, F., J.Chromatogr.A, 812, 369, 1998. 17- Macek, J., Ptacek, P., J. Chromatogr.B, 673, 316, 1995. 18- Carlucci,G., Cilli, A., Liberato, M., Mazzeo, P., J.Pharm.Biomed.Anal., 11, 1105, 1993. 19- Hopkala, H., Kowalczuck, D., Die Pharmazie, 55, 432, 2000. 20- Hopkala, H., Kowalczuck, D., Acta Polon. Pharm., 57, 3, 2000. 21- Novakovic,J., Nesmerak, K., Nova, H., Filka, K., J.Pharm.Biomed.Anal., 25, 957, 2001. 22- Sun, S.W., Wu, A.-C., J.Liq.Chromatogr.Rel.Tech., 22, 281, 1999. 23- Kenley, R.A., Jackson, S.E., Martin, J.C., Visor, G.C., J.Pharm.Sci., 74, 1082, 1985. 24- Visor, G.C., Jackson, S.E., Kenley, R.A., Lee, G.C., J.Pharm.Sci., 74, 1078, 1985. 25- Kusmierek, J.T., Czochralska, B., Johansson, N.G., Shugar, D., Acta Chem. Scan., Ser B., 41, 701, 1987. 26- Merido, M., Campanero, M.A., Mirshahi, T., Mirshahi, M., Irache, J.M., J. Chromatogr.A., 870, 159, 2000. 27- Bangaru, R.A., Bansal, Y.K., Rao, A.R.M., Gandhi, T.P., J.Chromatogr. B., 739, 231, 2000. 28- Tsuchie, M., Hara, S., Kimura, M., Fuji, M., Ona, N., Kai, M., Anal.Sci., 17, 811, 2001. 29- Pham-huy, C., Stathoulopoulou, F., Sandouk, P., Scherrmann, J.-M., Palombo, S., Girre, C., J. Chromatogr. B, 732, 47, 1999. 30- Brown, S.D., White, C.A., Chu, C.K., Bartlett, M.G., J. Chromatogr. B, 772, 327, 2002. 31- Chu, F., Kiang, C.H., Sung, M.L., Huang, B., Reeve, R.L., Tarnowski, T., J.Pharm. Biomed.Anal., 21, 657, 1999. 32-Campanero, M.A., Sadaba, B., Garcia-Quetglas, ., Azanza, J.R., J.Chromatogr. B, 706, 311-317, 1998. 33- Boulieu, R., Gallant, C., Silberstein, N., J.Chromatogr. B, 693, 233, 1997. 34- Volpato, N.M., Santi, P., Laureri, C., Colombo, P., J.Pharm.Biomed.Anal., 16, 515, 1997. 35- Peh, K.K., Yuen, K.H., J.Chromatogr. B, 693, 241, 1997. 36- Zhang, S.S., Yuan, Z.B., Liu, H.X., Zou, H., Xiong, H., Wu, Y., Electrophoresis, 21, 2995, 2000. 37- Zhang, S.S., Liu, H.X., Chen, Y., Yuan, Z.B., Biomed.Chromatogr., 10, 256, 1996. 38- Badavaiah, K., Prameela, H.C., Farmaco, 2002. 39- Barone, G.C.,3rd, Pesce, a.J., Halsall, H.B., Heineman, W.R., Anal. Biochem., 198, 6, 1991. 40- Kawczynski, W., Czochralska, B., Shugar, D., Acta Biochim. Polon., 40, 213, 1993. 41- Fan, B., Stewart, J.T., J.Liq.Chrom.Rel.Tech., 24, 3017, 2001. 42- Marchei, E., Pacifici, R., Tossini, G., Di Fava, R., Valvo, L., Zuccaro, P., J.Liq.Chrom.Rel. Tech., 24, 2325, 2001. 43- Clarck, T.N., White, C.A., Chu, C.K., Bartlett, M.G., J.Chrom.B., 755, 165, 2001. 44- Aymard, G., Legrand, M., Trichereau, N., Diquet, B., J.Chrom.B., 744, 227, 2000. 45- Sparidans, R.W., Hoetelmans, R.M.W., Beijnen, J.H., J.Chromatogr., 742, 185, 2000. 46- Pereira, A.S., Kenney, K.B., Cohen, M.S., Hall, J.E., Eron, J.J., Tidwell, R.R., Dunn, J.A., J.Chromatogr. B, 742, 173, 2000. 47- Kenney, K.B., Wring,S.A., Carr, R.M., Wells, G.N., Dunn, J.A., J.Pharm.Biomed.Anal., 22, 967, 2000. 48- Tan, X., Boudinot, F.D., J.Chromatogr. B, 740, 281, 2000. 49- Zheng, J.J., Wu, S.T., Emm, T.A., J.Chromatogr. B, 761, 195, 2001. 50- Simon, V.A., Thiam, M.D., Lipford, L.C., J.Chromatogr. A, 913, 447,2001. 51- Harker, A.J., Evans, G.L., Hawley, A.E., Morris, D.M., J.Chromatogr. B, 657, 227, 1994. 52- Hoetelmans, R.M.W., Profijt, M., Meenhorst, P.L., Mulder, J.W., Beijnen, J.H., J.Chromatogr. B, 713, 387, 1998. 53- Langmann, P., Schirmer, D., Valdieth, T., Desch, S., Zilly, M., Klinker, H., J.Chromatogr. B, 767, 69, 2002. 54- Fan, B., Stewart, J.T., J.Liq.Chrom.Rel.Tech., 25, 241, 2002. 55- Cahours, X., Morin, P., Dessans, H., Agrofoglio, L.A., Electrophoresis, 23, 88, 2002. 56- Agrofoglio, L.A., Cahours, X., Tran, T.T., Dessans, H., Kieda, C., Morin, P., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic acids, 20, 375, 2001. 57- Baig, M.V., Kapse, G.S., Raju, S.A., Asian J. Chem., 13, 185, 2001. 58- Bersier, P.M., J.Pharm.Biomed.Anal., 1, 475, 1983. 59- Bersier, P.M., Bersier, J., Analyst, 114, 1531, 1989. 60- Kauffmann, J.M., Vire, J.C., Anal. Chim.Acta, 273, 329, 1993. 61- Tuzhi, P., Zhongping, Y., Rongshan, L., Talanta, 38, 741, 1991. 62- Vire, J.C., Zhang, H., Quarin, G., Patriarche, G.J., Şentürk, Z., Christian, G.D., Talanta, 40, 313,1993. 63- Farghaly, O.A.M., J.Pharm.Biomed.Anal., 23, 783, 2000. 64- Yılmaz, S., Uslu, B., Özkan, S.A., Talanta, 54, 351, 2001. 65- Özkan, S.A., Özkan, Y., Şentürk, Z., Anal.Chim.Acta, 453, 221, 2002. 66- Vilchez, J.L., Araujo, L., Prieto, A., Navalon, A., J.Pharm.Biomed.Anal., 26, 23, 2001. 67- Wang, J. (Ed.) Electroanalytical Techniques in Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, VCH Publishers, Inc., New York, 1988. 68- Özkan, S., Biryol, İ., Şentürk, Z., Turk.J.Chem., 18, 34, 1994. 69- Özkan, B., Biryol, İ., Şentürk, Z., FABAD, J. Pharm.Sci., 18, 95, 1993. 70- Biryol, İ., Uslu, B., Küçükyavuz, Z., J.Pharm.Biomed.Anal., 15, 371, 1996. 71- Chatten, L.G., J.Pharm.Biomed.Anal., 1, 491, 1983. 72-Palecek, E., Jelen, F., Crit. Rew. Anal.Chem., 32, 261-270, 2002. 73- La-Scalea, M.A., Serrano, S.H.P., Ferreira, E.I., Brett, A.M.O., J.Pharm.Biomed.Anal., 29, 561-568, 2002. 74- Kerman, K., Özkan, D., Kara, P., Meriç, B., Gooding, J.J., Özsöz, M., Anal.Chim.Acta, 462, 39-47, 2002. 75- Kerman, K., Meriç, B., Özkan, D., Kara, P., Erdem, A., Özsöz, M., Anal.Chim.Acta, 450, 45-52, 2001. 76- Ibrahim, M.S., Shehatta, I.S., Al-Nayeli, A.A., J.Pharm.Biomed.Anal., 28, 217-225, 2002. VII. Ekler a)Mali Bilanço ve Açıklamaları b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar (BAP Demirbaş numaraları dahil ) Bu proje kapsamında analınan BAS 100W elektrokimyasal Analizörü ve Döner elektrot ve Damlayan cive elektrot üniteleri Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Merkez I Labaratuvarında bulunmaktadır. (Demirbaş No: 1060/1) Cihaz ile proje kapsamındaki ve proje kapsamında yer almayan pek çok ilaç etkin maddesi ile çalışmalar yapılmış ve yapılmaktadır. İleride de cihaz Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Merkez I Labaratuvarında yoğun bir şekilde kullanılmaya devam edecektir. Cihazla araştırmaların yanı sıra tezler de gerçekleştirilmektedir. Yapılan bir tez bitmek üzeredir (tez aşağıda sunulmuştur). Bu tezden yapılan çalışma da yayına gönderilmiştir ve yayın inceleme aşamasındadır. c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) Tüm ayrıntılar yukarıda verilmiştir. d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) 1- B.Uslu, S.A. Özkan “ Anodic voltammetry of abacavir and its determination in pharmaceuticals and biological fluids” 10 th International Conference on Electroanalysis (ESEAC 2004), 6-10 June, 2004, Galway,Ireland, Abstract p.153, 2004. 2- P.Talay, B.Uslu, S.A.Özkan, Z.Şentürk “ Electrooxidation of the antiviral drug valacyclovir at glassy carbon electrode in aqueous and micellar media10 th International Conference on Electroanalysis (ESEAC 2004), 6-10 June, 2004, Galway,Ireland, Abstract p.154, 2004. e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler 1- Uslu, B., Özkan,S.A., Anodic Voltammetry of Abacavir and Its Determination in Pharmaceuticals and Biological Fluids. Electrochimica Acta, 49, 4321-4329, 2004. (3. ara rapor ile basılmış şekli gönderildi). Kesin rapora da 1 nüsha eklendi. 2- Uslu, B., Doğan, B., Özkan,S.A., Electrochemical studies of ganciclovir at glassy carbon electrodes and its direct determination in serum and pharmaceutics by square wave and differential pulse voltammetry. Analytica Chimica Acta, 537, 307-313, 2005. 3- Gölcü, A., Doğan, B., Özkan,S.A., Anodic Voltammetric Behavior and Determination of Cefixime in Pharmaceutical Dosage Forms and Biological Fluids. Talanta (Baskıda). (Kabul yazısı ve provası eklendi). 4- Doğan, B., Uslu, B., Özkan,S.A., Electrochemical Characterization of Flupenthixol and Rapid Determination of the Drug in Human Serum and Pharmaceuticals by Voltammetry. Analytical Letters, 38,641-656, 2005. 5- Doğan, B., Uslu, B., Süzen S., Özkan,S.A., Electrochemical evaluation of nucleoside analogue lamivudine in pharmaceutical dosage forms and human serum. Electroanalysis (Kabul yazısı eklendi). 6- Doğan, B., Özkan,S.A., Electrochemical Behavior of Carvedilol and its Adsorptive stripping determination in dosage forms and biological fluids. (YAYINA YOLLANDI). (Bu proje kapsamında alınan cihaz ile gerçekleştirilen aşağıda belirtilen Yüksek Lisans Tezinden oluşturulan makale). TEZLER: Burcu DOGAN ; Karvedilol’ün Elektrokimyasal Yöntemlerle Miktar Tayini. YÜKSEK LİSANS TEZİ, Haziran 2005’te bitirilecek (Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü). NOT :Verilen kesin rapor 2 nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD veya disket ile verilecektir.
