T.C. YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DÜZLEMSEL HOMOTETİK HAREKETLER ALTINDAT.C. YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FUSOBACTERIUM NUCLEATUM’UN ENOLAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN KLONLANMASI VE ANALİZİ SİNEM YAKARSÖNMEZ DANIŞMANNURTEN BAYRAK YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOMÜHENDİSLİK ANABİLİM DALI BİYOMÜHENDİSLİK PROGRAMI YÜKSEK LİSANS TEZİ ELEKTRONİK VE HABERLEŞME MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI HABERLEŞME PROGRAMI DANIŞMAN PROF. DR. DİLEK TURGUT-BALIK İSTANBUL, 2011DANIŞMAN DOÇ. DR. SALİM YÜCE İSTANBUL, 2013 T.C. YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FUSOBACTERIUM NUCLEATUM’UN ENOLAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN KLONLANMASI VE ANALİZİ Sinem YAKARSÖNMEZ tarafından hazırlanan tez çalışması 23.12.2013 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Yıldız Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyomühendislik Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Tez Danışmanı Prof. Dr. Dilek TURGUT-BALIK Yıldız Teknik Üniversitesi Jüri Üyeleri Prof. Dr. Dilek TURGUT-BALIK Yıldız Teknik Üniversitesi _____________________ Doç. Dr. Erkan ŞAHİNKAYA İstanbul Medeniyet Üniversitesi _____________________ Doç. Dr. Nehir ÖZDEMİR ÖZGENTÜRK Yıldız Teknik Üniversitesi _____________________ ÖNSÖZ Laboratuvar ve tez çalışmamda bilgi ve deneyimi ile bana yol gösteren, karşılaştığım her türlü sorunu ilgi ve sabırla dinleyip çözümlerini esirgemeyen, akademik çalışma hayatımda ilerleyebilmem için bana her zaman destek olan, kendisinden çok şey öğrendiğim değerli hocam Prof. Dr. Dilek Turgut-Balık'a, Tez çalışmasının yürütülmesine destek sağlayan Yıldız Teknik Üniversitesi KimyaMetalurji Dekanlığı'na, Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Başkanlığı'na ve bölümümdeki tüm hocalarıma, Tez çalışmasında kullanılan Fusobacterium nucleatum genomik DNA’sını sağlayan Dr. Mike Wilward ve Dr. Paul R. Cooper’a, The School of Dentistry, University of Birmingham, Birmingham, United Kingdom, Tez çalışmasının yürütülmesi ve tamamlanmasında her türlü destek ve katkılarını esirgemeyen Uzman Ayşegül Erdemir, Belma Nural, Araştırma Görevlisi Ebru Çayır, Araştırma Görevlisi Emrah Sarıyer, Araştırma Görevlisi Özal Mutlu, Zeynep Büşra Bolat başta olmak üzere tüm laboratuvar grup arkadaşlarıma, Yıldız Teknik Üniversitesi, Biyomühendislik Bölümü’nde bulunan diğer yüksek lisans, doktora öğrencisi arkadaşlarıma, Hayatım boyunca aldığım kararlarda her zaman yanımda olan ve yüksek lisans eğitimim boyunca maddi, manevi desteklerini esirgemeyen sevgili aileme çok teşekkür ederim. Aralık, 2013 Sinem YAKARSÖNMEZ İÇİNDEKİLER Sayfa SİMGE LİSTESİ...................................................................................................................vii KISALTMA LİSTESİ ..............................................................................................................ix ŞEKİL LİSTESİ ......................................................................................................................xi ÇİZELGE LİSTESİ ............................................................................................................... xiii ÖZET………………………………………………………………………………………………………………………….xiv ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………………....xvi BÖLÜM 1 GİRİŞ .................................................................................................................................. 1 1.1 Literatür Özeti ............................................................................................. 1 1.1.1 Periodontal Hastalıklar ........................................................................ 1 1.1.1.1 Periodontal Hastalıkların Başlıca Risk Faktörleri ............................ 1 1.1.1.1.1 Dental plak ve oral hijyen............................................................... 2 1.1.1.1.2 Sigara .............................................................................................. 2 1.1.1.1.3 Mikroorganizmalar ......................................................................... 3 1.1.1.1.4 Konak Yanıtı.................................................................................... 4 1.1.1.1.5 Genetik Faktörler ........................................................................... 4 1.1.1.1.6 Psikolojik Faktörler ......................................................................... 5 1.1.1.2 Periodontal Hastalıkların Epidemiyolojisi ...................................... 6 1.1.1.3 Periodontal Hastalıkların Başlıca Tedavi Yöntemleri ..................... 8 1.1.2 Fusobacterium nucleatum ................................................................... 9 1.1.2.1 Periodontal Hastalıklar ile İlişkisi ................................................. 11 1.1.2.1.1 Farklı Bakteriler ile Olan Etkileşimi .............................................. 12 1.1.2.1.2 Konak Hücreler ile Olan Etkileşimi ve İmmün Yanıt Oluşumu ..... 13 1.1.2.2 Diğer Hastalıklarla Olan İlişkisi ..................................................... 14 1.1.2.3 Antibiyotiklere Karşı Duyarlılığı ve Direnci ................................... 16 1.1.3 Enolaz Enziminin Özellikleri ............................................................... 16 1.2 Tezin Amacı ............................................................................................... 18 iv 1.3 Hipotez ...................................................................................................... 18 BÖLÜM 2 MATERYAL VE METOD .................................................................................................... 19 2.1 Materyaller ............................................................................................... 19 2.1.1 Kimyasallar, Enzimler ve Kitler .......................................................... 19 2.1.2 Deneylerde Kullanılan Cihazlar .......................................................... 20 2.1.3 Bakteriyolojik Büyüme Besiyerleri ve Çözeltileri ............................... 21 2.1.4 Stok Çözeltiler ve Tamponlar............................................................. 22 2.1.5 Primerler ............................................................................................ 26 2.1.6 Genomik DNA .................................................................................... 27 2.1.7 Klonlama ve Ekspresyon Vektörleri ................................................... 27 2.1.8 Escherichia coli Soyları ....................................................................... 28 2.2 Metod ....................................................................................................... 28 2.2.1 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin Klonlama Vektörüne (pGEM®-T Easy Vektör Sistemi) Klonlanması .................. 28 2.2.1.1 FnENO Genine Uygun Primerlerin Tasarlanması ......................... 28 2.2.1.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu ........................................................ 29 2.2.1.3 Etidyum Bromür ile Boyanan Agaroz Jel Elektroforezi ................ 29 2.2.1.4 PCR Ürünlerinin Saflaştırılması .................................................... 30 2.2.1.5 FnENO Geninin Klonlanması için Adenin (A) Kuyruğunun Eklenmesi ..................................................................................... 30 2.2.1.6 Ligasyon Aşaması ......................................................................... 30 2.2.1.7 Kalsiyum Klorür (CaCl2) Muamelesi ile Kompetant E. coli Hücrelerinin Hazırlanması ............................................................ 31 2.2.1.8 Rekombinant Plazmid DNA’nın E. coli DH5α Hücrelerine Transformasyonu ......................................................................... 31 2.2.1.9 Rekombinant Plazmid DNA İzolasyonu ........................................ 31 2.2.1.10 Klonlanan genin PCR ile Kontrol Edilmesi .................................... 32 2.2.1.11 DNA Dizi Analizi ............................................................................ 32 2.2.2 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin İfade Vektörüne (pLATE 31) Klonlanması ................................................... 32 2.2.2.1 aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) Sistemine Uygun Primerlerin Tasarlanması ................................. 33 2.2.2.2 FnENO Geninin Klonlama Vektöründen Amplifikasyonu ............. 33 2.2.2.3 PCR ürünlerinin Kristal-Viyole (CV) Jelde Yürütülmesi ve Saflaştırılması ............................................................................... 34 2.2.2.4 LIC Reaksiyonu ve Rekombinant Plazmid DNA’ların E. coli BL21 (DE3) Hücrelerine Transformasyonu............................................ 35 2.2.2.5 Klonlanan FnENO Geninin Koloni PCR Metodu ile Kontolü ......... 36 2.2.2.6 DNA Dizi Analizi ............................................................................ 36 2.2.3 FnENO Dizisinin Aminoasit Düzeyinde Karşılaştırmalı Analizi ve FnENO Enziminin Filogenetik Analizi ................................................. 37 2.2.4 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Ekspresyonu ............... 37 2.2.5 Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi ...................... 38 2.2.6 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Saflaştırılması ............. 38 2.2.7 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Molekül Ağırlığı ve Molar v Absorblama Katsayısının Değerlerinin Hesaplanması ....................... 39 2.2.8 Saflaştırılmış Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Konsantrasyonun Hesaplanması ....................................................... 39 2.2.9 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Optimum pH ve Spesifik Aktivite Değerlerinin Belirlenmesi ..................................................... 40 2.2.10 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimin Termostabilitesinin Belirlenmesi....................................................................................... 41 2.2.11 Saflaştırılmış Enzimin Kinetik Analizi ................................................. 41 2.2.12 F. nucleatum Enolaz Enziminin Homoloji Modellemesi ve Süperimpozisyonlarının Yapılması .................................................... 43 BÖLÜM 3 SONUÇLAR VE TARTIŞMA................................................................................................ 45 3.1 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin pGEM®-T Easy Vektör Sistemine Klonlanması .................................................................. 45 3.1.1 Amplifikasyon Primerlerinin Tasarlanması ........................................ 45 3.1.2 FnENO Geninin Amplifikasyonu ve E.coli DH5α Hücrelerine Transformasyonu ............................................................................... 46 3.1.3 Klonlanan Genin Kontrolü ve Dizi Analizi .......................................... 48 3.2 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin pLATE 31 Ekspresyon Vektörüne Klonlanması ......................................................... 50 3.2.1 FnENO Geninin Amplifikasyonu ve E. coli BL21(DE3) Hücrelerine Transformasyonu ............................................................................... 50 3.2.2 Gen Aktarımının Kontrolü ve Dizi Analizi........................................... 52 3.2.3 FnENO Dizisinin Aminoasit Düzeyinde Karşılaştırmalı Analizi ve FnENO Enziminin Filogenetik Analizi ................................................. 54 3.2.4 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Ekspresyonu ............... 56 3.2.5 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Saflaştırılması ............. 58 3.2.6 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Optimum pH ve Spesifik Aktivite Değerinin Belirlenmesi ......................................................... 59 3.2.7 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzim Termostabilitesinin Belirlenmesi ....................................................................................... 61 3.2.8 Saflaştırılmış FnENO Enziminin Kinetik Analizinin Yapılması ............. 63 3.2.9 FnENO Enziminin Homoloji Modellemesinin Yapılması .................... 65 3.2.10 F. nucleatum Enolazının Süperimpozisyonlarının Yapılması ve RootMean-Square Deviation (RMSD) Değerlerinin Belirlenmesi ............. 72 BÖLÜM 4 DEĞERLENDİRME VE ÖNERİLER ...................................................................................... 74 KAYNAKLAR ..................................................................................................................... 78 ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................... 85 vi SİMGE LİSTESİ A bç c 0 C CaCl2 cm dH2O dk ε E ES g GC HCl H2O k1 k2 k-1 kb KCl kcat kDa Km l L Mg MgCl2 MgSO4 µg µl mA mg ml Absorbans Baz çifti Protein konsantrasyonu Santigrat derece Kalsiyum klorür Santimetre Distile su Dakika Molar absorblama katsayısı Enzim Enzim-substrat kompleksi Gram Guanin-sitozin Hidroklorik asit Su Birleşme reaksiyon katsayısı Ayrışma reaksiyon katsayısı Tekrar-ayrışma reaksiyon katsayısı Kilobaz Potasyum klorür Dönüşüm katsayısı KiloDalton Michaelis-Menten sabiti Litre Hücre yol uzunluğu Magnezyum Magnezyum klorür Magnezyum sülfat Mikrogram Mikrolitre Miliamper Miligram Mililitre vii mm mM M Me Ms MW NaCl NaH2PO4 ng nm OD pmol rpm sn Tm U Ü VE Vmax VT Milimetre Milimolar Molarite Enzim konsantrasyonu Son molarite Molekül ağırlığı Sodyum klorür Sodyumdihidrojenfosfat Nanogram Nanometre Optik yoğunluk Pikomol Revolutions per munite (Dakika başına devir sayısı) Saniye Erime sıcaklığı Ünite Ürün Enzim hacmi Maksimum hız Toplam reaksiyon hacmi viii KISALTMA LİSTESİ ABD ATP B. forsythus BSA CPI CPITN CV dATP DNA dNTP DOPE E. coli EDTA EhENO EtBr FISH FnENO FNP F. nucleatum H. sapiens HuENO IL IPTG LB NCBI ncRNA Ni-NTA NMR PCR PDB PEP 2-PGA P.gingivalis Amerika Birleşik Devletleri Adenozin Trifosfat Bacterioides forsythus Mavi Seçim Agarı Toplum Periodontal İndeksi Tedavi İhtiyaçlarının Toplum Periodontal İndeksi Kristal Viyole Deoksiriboadenozintrifosfat Deoksiribonükleik asit Deoksiribonükleotidtrifosfat Discrete Optimized Protein Energy Escherichia coli Etilendiamintetraasetik asit Entrococcus hirae Enolaz Etidyum Bromür Floresans in-situ hibridizasyon Fusobacterium nucleatum Enolaz Fusobacterium nucleatum polymorphyum Fusobacterium nucleatum Homo sapiens Homo sapiens Enolaz Enzimi İnterlökin İzopropil-β -D- tiyogaltopiranosid Luria-Bertani National Center for Biotechnology Information Kodlanmayan Ribonükleik asit Nikel Nitriloasetik asit Nükleer Manyetik Rezonans Polimeraz Zincir Reaksiyonu Protein Data Bank Fosfoenolpirüvat 2-fosfo-D-gliserat Porphyromonas gingivalis ix RMSD RNA rRNA RO SAB SDS SDS-PAGE T. annulata TAE TaENO TEMED T. forsythia tRNA UV WHO X-Gal Root-Mean Square Deviation Ribonükleik asit Ribozomal Ribonükleik asit Bölge Ofisi Örnek Uygulama Tamponu Sodyum Dodesil Sülfat Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi Theileria annulata Tris-Asetat-EDTA Theileria annulata Enolaz Enzimi Tetrametiletilendiamin Tannerella forsythia Taşıyıcı Ribonükleik asit Ultraviyole Dünya Sağlık Örgütü 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid x ŞEKİL LİSTESİ Sayfa Şekil 1. 1 Şekil 1. 2 Şekil 1. 3 Şekil 1. 4 Şekil 1. 5 Şekil 2. 1 Şekil 2. 2 Şekil 2. 3 Şekil 2. 4 Şekil 2. 5 Şekil 3. 1 Şekil 3. 2 Şekil 3. 3 Şekil 3. 4 Şekil 3. 5 Şekil 3. 6 Şekil 3. 7 Şekil 3. 8 Şekil 3. 9 Şekil 3. 10 Şekil 3. 11 Şekil 3. 12 Şekil 3. 13 Şekil 3. 14 Şekil 3. 15 WHO Bölgesel Ofisi (RO)’nin belirlediği 35-44 yaş yetişkinleri içersinde en yüksek CPI skorlarının ortalama yüzdeleri. .................................................... 7 Dünya genelindeki 35-44 yaş arası yetişkinlerin diş çürüğü düzeyleri .......... 8 Fusobacterium nucleatum’un elektron mikroskobu görüntüsü .................. 10 FNP ATCC 10953 suşunun genom haritası. .................................................. 11 Glikoliz basamaklarının şematik gösterimi .................................................. 17 pGEM®-T Easy Vektör Sistemi ..................................................................... 27 pLATE 31 ekspresyon vektörü . .................................................................... 28 Enzim katalizlemesi ile substratın ürüne dönüşüm reaksiyonu................... 41 Reaksiyon hızı ve substrat konsantrasyonuna bağlı Michaelis-Menten denkleminin grafiği. ..................................................................................... 42 Lineweaver-Burk denkleminin grafiği. ........................................................ 43 F. nucleatum üç alt türünün enolaz enzimini kodlayan gen dizilerinin eşleştirmesi sonucundaki 5’ ucu nükleotid dizisi ......................................... 45 F. nucleatum üç alt türünün enolaz enzimini kodlayan gen dizilerinin eşleştirmesi sonucundaki 3’ ucu nükleotid dizisi ......................................... 45 PCR ile amplifiye edilen FnENO geninin agaroz jel elektroforez görüntüsü.46 Long PCR Enzim Mix ile oluşan PCR ürününün agaroz jel elektroforezi görüntüsü ..................................................................................................... 47 pGEM®-T Easy Vektör Sistemi ile yapılan klonlama sonrası transformasyonda LB-BSA petrilerinde görülen koloniler ........................... 47 Klonlanan genin PCR ile yapılan kontrolünün jel görüntüsü. ...................... 48 Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 enolaz geni (1. sıra) ile bu çalışmada klonlanan genin (2. sıra) dizi analizi ..................... 49 FnENO geninin amplifikasyon sonucu.......................................................... 51 FnENO geninin saflaştırma sonrası agaroz jel elektroforez görüntüsü. ...... 51 Koloni PCR sonrasında elde edilen agaroz jel elektroforez görüntüsü. ....... 53 Alt-klonlama ile FnENO gen dizisine eklenen 6xHis-tag bölgesinin gösterimi . ...................................................................................................................... 54 Enolazın çoklu dizi eşleştirmesi.. .................................................................. 55 FnENO’nun filogenetik ağacı ........................................................................ 55 Hücrelerin 5 saat inkübe edilmesinin ardından elde edilen ekspresyonsonucu. ...................................................................................... 57 Hücrelerin bir gece boyunca inkübe edilmesinin ardından elde edilen xi Şekil 3. 16 Şekil 3. 17 Şekil 3. 18 Şekil 3. 19 Şekil 3. 20 Şekil 3. 21 Şekil 3. 22 Şekil 3. 23 Şekil 3. 24 Şekil 3. 25 Şekil 3. 26 Şekil 3. 27 Şekil 3. 28 Şekil 3. 29 Şekil 3. 30 Şekil 3. 31 ekspresyon sonucu....................................................................................... 57 Saflaştırma sonrası gerçekleştirilen SDS-PAGE görüntüleri. ........................ 59 Ortalama değerlere göre belirlenen pH-absorbans değerleri ..................... 61 FnENO enziminin termostabilite deneyi sonucunda elde edilen absorbans değerleri ve zaman grafiği ............................................................................ 62 Saflaştırma sonrası elüsyonlardan elde edilen FnENO enziminin SDS-PAGE görüntüsü. .................................................................................................... 63 FnENO enziminin kararlı hal kinetiği grafiği ................................................. 65 FnENO (2. sıra) ve EhENO (1. sıra) enzimlerinin aminoasit dizilerinin eşleştirilmesi ................................................................................................ 66 FnENO’nun seçilen en iyi modelinin görüntüsü ........................................... 67 Model FnENO’nun ERRAT programı sonucunun görüntüsü. ....................... 67 Optimizasyon sonrası FnENO modelinin Z-skor sonucu .............................. 68 Optimizasyon sonrası FnENO modelinin enerji düzeyi grafiği ..................... 69 Optimizasyon sonrası FnENO modelinin Ramachandran diyagramı. .......... 69 SOPMA programına göre FnENO model proteinin ikincil yapı sonuçları..... 70 Model proteinin aktif bölgelerinin Q-SiteFinder görüntüsü. ....................... 71 Model proteinin aktif bölgelerinin DoGSiteScorer görüntüsü. .................... 71 FnENO ve EhENO enzimlerinin aminoasit dizilerinin süperimpozisyonu. ... 72 Üç farklı insan enolaz dizileri ile FnENO’nun aminoasit dizilerinin süperimpozisyonları. .................................................................................... 73 xii ÇİZELGE LİSTESİ Sayfa Çizelge 1. 1 Çizelge 2. 1 Çizelge 2. 2 Çizelge 2. 3 Çizelge 2. 4 Çizelge 2. 5 Çizelge 3. 1 Çizelge 3. 2 Çizelge 3. 3 Çizelge 3. 4 Çizelge 3. 5 Çizelge 3. 6 Çizelge 3. 7 Çizelge 3. 8 F. nucleatum enfeksiyonun primer tanısı............... ………………………………15 FnENO geninin genomik DNA’dan amplifikasyonunda kullanılan PCR bileşenleri ................................................................................................ 29 Ligasyon Bileşenleri ................................................................................. 30 FnENO geninin rekombinant plazmid DNA’dan amplifikasyonunda kullanılan PCR Bileşenleri ........................................................................ 34 FnENO gende 5’ ve 3’ yapışkan uçları oluşturmak için gerekli olan reaksiyon bileşenleri ............................................................................... 35 Koloni PCR Bileşenleri.............................................................................. 36 Ligasyon reaksiyonunun bileşenleri ........................................................ 52 Çoklu tekrarlar sonrasında elde edilen ortalama absorbans değerleri (ΔA240/dk) .............................................................................................. 60 FnENO enziminin termostabilite deneyi sonucundaki absorbans değerleri (ΔA240/dk) ............................................................................... 62 Saflaştırma sonrası seçilen elüsyonların 280 nm’deki absorbans değerleri ................................................................................................................. 63 Değişen substrat konsantrasyonlarına göre ölçülen ortalama ΔA240/dk değerleri .................................................................................................. 64 F. nucleatum enolaz enziminin belirlenen kinetik özellikleri .................. 65 RMSD değerleri ....................................................................................... 73 Farklı türlerdeki enolaz enzimlerinin 2-PGA için kinetik değerlerinin karşılaştırılması ........................................................................................ 76 xiii ÖZET FUSOBACTERIUM NUCLEATUM’UN ENOLAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN KLONLANMASI VE ANALİZİ Sinem YAKARSÖNMEZ Biyomühendislik Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı: Prof. Dr. Dilek TURGUT BALIK Fusobacterium nucleatum insanlarda periodontitis, gingivitis gibi periodontal hastalıklara neden olmaktadır. Ayrıca F. nucleatum oral mikrobiyomda bulunan yaygın türlerden biri olup, oral floradaki diğer bakteriler ve konak epitelyal hücreler ile etkileşmektedir. Fusobacteria’larda antibiyotik duyarlılığının rapor edilmesi, bu türe karşı alternatif ilaçların geliştirilmesi gerektiğini göstermektedir. Enolaz F. nucleatum’un glikolitik yolağındaki, 2- fosfogliserik asidin (2-PGA) fosfoenol pirüvata (PEP) dönüşümü reaksiyonundan sorumlu enzimdir. Bakterinin metabolizmadaki rolünden dolayı F. nucleatum’un enolaz enzimi bu çalışmada hedef molekül olarak seçilmiştir. F. nucleatum enolaz enzimi literatürde ilk defa izole edilmiş, klonlanmış, eksprese edilmiş, kinetik ve yapısal olarak analiz edilmiştir. F. nucleatum enolazı (FnENO) kodlayan gen ilk olarak pGEM®-T Easy Vektör sistemine klonlanmıştır. Daha sonra Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde enzimin ekspresyonunun yapılması için pLATE 31 vektörüne alt-klonlaması yapılmıştır. Ni-NTA agarozu kullanılan affinite kromatografisi ile protein saflaştırılmasını sağlamak için proteinin C- terminal ucuna 6xHis-tag bölgesi eklenmiştir. Protein saflaştırma işleminden sonra 46,37 kDa olan proteinin SDS-PAGE analizinde enzimin, % 95’in üzerindeki yüksek saflıkta elde edildiği gösterilmiştir. Bu enzimin kinetik karakterizasyonu öncesinde optimum pH ve termostabilite analizleri yapılmıştır. FnENO xiv enziminin optimum pH’ı 8,5 olarak bulunmuştur ve spesifik aktivitesi 57,14 U/mg olarak hesaplanmıştır. Termostabilite analizleri FnENO aktivitesinin 30-60 0C arasında stabil kaldığını göstermiştir. Kinetik analiz pH 8,5 ve 250C’de yapılmıştır. Saflaştırılmış FnENO enziminin kinetik parametreleri GraFit 3.0 kullanılarak belirlenmiştir. Kinetik değerler, 2-PGA substratının kullanılmasıyla Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1 olarak elde edilmiştir. Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin homoloji modellemesi Enterococcus hirae enolazının yapısı kalıp alınarak oluşturulmuş ve muhtemel ilaç hedef bölgeleri tanımlanmıştır. Tüm bu sonuçlar yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı doğrultusunda yeni görüşler ortaya çıkarabilecek ve enolaz, insandaki Fusobacterium nucleatum enfeksiyonlarını baskılamak için aday olabilecektir. Anahtar kelimeler: Fusobacterium nucleatum, enolaz, periodontal hastalıklar, kinetik karakterizasyon, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı. YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ xv ABSTRACT CLONING AND ANALYSIS OF THE GENE ENCODING ENOLASE ENZYME FROM FUSOBACTERIUM NUCLEATUM Sinem YAKARSÖNMEZ Department of Bioengineering MSc. Thesis Adviser: Prof. Dr. Dilek TURGUT-BALIK Fusobacterium nucleatum is related to periodontal diseases such as gingivitis and periodontitis in human. It is also one of the prevalent species in the oral microbiome and interacts with other bacteria in oral flora and host epithelial cells. Antibiotic susceptibility in Fusobacteria has been reported, so this showed that development of alternative drugs against this species is required. Enolase is an enzyme which is responsible from a reaction in glycolytic pathway of F. nucleatum and converts 2-phosphoglyceric acid (2-PGA) to phosphoenolpyruvate (PEP). In this study, F. nucleatum enolase was chosen as a target molecule because of its role in the metabolism of the bacteria. The enzyme was isolated, cloned, expressed and analysed both kinetically and structuraly, for the first time in the literature. The gene encoding enolase from F. nucleatum (FnENO) was first cloned into pGEM®-T Easy Vector system and then sub-cloned into pLATE 31 vector for the expression of enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) cells. 6xHis-tag region was added to the Cterminal of the protein to enable purification of the protein by affinity chromotography using Ni-NTA agarose. SDS-PAGE analysis of the 46,37 kDa protein showed that the enzyme was obtained at high purity, over >% 95, following the protein purification process. Optimum pH and thermostability analyses were performed prior to kinetic characterization of the enzyme. It was found that the optimum pH was 8,5 for this enzyme and specific activity was calculated as 57,14 U/mg. Thermostability analyses showed that FnENO activity remained stable between 30-60 0C. Kinetic xvi analysis was performed at pH 8,5 and 250C. Staedy state kinetic parameters of purified FnENO was determined using GraFit 3.0. Kinetic values were obtained using 2-PGA as substrate; Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1. Homology modelling of Fusobacterium nucleatum enolase enzyme was built using Enterococcus hirae enolase structure as template and possible drug target regions were described. All these results may open new insights towards structure based drug design studies and enolase may be a candidate molecule to combat Fusobacterium nucleatum infections in human. Keywords: Fusobacterium nucleatum, enolase, characterization, structure based drug design. periodontal diseases, kinetic YILDIZ TECHNICAL UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES xvii BÖLÜM 1 GİRİŞ 1.1 Literatür Özeti 1.1.1 Periodontal Hastalıklar Periodontal hastalıklar öncelikli olarak bakterilerin neden olduğu dişeti ve dişleri destekleyen dokuları etkileyen kronik bulaşıcı hastalıklardır. Bu hastalıklardan biri dişeti iltihabı olan gingivitistir. Gingivitis bağ doku kaybı olmaksızın diş eti inflamasyonunun oluşmasıdır ve dişeti oluk bölgesinde kanama ya da renk değişimi görülmesi ile belirlenmektedir. Periodontitis ise diş eti inflamasyonunun, diş kökü yüzeyinden epitalyal bağlantılardaki uç noktalara kadar yayılması ile meydana gelir. Bu durum bağ doku ve alveolar kemik kaybına kadar gidebilmektedir [1], [2], [3], [4]. Periodontal hastalıkların oluşmasında pek çok risk faktörü etkili olabilmektedir. Bu hastalıklarda bu risk faktörlerinin belirlenmesi ve erken tanının yapılması diş kaybının engellenmesi açısından oldukça önemlidir. Periodontal hastalıkların belirlenmesi ve tedavisi ile dişlerin korunması ve böylece sindirimin iyi bir şekilde yapılması sağlanabilmektedir [1]. 1.1.1.1 Periodontal Hastalıkların Başlıca Risk Faktörleri Geçmişte periodontal hastalıkların diş plaklarına sahip ve oral hijyeni eksik olan duyarlı bireylerde meydana geldiği düşünülmekteydi. Ancak, son zamanlarda spesifik bakteriyel enfeksiyonlarla birlikte çeşitli risk faktörlerinin de bu hastalıkların gelişmesinde etken olduğu görülmektedir. Bu risk faktörlerinin anlaşılması, 1 klinisyenlerin periodontal hastalığa duyarlı bireyleri ve tedaviye yönelik hedefleri belirlemelerini sağlamaktadır [4], [5]. 1.1.1.1.1 Dental plak ve oral hijyen Dental plakların, gingivitisin gelişmesinde temel risk faktörlerinden biri olduğu 1965’te Löe ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir [6]. Buna bağlı olarak oral hijyen seviyesi diş üzerinde plakların oluşmasında doğrudan etkilidir [2], [4]. Oral hijyen gingivitisin gelişmesinde doğruda etkiliyken, periodontitis hastalığının gelişmesinde daha az bir etkisi bulunmaktadır. Dişin yüzey ve orta kısımlarındaki mikrobiyal floranın ekolojisini etkileyebilmektedir, ancak konak cevabına bir etkisi bulunmamaktadır. Ayrıca; oral hijyenin dişetinin en alt kısımlarındaki mikrofloraya olan etkisi azdır. Yapılan çalışmalarda periodontitis gibi dişeti hastalıkların ileri seviyesinin oral hijyen ile çok fazla ilgisinin olmadığı görülmüştür [4]. Kapsamlı ağız hijyeni programları yetişkinlerde ve çocuklarda dişeti iltihaplarının önlenmesi ve azaltılması açısından oldukça etkilidir. Ancak; bu programlar periodontal hastalıkların agresif formlarının önlenmesinde çok fazla etkili olamayabilir [2], [4]. 1.1.1.1.2 Sigara Sigara; içinde bulunan 4.000 'den fazla toksin ile ölüm, kardiyovasküler hastalıklar, çeşitli kanserler ve çeşitli kronik hastalıklar için önemli bir risk faktörüdür. Ayrıca; sigara içmek, periodontal hastalıklar ve diş kaybı ile uzun süreden beri ilişkili olmuştur. Örneğin; akut nekrotizan ülseratif gingivitis ile sigara arasındaki ilişki 1947 yılında rapor edilmiştir [7]. Araştırmalara göre; ağır ve uzun süreli bir sigara öyküsü bulunanlarda, hafif derecede sigara içenlere göre daha ciddi doku kayıpları gözlenmektedir. Öyle ki sigara ile periodontal hastalığın şiddeti arasında bir doz-etki ilişkisi vardır. Genellikle çalışmalarda, sigara içenlerde içmeyenlere kıyasla diş doku kaybında 2 ila 7 kat arasında bir artış olduğu gösterilmiştir. Ayrıca bu durum sigara içen genç bireylerde daha belirgin gözlenmiştir [4]. Periodontal tedavi ise sigara içenlerde içmeyenlere göre daha az başarı gösterme eğilimindedir. Yapılan çalışmalarda, yumuşak doku aşılama işlemlerinin ve implant 2 prosedürlerinin başarı oranları üzerinde sigaranın olumsuz bir etkisinin olduğunu gösterilmiştir [5]. 1.1.1.1.3 Mikroorganizmalar Dental biyofilm mikroorganizmaların varlığı periodontal hastalıkların başlamasında ve ilerlemesinde bir ön koşul oluşturmaktadır. Yapılan çalışmalar bakteri türlerinin kolonizasyonunun dişeti bölgelerindeki patogenezde çeşitli roller oynadığını göstermektedir. Ayrıca periodontal doku kayıplarının riskini farklı düzeylerde arttırabilmektedirler [2],[4]. Ağızda koloni halinde bulunan mikroorganizmalar arasında özellikle Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Actinobacillus actinomycetemcomitans türleri periodontitis için önemli etiyolojik ajanlardır. Periodontitisin erken başlangıçlı agresif formları ile ilişkili bakteri türleri arasında Actinobacillus actinomycetemcomitans, genellikle şiddetli bağ doku kaybı veya hastalığın hızlı ilerlediği görülen kişilerde tespit edilmiştir. P. gingivalis’in ise kronik periodontitis ile kuvvetli bir biçimde ilişkili olduğunu gösterilmiştir. Dişeti florasında P. gingivalis ve Bacteroides forsythus’un varlığı, periodontal doku kaybının riskinde artış ile ilişkilendirilmiştir [2], [5]. Yapılan çalışmalarda Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum gibi bakterilerin de çeşitli popülasyonlarda periodontal hastalıklar için risk oluşturduğu gösterilmiştir [2]. İnsan sitomegalovirüs ve diğer herpesvirüslerin aktif enfeksiyonları; kronik ve agresif periodontitis, nekrotizan dişeti hastalıklarını içeren yıkıcı periodontal hastalıklarda risk faktörleri olarak görülmektedir. Bir çalışmada; dişetinde bulunan herpesvirüslerin periodontopatik bakterilerin bu bölgelerdeki kolonizasyonu ile ilişkili olduğu bulunmuştur [4]. Periodontal çatlaklarda bulunan bu organizmalar periodontitis ile yakından ilişkilidir ve supragingival plağın bu organizmalar için önemli bir korunak olduğu belirlenen bulgular arasındadır. Sıklıkla yapılan profesyonel dişeti temizlemesi, iyi bir ağız bakımı iç kısımlardaki dişeti mikroflorası için yararlı etki gösterebilmekte ve bu hastalıkları önleyebilmektedir [4]. 3 1.1.1.1.4 Konak Yanıtı Periodontal hastalıklardaki iltihabi reaksiyon, mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilen mikrobiyal saldırı sonucunda başlamaktadır. Bu mikroorganizmaların zararlı antijenleri ve toksik etkilerine karşı konakta immün yanıt oluşmaktadır. Ancak; yeterli olmayan immün yanıt mikrobiyal saldırıların yararına gerçekleşmektedir ve doku kayıpları oluşabilmektedir. Diğer bir şekilde; hiperaktif immün yanıt sitokinlerin ve diğer inflamatuar moleküllerin fazla üretilmesine neden olmaktadır ve bunun sonucunda yavaş ve düzenli olarak periodontal bağ doku kayıpları meydana gelmektedir [2]. İleri düzeyde periodontitis oluşması durumunda; aşırı aktif ve değişime uğramış nötrofiller bu hastalıkta gözlemlenen doku yıkımlarından sorumlu olmaktadır [5]. Lokalize juvenil periodontitis hastalarındaki nötrofiller ve monositler; artan bağışıklık, anormal sinyal iletimi ve depresif kemotaksis gibi fonksiyonel anormallikler göstermektedirler. Sonuç olarak; sistemik konak immün yanıtındaki bozukluklar periodontitisin patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır [2]. 1.1.1.1.5 Genetik Faktörler Periodontal hastalıkların oluşmasında genetik faktörlerin etkili olduğu, bazı genlerin bu hastalıkları modifiye ettiği düşünülmektedir. Ayrıca; gen-gen etkileşimleri ve epigenetik faktörler gibi diğer genetik etkenler periodontal hastalıkların gelişmesinde önemli olabilmektedir [7]. Periodontitisin artan riski ile ilişkili olduğu gösterilen pek çok gen polimorfizmleri araştırılmıştır. 1997’de yapılan bir çalışmada, özel muayenehanelerdeki hasta verilerini kullanarak, polimorfik interlökin-1 (IL-1) gen bölgesinin belirli bir genotipinin şiddetli periodontitis ile ilişkili olduğunu bulunmuştur. Ancak bu bulgular sadece sigara içmeyen hastalarda gözlenmiştir. Böylece bu genetik faktörün hastalığın oluşmasında sigara kadar etkili bir risk faktörü olmadığını gösterebilmektedir. Enfeksiyona karşı konakçı cevabı düzenleyen IL-1 genotipi ve sigara öyküsü birleşimi hastalar için iyi bir risk profili sağlayabilmektedir ve sigara-genetik faktör arasındaki etkileşim periodontitis şiddetini belirlemede bir etken olabilmektedir [4]. 4 Tek yumurta ikizleri ile yapılan çalışmalar; konak faktörlerinin etkili olduğu periodontal hastalıklara yatklınlığı % 50 oranında desteklemektedir [4]. Ayrıca bu çalışmalar kronik periodontal hastalıklarda genetik faktörlerin bir rolü olduğunu kanıtlamaktadır. Agresif periodontitisin ailesel agregasyonunun, etkilenen kardeşlerin ve birincil üyelerin % 4050’ ye varan yüzdeleri ile belirli ailelerde yüksek etkinlikte olduğu görülmüştür. Agresif periodontitisin altında yatan sebep bazı durumlarda lökositlerin fonksiyon bozukluğudur ve bu bozukluğun genetik etkenlerden kaynaklandığı düşünülmektedir [7]. Periodontal hastalığın ailesel agregasyonu genç bireylerde periodontitiste daha belirgindir ve böylece hastalığın bu formu, yetişkinlerdeki kronik periodontitise göre daha güçlü genetik altyapılara sahip olabilir [7] 1.1.1.1.6 Psikolojik Faktörler Psikolojik faktörlerin yıkıcı periodontal hastalıkların artan risk faktörlerinden biri olduğu hipotezi uzun süredir desteklenmektedir [2]. Araştırmalar, psikolojik stres altındaki bireylerdeki kliniksel bağ doku kaybı ve alveol kemik kaybı gelişiminin daha olası olduğunu göstermektedir [5]. Yapılan bir çalışmada; sigara, B. forsythus ve P. gingivalis gibi önemli risk faktörleini içeren bir model kullanarak psikolojik stres, sıkıntı gibi ölçümler periodontal hastalıkların çeşitli parametreleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçlarına göre; mali gerginlik, sıkıntı ve depresyon gibi bozukluklar kronik periodontitisin önemli risk göstergeleri oldukları belirlenmiştir [2]. Stres ve diğer psikolojik faktörlere bağlı peiodontal doku kaybı risklerine odaklanılan araştırmalarda immün sistem ve merkezi sinir sistemi arasındaki etkileşim çalışılmıştır. Psikolojik stres hücresel bağışıklık cevabını down-regüle edebilmektedir ve sinir, endokrin ve immün sistemi bağlayan sinyal ağının homeostazı bozabilmektedir [2]. Ayrıca; psikolojik stresin artışıyla immün cevap içerisinde olan IL-6 üretiminde artış gözlenebilmektedir. Başka bir araştırmada; stresin P. gingivalis enfeksiyonuna karşı immün yanıt için negatif etki oluşturabileceği düşünülmektedir [5]. Sonuç olarak, periodontal hastalıkların gelişmesinde psikolojik etkenler risk oluşturabilmektedir ve tedavi sürecini olumsuz etkileyebilmektedir. 5 1.1.1.2 Periodontal Hastalıkların Epidemiyolojisi Epidemiyoloji, toplumlardaki sağlık ve hastalık çalışmalarıdır ve bu çalışmalar ülkelerin çeşitli biyolojik, demografik, çevresel ve yaşam tarzı etkisiyle oluşmaktadır. Periodontal hastalıkların epidemiyoloji çalışmalarının ön koşulu bu hastalıkların doğru bir şekilde tanımının yapılmasıdır. Epidemiyolojik çalışmalar; diş eti iltihabını, alvolar kemik kaybının radyolojik değerlendirmesini, bağ doku düzeyinin belirlenmesini içeren semptomların geniş bir yelpazesi kullanılarak yapılmıştır [4]. Diş plağı, gingitivis ve periodontitis arasındaki ilişki anlayışı değişmiştir ve bu değişim ile birlikte periodontal hastalıkların küresel ölçüdeki anlayışı ortaya çıkmıştır. Periodontal hastalığın ölçümünde ilk büyük metodolojik değişiklik Tedavi İhtiyaçlarının Toplum Periodontal İndeksi (CPITN)’nin tanıtımı olmuştur. CPITN daha sonra Dünya Sağlık Örgütü tarafından onaylanmıştır ve ismi Toplum Periodontal İndeksi (CPI) olarak değiştirilmiştir [8]. Veri sunumu için standart parametreler, en yüksek CPI skoru tarafından kişilerin yüzdeleri ve CPI skoru ile ortalama şiddet miktarı şunlardır; Skor 0: sağlıklı periodontal koşullar, skor 1: dişeti kanamaları, skor 2: dişeti kanaması ve diştaşı, skor 3: sığ periodontal cepler (4-5 mm), skor 4: dip periodontal cepler (≥ 6 mm) [9]. En güncel CPITN/ CPI skorlarının listesi Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yayınlanmıştır. Buradaki sonuca göre; WHO bölgesel alanlardaki en yüksek skor üzerinden değerlendirildiğinde CPI skorları 4 olan Kuzey ve Güney Amerika’daki ortalama prevalansın 35-44 yaş arasındaki yetişkinlerin % 20’si olduğu görülmüştür (Şekil 1.1). Dahası; WHO, Kuzey ve Güney Amerika’daki benzer yaşlardaki yetişkinlerin % 40’ının CPI skorunun 3 olduğunu tahmin etmektedir [8], [9]. 6 Şekil 1. 1 WHO Bölgesel Ofisi (RO)’nin belirlediği 35-44 yaş yetişkinleri içersinde en yüksek CPI skorlarının ortalama yüzdeleri. AFRO: Africa RO, AMRO: Amerika RO, EMRO: Doğu Akdeniz RO, EURO:Avrupa RO, SEARO: Güneydoğu Asya RO, WPRO: Batı Pasifik RO [8], [9]. Ülkelerin son zamanlardaki periodontal hastalıklara eğilimini belirlemek için Dünya Sağlık Örgütü (WHO)’nün periodontal veritabanları ve diğer kaynaklar kullanılmıştır. Bu verilere göre; Almanya’da 1997 ve 2005 yılları arasında, periodontal ceplerinin derinliği 4 mm’den fazla olan 35-44 yaşları arasındaki yetişkinlerin yüzdesi % 46’dan % 73’e yükselmiştir. Benzer bir yükseliş 65-74 yaşları arasındaki yetişkinlerde de gözlenmiştir. Macaristan’da da 35-44 yaşları arasındaki yetişkinlerde de bu yüzde de % 18’den % 27’ye varan bir artış görülmüştür. İngiltere’de ise bu gözlemlerin aksine 1988 ve 1998 yılları arasında % 75’ten % 59’a varan bir düşüş belirlenmiştir. Amerika’daki verilere bakıldığında, periodontal ceplerinin derinliği 4 mm’den fazla olan hastalıkların 19881994 ve 1999-2004 yılları arasındaki prevalansı 35-49 yaş arası yetişkinlerde % 22.2’den % 11.9’a düşmüştür. 4 mm’den fazla doku kaybı olan hastalıkların prevalansının ise % 25.4’ten % 17.82’e düştüğü gözlenmiştir. Bu yıllar arasında periodontitisin prevalansına bakıldığında yetişkinlerde benzer düşüşler görülmektedir. Avustralya için bakıldığında periodontal ceplerinin derinliği 4 mm’den fazla olan hastalıkların 1995-1996 ve 20042006 yılları arasındaki prevalansının yetişkinlerde azaldığı gözlenmiştir [8]. Periodontal hastalıklara ilişkin tüm dünya genelini içeren bilgilere son zamanlarda rastlanmamaktadır. Bu nedenle genel olarak ağız sağlığı durumuna bakılacak olursa Dünya Sağlık Örgütü (WHO)’nün 2003 yılında yayınladığı ağız sağlığı raporu 7 bulunmaktadır. Bu raporda bulunan dünya genelindeki 35-44 yaş arası yetişkinlerin diş çürüğü düzeylerini gösteren harita Şekil 1.2’de verilmiştir. Bu haritaya göre Türkiye orta düzeyde diş çürüğü prevalansına sahip ülkeler arasındadır [10]. Şekil 1. 2 Dünya genelindeki 35-44 yaş arası yetişkinlerin diş çürüğü düzeyleri [10]. 21. yüzyılın ilk 10 yılında küresel popülasyonun periodontal durumu bilinmemektedir. Ulusal ve bölgesel ağız sağlığı araştırmaları periodontal değerlendirmeleri içermekte ve çoğunlukla gelişmiş ülkelerde yapılmaktadır. Küçük epidemiyolojik çalışmalar, geniş ulusal anketler periodontitisi tanımlayan doku kaybını ve periodontal cep derinliğini içermektedir ve bu çalışmalar popülasyon bazlı araştırmaları standartlaştırmada kullanılabilmektedir. Böylece ileride toplumlardaki potansiyel periodontal hastalık seviyesinin daha iyi belirleneceği düşünülmektedir [8]. 1.1.1.3 Periodontal Hastalıkların Başlıca Tedavi Yöntemleri Periodontal tedaviler; diş implantlarının kullanılmasını, dişin düzeltilmesini ve çevre dokuların desteklenmesini amaçlayarak bu hastalıkların iyileştirilmesini ve önlenmesini sağlamaktadır [11]. Periodontal hastalıkların oluşmasına neden olan bakteri plağı ve diş taşlarının çıkarılması tedavinin temelini oluşturur. Buna yönelik diş yüzeyi temizliği ve kök yüzeyi düzleştirmesi yapılmaktadır. Diş yüzeyinin cilalanması ve parlak bir yüzey oluşturulması 8 ile başlangıçta uygulanan tedaviler tamamlanmaktadır [1]. Bazı durumlarda; bu işlemlere cerrahi müdahalelerde dahil edilebilmektedir. Bu cerrahi uygulamalarda rezektif yöntemler kullanılabilmektedir. Rezektif yöntemlerde periodontal cebin yumuşak doku duvarı çıkartılmaktadır. Ayrıca; cebin sert doku duvarının da çıkarıldığı osteoplasti-osteoektomi işlemleri de uygulanabilmektedir. Diş doku prosedürleri ise kök rezeksiyonu, diş hemiseksiyonu ve odontoplastiyi içermektedir. Sonraki aşamada kemoterapik ajanlar; mikrobiyal patojenleri azaltmak ve etkinliklerini değiştirmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca; lokal ya da sistemik ilaç salımı ile immün yanıtı değiştirmek için ilaç tedavisi uygulanabilmektedir [11], [12]. Çeşitli biyolojik yöntemler kullanılarak da periodontal dokuların yenilenmesi sağlanabilmektedir. Kemik defektleri, dişeti çekilmesi gibi durumlarda kemik yenileme greftleri, kök biyomodifikayonu, yönlendirilmiş doku rejenerasyonu ve bunların kombinasyonlarını içeren prosedürler uygulanabilmektedir. Ek olarak; dişetinde büyüme ya da yumuşak doku deformitelerinin düzeltilmesinde periodontal plastik cerrahi de kullanılabilmektedir. İmplant tedavilerinde ise, cerrahi yöntemlerle dental implantlar yerleştirilmektedir ve peri-implant hastalıkları önlenmektedir. Son olarak; prosedürler tamamlandığında günlük ağız hijyeni ve gerekli kontroller ile tedavi devam ettirilmektedir [11]. 1.1.2 Fusobacterium nucleatum Fusobacterium nucleatum Bacteroidaceae ailesine ait olan Fusobacterium genusunun bir türüdür [13]. Anaerobik, spor oluşturmayan, hareketsiz, gram negatif çubuklu bir bakteridir (Şekil 1.3). F. nucleatum, en fazla %6 oranındaki oksijen varlığında yaşayabildiğinden dolayı aerotoleranslı bakteri olarak tanımlanmıştır [13], [14]. Sağlıklı veya hastalıklı insanların ağız mikroflorasında doğal olarak bulunmaktadır. Konik uçları olan çok uzun bir çubuk bakterisi olup, ağız boşluğu içinde bulunan 500 veya daha fazla organizmanın baskın türlerinden biridir. Oral florada genellikle kommensal bakteriler bulunmaktadır ancak F. nucleatum’u da içeren bir kısmı bakteri fırsatçı patojendirler [15]. 9 Şekil 1. 3 Fusobacterium nucleatum’un elektron mikroskobu görüntüsü [13]. F. nucleatum beş alt türü içerir: polymorphum, nucleatum, vincentii, Fusiforme ve animalis [16]. Dental plak içerisinde koloni oluşturan türler arasında bir köprü görevi görmektedir ve ağız boşluğunda bulunan periodontal patojenlerin çoğu türüyle koagregasyon oluşturma özelliğine sahiptir [13]. Gram negatif ve gram pozitif türler arasındaki fiziksel etkileşimi sağlayarak biyofilm kolonizasyonunun oluşmasında merkezi bir rol oynamaktadır. Oksijeni tolere edemeyen anaerob bakteriler için gerekli olan indirgeyici koşulların ortaya çıkmasına katkıda bulunmaktadır [16]. Karakteristik lipid bileşenleri ile birlikte glikoz ve pepton fermantasyonunun bir ana ürünü olarak butirik asit üretimi, bu bakteriyi diğer anaerobik, gram-negatif, spor oluşturmayan Fusobacterium türlerinden ayırmaktadır. Değişken kalınlıkta bir mukopolisakkarit kapsüle sahip olması patojenik özelliği açısından önemlidir [13]. F. nucleatum alt türü polymorphum ATCC 10953 (FNP) suşu bu çalışmada kullanılmıştır. Bu suşun genomik özelliklerinin belirtildiği genom haritası Şekil 1.4’de gösterilmiştir [16]. 10 Şekil 1. 4 FNP ATCC 10953 suşunun genom haritası. Açık kahverengi: hücre prosesi, koyu mor: hücre yapısı, kırmızı: DNA replikasyonu, mavi: genel metabolizma, açık yeşil: regülasyon, sarı: transkripsiyon, turuncu: translasyon, açık mavi: transport, pembe: virulans, siyah: bilinmeyen kısımlar. İç halka (turuncu) 5 kb kayan bir pencere kullanılarak hesaplanan yüzde GC’yi göstermektedir. Sonraki dairedeki üçgenler tRNA’lar (kırmızı) ve ncRNA’ların (mavi) yerini ve yönünü göstermektedir. Plazmid (yeşil) ve faj yerleri (camgöbeği rengi) dış dairede görülmektedir [16]. 1.1.2.1 Periodontal Hastalıklar ile İlişkisi Periodontal hastalıkların patogenezi, dişeti plağındaki mikrobiyota ve konak yanıtı arasındaki etkileşimi içermektedir. Dental dokuların yıkımı ve inflamasyonu, gramnegatif patojenleri içeren bir mikrobiyal biyofilme duyarlı konak yanıtının sonucunda oluşmaktadır. Ağız boşluğunda belirlenen 300’den fazla türün arasında; Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Campylobacter spp., Capnocytophoga spp., Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia’yı oluşturmaktadır. Bu içeren bakteriler küçük bir potansiyel grubu gram-negatif periodontal bakteriler patojenler olarak tanımlanmaktadır. Periodontal hastalıklarla ilişkilendirilen bu gram-negatif bakteriler arasında Fusobacterium nucleatum en ilgi çekici olanlarından biridir [17], [18]. Fusobacterium nucleatum dişeti plağında çok fazla bulunan bir anaeorob bakteri türüdür. Kommensal olma özelliğiyle sağlıklı periodontal bölgelerden izole edilebilen ve 11 aynı zamanda bu hastalıklara neden olabilen fırsatçı bir patojendir. Periodontal ceplerde ve periapikal lezyonlarda artan oranlarda bulunmaktadır [19]. F. nucleatum, toksik etkileri bulunan değişken sülfür bileşenleri, bütrik ve propiyonik asit üretebilmektedir. Ayrıca lenfositleri aktive edebilmekte ve oral epitelyal hücreler, eritrositler, fibroblastlar, lemfositler, polimorfonükleer lökositler, kollajen IV ve laminin ile adhezyon oluşturabilmektedir. Patojenler ile epitalyal yüzeyde ve dişte kolonize olan kommensalların etkileşiminde kolonizer köprü olarak bulunmaktadır. Bu bakteri; hücresel hasarın oluşmasına ve konak içerisinde patojenlerin dağılımına öncülük etmektedir [17], [20]. 1.1.2.1.1 Farklı Bakteriler ile Olan Etkileşimi F. nucleatum, ağız boşluğundaki mikrobiyal ekolojide önemli bir rol oynamaktadır. Farklı bakteri türleri ile fiziksel etkileşime geçerek koagregasyon oluşturabilmektedir ve bu etkileşim rastgele olmamakla birlikte diğer bakteriye spesifik olarak bağlanmaktadır. F. nucleatum; Streptococci gibi erken kolonizerler arasında anahtar bir role sahiptir ve doğal dental plak içerisinde özellikle zorunlu anaeorob bakteriler ile etkileşim içerisindedir. Bu etkileşim anaerob bakterilerin karışık kültürler içerisinde büyümesini sağlamaktadır [21], [22]. Yapılan bir çalışmada periodontal hastalıklarda etkisi bulunan Peptostreptococcus micros ile F. nucleatum arasındaki etkileşim incelenmiştir. Peptostreptococcus micros’un fibril benzeri yapılarının F. nucleatum ile etkileşmesiyle koagregasyon oluşturduğu görülmüştür. Bu bulgunun bakteriyel kolonizasyon ve periodontal patogenezisin gelişmesinde önemli bir etkisi olduğu düşünülmektedir [23]. F. nucleatum’un erken kolonizer olan Streptococcus, Actinomyces, Veillonella, Selenomonas türleri ve P. gingivalis gibi periodontopatojenler ile koagregasyon yapabildiği rapor edilmiştir [24]. Erken kolonizerler dişin ince zar kısmına tutunurlar, diğer erken kolonizerler ve F. nucleatum ile koagregasyon oluşturmaktadırlar. Ayrıca; Selenomonas flueggi gibi geç kolonizerler ve Eubacterium, Actinobacillus, Capnocytophaga, Treponema türleri yalnızca F. nucleatum ile etkileşime girmektedirler [13]. 12 In vitro ortamda F. nucleatum, patogenezis ve biyofilm oluşumu sırasında Tannerella forsythia ile sinerji oluşturmaktadır. In vivo ortamda F. nucleatum ve T. forsythia dişeti biyofilmlerinde ara tabakalara hükmetmektedirler. Yapılan bir çalışmada bu iki bakterinin konak inflamatuar yanıtını indüklediği ve alveolar kemik kaybında sinerjik etkileri olduğu görülmüştür [25]. F. nucleatum; ya doğrudan ya da diğer virülans bakterilerin plak oluşturmasına aracı olarak insanlarda periodontal hastalıkların gelişmesinde önemli bir etken olmaktadır [18]. 1.1.2.1.2 Konak Hücreler ile Olan Etkileşimi ve İmmün Yanıt Oluşumu Bakterilerin etkileşimi ve bu etkileşim sonucunda epitelyumun çevrelenmesi bakteriyal enfeksiyonların oluşmasında kritik faktörlerdendir. Epitelyal hücreler ile etkileşim içinde olmaları koloni oluşturmalarını kolaylaştırmaktadır. Bakterilerin istilası, dokuların iç kısımlarına yayılmasına neden olur ve immün yanıtın oluşmasını sağlamaktadır [18]. F. nucleatum’un çeşitli virülans fenotipleri belirlenmiştir ve adhesif organizma olarak tanımlanmaktadır. Çünkü; epitelyal ve endotelyal hücreler, polimorfonükleer lökositler, monositler, eritrositler, fibroblastlar ve HeLa hücreleri gibi çeşitli konak memeli hücrelerine bağlanmaktadır. F. nucleatum’un adhesin moleküllerinin belirlenmesi patogenezin anlaşılması açısında önemlidir. Lektin benzeri ve lektin benzeri olmayan adhesinler bu bakteride bulunmaktadır ve porin proteini, çeşitli polipeptidler F. nucleatumda bulunan uygun adhesinlerdir [26]. F. nucleatum epitel hücrelerini istila etmektedir ve bu hücreler içerisinde yaşayıp, çoğalabilmektedir. Epitel hücreleri içerisinde matriks metalloproteinazların üretilmesini indükleyerek periodontitiste bağ doku yıkımına neden olabilmektedirler. Ayrıca; enfekte olan epitel hücrelerini ortadan kaldırmak ve enfeksiyonun daha fazla yayılmasını engellemek amacıyla bu bakteri hücreleri apoptozise yönlendirebilmektedir. Periferik kanın mononükleer ve polimorfonükleer hücrelerinin apoptozu indüklemektedir ve periapikal fibroblastların da büyümesini önlemektedir. Bu durum, iltihaplı dişetlerinde yaygın hücre hasarlarına neden olmaktadır [19]. F. nucleatum epitel hücrelerini çeşitli sitokinleri, inflamutar molekülleri üretmesi için tetiklemektedir. Epitel hücreler monositler ve nötrofilleri etkileyen kemokinler gibi 13 antimikrobiyal peptitleri üretmektedir [17], [19].Yapılan bir çalışmada; F. nucleatum’un insan dişeti epitel hücrelerini kapladığı ve bu hücrelerden yüksek oranda interlökin-8 (IL-8) salımını indüklediği görülmüştür. IL-8 düşük molekül ağırlığına sahip bir proinflamatuar kemokindir ve nötrofilleri aktive etmektedirler. Nötrofillerin dişeti oluğuna göçünü düzenleyerek immün yanıtı tetiklemektedirler [18]. Çalışmalar F. nucleatum hücre duvarı ekstraktının, immün yanıt ile ilişkili genlerin ifadesinde önemli değişikliklere neden olduğunu göstermektedir. CCL20, S100A7, Skalp, IL1F9, CXCL5, C3, IL32, SAA1, SPRR2C ve CXCL1’i içeren 20 genin up-regüle olmasına neden olmaktadır. Bu 20 genin içerisinde 14’ü sitokinler, doğal bağışıklık ve inflamatuar markırları, antimikrobiyaller, proteaz inhibitörleridir. Bunlardan ikisi epitelyal tabakanın yapısı ile ilişkilidir. Down-regüle olan genler ise genellikle hücre döngüsünü düzenleyen genleri içermektedir. Bu şekilde F. nucleatum’un immün yanıtın oluşmasında önemli etkileri bulunmaktadır [17]. 1.1.2.2 Diğer Hastalıklarla Olan İlişkisi F. nucleatum, insan oral floranın bir üyesidir ve periodontal hastalıkların bir ajandır. Oral anaerobların, aynı zamanda ekstra-oral enfeksiyonlara da büyük olasılıkla neden olduğu görülmektedir. Fusobacterium nucleatum akciğer ve beyin apseleri, osteomiyelitis, pelvik enfeksiyonları ve sinüzit gibi insan klinik enfeksiyonlarında gözlenebilen yaygın bir anaeorobtur [27], [28]. Yapılan bir çalışmada; geçmişte çeşitli periodontal hastalıkları bulunan sağlıklı bir kadında F. nucleatum’dan kaynaklı göz çevresinde septik trombofilebitis ve kavernöz sinüsün geliştiği görülmüştür. Büyük olasılıkla fusobacterial enfeksiyon periodontal bölgede ortaya çıkmıştır, kavernöz sinüs ve çevresinde bu bakteri sekonder olarak yayılmıştır [29]. Son zamanlarda; ağırlıklı olarak erken doğum olgularında belirlenen rahim içi enfeksiyonlarda F. nucleatum en yaygın türlerden biridir. Oluşan bu enfeksiyonun ağız boşluğunda bulunan F. nucleatum’dan kaynaklandığı düşünülmektedir. Bu ölü doğum süreci durumunda; bu bakteri vajinal ve rektal florada değil annenin ağız boşluğunda bulunmuştur. Yapılan hayvan çalışmalarında ağızda bulunan F. nucleatum’un hamile farenin plesantasında lokal inflamasyona sebep olan spesifik kolonizasyon oluşturduğu 14 görülmüştür [30]. Ayrıca; F. nucleatum enfeksiyonunun başka hastalıklarla da ilişkilendirilerek primer tanısı yapılabilmektedir (Çizelge 1. 1) [27]. Çizelge 1. 1 F. nucleatum enfeksiyonun primer tanısı [27] Primer Tanı (Örnek sayısı = 39) Belirlenen Sayı (% Yüzde) Teşhis Olmayan 12 (31) Karın İçi Hastalıkları 10 (26) Hematolojik Bozukluklar 7 (18) Diğer1 3 (8) Deri ve Yumuşak Doku 2 (5) Solid Organ Malignitesi 2 (5) Genitoüriner 2 (5) 1.Bir kemik ve eklem enfeksiyonu, bir trombüs ilişkili enfeksiyonu, bir akciğer enfeksiyonunu içermektedir. F. nucleatum’un neden olduğu beyin, karaciğer, eklem ve kalp kapakçığını içeren metastatik enfeksiyonlar nadir de olsa görülmektedir [27]. Ayrıca; son zamanlarda bu bakterinin kolorektal kanser ile ilişkili olduğu belirlenmiştir. Yapılan çalışmada donmuş bir tümör örneğinden Fusobacterium izolatı elde edilmiştir ve bu izolat bilinen bir bağırsak mukoza izolatı ile yüksek seviyede dizi benzerliği göstermiştir. Böylece F. nucleatum’un invaziv olduğu doğrulanmıştır [31]. Bir diğer çalışmada; Fusobacterium dizileri karsinomlarda belirlenmiştir ve 95 karsinom/normal DNA çiftlerinin kuantitif PCR ve 16S rRNA dizi analizi ile doğrulanmıştır. Ayrıca; floresans in-situ hibridizasyon (FISH) yöntemi kullanılarak Fusobacteria kolorektal kanser tümörlerinin içerisinde görüntülenmiştir. Bu bulgular kolorektal kanserin mikrobiyotasında değişiklikler olduğunu ortaya koymaktadır ve Fusobacteria’nın bu anlamda incelenmesi gerektiğini göstermektedir [32]. 15 1.1.2.3 Antibiyotiklere Karşı Duyarlılığı ve Direnci Fusobacteria en sık kullanılan antibiyotiklerin birçoğunu duyarlıdır. Yapılan çalışmalarda; Fusobacteria’ların tüm izolatlarının metronidazol ve kalindamisine duyarlı olduğu görülmüştür. Ancak neomisin, eritromisin, amoksisilin, amfisillin, fenoksimetilpenisilin ve vankomisine duyarlılığı azalmakta ya da dirençli olabilmektedir [13], [27]. F. nucleatum’un genellikle bir penisilinaz olduğu bilinen β-laktamazı ürettiği bilinmektedir. Oral kommensal flora içerisinde F. nucleatum’un β-laktamazı üreten formları da üretmeyen formları da bulunabilmektedir. β-laktamazı üreten türlerinin oluşmasının artması ile birlikte penisiline olan direnç de artmaktadır. Bir çalışmada; F. nucleatum izolatlarının penisiline karşı %9 oranında dirençli olduğu görülmüştür. Erken çocukluk döneminde yapılan başka bir çalışmada ise; yaşamın ilk yılındaki antimikrobiyal ajan kullanımına ve yaşın ilerlemesine göre penisiline dirençli F. nucleatum taşıyıcılık oranının arttığı belirlenmiştir [27], [33]. Tetrasikline dirençli F. nucleatum türleri periodontal hastalığı olan hastalardan alınan dişeti plağı örneklerinde bulunmuştur. Bu bakteri, tetrasikline karşı ribozomların korunmasını sağlayan proteinleri kodlayan tetM genini taşımaktadır. Bu gen konjugasyon yoluyla diğer bakterilere aktarılabilmektedir ve böylece tetrasiklin kullanımının artmasıyla bu antibiyotiğe karşı olan direnç artabilmektedir. Ayrıca; bu genin bulunduğu bölgede başka antibiyotik direnç genleri bulunabildiğinden bu genin transferi ile diğer antibiyotiklere karşı da direnç gelişebilmektedir [13]. Ampisilin dirençli F. nucleatum izolatlarıyla D sınıfı β-laktamaz sentezi antimikrobiyal tedaviyi karmaşık hale getirebilmektedir. Çünkü; bu enzimlerin sentezi ile birçok βlaktam antibiyoiklerine karşı direnç oluşabilmektedir [14]. 1.1.3 Enolaz Enziminin Özellikleri Enolaz, pirüvatın sentezlenmesi reaksiyonlarında etkili olan metabolik bir enzimdir ve 2-fosfo-D-gliseratın (2-PGA) fosfoenolpirüvata (PEP) dehidrasyonunu katalizleyen bir metalloenzimdir. Fosfopirüvat hidrataz olarak da bilinen enolaz, Lohman ve Mayerhof tarafından 1934 yılında keşfedilmiştir. Bu enzimin ters reaksiyonu ise glukoneogenesis sırasında meydana gelmektedir ve PEP’in 2-PGA’ya hidrasyonunu katalize etmektedir 16 [34], [35], [36]. Enolaz enzimi glikolitik yolağın bir basamağında görev aldığından ökaryotik ve prokaryotik hücreler için oldukça önemlidir (Şekil 1.5) [36]. Şekil 1. 5 Glikoliz basamaklarının şematik gösterimi; HK: Hekzokinaz, FGİ: Fosfoglikoz izomeraz, FFK: Fosfofruktokinaz, TFİ: Trioz fosfoizomeraz, GAFDH: Gliseraldehit fosfodehidrogenaz, FGK: Fosfogliserat kinaz, FGM: Fosfogliserat mutaz, PK: Pirüvat kinaz [37] Enolaz iki değerlikli katyon metaller ile aktifleşen bir enzimdir ve magnezyum doğal kofaktör olarak görev görmektedir. Mg+2 varlığında enolaz en yüksek aktivitesini göstermektedir [34], [38]. Arkeabakterilerden memelilere kadar olan bütün canlılarda enolaz bulunmaktadır ve gen dizisi yüksek ölçüde korunmuştur [35]. Bu enzim memelilerde dimer olarak bulunurken, prokaryotlarda dimer ya da oktomer şeklinde olabilmektedir [38]. Ökaryotik ve prokaryotik hücrelerin enolazlarının fibronektin bağlayıcı aktiviteye sahip olduğu ve patogeneziste rol oynadığı düşünülmektedir [39]. Yapılan bir çalışmada; enolazın fibronektine yüksek affinite gösterdiği görülmüştür. Ayrıca; bu protein yeni bir adhezin olarak endotelyal hücrelerin istilası için bakteriyal adhezyona katkıda 17 bulunmaktadır. Bu sonuçlara göre; enolaz, konakçı hücreler ile bakteriyel etkileşimleri kolaylaştırarak patogenezde önemli bir molekül olabileceğini göstermektedir [40]. Ek olarak yapılan hayvan çalışmalarında patojenik bakterilerden kaynaklı enolazın immunojenik protein olarak rol aldığı görülmüştür [39]. Enolazın patolojik rolü hücrenin yüzeyinde eksprese olması ile bağlantılıdır ve birçok patojen bakteride plazminojen bağlayabilme özelliğine sahiptir. Fibrinolitik sistemin ilerleyen aktivasyonu, enfekte konağın bariyerlerine bakterilerin nüfuz etmesini tetiklemektir. Enolaz gibi çeşitli bakteriyel moleküllerin plazminojen reseptör olarak görev gördüğü rapor edilmiştir [41]. Enolazın α ve β izorformlarının her ikisi de plazminojen bağlayıcı proteindirler ve plazminojen ile etkileşimleri sırasında C-terminal lizin rezidüleri gerektirmektedirler. Enolaz burada plazminojen ile C-terminal lizin rezidülerinden bağlanan hücre yüzeyi proteinlerini temsil etmektedir [42]. Çoğu ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde bu proteinin hücre yüzeyinde eksprese edilmesiyle plazminojen reseptörü olarak görev alırlar ve kanser metastazı ile hücre göçünü tetiklemektedirler [35]. 1.2 Tezin Amacı Tez çalışmasının amacı; periodontal hastalıklara karşı geliştirilebilecek olan alternatif tedavi yöntemlerinde Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin hedef molekül olarak çalışılabilmesi için; bu enzimi kodlayan gen bölgesinin klonlanması, ifadesinin yapılması, aktif enzimin yüksek saflıkta üretilmesi, kinetik karakterizasyonunun yapılması ve enzimin homoloji modellemesi yapılarak potansiyel ilaç hedef bölgelerinin belirlenmesidir. 1.3 Hipotez F. nucleatum enolaz enziminin hedeflenerek glikolitik yolağın inhibe edilmesi ile bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonların baskılanabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle enzimin, yüksek oranda saf ve aktif olarak üretilmesi ile yeni ilaçların geliştirilmesi için ileride yapılabilecek olan inhibitör çalışmalarında önemli bir hedef olarak kullanılabileceği öngörülmektedir. 18 BÖLÜM 2 MATERYAL VE METOD 2.1 Materyaller 2.1.1 Kimyasallar, Enzimler ve Kitler DNA’nın replikasyonu için yapılan polimeraz zincir reaksiyonlarında (PCR) Thermo Scientific (ABD) marka Long PCR Enzim Mix ve Fermantas (Litvanya) marka Pfu DNA Polimeraz ile birlikte tamponları kullanılmıştır. Ayrıca Fermantas (Litvanya) tarafından üretilen Taq Polimeraz enzimi, tamponu ve MgCl2 çözeltisi kullanılmıştır. Genin pGEM®-T Easy Vektör sistemine klonlanması sırasında kullanılan T4 DNA Ligaz enzim ve tamponlar Promega (ABD)’dan sağlanmıştır. DNA izolasyonu Promega (ABD) tarafından üretilen Wizard Plus SV Minipreps DNA Saflaştırma sistemi ile yapılmıştır. PCR sonrası elde edilen ürünlerin saflaştırılması için kullanılan Wizard SV Gel ve PCR Clean-up sistem Promega (ABD) ve DNA QIAprep Miniprep kiti QIAGEN (Almanya)’den temin edilmiştir. Klonlama vektörü olarak kullanılan pGEM®-T Easy Vektör Sistemi Promega (ABD)’dan sağlanmıştır. Protein ekspresyonu için kullanılan pLATE 31 vektörü ve bu vektörün içerisinde bulunduğu aLICator LIC Cloning ve Expression Kit 3 (C-terminal His-tag) sistemi Thermo Scientific (ABD)’ten temin edilmiştir. Ekspresyon sonrasında elde edilen proteinlerin saflaştırılması için QIAGEN (Almanya) tarafından üretilen Nikelnitriloasetik asit (Ni-NTA) agaroz kullanılmıştır. 19 Agaroz jel elektroforezinde DNA’nın baz çifti (bç) uzunluğunu belirlemek için Fermantas (Litvanya) tarafından üretilen O’GeneRuler DNA Ladder Mix kullanılmıştır. Bu markırda bulunan DNA bantlarının baz çifti uzunlukları sırasıyla; 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100’dür. DNA’nın konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılan Lambda DNA/Hind III markır Amersham Pharmacia Biotech (ABD)’ten temin edilmiştir. Bu markırda bulunan DNA bantlarının baz çifti uzunlukları ve konsantrasyonları sırasıyla 23130 (238.4ng/0.5μg), 9416 (97.1ng/0.5μg), 6557 (67.6ng/0.5μg), 4361 (45ng/0.5μg), 2322 (23.9ng/0.5μg), 2027 (20.9ng/0.5μg), 564 (5.8ng/0.5μg), 125 (1.3ng/0.5μg)’dir. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) proteinlerin molekül ağırlığını belirlemek için ise Thermo Scientific (ABD) tarafından üretilen Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder kullanılmıştır. Bu markırda bulunan protein bantlarının molekül ağırlıkları sırasıyla; 260, 140, 100, 70, 50, 40, 35, 25, 15, 10 kDA’dur. Deneyler sırasında kullanılan diğer kimyasal maddeler BDH, Sigma, Promega, Roche tarafından temin edilmiştir. 2.1.2 Deneylerde Kullanılan Cihazlar Su Banyosu- Kerman Mikrosantrifüj- Sigma UV Visible Spektrofotometre- Thermo Scientific Dikey Elektroforez Sistem- BioRad Soğutmalı Santrifüj- Sigma Termal Döndürücü- Eppendorf Vorteks- Heidolph Çalkalamalı İnkübatör- GFL pH Metre- CyberScan Ultrasonikasyon- Bandelin Mikrodalga Fırın- Beko Etüv- Binder Yatay Elektroforez Sistem- BioRad Jel Görüntüleme Sistemi- BioRad 20 Bilgisayar- LG Çalkalayıcı – Labnet Buz Makinası- Optic Ivymen System Distile Su Cihazı- GFL -80 0C Buzdolabı- Heto +4 0C Buzdolabı- Beko -20 0C Buzdolabı- Beko Otoklav- Systec Hassas Terazi- Ohaus 2.1.3 Bakteriyolojik Büyüme Besiyerleri ve Çözeltileri LB (Luria-Bertani) Sıvı Besiyeri Maya Ekstraktı 5 g/l Tripton 10 g/l NaCl 10 g/l LB (Luria-Bertani) Agar Maya Ekstraktı 5 g/l Tripton 10 g/l NaCl 10 g/l Agar 15 g/l SOC Mediyum (25 ml) Maya Ekstraktı 0,5 g Tripton 0,125 g 1 M NaCl 0,25 ml 1 M KCl 0,0625 ml 2 M Mg+2 Çözeltisi 0,25 ml 2 M Glikoz 0,25 ml 21 2 M Mg+2 çözeltisi ve 2 M glikoz çözeltisi filtre ile sterilize edilerek hazırlanır. Maya ekstraktı, tripton, 1 M NaCl, 1 M KCl karışımına 24,1875 ml su eklenerek tamamlanır ve otoklavlanarak sterilize edilir. Otoklavlandıktan sonra oda sıcaklığına ulaştığında 2 M Mg+2 çözeltisi ve 2 M glikoz çözeltisi gerekli miktarlarda karışıma eklenerek 25 ml SOC mediyum hazırlanır. BSA (Mavi Seçim Agarı) Amfisilin (stok 100 mg/ml) 100 µl X-Gal (stok 20 mg/ml) 200 µl IPTG (stok 20 mg/ml) 160 µl Otoklavlanarak sterilize edilmiş olan 100 ml LB agara yukarıdaki kimyasal maddeler eklenerek hazırlanır. 2.1.4 Stok Çözeltiler ve Tamponlar Amfisilin (100 mg/ml) Stok amfisilin 1 ml’ye 100 mg olacak şekilde sulandırılır ve filtre ile sterilize edilir. 50X TAE (Tris-Asetat-EDTA) Tampon Çözeltisi (100 ml) Trizma Base 24,2 g Asetik Asit 5,71 ml 1 M EDTA (pH 8.0) 50 ml Elde edilen karışım dH2O ile 100 ml’ye tamamlanır. Çalışma sırasında dH2O ile 1 X TAE’ye seyreltilir. CaCl2 Çözeltisi (100 ml) 100 mM CaCl₂.2H₂O 1,4702 g 5 mM 0,10165 g MgCl₂.6H₂O 5 mM Tris HCl (pH: 7.6) 0,5 ml Stok 1 M Tris-HCl (pH: 7.6)’den 0,5 ml eklenerek son konsantrasyon 5 mM olacak şekilde ayarlanır. Elde edilen çözelti 121 0C’de otoklavlanarak sterilize edilir. 22 Mg⁺² Stok Çözeltisi (100 ml) MgCl₂.6H₂O 20,33 g MgSO₄.7H₂O 24,65 g Yukarıda verilen kimyasal maddelere distile su eklenerek 100 ml’ye tamamlanır. Filtre ile sterilize edilir ve +4 0C’deki dolaba kaldırılır. EtBr-Agaroz Jel için Örnek Uygulama Tamponu (EtBr-SAB) (10 ml) Sükroz 4g 2 M Tris-HCl 0,5 ml 0.5 M EDTA 2 ml Bromfenol mavisi 4 mg Kristal Viyole (CV) Çözeltisi Distile su ile 5 mg/ml stok çözeltisi hazırlanır ve karanlık ortamda saklanır. Kristal Viyole Jel İçin Örnek Uygulama Tamponu (CV-SAB) Gliserol 500 µl/ml 1X TAE 500 µl/ml Kristal viyole (stok 5 mg/ml) 10 µl/ml Hazırlanan tampon karanlık ortamda saklanır. X-GAL (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid) 0,02 g X-Gal, 1 ml N,N-dimetilformamid (DMF) içersinde çözülerek 20 mg/ml stok X-Gal çözeltisi hazırlanır ve filtre ile sterilize edilir. IPTG (İzopropil-β -D- tiyogaltopiranosid) 100 mM 1,5 ml stok IPTG için 35,74 mg IPTG tartılır ve distile su ile 1,5 ml’ye tamamlanır. Filtre ile sterilize edilir. 23 % 30 Akrilamid/Bis Çalışma Çözeltisi (30 ml) Akrilamid 8,7 g N, N'-Metilen-Bis-Akrilamid 0,3 g %10 Amonyum Persülfat Çözeltisi 30 mg amonyum persülfat üzerine 300 µl distile su eklenerak hazırlanmaktadır. SDS-PAGE Ayırma Jeli (%12) dH2O 3,35 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 2,5 ml %10 SDS 100 µl %30 Akrilamid/Bis 4 ml % 10 Amonyum Persülfat 75 µl TEMED 15 µl SDS-PAGE Yükleme Jeli (%4) dH2O 3,05 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 1,25 ml %10 SDS 50 µl %30 Akrilamid/Bis 0,65 ml % 10 Amonyum Persülfat 30 µl TEMED 6 µl SDS-PAGE Örnek Uygulama Tamponu (SDS-SAB) (10 ml) % 10 SDS 1g 0.5 M Tris HCl (pH: 6.8) 0.6 g % 5 Gliserol 0.5 ml 24 % 25 β-Merkaptoetanol % 0.05 Bromfenol mavisi 0.25 ml 0.005 g 5X SDS-PAGE Tank Tamponu 0,025 M Trizma Base 15 g/l 0,192 M Glisin 72 g/l % 0,1 SDS 5 g/l Distile su ile 1X’e seyreltilerek kullanılır. Protein Boyama Çözeltisi % 0,1 Coomassie Brillant Mavisi % 40 Metanol % 10 Glasiyal Asetik Asit Boya Uzaklaştırıcı Çözelti % 5 Metanol % 7 Asetik Asit Boya uzaklaştırıcı çözelti kullanıldıktan sonra aktif karbon ile muamele edilir. Çözelti, filtre kağıdı ya da peçete ile süzülerek tekrar kullanılabilir. Lizis Tamponu (1 l) (pH : 8.0) 50 mM NaH2PO4 6,00 g NaH2PO4 (MW 119,99 g/mol) 300 mM NaCl 17,54 g NaCl (MW 58,44 g/mol) 10 mM imidazol 0,68 g imidazol (MW 68,08 g/mol) Yıkama Tamponu (1 l) (pH : 8.0) 50 mM NaH2PO4 6,00 g NaH2PO4 (MW 119,99 g/mol) 300 mM NaCl 17,54 g NaCl (MW 58,44 g/mol) 20 mM imidazol 1.36 g imidazol (MW 68.08 g/mol) 25 Elüsyon Tamponu (1 l) (pH : 8.0) 50 mM NaH2PO4 6,00 g NaH2PO4 (MW 119,99 g/mol) 300 mM NaCl 17,54 g NaCl (MW 58,44 g/mol) 250 mM imidazol 17 g imidazol (MW 68.08 g/mol) Fusobacterium nucleatum Enolaz (FnENO) Enzimi Aktivite Ölçümü İçin Tampon Çözeltisi 50 mM Tris HCl (pH :6,5 ; pH :7,0 ; pH :7,5 ; pH :8,0 ; pH :8,5 ; pH :9,0 ; pH :9,5) 1,5 mM MgCl2 Fusobacterium nucleatum Enolaz (FnENO) Enzimi Aktivite Ölçümü İçin Substrat Çözeltisi 1,5 mM 2-PGA 2.1.5 Primerler Fusobacterium nucleatum’un enolaz (FnENO) enzimini kodlayan genin vektörlere klonlanması için 4 farklı primer kullanılmıştır. FnENO1: 5’-ATGACAGGTATAGTAGAAGTAATTGG-3’ GC Yüzdesi: %35 Tm: 58,5 0C FnENO2: 5’- TTTTTTWATRTTATARAAAACATC-3’ GC Yüzdesi: %10 Tm:47,3 0C FnENO LIC F: 5’-AGAAGGAGATATAACTATGACAGGTATAGTAGAAG-3’ GC Yüzdesi: %34 Tm: 60 0C FnENO LIC R: 5’-GTGGTGGTGATGGTGATGGCCTTTTTTTATATTATAAAAAACATC -3’ GC Yüzdesi: %33 Tm: 64 0C Tasarlanan primerler Iontek ve Biogen firmasından sağlanmıştır. Bu primerler polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) ve DNA dizileme sırasında kullanılmıştır. DNA dizileme işlemi hizmet alımı ile Biogen ve Iontek tarafından yapılmıştır. 26 2.1.6 Genomik DNA Fusobacterium nucleatum genomik DNA’sı; Dr. Mike Wilward ve Dr. Paul R. Cooper tarafından The School of Dentistry, University of Birmingham, Birmingham, United Kingdom’dan temin edilmiştir. 2.1.7 Klonlama ve Ekspresyon Vektörleri pGEM®-T Easy Vektör Sistemi, her iki ucunda da 3’ terminal timidin bölgeleri bulunan lineer bir vektördür. Bu sayede kendi üzerine kapanması engellenmektedir ve 3’ terminal bölgelerine uyumlu kuyruğa sahip olan genlerin ligasyon etkinliğini arttırmaktadır (Şekil 2.1). pGEM®-T Easy Vektör Sistemi, Promega (ABD)’dan sağlanmıştır [43]. Şekil 2. 1 pGEM®-T Easy Vektör Sistemi [43] pLATE 31 ekspresyon vektörünün C- terminal bölgesinde, proteinin saflaştırılması sırasında kolon ile affinitesini sağlayacak olan 6xHis-tag dizisi bulunmaktadır. Ayrıca; gen ile vektörün ligasyonunu sağlayan yapışkan uç bölgeleri ve IPTG indüklemesi ile transkripsiyonu sağlayacak olan T7 promotör bölgesi içermektedir (Şekil 2.2). PCR için gerekli primerler bu yapışkan uç bölgelerine göre tasarlanmaktadır. pLATE 31 ekspresyon vektörü Thermo Scientific (ABD)’ten temin edilmiştir [44]. 27 Şekil 2. 2 pLATE 31 ekspresyon vektörü [44]. 2.1.8 Escherichia coli Soyları DH5α: {F- endAI hsdRJ7 (r-, mit) supE44 thi-J ArecAl gyrA96 relAI deoR Δ(lacZYA-argF)U169 480dlacZAM15} BL21 (DE3): fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ∆hsdS 2.2 Metod 2.2.1 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin Klonlama Vektörüne (pGEM®-T Easy Vektör Sistemi) Klonlanması 2.2.1.1 FnENO Genine Uygun Primerlerin Tasarlanması Klonlama vektörüne enolaz enzimini kodlayan genin klonlanabilmesi için bu gen dizinin genomik DNA’dan amplifiye edilmesi gerekmektedir. Genomik DNA’nın Fusobacterium nucleatum’un hangi suşundan elde edildiği bilinmediğinden National Center for Bıotechnology Information (NCBI)’da bulunan 3 farklı suşun enolaz geninin nükleotid dizileri eşleştirilmiştir [45]. Bu diziler referans alınarak 5’ primeri ve 3’ dejenere primeri tasarlanmıştır. 28 2.2.1.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimeraz zincir reaksiyonu Long PCR enzim mix, Taq DNA polimeraz ve Pfu DNA polimeraz kullanılarak yapılmıştır (Çizelge 2.1) Çizelge 2. 1 FnENO geninin genomik DNA’dan amplifikasyonunda kullanılan PCR bileşenleri Bileşenler Taq DNA Polimeraz Long PCR enzim Mix Pfu DNA Polimeraz Tampon 5 µl 5 µl 5 µl 10 mM dNTP mix 5 µl 5 µl 5 µl 25 mM MgCl2 3 µl - - 5’primer, stok 20 pmol/ µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 3’primer stok 20 pmol/ µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl dH2O 30 µl 33 µl 33 µl Kalıp DNA 1 µl 1 µl 1 µl Enzim 1 µl 1 µl 1 µl Polimeraz zincir reaksiyon koşulları; 95 0C’de 5 dk yapılan bir ön denatürasyon sonrasında sırasıyla 94 0C’de 1,5 dk, 44 0C’de 2 dk, 72 0C’de 2 dk 45 döngü olacak şekildedir. Son olarak 72 0C’de 10 dk son uzama basamağı bulunmaktadır. 2.2.1.3 Etidyum Bromür ile Boyanan Agaroz Jel Elektroforezi Elektroforez için %1’lik agaroz içeren 1 x TAE kaynatılmıştır. Oda sıcaklığında hazırlanan jel karıştırılarak soğutulmuştur. Soğutulmuş jele 5 µl etidyum bromür eklenmiştir ve karıştırılmıştır. Jel tepsisi hazırlanmış ve taraklar yerleştirilmiştir. Hazırlanan tepsiye jel dökülmüştür ve katılaşana kadar beklenmiştir. Taraklar çıkarıldıktan sonra DNA’nın belirlenmesi için 7 µl dH2O, 2 µl EtBr için sab, 1 µl DNA karışımı hazırlanarak oluşturulan kuyucuklara koyulmuştur. 40-50 mA’de yaklaşık 1-1.5 saat elektroforez yapılmıştır. Jelde oluşan DNA bantları 254-312 nm dalga boyunda ultraviyole transilluminatöründe görüntülenmiştir [46]. 29 2.2.1.4 PCR Ürünlerinin Saflaştırılması Elde edilen PCR ürünleri Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) kullanılarak saflaştırılmıştır [47]. 2.2.1.5 FnENO Geninin Klonlanması için Adenin (A) Kuyruğunun Eklenmesi FnENO geninin pGEM®-T Easy vektör sistemine aktarılması için amplifikasyonu yapılan genin 5´ ve 3´ ucuna protokole göre adenin kuyruğu eklenmiştir. Adenin kuyruğu ekleme reaksiyonu aşağıda gösterilmiştir: 10x Taq Tamponu 1 µl MgCl2 0,8 µl dATP (10mM) 3,2 µl PCR ürünü 4 µl Taq DNA Polimeraz 1 µl (stok ; 2,5 U/µl) Hazırlanan bileşenler 70 °C’de 30 dakika bekletilmiştir. Elde edilen karışım ligasyonda istenilen miktarda direkt olarak kullanılmıştır. 2.2.1.6 Ligasyon Aşaması Adenin kuyruğu eklenmiş olan gen T4 DNA Ligaz enzimi kullanılarak pGEM®-T Easy Vektör sistemine ligasyonu yapılmıştır (Çizelge 2. 2). Çizelge 2. 2 Ligasyon Bileşenleri Bileşenler Miktar 2 x Rapid Ligasyon Tamponu 5 µl pGEM®-T Easy Vektör 1 µl PCR Ürünü 2,5 µl T4 DNA Ligaz (3 ünite/ µl) 1 µl Steril dH2O 0,5 µl Toplam 10 µl 30 Belirlenen ligasyon bileşenleri ile reaksiyon 4 0C’de 16 saatte gerçekleştirilmiştir [43]. 2.2.1.7 Kalsiyum Klorür (CaCl2) Muamelesi ile Kompetant E. coli Hücrelerinin Hazırlanması E. coli DH5α hücreleri -80 0C’deki stoktan alınarak LB Agar’lı petrilere sürme ekimi yapılmıştır. Bu petriden tek koloni seçilerek 5 ml’lik LB sıvı besiyerine ekimi yapılmıştır. 37 0C’de 180 devirde bir gece boyunca bu kültür inkübe edilmiştir. Elde edilen kültürden 500 µl alınarak 50 ml’lik LB sıvı besiyerine aktarılmıştır. 37 0C’de 180 devirde UV spektrofotometrede 600 nm’de ölçülen optik yoğunluk (OD) absorbans değeri 0.30.4 olana kadar inkübe edilmiştir. İstenen değere ulaştıktan sonra kültür 4 0C’de 5000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatant atılmıştır ve pelletler 25 ml CaCl2 çözeltisinde çözdürülmüştür. Hücreler 30 dk buzda bekletilmiştir ve tekrar 40C’de 5000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatant atılıp pelletler 1 ml CaCl2 çözeltisinde çözdürülmüştür. 2 saat buzda bekletilen hücreler ya direk olarak transformasyonda kullanılmıştır [46]. 2.2.1.8 Rekombinant Plazmid DNA’nın E. coli DH5α Hücrelerine Transformasyonu Ligasyon sonrası elde edilen örneklere 200 µl kompetant hücre eklenmiştir. Hücreler 30 dk buzda bekletilmiştir ve 42 0C’de su banyosunda 90 sn bekletilmiştir. Sonraki aşamada 2 dk buz içerisinde bekletilmiştir. Örneklerin üzerine 800 µl SOC mediyum eklendikten sonra 30 dk 37 0C’de etüvde bekletilmiştir. Hazırlanan hücrelerin amfisilin eklenmiş olan BSA’lı petrilere ekimi yapılmıştır. Bir gece boyunca 37 0C’de etüvde bekletilmiştir [46]. Bu inkübasyondan sonra BSA petrilerinden koloni seçimi yapılmıştır. BSA petrilerinin içinde bulunan X-Gal bileşeni transforme olmuş hücrelerin beyaz, transforme olmamış hücrelerin mavi renkte görülmesini sağlamaktadır. Bu hücrelerden beyaz ve açık mavi renkte olan hücreler seçilmiştir ve DNA izolasyonu yapılmıştır. 2.2.1.9 Rekombinant Plazmid DNA İzolasyonu Seçilen koloni kürdan ile alınıp amfisilin içeren 5 ml’lik besiyerinde bir gece boyunca 37°C’de inkübe edilmiştir. 1,4 ml kültür alınarak 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpüne alınır ve DNA QIAprep Miniprep kiti kullanılarak izole edilmiştir. Alınan kültür santrifüj 31 edilerek süpernatant atılmıştır. Pellet 250 µl P1 tamponu ile çözdürülmüştür. Üzerine 250 µl P2 tamponu eklenerek karıştırılmıştır. 350 µl N3 tamponu eklenerek tekrar karıştırılmıştır. Elde edilen çözelti 13000 rpm’de 10 dk santrifüjlenmiştir ve süpernatant spin kolona aktarılmıştır. 13000 rpm’de 1 dk santifüjlenmiştir. Altta kalan kısmı dökülerek 0,5 ml PB tamponu eklenmiştir ve 13000 rpm’de 1 dk santrifüj edilmiştir. 0,75 ml PE tamponu eklenmiştir ve tekrar aynı koşullarda santrifüj edilmiştir. Son olarak 50 µl EB tamponu eklenmiştir ve 13000 rpm’de 1 dk santifüj edilmiştir. Bu şekilde rekombinant plazmid DNA’lar hücreden izole edilmiştir [48]. 2.2.1.10 Klonlanan genin PCR ile Kontrol Edilmesi İzole edilen rekombinant plazmid DNA’lar Long Enzim Mix kullanırak yapılan polimeraz zincir reaksiyonu ile kontrol edilmiştir. PCR, 2.2.1.2’de belirtilen şekilde yapılmıştır. Elde edilen PCR ürünleri EtBr’lü agaroz jelde yürütülerek görüntülenmiştir. 2.2.1.11 DNA Dizi Analizi Klonlanan geni içeren plasmid DNA’ların dizi analizi Iontek (Türkiye) firmasına yaptırılmıştır. 2.2.2 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin İfade Vektörüne (pLATE 31) Klonlanması aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) sistemi; ligasyon ve restriksiyon enzim kesimi basamakları olmadan genin ekspresyon vektörüne klonlanmasını sağlar. Genin amplifikasyonunda kullanılacak olan primerler kitte önerildiği gibi pLATE 31 vektörüne uygun olacak şekilde tasarlanır. Bu primerler kullanılarak yapılan reaksiyon sonrasında PCR ürünleri saflaştırılır. Saflaştırılan PCR ürünleri kitte belirtilen konsantrasyon değerlerine uygun olacak şekilde ligasyon işleminde kullanılır. LIC sisteminde bulunan T4 DNA polimeraz, 5'→3' polimeraz aktivitesi ve 3'→5' ekzonükleaz aktivitesi ile PCR ürünlerinin pLATE 31 vektörü ile birleşmesini sağlayacak yapışkan uçlar oluşturur. Sistemindeki ligasyon protokolüne göre vektör ve genin birleşmesi sağlanır. Son olarak elde edilen rekombinant DNA’lar E. coli BL21(DE3) hücrelerine transforme edilir [44]. 32 2.2.2.1 aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) Sistemine Uygun Primerlerin Tasarlanması Primer tasarımı, pLATE 31 vektörüne spesifik olacak şekilde kit sisteminde önerildiği gibi yapılmıştır [44]. Klonlacak gene komplementer olan nükleotid dizileri önerilen primerlerin 3’ ucuna eklenerek tasarlanmıştır. Kit kitapçığında bulunan 5’ primer dizaynı: 5'- AGAAGGAGATATAACTATG– ilgili gene spesifik dizi 3' Kit kitapçığında bulunan 3’ primer dizaynı: 5'-GTGGTGGTGATGGTGATGGCC– ilgili gene spesifik dizi 3' 2.2.2.2 FnENO Geninin Klonlama Vektöründen Amplifikasyonu Kalıp DNA olarak kullanılacak olan FnENO genini içeren pGEM®-T Easy vektör sisteminin bulunduğu E. coli suşu -80 0C’deki buzdolabından alınmıştır ve bu hücrelerin amfisilin içeren LB Agar’lı petrilere sürme ekimi yapılmıştır. Bir gece boyunca bekletildikten sonra tek koloni seçimi yapılarak 5 ml olarak hazırlanmış 5 µl amfisilin içeren LB sıvı besiyerine ekimi yapılmıştır. Bu hücre kültürü, 37 0C’de 180 rpm’de gece boyunca çalkalamalı inkübatöre bırakılmıştır. Daha sonra kültürden alınan 1,4 ml örnekten 2.2.1.9’dakine benzer şekilde Wizard® Plus SV Minipreps DNA Saflaştırma sistem kullanılarak rekombinant plazmid DNA’lar elde edilmiştir [49]. FnENO geninin PCR ile amplifikasyonunda Long PCR Enzim Mix, Pfu DNA polimeraz, Taq DNA polimeraz şeklinde 3 farklı enzim kullanılmıştır (Çizelge 2. 3). Polimeraz zincir reaksiyonu 2.2.1.2’de verilen koşullarla aynı olacak şekilde uygulanmıştır. Elde edilen PCR ürünleri agaroz jel elektroforezinde yürütülürek genin amplifiye edilip edilmediği kontrol edilmiştir. 33 Çizelge 2. 3 FnENO geninin rekombinant plazmid DNA’dan amplifikasyonunda kullanılan PCR Bileşenleri Bileşenler Taq DNA Polimeraz Long PCR enzim Mix Pfu DNA Polimeraz Tampon 5 µl 5 µl 5 µl 10 mM dNTP mix 5 µl 5 µl 5 µl 25 mM MgCl2 3 µl - - 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 30 µl 33 µl 33 µl Kalıp DNA 1 µl 1 µl 1 µl Enzim 1 µl 1 µl 1 µl 5’primer, stok 20 pmol/ µl 3’primer, stok 20 pmol/ µl dH2O 2.2.2.3 PCR ürünlerinin Kristal-Viyole (CV) Jelde Yürütülmesi ve Saflaştırılması FnENO geninin Taq DNA polimeraz ile yapılan amplifikasyonlarından sonra kristalviyole (CV) jel elektroforezi yapılmış ve saflaştırılmıştır. CV jel hazırlamak için 1X TAE tamponuna %1’lik olacak şekilde agaroz eklenerek mikrodalga fırında kaynatılmıştır. Elde edilen karışıma son konsantrasyonu 2 µg/ml olacak şekilde kristal-viyole eklenerek CV jel elde edilmiştir. Jel tepsisine kuyucukları oluşturacak tarak konulduktan sonra hazırlanan jel dökülmüştür. Jel donduktan sonra tanka yerleştirilmiştir ve taraklar çıkarılmıştır. PCR örneklerinin içine 2 µl CV için sab eklenerek kuyucuklara konulmuştur. 30 mA’de yaklaşık 10 dakika elektroforezde yürütülmüştür [46]. Beyaz ışık altında görüntülenen jelde uygun bant belirlenerek neşter ile kesilmiştir. Wizard® SV Gel ve PCR Clean-up sistem protokolü uygulanarak DNA örnekleri saflaştırılmıştır [47]. 34 2.2.2.4 LIC Reaksiyonu ve Rekombinant Plazmid DNA’ların E. coli BL21 (DE3) Hücrelerine Transformasyonu Ligasyon için aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) sistemi protokolüne göre FnENO geninin nükleotid dizisi uzunluğuna göre ligasyonda kullanılacak miktar hesaplanmıştır. Çizelge 2.4’de belirtilen oranlarda reaksiyon karışımı hazırlanarak gende 5’ ve 3’ yapışkan uçlarının oluşması sağlanmıştır. Çizelge 2. 4 FnENO gende 5’ ve 3’ yapışkan uçları oluşturmak için gerekli olan reaksiyon bileşenleri Bileşenler Hacim 5 x LIC Tampon 2 µl Saflaştırılmış PCR Ürünü 0,1 pmol Su 9 µl’ye kadar kullanılabilir T4 DNA Polimeraz, 1u/µl 1 µl Toplam 10 µl Bileşenler sırasıyla eklendikten sonra 3-5 saniye santrifüj edilmiştir ve 5 dakikayı geçmeyecek şekilde oda sıcaklığında bekletilmiştir. Beklemeden sonra 0,6 µl 0,5 M EDTA ve 1 µl pLATE 31 vektör (60 ng, 0,02 pmol DNA) eklenmiştir. Tekrar 3-5 saniye santrifüj edilmiştir. Son olarak 2 saati geçmeyecek şekilde oda sıcaklığında bekletilmiştir. Elde edilen rekombinant plazmid DNA’lar E. coli BL21(DE3) hücrelerine transforme edilmiştir. Transformasyon için kompetant E. coli BL21(DE3) hücreleri 2.2.1.7’deki protokole göre hazırlanmıştır. Ancak transformasyon aşamasında iki farklı protokol uygulanmıştır. Birincisinde 12 µl rekombinant DNA örneğine 200 µl kompetant hücre eklenmiştir. İkincisinde 6 µl rekombinant DNA örneğine 50 µl kompetant hücre eklenmiştir. İkinci transformasyon protokolü aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal Histag) sisteminde belirtilen değerlere uygun olcak şekilde hesaplanarak yapılmıştır [44]. Hücre ekimi basamağından sonraki aşamalar 2.2.1.8’de verilen şekilde uygulanmıştır. Farklı olarak ikinci transformasyonda 300 µl SOC besiyeri kullanılmıştır. Son olarak elde edilen hücreler amfisilin içeren LB agar’lı petrilere ekim yapılmıştır ve 37 0C’de gece boyunca etüvde bekletilmiştir. 35 2.2.2.5 Klonlanan FnENO Geninin Koloni PCR Metodu ile Kontolü Petrilerde görülen beyaz koloniler alınıp koloni PCR yapılarak transformasyonun kontrolü yapılmıştır. Öncelikle koloniler seçilerek 5 ml’lik amfisilinli LB sıvı besiyerinde kültürleri yapılmıştır. Bu kültürlerden 100 µl alınarak 13000 rpm’de 7 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatantları atıldıktan sonra 100 µl dH2O’da çözülmüştür. 10 dk kaynar suda bu örnekler bekletilmiştir. Tekrar 13000 rpm’de 15 dk santrifüj edilmiştir ve hazırlanan örneklerden 10 µl çekilerek PCR yapılmıştır (Çizelge 2. 5). Çizelge 2. 5 Koloni PCR Bileşenleri Bileşenler Örnekler Kontrol Tampon 5 µl 5 µl 10 mM dNTP mix 5 µl 5 µl 25 mM MgCl2 3 µl 3 µl FnENO LIC F (5’primer) stok 20 pmol/ µl 2,5 µl 2,5 µl FnENO LIC R (3’primer) stok 20 pmol/ µl 2,5 µl 2,5 µl dH2O 21 µl 30 µl Kalıp DNA 10 µl 1 µl Enzim 1 µl 1 µl Koloni PCR yapılırken Bölüm 2.2.2.2’de verilen PCR koşulları kullanılmıştır. Kontrolü yapılan hücrelerin gliserol ile -80 0C’de stoku hazırlanmıştır. 2.2.2.6 DNA Dizi Analizi Pozitif kolonilerin hücre kültürüne Wizard® Plus SV Minipreps DNA Saflaştırma sistem protokolü uygulanarak rekombinant plazmid DNA’lar elde edilmiştir [49]. aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) sisteminde bulunan 5’ ve 3’ primerler kullanılarak dizi analizi Biogen (Türkiye) firması tarafından yapılmıştır. 36 2.2.3 FnENO Dizisinin Aminoasit Düzeyinde Karşılaştırmalı Analizi ve FnENO Enziminin Filogenetik Analizi F. nucleatum’un konağı olan Homo sapiens’in beyin ve kas hücrelerinin enolaz proteinin aminoasit dizileri NCBI veri tabanından bulunmuştur [45]. Bu diziler FnENO dizisi ile aminoasit düzeyinde Clustal W2 programı kullanılarak eşleştirilmiştir [50]. Laboratuvarımızda bir apikompleksan paraziti olan Theileria annulata’nın enolaz enzimi ile daha önceden yapılan karşılaştırmalı analizde katalitik rezidüler belirlenmiştir [51]. Bu tez çalışmasında da Theileria annulata enolaz enziminin aminoasit dizisi referans alınarak yapılan eşleştirme sonucunda katalitik rezidüler belirlenmiştir. Karşılaştırma sonucundan bu türlerin filogenetik ağacı MEGA 5.3 programında neighbour- joining (N-J) yöntemiyle oluşturulmuştur [52]. 2.2.4 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Ekspresyonu -80 0C’de stoktaki FnENO genini içeren pLATE 31 ekspresyon vektörünü bulunduran E.coli BL21(DE3) hücreleri ve negatif kontrol amaçlı FnENO genini içermeyen E.coli BL21(DE3) hücreleri alınarak LB agara sürme ekimi yapılmıştır. Ertesi gün bu hücrelerin 5 ml’lik LB sıvı besiyerine kültürü yapılmıştır. FnENO genini içeren hücrelerin ekiminde besiyerlerine amfisilin eklenmiştir. Her iki örnek için de 100 ml LB sıvı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan besiyerlerinden birine 100 µl amfisilin eklenmiştir ve 1 ml FnENO genini içeren E.coli BL21(DE3) hücreleri bu besiyerine ekilmiştir. Diğer besiyerine de 1 ml FnENO genini içeren E.coli BL21(DE3) hücreler ekilmiştir. Bu örnekler 37 0C’de 180 devirde inkübe edilmiştir. UV spektrofotometrede 600 nm’de optik yoğunluk (OD) ölçümü alınmıştır. OD600 değeri 0,6 olduğunda hücreler, uygun konsantrasyonda bulunduklarından IPTG indüklemesine hazır hale gelmektedirler. Bu değerde ölçüm alındıktan sonra örnekler 50 ml’lik olacak şekilde bölünmüştür. 50 ml’lik negatif kontrol E.coli BL21(DE3) hücre kültürüne ve 50 ml’lik FnENO genini içeren E.coli BL21(DE3) hücre kültürüne son konsantrasyonları 0,5 mM olacak şekilde IPTG indüklemesi yapılmıştır. İndüklenmemiş hücre kültürleri ile birlikte indüklenmiş hücre kültürleri aynı zamanda 30 0C’de 180 devirde inkübe edilmiştir. 3 saat, 5 saat ve gece boyunca bekletme sonunda kültürlerden 3 ml’lik örnekler alınmıştır. 4 0C’de 5000 37 rpm’de 20 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda örneklerden süpernatantlar atılarak kalan hücre pelletleri kullanılmıştır. Tüm hücre pelletleri 500’er µl Tris-HCl (pH 7.4) tamponu ile çözdürülmüştür. Hazırlanan pelletlerin, %20’lik güç kullanılarak 10 sn sonikasyon 20 sn bekleme olacak şekilde 6 döngülük ultrasonikasyonu yapılmıştır. Ultrasonikasyonu yapılan örnekler +40C’de 20 dk 14000 rpm’de santrifüj edilmiştir. Elde edilen örneklerin süpernatant ve pelletleri ayrı ayrı hazırlanmıştır [53] . 2.2.5 Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi SDS poliakrilamid jel elektroforezi BIO-RAD Mini-PROTEAN 3 CelI jel elektroforez sistemi kullanılarak yapılmıştır. SDS-PAGE’de kullanılan jel, ayırma ve yükleme jeli olarak hazırlanmıştır. Hazırlanan örneklere aynı miktarda SDS-PAGE örnek uygulama tamponu eklenmiştir ve 5 dakika kaynar suyun buharında bekletilmiştir. Jelde bulunan kuyucuklara bu örnekler yüklenmiştir. Elektroforez tamponu olarak 1 x TAE kullanılmıştır. Örnekler 75 voltta bromfenol mavisi jelin sonuna gelinceye kadar yürütülmüştür. Jel protein boyama çözeltisinde bir gece boyunca oda sıcaklığında boyanmıştır ve daha sonra boya uzaklaştırıcı çözelti içerisinde protein bantları net bir şekilde gözlenene kadar bekletilmiştir. Elde edilen jel örnekleri uygun koşullarda saklanmıştır [54]. 2.2.6 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Saflaştırılması Protein saflaştırma öncesinde ekspresyon için 100 ml LB sıvı besiyeri 100 µl amfisillin eklenerek hazırlanmıştır. Bu besiyerine 1 ml FnENO genini içeren E.coli BL21(DE3) hücreleri ekilmiştir. 600 nm’de OD değeri 0,6 olana kadar 37 0C’de 180 devirde inkübe edilmiştir. Son konsantrasyon 0,5 mM olacak şekilde IPTG indüklemesi yapılmıştır ve 30 0 C’de 180 devirde 5 saat inkübe edilmiştir. Elde edilen hücre kültürü 4 0C’de 5000 rpm’de 20 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatantlar atılmıştır ve hücre pelletleri 3 ml lizis tamponunda çözdürülmüştür. Hazırlanan pelletlerin, %40’lik güç kullanılarak 10 sn sonikasyon 10 sn bekleme olacak şekilde 6 döngülük ultrasonikasyonu yapılmıştır. Ultrasonikasyon yapıldıktan sonra; 14000 rpm’de 4 0C’de 30 dk santrifüj edilmiştir. Bu aşamada süpernantlar alınmıştır. 38 Elde edilen yaklaşık 4 ml hücre lizatı, 1 ml nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) agaroz ile 1 saat boyunca 4 0C’de 120 rpm’de karıştırılmıştır. Bu sırada kolon hazırlaması için, 5 ml’lik şırınga alınarak alt yüzeyine kurutma kağıdı konulmuştur ve 2 ml’ye kadar cam yünü eklenmiştir. Uç kısmına tubing geçirilerek kolon hazırlanmıştır. Hücre lizatı ve NiNTA agaroz karışımı kolona yüklenmiştir. İlk süzüntü fraksiyonu toplanmıştır. Kolon iki defa 4 ml yıkama tamponu ile yıkanmıştır ve yıkama fraksiyonları (Y 1, Y2, Y3) toplanmıştır. Son olarak 4 ml elüsyon tamponu kullanılarak elüsyon fraksiyonları toplanmıştır [55]. Toplanan örneklerin her birinden 30 µl alınarak aynı miktar SDSPAGE örnek uygulama tamponu ile 2.2.5’te verilen şekilde SDS-PAGE için hazırlanmıştır. 2.2.7 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Molekül Ağırlığı ve Molar Absorblama Katsayısının Değerlerinin Hesaplanması Protein konsantrasyon değerinin hesaplanması için saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve molar absorblama değerlerinin bulunması gerekmektedir. Bu değerler web tabanlı bir program olan “Peptide Proporties Calculator” ile hesaplanmıştır [56]. Bu programa aminosit dizisinin girilmesiyle istenen değerler elde edilmiştir. 2.2.8 Saflaştırılmış Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Konsantrasyonun Hesaplanması Enolaz enziminin konsantrasyonun hesaplanması için saflaştırılan proteinin UV spektrofotometrede 280 nm’de (A280) ölçümü alınmıştır. Konsantrasyon hesaplaması Lambert-Beer yasasına göre yapılmıştır. Protein konsantrasyonu (c), molar absorblama katsayısı (ε) ve molekül ağırlığı (MW) değerleri kullanılarak aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır: c (mol/l) = (A280)/ (ε x L) (2.1) c (mg/l) = (A280)x MW / (ε x L) (2.2) L, hücre yol uzunluğunu (cm) ifade etmektedir ve bu çalışmada kullanılan kuartz küvette hücre yol uzunluğu 1 cm’dir. Buna göre yukarıdaki eşitlikler aşağıdaki şekilde hesaplanabilmektedir [57]: 39 c (mol/l) = (A280)/ (ε) (2.3) c (mg/l) = (A280)x MW / (ε) (2.4) 2.2.9 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Optimum pH ve Spesifik Aktivite Değerlerinin Belirlenmesi Enolaz enziminin aktivite ölçümü, UNICAM UV/Vis spektrometre kullanılarak 2fosfogliserik asidin (2-PGA) fosfoenol pirüvata (PEP) dönüşümünün 240 nm’de belirlenmesiyle yapılmıştır. 240 nm dalga boyunda fosfoenol pirüvatın (PEP) artışı ölçülmüştür. Bu reaksiyonda 2-PGA substrat, MgCl2 kofaktör olarak kullanılmıştır. Reaksiyon hacmi 1 ml ve reaksiyon süresi 2 dakika olarak belirlenmiştir. Ölçüm 1,5 mM 2-PGA, 1,5 mM MgCl2 ve 50 mM Tris-HCl tampon içerisinde 25 0 C’de gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon 1 ml kuartz küvete tampon, MgCl2 ve substrat ilavesinden sonra enzim eklenerek başlatılmıştır [58]. Optimum pH deneyinde bu reaksiyon farklı pH’taki Tris-HCl (pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9.0, pH 9.5) tamponlarında aynı bileşenler kullanılarak gerçekleştirilmiştir [39], [59]. F. nucleatum enolaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği pH değeri belirlendikten sonra bu pH’da belirlenen absorbans değeri ele alınarak spesifik aktivite değeri hesaplanmıştır. Reaksiyonda oluşan fosfoenolpirüvat ile absorbans artışı tayin edildiğinden dolayı bu hesaplamada PEP’in molar absorblama katsayısı (εPEP) kullanılmıştır. Toplam reaksiyon hacminin (VT) ve kullanılan enzim hacminin (VE) hesaba katıldığı enzim aktivitesi Ünite/ml (U/ml) olarak aşağıdaki (2.5) denklemine göre hesaplanmıştır [58]: U/ml = (ΔA240/dk) x VT / (εPEP x VE) (2.5) Belirlenen bu değer enzim konsantrasyonuna bölünerek 1 mg protein başına düşen enzim ünitesi hesaplanmıştır. Böylece spesifik enzim aktivitesi belirlenmiştir. 40 2.2.10 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimin Termostabilitesinin Belirlenmesi Enolaz enzimin termostabilitesinin belirlenmesi deneyi, sabit pH’daki Tris-HCl 2.2.9’da belirtilen reaksiyon bileşenleri ile 240 nm’de ölçüm alınarak yapılmıştır. Bu deneyde enzim sırasıyla 60 0C, 40 0C, 30 0C’de su banyosunda 15 dakika bekletilmiştir. Her 3 dakikada bir ölçüm alınarak termostabilitesi belirlenmiştir [39],[58],[59]. 2.2.11 Saflaştırılmış Enzimin Kinetik Analizi Michaelis-Menten kinetiği; enzim katalizleme reaksiyonunun başlangıç konsantrasyonuna bağlı olduğunu açıklamaktadır [60]. Şekil 2.3’te substratın (S) bir enzimin (E) katalizlemesi sonucu ürüne (Ü) dönüştüğü reaksiyon gösterilmiştir. [ES] enzim-substrat kompleksini tanımlamakta ve k1, k-1 ve k2 reaksiyon sabitleridir [61]. Şekil 2. 3 Enzim katalizlemesi ile substratın ürüne dönüşüm reaksiyonu [60]. Enzim-substrat kompleksinin ayrışma (k2) reaksiyonunun; birleşme (k1) ve tekrarayrışma (k-1) reaksiyonlarından daha yavaş olduğu düşünülmektedir ve ters reaksiyon (Ü→S) ihmal edilebilir düzeydedir [61]. Bu işlemler göze alınarak yapılan hesaplamalar sonucunda reaksiyon hızını belirlemek için aşağıdaki Michaelis-Menten denklemi elde edilmektedir [62]: (2.5) Bu eşitlikte verilen Km (mol.l−1) değeri; sabit bir pH, sıcaklık ve redoks durumunda, belirli bir enzim için sabittir ve bu parametre, bu enzimin substrata bağlanma gücünün bir göstergesidir. Vmax ise bir enzimin elde edebileceği maksimum hızdır. Bu ölçüm teoriktir. Çünkü Vmax değeri substratlara tamamen bağlanmış bütün enzim moleküllerini gerektirmektedir ve hiçbir zaman bu değere ulaşamaz. Ayrıca; enzime bağlanan substrat değeri Km değerine ulaştığında reaksiyon hızı Vmax’ın yarısı olmaktadır. (Şekil 2.4). 41 Şekil 2. 4 Reaksiyon hızı ve substrat konsantrasyonuna bağlı Michaelis-Menten denkleminin grafiği [62]. kcat (s-1) değeri ise; birim enzimin birim zamanda substrat ile doyurulması sonucunda oluşan ürünün maksimum katalitik üretiminin bir ölçüsüdür. Bu değer aşağıdaki denklemde gösterildiği gibi; Vmax’ın ortamda bulunan toplam enzim konsantrasyonuna bölünmesi ile bulunmaktadır [61]. Ayrıca; kcat/Km (s–1 (mol.l–1)−1) oranı katalitik verim olarak tanımlanmaktadır ve substrat spesifitesinin bir ölçüsü olarak alınabilmektedir [61]. (2.6) Michaelis-Menten denklemindeki kinetik sabitlerin (Km ve Vmax) daha basit bir şekilde belirlenmesi için 1934 yılında Lineweaver-Burk, Michaelis-Menten denkleminin karşıt formunu tanımlamıştır. Bu denklem aşağıda gösterildiği gibidir [62]: (2.7) Bu denklemin karşıt formu Şekil 2.5’te verilen grafikte görüldüğü gibi düz bir çizgi oluşturmaktadır ve bu çizginin Y eksenindeki kesişim noktası 1/Vmax, X eksenindeki kesişim noktası ise -1/Km değerini göstermektedir. Ayrıca bu grafikten elde edilen eğim Km/Vmax değerini vermektedir. Michaelis-Menten denklemi analizindeki bu gelişme, enzim sistemlerinin katalitik aktivitesi değiştiğinde bileşiklerin etkisini basit bir şekilde analiz etmeyi sağlamaktadır [62]. 42 Şekil 2. 5 Lineweaver-Burk denkleminin grafiği [62]. Yapılan bu çalışmada 240 nm dalga boyunda reaksiyon sonucunda oluşan fosfoenol pirüvatın (PEP) artışı ölçülmüştür. Reaksiyon hacmi 1 ml ve reaksiyon süresi 2 dakika olarak belirlenmiştir. Ölçüm 1,5 mM MgCl2 ve 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) (deney sonucunda belirlenen optimum pH) tampon içerisinde 25 0C’de gerçekleştirilmiştir [58]. Saflaştırılan enzimin bu koşullarda farklı substrat konsantrasyonlarındaki reaksiyon sonuçlarına göre kinetik özellikleri belirlenmiştir. Ölçümler birkaç kez tekrarlanarak alınmıştır. Elde edilen reaksiyon değerleri ile GraFit 3.0 programı [63] kullanılarak enzimin kararlı hal kinetik grafiği elde edilmiştir ve Km, Vmax değerleri hesaplanmıştır. Vmax, enzim konsantrasyonu (Me), PEP’in molar absorblama katsayısı (εPEP) kullanılarak aşağıdaki eşitliklerde verildiği gibi kcat hesaplaması yapılmış ve daha sonra Km değeri hesaba katılarak katalitik verim bulunmuştur [53]. B = (Vmax/εPEP)/60 (2.8) kcat = B / Me (2.9) 2.2.12 F. nucleatum Enolaz Enziminin Homoloji Modellemesi ve Süperimpozisyonlarının Yapılması Klonlanan F. nucleatum enolaz proteninin aminoasit dizisi kullanılarak homoloji modellemesi yapılmıştır. Homoloji modelleme; kalıp belirleme, eşleştirme, model oluşturma ve validasyon aşamaları takip edilerek yapılmıştır [64]. Öncelikle FnENO aminoasit dizisi web tabanlı BLAST programına girilmiştir ve Protein Data Bank (PDB)’ 43 taki diğer proteinlerle eşleştirilerek kalıp protein belirlenmiştir [65], [66]. Web tabanlı Clustal Omega programı kullanılarak kalıp proteinin aminoasit dizisi ile FnENO proteininin aminoasit dizisinin eşleştirmesi yapılmıştır ve identity yüzdesi belirlenmiştir [67]. Protein modellemesi MODELLER v9.12 programı kullanılarak yapılmıştır [68]. Bu yazılıma FnENO aminoasit dizisi ile kalıp protein 3 boyutlu yapısı girilmiş ve dizi eşleştirmeleri program tarafından yapılarak 50 farklı model oluşturulmuştur. Discrete Optimized Protein Energy (DOPE) skoru en düşük olan belirlenerek validasyon aşamalarına geçilmiştir. Protein modelinin geometrisi, HyperChem versiyon 8.07 programında AMBER99 forcefiled (FF) kullanılarak 250 döngüde optimize edilmiştir [69]. Enerji optimizasyonu yapılan protein yapısının validasyonu yapılmıştır. Validasyon aşamasında 3 farklı web tabanlı sunucu kullanılmıştır. ERRAT Versiyon 2.0 serverı ile proteinin 3 boyutlu yapısında bulunan atomlar arasındaki hatalar istatiksel olarak belirlenmiştir [70]. ProSA programı ile proteinin, X-ray kristalografisinde ve NMR’da çözülmüş diğer proteinler ile eşleştirilmesi yapılmış ve enerji skoru ile konformasyonu değerlendirilmiştir [71]. Son olarak validasyon için RAMPAGE programı kullanılmış ve Ramachandran diyagramı gösterilmiştir [72]. Proteinin ikincil yapısının analizi SOPMA programı kullanılarak yapılmıştır [73]. Muhtemel ilaç bölgelerinin belirlenmesi ise; Q-SiteFinder ve DoGSiteScorer programları ile yapılmıştır [74], [75]. Son olarak; Homo sapiens akciğer, beyin ve kas hücrelerinin enolaz dizileri NCBI veri tabanından bulunmuştur [45]. Daha sonra bu diziler ve kalıp protein ile FnENO aminoasit dizisinin süperimpozisyonu MolSoft-ICM Browser 3.7-2d (MolSoft LLC, San Diago, CA, ABD) program kullanılarak yapılmıştır. Root-mean-square deviation (RMSD) değerleri web tabanlı program olan SuperPose versiyon 1.0 kullanılarak belirlenmiştir [76]. 44 BÖLÜM 3 SONUÇLAR VE TARTIŞMA 3.1 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin pGEM®-T Easy Vektör Sistemine Klonlanması 3.1.1 Amplifikasyon Primerlerinin Tasarlanması F. nucleatum genomik DNA’sının hangi soydan temin edildiği ilk aşamada bilinmediğinden uygun primerlerin tasarlanması için NCBI’dan [45] dizileri belirlenen F. nucleatum’un üç alt türünün enolaz dizileri eşleştirilmiştir. Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 25586, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 ve Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum F0401 türlerinin enolaz dizileri alınarak Şekil 3.1 ve Şekil 3.2’de verilen eşleştirme yapılmıştır. Şekil 3. 1 F. nucleatum üç alt türünün enolaz enzimini kodlayan gen dizilerinin eşleştirmesi sonucundaki 5’ ucu nükleotid dizisi Şekil 3. 2 F. nucleatum üç alt türünün enolaz enzimini kodlayan gen dizilerinin eşleştirmesi sonucundaki 3’ ucu nükleotid dizisi 45 Eşleştirme sonucuna göre 5’ ucunda bütün nükleotidlerin aynı olduğu görülmüştür ve aynı diziler baz alınarak 5’ primeri tasarlanmıştır. 3’ ucuna bakıldığında ise üç nükleotidin farklı olduğu görülmüştür. 3’ primeri dejenere primer olarak aşağıdaki şekilde tasarlanmıştır(W: T ya da A, R: C ya da T). 3’ primeri: 5’ TTTTTTWATRTTATARAAAACATC 3’ 5' primeri: 5'ATGACAGGTATAGTAGAAGTAATTGG 3' 3.1.2 FnENO Geninin Amplifikasyonu ve E.coli DH5α Hücrelerine Transformasyonu Tasarlanan primerler ile üç farklı polimeraz enzimi kullanılarak genomik DNA amplifiye edilmiştir. Bu deneyde 3’→ 5’ ekzonükleaz aktivitesi olduğu bilinen Pfu DNA polimeraz ve termostabil bir enzim olan ancak 3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi olmayan Taq DNA polimeraz kullanılmıştır. Ayrıca 5’→3’ polimeraz ve 3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi bulanan başka bir termostabil bir enzimin karışımı olan Long PCR Enzim Mix (Thermo Scientific, #K0181, ABD) kullanılmıştır. Belirlenen PCR koşullarında yapılan amplifikasyon sonucunda Şekil 3.3’teki agaroz jel elektroforezi görüntüsüne göre Taq DNA polimeraz ve Long PCR Enzim Mix’in FnENO geninin doğru büyüklükte amplifiye ettiği görülmüştür. Long PCR Enzim Mix’in 3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi bulunduğundan ve Taq DNA polimeraza göre çok daha yüksek verimde reaksiyonu gerçekleştirdiğinden bu enzim ile çalışılmasına karar verilmiştir. Şekil 3. 3 PCR ile amplifiye edilen FnENO geninin agaroz jel elektroforez görüntüsü. Hat 1: Taq DNA polimeraz kullanılarak yapılan PCR ürünü, Hat 2: Pfu DNA Polimeraz kullanılarak yapılan PCR ürünü, Hat 3: Long PCR Enzim Mix kullanılarak yapılan PCR ürünü, Hat M: GeneRuler DNA Markır 46 FnENO geninin pGEM®-T Easy Vektör sistemine klonlamasının yapılması için tekrar Long PCR Enzim Mix ile aynı koşullarda PCR yapılmıştır. Saflaştırma sonrası yapılan agaroz jel elektroforezinde görüldüğü gibi FnENO geni doğru büyüklükte amplifiye edilmiştir (Şekil 3.4). Şekil 3. 4 Long PCR Enzim Mix ile oluşan PCR ürününün agaroz jel elektroforezi görüntüsü. Hat M1: GeneRuler DNA Markır, Hat 1 ve 2: PCR ürünü, Hat M2: Lambda Markır Saflaştırılan PCR ürünü pGEM®-T Easy Vektörüne aktarılmış ve devamında transformasyon basamakları uygulanarak elde edilen rekombinant DNA E.coli DH5α hücrelerine aktarılmıştır. Transformasyon sonrasında amfisilin içeren LB-BSA petrilerinde negatif olan mavi ve muhtemel pozitif olan beyaz koloniler görülmüştür (Şekil 3.5). Beyaz kolonilerden 3 tanesi seçilerek 5 ml’lik amfisilinli sıvı besiyerine alınmış ve bir gece inkübe edilmiştir. Şekil 3. 5 pGEM®-T Easy Vektör Sistemi ile yapılan klonlama sonrası transformasyonda LB-BSA petrilerinde görülen koloniler 47 3.1.3 Klonlanan Genin Kontrolü ve Dizi Analizi İnkübe edilen plazmid DNA izolasyonu yapılmıştır. Elde edilen rekombinant plazmid DNA’ların Long PCR Enzim Mix kullanılarak 5’ ve 3’ primerleri kullanılarak PCR ile amplifikasyon yapılmıştır. Beyaz kolonilerden rastgele seçilen üç koloninin de pozitif olduğu agaroz jel elektroforezinde görülmüştür (Şekil 3.6). Şekil 3. 6 Klonlanan genin PCR ile yapılan kontrolünün jel görüntüsü. Hat M1: Lambda Markır, Hat M2: GeneRuler DNA Markır, Hat 1-3: Seçilen kolonilerden elde edilen plazmid DNA’lar ile yapılan PCR sonucu Bu kolonilerden elde edilen rekombinant plazmid DNA’lar dizi analizinin yapılması için Iontek firmasına gönderilmiştir. Dizilemesi yapılan gen, NCBI’da [45] kayıtlı olan üç FnENO gen dizisi ile Clustal W2 [50] programı kullanılarak eşleştirmesi yapılmıştır. Yapılan eşleştirme sonucunda genomik DNA’nın yüksek oranda Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 suşundan elde edildiği tespit edilmiştir (Şekil 3.7). 48 Şekil 3. 7 Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 enolaz geni (1. sıra) ile bu çalışmada klonlanan genin (2. sıra) dizi analizi 49 Dizi analizi sonucuna bakıldığında 3’ ucunda iki farklı nükleotidin bulunduğu görülmektedir. Bu iki gen dizisinin aminoasit dizisi oluşturularak eşleştirme yapılmıştır. 3’ ucundaki nükleotid farklılıklarının aminoasit dizisinde bir değişiklik oluşturmadığı görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlardan sonra; pGEM®-T Easy Vektör sistemine aktarılan FnENO genini içeren E. coli DH5α hücre kültürlerinin -80 0C’de saklamak üzere stok kültürleri hazırlanmıştır. 3.2 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzimini Kodlayan Genin pLATE 31 Ekspresyon Vektörüne Klonlanması 3.2.1 FnENO Geninin Amplifikasyonu ve E. coli BL21(DE3) Hücrelerine Transformasyonu -80 0C’de stoku bulunan FnENO genini içeren E. coli DH5α hücre kültüründen öze ile örnek alınarak amfisilin içeren LB agarlı besiyerine sürme ekim yapılmış ve 37 0C’de bir gece inkübe edilmiştir. Petriden tek koloni seçilerek 5 ml amfisilinli LB sıvı besiyerine ekimi yapılmış ve tekrar 37 0C’de bir gece inkübe edilmiştir. Bu kültürden rekombinant plazmid DNA’lar elde edilmiştir. aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) sistemi [44] protokolüne göre hazırlanan primerler ile daha önceki amplifikasyonlarda da kullanılan üç farklı DNA polimeraz kullanılarak PCR yapılmıştır. Agaroz jelde FnENO genini sadece Taq DNA Polimerazın doğru büyüklükte amplifiye ettiği görülmüştür. Ancak amplifiye edilen genin dışında reaksiyona katılmayan primerler de bant oluşturmuştur (Şekil 3.8). Yapılan deneyler sonucunda aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal Histag) sistemi protokolüne göre hazırlanan primerler ile yapılacak olan amplifikasyonlarda Taq DNA polimerazın kullanılmasına karar verilmiştir. FnENO geni ligasyon ve transformasyon aşamaları için tekrar Taq DNA polimeraz kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiştir. 50 (A) (B) Şekil 3. 8 FnENO geninin amplifikasyon sonucu. (A) Hat M1: GeneRuler DNA Markır, Hat 1: Taq DNA polimeraz kullanılarak yapılan PCR ürünü, Hat M2: Lambda Markır, Hat 2: Long PCR Enzim Mix kullanılarak yapılan PCR ürünü. (B) Hat M1: GeneRuler DNA Markır, Hat 1: Pfu DNA polimeraz enzimi kullanılarak yapılan PCR ürünü, Hat 2: Taq DNA polimeraz kullanılarak yapılan PCR ürünü. Ortamda bulunan primerleri uzaklaştırmak için PCR ürünleri kristal viyole agaroz jelde yürütülmüştür. PCR amplifikasyon ürünü jelden kesilerek alınmış ve saflaştırılmıştır. Saflaştırma sonrası doğru genin elde edildiğini göstermek için DNA örnekleri agaroz jelde yürütülmüştür (Şekil 3.9). Şekil 3. 9 FnENO geninin saflaştırma sonrası agaroz jel elektroforez görüntüsü. Hat M1: GeneRuler DNA Markır, Hat 1: Saflaştırılmış FnENO geni. 51 1302 baz çift büyüklüğündeki genin vektör DNA’ya ligasyonu için aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) sistemi protokolüne göre yaklaşık 90 ng örnek gerekmektedir [44]. Şekil 3. 9’da görülen DNA bandının konsantrasyonu Lambda DNA/Hind III markır ile kıyaslanarak 1 µl’de yaklaşık 30 ng olarak belirlenmiştir. Reaksiyon sistem protokolüne göre yapılmış ve FnENO geninin pLATE 31 vektörü ile ligasyonu gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3.1). Ligasyon, kit içerisinde bulunan T4 DNA polimerazın 3’→5’ ekzonükleaz ve 5’→3’ polimeraz aktiviteleri sayesinde gerçekleştirilmektedir. pLATE 31 vektörü içerisinde T7 promotörü bulunmaktadır. Bu nedenle vektör ile oluşturulan rekombinant plazmid DNA’lar, IPTG ile indüklenebilen lacUV5 promotörünün kontrolü altında T7 RNA polimeraz genini içeren BL21(DE3) gibi bir E. coli suşuna transforme edilebilmektedir [44]. Çizelge 3. 1 Ligasyon reaksiyonunun bileşenleri Bileşenler Hacim 5 x LIC Tampon 2 µl Saflaştırılmış PCR Ürünü 3 µl (90 ng) Su 4 µl T4 DNA Polimeraz, 1u/µl 1 µl Toplam 10 µl Ligasyon aşamasından sonra transformasyon 2.2.2.4’te belirtilen şekilde yapılmıştır. Transformasyon sonrası elde edilen hücrelerin amfisilin içeren LB agarlı petrilere sürme ekimi yapılarak bir gece 37 0C’de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası koloniler elde edilmiştir. 3.2.2 Gen Aktarımının Kontrolü ve Dizi Analizi Aktarılan genin kontrolü koloni PCR ile yapılmıştır. Petrilerden 9 koloni seçilerek plazmid DNA elde edilmiş ve Taq DNA polimeraz ile koloni PCR koşullarında amplifiye edilmiştir. 9 koloniden 5’i pozitif sonuç vermiştir (Şekil 3.10). 52 Şekil 3. 10 Koloni PCR sonrasında elde edilen agaroz jel elektroforez görüntüsü. Hat M1: GeneRuler DNA Markır; Hat 1,3,7 ve 9: Negatif PCR sonucu, Hat 2,4,5,6 ve 8: Pozitif PCR sonucu Pozitif çıkan sonuçlardan dördüncü koloni seçilerek 5 ml’lik sıvı besiyerindeki kültürden -80 0C’de saklanmak üzere stok kültür hazırlanmıştır. Ayrıca; bu kültürden plazmid DNA’lar izole edilmiştir. Bu plazmid DNA’lar, aLICator LIC Klonlama ve Ekspresyon Kit 3 (C-terminal His-tag) sistemi içerisinde hazır olarak bulunan pLATE 31 ekspresyon vektörüne uygun primerler [44] ile çift yönlü dizileme için Biogen firmasına gönderilmiştir. Dizileme sonucunda, önceden pGEM®-T Easy Vektörüne klonlanmış olan gen dizisi referans alınarak eşleştirme yapılıp FnENO geninin tam ve doğru olarak dizilendiği görülmüştür. Alt-klonlama sonrası dizileme işlemi, gen amplifikasyonunun 3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi olmayan enzim kullanılarak yapıldığı için gerçekleştirilmiştir. Ek olarak; saflaştırma için gerekli olan 6xHis-tag dizisinin, genin 3’ ucuna başarılı olarak eklendiği belirlenmiştir (Şekil 3.11). 53 Şekil 3. 11 Alt-klonlama ile FnENO gen dizisine eklenen 6xHis-tag bölgesinin gösterimi. (A) FnENO gen dizisi (1. sıra) ve önceden klonlanan FnENO gen dizisinin (2. sıra) eşleştirmesi sonucunda belirlenen 6xHis-tag bölgesi (B) 6xHis-tag bölgesinin kromatogram görüntüsü. 3.2.3 FnENO Dizisinin Aminoasit Düzeyinde Karşılaştırmalı Analizi ve FnENO Enziminin Filogenetik Analizi Bu çalışmada klonlanan ve karakterizasyonu yapılan FnENO dizisinin aminoasit düzeyinde karşılaştırmalı analizi web tabanlı bir yazılım olan Clustal W2 [50] programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla konak olan H. sapiens enolaz2 (HuENO2) (insan nöron spesifik gamma-2 enolaz, erişim no: M22349.1), H. sapiens enolaz3 (HuENO3) (insan kas spesifik beta enolaz izoform 1, erişim no: X55976.1) ile yapılan analiz sonucunda, enolaza ait katalitik rezidüler FnENO'da da belirlenmiştir. Şekil 3. 12'de analiz sonucu belirlenen katalitik rezidüler kırmızı kutu ile gösterilmiştir. FnENO proteininin homoloji modellemesi yapılarak muhtemel ilaç hedef bölgelerinin belirlenmesi bölüm 3.2.9'da sunulmuştur. 54 Şekil 3. 12 Enolazın çoklu dizi eşleştirmesi. Bu eşleştirme sonucunda kırmızı kutucuklar katalitik rezidüleri belirtmektedir. H. sapiens enolaz2 (nöron spesifik gamma-2 enolaz) aminoasit dizisi (1. sıra), H. sapiens enolaz3 (kas spesifik beta enolaz izoform 1) aminoasit dizisi (2. sıra), Theileria annulata enolaz aminoasit dizisi (3. sıra) Fusobacterium nucleatum enolaz aminoasit dizisi (4. sıra) bu eşleştirmede kullanılmıştır. Bu çalışmada klonlanan FnENO’nun filogenetik analizi konağı H. sapiens enolaz formları ve referans dizi olarak daha önce klonlanmış Theileria annulata enolazı ile mRNA düzeyinde benzerlik araştırması yapılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen filograma göre, H. sapiens enolazları aynı grupta yer almakta iken T.annulata ve F. nucleatum enolazları ayrı gruplar olarak yer almıştır (Şekil 3. 13). Referans dizi olarak kullanılan ve bir apikompleksan paraziti olan T. annulata enolazı BLAST analizine de uygunluk göstererek insan enolazına daha yakın gruptadır ve bu diziyi ayrı bir grup olarak F. nucleatum enolazı takip etmektedir. Şekil 3. 13 FnENO’nun filogenetik ağacı 55 3.2.4 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Ekspresyonu F. nucleatum enolaz enziminin ekspresyonu için indükleyici olarak IPTG kullanılmıştır. IPTG; lac operonu tarafından kontrol edilen genlerin protein ekspresyonunda tetikleyici olarak görev yapmaktadır. lac operonunun represör molekülüne bağlanarak gen bölgesinin açılmasına ve o bölgeye enzimin bağlanmasına yardımcı olmaktadır. Böylece β- galaktosidaz gibi lac operonu ile kontrol edilen genlerin transkripsiyonunu, dolayısıyla da ekspresyonunu tetiklemektedir [77]. Yapılan ekspresyon deneyinde 50 ml LB sıvı besiyerindeki hücre kültürlerine 0,5 mM IPTG eklenerek indükleme işlemi yapılmıştır. FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücreleri hem indükleme yapılarak hem de yapılmadan inkübe edilmiştir. Ayrıca; negatif kontrol için de FnENO genini içermeyen E. coli BL21(DE3) hücreleri indükleme yapılarak ve yapılmadan inkübe edilmiştir. Hücrelerin inkübe edilme süreleri 3 saat, 5 saat ve bir gece boyu olarak ayarlanmıştır. F. nucleatum enolaz enziminin molekül ağırlığı ve molar absorblama katsayısı (extinction coefficient) Peptide Properties Calculator programı [56] ile belirlenmiştir. FnENO’nun 433 aminoasitlik protein dizisi programa girilmiş ve bu değerler hesaplanmıştır. Yapılan hesaplamalara göre; FnENO proteininin molekül ağırlğı 46370 g/mol (46,37 kDa) ve molar absorblama katsayısı 34070 cm-1 M-1 bulunmuştur. F. nucleatum enolaz enziminin molekül ağırlığı ve molar absorblama katsayısı, protein konsantrasyonunun hesaplanmasında ve SDS-PAGE analizlerinde proteinin büyüklüğünü belirleyebilmek için kullanılmıştır. Ekspresyon sonrası elde edilen hücre lizatları SDS poliakrilamid jel elektroforezinde yürütülmüştür. FnENO proteini Şekil 3.14 ve Şekil 3.15’te görüldüğü gibi indüklenen örneklerin süpernatantta çözünür halde beklenen büyüklükte üretildiği görülmektedir (Hat 7). 56 Şekil 3. 14 Hücrelerin 5 saat inkübe edilmesinin ardından elde edilen ekspresyon sonucu. Hat M: Protein markır, Hat 1: İndüklenmeyen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı, Hat 2: İndüklenmeyen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti; Hat 3: İndüklenen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı Hat 4: İndüklenen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti, Hat 5: İndüklenmeyen FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı, Hat 6: İndüklenmeyen FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti; Hat 7: İndüklenen FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı, Hat 8: İndüklenen FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti. Şekil 3. 15 Hücrelerin bir gece boyunca inkübe edilmesinin ardından elde edilen ekspresyon sonucu. Hat M: Protein markır; Hat 1: İndüklenmeyen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı, Hat 2: İndüklenmeyen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti, Hat 3: İndüklenen E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı, Hat 4: İndüklenen E.coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti, Hat 5: İndüklenmeyen FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı Hat 6: İndüklenmeyen FnENO genini içeren E. coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti, Hat 7: İndüklenen FnENO genini içeren E.coli BL21(DE3) hücrelerinin süpernatantı Hat 8: İndüklenen FnENO genini içeren E.coli BL21(DE3) hücrelerinin pelleti. 57 Laboratuarımızda yapılan önceki ekspresyon çalışmalarda 5 saatlik inkübasyon ile elde edilen örneklerin enzim aktivitesi sonuçlarının gece boyunca inkübe edilen örneklere göre daha iyi olduğu görülmüştür. Bu nedenle, bir sonraki saflaştırma aşamasına 5 saatlik inkübasyon ile elde edilen örneklerle devam edilmiştir. 3.2.5 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Saflaştırılması Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin saflaştırılması için C- terminal bölgesine polihistidin bölgesi eklenmiştir. Elde edilen bu rekombinant proteinin saflaştırılması afinite kromotografisi ile yapılmıştır. Affinite kromatografisinde kolon dolgu malzemesi olarak polihistidin bölgesi ile etkileşimi bilinen nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) agaroz kullanılmıştır. Bu kolonda nikel iyonundaki altı bağlanma bölgesinin dördü NTA ile kaplanmakta, kalan iki bağlanma bölgesi de 6xHis-tag bölgesi ile etkileşime girmektedir. NTA, özellikle güçlü yıkama koşulları altında bile diğer şelat reçinelere göre çok daha stabil bir şekilde metal iyonlarını bağlamaktadır ve çok çeşitli koşullarda metal iyonlarını korumaktadır [55]. Saflaştırma yapılırken ilk önce 10 mM imidazol içeren lizis tamponu ile hücrelerin sonikasyonu yapılmaktadır. Sonikasyon sonrasından Ni-NTA agaroz ile muamale edilmektedir. Bu muamele sırasında imidazol ve protein Ni-NTA ile etkileşime girebilmek için bir yarışa girmektedir. Bu aşamada protein konsantrasyonu daha fazla olduğundan protein Ni-NTA ile daha fazla etkileşime girmektedir. 20 mM imidazol içeren yıkama tamponu ile kolon yıkanarak ortamdaki diğer proteinler uzaklaştırılmaktadır. Son olarak 250 mM imidazol içeren elüsyon tamponu kullanılarak Ni-NTA ile imidazol etkileşimi arttırılmaktadır. Böylece kolonda bulunan protein serbest kalarak elüsyonlarda saf olarak toplanması sağlanmaktadır [55]. FnENO proteini süpernatantta çözünür halde bulunduğundan doğal koşullarda uygulanan saflaştırma yapılmıştır. Şekil 3.16’da verilen SDS-PAGE görüntüsündeki elüsyon örneklerinde görüldüğü gibi FnENO proteini yüksek saflıkta elde edilmiştir. Protein yüksek saflıkta elde edilmesine rağmen düşük konsantrasyonlarda üretilmiştir. Bu durum kolonun iyi paketlenememesinden ya da çok fazla yıkama yapılmasından dolayı proteinin kaybedilmesinden kaynaklanabilmektedir. Ancak elde edilen değerler 58 optimum pH deneyini yapabilmek için yeterli olduğundan tekrar saflaştırmaya gidilmeden bu deneyler yapılmıştır. (A) (B) Şekil 3. 16 Saflaştırma sonrası gerçekleştirilen SDS-PAGE görüntüleri. (A) Hat M: Protein markır; Hat 1: Elüsyon 1, Hat 2: Elüsyon 2, Hat 3: Elüsyon 3, Hat 4: Elüsyon 4, Hat 5: Elüsyon 5, Hat 6: Elüsyon 6, Hat 7: Elüsyon 7, Hat 8: Elüsyon 8, (B) Hat M: Protein markır, Hat 1: İlk süzüntü, Hat 2: Yıkama 1, Hat 3: Yıkama 2, Hat 4: Yıkama 3, Hat 5: Yıkama 4. 3.2.6 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enziminin Optimum pH ve Spesifik Aktivite Değerinin Belirlenmesi FnENO proteinin en yüksek aktivite gösterdiği optimum pH’ın belirlenebilmesi için standart reaksiyon 7 farklı pH’ta hazırlanan tamponlar içerisinde gerçekleştirilmiştir [39], [59]. Reaksiyonda farklı pH’larda tampon (50 mM Tris-HCl + 1,5 mM MgCl), 2-PGA 59 (1,5 mM), dH2O ve saflaştırılmış enzim kullanılmıştır [58]. UV spektrofotometrede 240 nm’de bu reaksiyon 2 dakikalık bir sürede en az iki kez ölçüm alınarak gerçekleştirilmiştir. Belirlenen bu deney iki farklı elüsyon örneği ile yapılmış ve elde edilen absorbans değerlerinin ortalaması alınarak optimum pH bulunmuştur. İlk optimum pH deneyinde 280 nm’deki absorbans değeri 0,012 olarak ölçülen elüsyon 8 örneği kullanılmış ve 1 ml’de 8,2 µg enolaz enzimi olacak şekilde farklı pH değerlerinde reaksiyon gerçekleştirilmiştir. İkincisinde ise; 280 nm’deki absorbansı 0,011 olarak ölçülen elüsyon 6 örneği kullanılmış ve 1 ml reaksiyonda 7,5 µg enolaz enzimi olacak şekilde deney tekrarlanmıştır. Absorbans değerleri ölçülerek enzimin aktivitesi belirlenmiştir (Çizelge 3. 2). Belirlenen bu protein miktarları aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır: (A280/ ε) x seyreltme faktörü x MW = M (mol/ml) (3.1) Reaksiyonda 10 µl enzim kullanıldığında; M x 1. 10-2 = Ms (Son molarite) x 1 (ml) (3.2) MS x MW = C (µg/ml) (3.3) Yapılan her iki deneyde de çalışılan enzim konsantrasyonu değerleri birbirine yakın olduğundan elde edilen absorbans değerlerinin ortalaması alınmış ve çıkan değerler grafik üzerinde gösterilmiştir (Şekil 3.17). Çizelge 3. 2 Çoklu tekrarlar sonrasında elde edilen ortalama absorbans değerleri (ΔA240/dk) pH Aktivite Deney 1 (ΔA240/dk) Aktivite Deney 2 (ΔA240/dk) Ortalama Absorbans (ΔA240/dk) 6,5 0,372 0,359 0,3655 7 0,470 0,481 0,4755 7,5 0,535 0,534 0,5345 8 0,633 0,580 0,6065 8,5 0,656 0,605 0,6305 9 0,518 0,477 0,4975 9,5 0,435 0,414 0,4245 60 Şekil 3. 17 Ortalama değerlere göre belirlenen pH-absorbans değerleri Optimum pH deneyinin sonucunda FnENO enziminin en yüksek aktivite gösterdiği pH değeri 8,5 olarak belirlenmiş ve kinetik analizlerde pH’ı 8,5 olan tampon kullanılarak reaksiyonlar gerçekleştirilmiştir. Optimum pH belirlendikten sonra, en yüksek absorbans değerinin ilk yapılan deneyde pH’ı 8,5 olan tampon kullanılarak belirlenen ortalama absorbans değeri olduğu görülmüştür ve bu veri kullanılarak enzimin spesifik aktivite değeri hesaplanmıştır. Bu deneyde hazırlanan stok enzim konsantrasyonu 0,82 mg/ml’dir. 2.2.9’da verilen formülde εPEP (1,4 mM-1. cm-1) değeri [58] ve hacim değerleri yerine konularak yapılan hesaplama sonucunda enzim ünitesi 46,85 U/ml olarak hesaplanmıştır. Bu değer protein konsantrasyonuna bölündüğünde elde edilen spesifik aktivite değeri 57,14 U/mg’dır. 3.2.7 Fusobacterium nucleatum Enolaz Enzim Termostabilitesinin Belirlenmesi FnENO enziminin termostabilite deneyi enzimin belirli sıcalıklarda belirli sürelerde inkübe edilmesi ile yapılmıştır. Belirli sıcaklıklarda inkübe edilen enzimin her 3 dakikada bir 240 nm’de UV spektrofotometrede enolaz aktivitesi ölçülmüştür. Absorbans değerleri belirlenerek FnENO enziminin aktivitesinin sıcaklıkla nasıl bir değişim gösterdiği belirlenmiştir. 61 Reaksiyonlarda pH 8,5’ta tampon (50 mM Tris-HCl+ 1,5 mM MgCl), 2-PGA (1,5 mM), dH2O ve enzim kullanılmıştır [58]. Yapılan bu deneyde 1 ml’de 5,44 µg saflaştırılmış FnENO enzimi kullanılmıştır. Zamana bağlı olarak gerçekleştirilen reaksiyonun absorbans değerleri Çizelge 3.3’te verilen şekilde belirlenmiştir. Çizelge 3. 3 FnENO enziminin termostabilite deneyi sonucundaki absorbans değerleri (ΔA240/dk) Sıcaklık (0C) Absorbans (ΔA240/dk) 3 dk 6 dk 9 dk 12 dk 15 dk 60 0,379 0,458 0,458 0,501 0,483 40 0,433 0,487 0,548 0,522 0,560 30 0,485 0,514 0,525 0,593 0,488 Elde edilen absorbans değerleri ile grafik oluşturulduğunda sıcaklık ile FnENO enziminin aktivitesinin çok fazla değişmediği görülmüştür (Şekil 3.18). 60 0C’deki absorbans değerlerine bakıldığında sıcaklık arttığında aktivitenin bir miktar azaldığı ancak reaksiyonu önleyecek derecede bir değişimin olmadığı görülmüştür. Ayrıca; zaman parametresinin de FnENO enzimi aktivitesi üzerinde bir değişiklik yapmadığı belirlenmiştir. Uygulanan sıcaklıklarda 15 dakika sonunda da enzimin aktivitesinde belirgin bir azalma ya da artmanın olmadığı görülmüştür. Şekil 3. 18 FnENO enziminin termostabilite deneyi sonucunda elde edilen absorbans değerleri ve zaman grafiği 62 3.2.8 Saflaştırılmış FnENO Enziminin Kinetik Analizinin Yapılması FnENO enzimi kinetik analizinin yapılması için tekrar üretilmiştir ve 2.2.6’da belirtilen saflaştırma protokolü uygulanmıştır. Saflaştırma sonucunda elde edilen elüsyonların UV spektrofotometrede 280 nm’de absorbans değerleri ölçülmüş ve bu değerlere göre en yüksek protein konsantrasyonuna sahip elüsyon kinetik analizde kullanılmıştır (Çizelge 3.4). Ayrıca; belirlenen elüsyonun absorbans değeri kinetik parametrelerin hesaplanmasında kullanılmıştır. Şekil 3.19’da verilen SDS poliakrilamid jel elektroforezinde görüldüğü gibi FnENO enzimi yüksek oranda saf olarak elde edilmiştir. Çizelge 3. 4 Saflaştırma sonrası seçilen elüsyonların 280 nm’deki absorbans değerleri Elüsyonlar E3 E4 E5 E6 E7 E8 Absorbans (A280) 0,032 0,026 0,016 0,017 0,016 0,015 Şekil 3. 19 Saflaştırma sonrası elüsyonlardan elde edilen FnENO enziminin SDS-PAGE görüntüsü. Hat M: Protein markır; Hat 1,2,3,4,5,6,7,8 sırasıyla: Elüsyon 1, Elüsyon 2, Elüsyon 3, Elüsyon 4, Elüsyon 5, Elüsyon 6, Elüsyon 7, Elüsyon 8 Saflaştırma sonrası FnENO enziminin substrat kinetiği analizi için elüsyon 3 örneği kullanılmıştır. Farklı 2- PGA substrat konsantrasyonlarında, 1 ml’de 4,3 µg enzim kullanılarak reaksiyon gerçekleştirilmiştir. 0,02-3,5 mM arasında değişen substrat konsantrasyonlarında yapılan reaksiyonların 240 nm’de absorbans ölçümü alınmıştır. Değişen konsantrasyonlarda üç kez tekrarlanarak alınan ölçümlere göre ortalama absorbans değerleri Çizelge 3.5’te verilmiştir. 63 Değişen substrat konsantrasyonları ile yapılan deney sonucunda GraFit 3.0 programı [63] kullanılarak elde edilen veriler ile Km ve Vmax değerleri hesaplanmıştır. Ayrıca; bu program kullanılarak enzimin kararlı hal kinetik grafiği oluşturulmuştur (Şekil 3. 20). kcat ise enzim konsantrasyonu, εPEP (1400 M-1 cm-1), Vmax değerleri kullanılarak hesaplanmıştır. Öncelikle kullanılan 4,3 µg enzimin konsantrasyonu 9,27.10-8 M olarak bulunmuştur. Elde edilen bu değerler 2.8, 2.9’da verilen denklemlerde kullanılmış ve sonuç olarak kcat değeri bulunmuştur. Belirlenen Km değeri kullanılarak da kcat/Km değeri belirlenmiştir. Çizelge 3. 5 Değişen substrat konsantrasyonlarına göre ölçülen ortalama ΔA240/dk değerleri Substrat Konsantrasyonu (mM) Ortalama Absorbans (ΔA240/dk) 0,02 0,0043 0,06 0,014 0,1 0,024 0,12 0,033 0,16 0,051 0,32 0,061 1,0 0,103 1,5 0,114 2,0 0,1325 2,5 0,134 3,0 0,138 3,5 0,140 64 Şekil 3. 20 FnENO enziminin kararlı hal kinetiği grafiği Kinetik analiz sonucunda Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin Km, Vmax, kcat, kcat/Km değerleri literatürde ilk defa belirlenmiştir (Çizelge 3.6) Çizelge 3. 6 F. nucleatum enolaz enziminin belirlenen kinetik özellikleri Kinetik Özellik Belirlenen Değer Standart hata Km 0,4825 mM 0,0043 Vmax 0,1587 0,0491 kcat 20,38 s-1 - kcat/Km 4,22 x 104 M-1s-1 - 3.2.9 FnENO Enziminin Homoloji Modellemesinin Yapılması Öncelikle FnENO enziminin aminoasit dizisi web tabanlı BLAST programına girilip PSIBLAST [65] algoritması kullanılarak PDB (Protien Data Bank) proteinlerine karşı protein taraması gerçekleştirilmiştir [66]. Bu eşleştirme sonucunda homoloji modelleme için identity değeri %30’un üzerinde olacak şekilde kalıp protein seçilmesi gerekmektedir [65], [66]. Çıkan sonuçlardaki Maksimum Skor (573), Identity (%67) ve E-value (0.0) değerlerine göre Enterococcus hirae enolaz (EhENO) enzimi kalıp protein olarak 65 seçilmiştir. EhENO’nun [78] 3 boyutlu yapısı Protein Data Bank kullanılarak bulunmuş ve modelleme çalışmasında kalıp olarak kullanılmıştır (PDB ID: 1IYX) Daha sonra FnENO ve EhENO enzimlerinin aminoasit dizileri Clustal Omega [67] programı kullanılarak eşleştirilmiştir (Şekil 3. 21). Bu eşleştirme sonucuna göre identity yüzdesi % 65,899 olarak belirlenmiştir. Şekil 3. 21 FnENO (2. sıra) ve EhENO (1. sıra) enzimlerinin aminoasit dizilerinin eşleştirilmesi F. nucleatum enolaz enziminin üç boyutlu yapısı; Enterococcus hirae enolazının kristal yapısı, FnENO aminoasit dizisi ve eşleştirme dosyası kullanılarak Modeller v9.12 programı [68] ile belirlenmiştir. Oluşturulan 50 farklı modelden içerisinden DOPE (Discrete Optimized Protein Energy) skoru en düşük olan model ileriki çalışmalar için seçilmiştir. Seçilen model 28’in DOPE Skoru -48462.25000 olarak belirlenmiştir (Şekil 3. 22). 66 Şekil 3. 22 FnENO’nun seçilen en iyi modelinin görüntüsü Protein modelinin geometrisinin optimizasyonu (enerji minimizasyonu) AMBER99 forcefield (FF) [69] kullanılarak 250 döngüde yapılmıştır. Bu modelin optimizasyon öncesi enerji değeri 3390.420505 kcal/mol ve optimizasyon sonrası enerji değeri 8689.888932 kcal/mol’dür. Validasyon aşamasında ilk olarak ERRAT programı kullanılmıştır. Bu program oluşturulan protein modelinin üç boyutlu yapısının doğruluğunun atomik bağlar açısından değerlendirilebilmesini sağlamaktadır. Şekil 3. 23 Model FnENO’nun ERRAT programı sonucunun görüntüsü. 67 ERRAT programı amino asitlerdeki CC, CN, CO, NN, NO ve OO atomlarının arasındaki bağlı olmayan atomik etkileşimleri tahmin etmede kullanılmaktadır [70]. Program çıktısına göre elde edilen grafikte; %95’in üzerinde olan alanlar (daha koyu alanlar) hatalı olan aminoasitleri göstermektedir (Şekil 3. 23). Optimizasyon öncesi 91.294 olarak elde edilen skor optimizasyon sonrası 94.774 değerine yükselmiştir. Skorun yüksek olması atomlar arasındaki etkileşimin düzeldiğini ve proteinin üç boyutlu yapısının optimizasyon sonrası doğruluğunun arttığını göstermektedir. ProSA programı protein modelinin yapısal kalitesini tespit etmekte kullanılmıştır. Program çıktı olarak bir Z-skoru ve bir enerji grafiği vermektedir. Z-skoru toplam model kalitesini ifade etmekte ve tabloda yapısı çözümleniş diğer proteinlerin Z-skoru değerleriyle birlikte verilmektedir. Eğer ortaya çıkan değer deneysel olarak yapısı çözümlenmiş proteinlerin Z-skoru değerlerinin dışında çıkarsa protein hatalı olarak kabul edilmektedir [71]. Yapılan her iki validasyon sonucunda da protein modeli, yapısı X-ray kristalografisinde çözülmüş proteinler arasında görülmüştür. Optimizasyon öncesi Z skoru -9.08 (-10.21 EhENO) iken optimizasyon sonrası -9.11 (-10.21 EhENO) olmuştur. Z-skoru proteinin deneysel olarak yapısı çözümlenen proteinlerin skorları arasında yer aldığından model doğru olarak kabul edilmiştir (Şekil 3. 24). Enerji düzeyine bakıldığında ise her iki sonuçta da dizi pozisyonuna göre negatif değerlerde olduğu görülmüştür (Şekil 3.25). Bu durum model proteinin konformasyonun daha doğru bir şekilde belirlendiğini göstermektedir. Pozitif değerin olması proteindeki sorunlu veya hatalı aminoasitlerin varlığını göstermektedir. Şekil 3. 24 Optimizasyon sonrası FnENO modelinin Z-skor sonucu 68 Şekil 3. 25 Optimizasyon sonrası FnENO modelinin enerji düzeyi grafiği RAMPAGE programı [72] ile proteinin birincil yapısında bulunan aminoasitlerin ikincil yapı içerinde hangi pozisyonda bulunduklarını belirlemek amacıyla kullanılan ramachandran diyagramı oluşturulmuştur. Çıkan sonuçlara göre proteinin üç boyutlu yapısının kabul edilebilir doğrulukta modellenmiş olduğu görülmektedir. Optimizasyon öncesi Ramachandran diyagramındaki asıl bölge, kabul edilebilir bölge ve dış bölgedeki rezidülerin yüzdeleri sırasıyla; %96.3, %3.0, %0.7 iken optimizasyon sonrası yüzdeler sırasıyla; %94.7, %4.6, %0.7’dir (Şekil 3. 26). Şekil 3. 26 Optimizasyon sonrası FnENO modelinin Ramachandran diyagramı. Bu diyagramda asıl bölgeler mavi, kabul edilebilir bölgeler turuncu, dış bölgeler beyaz olarak gösterilmiştir. 69 SOPMA programı [73] kullanılarak proteinin ikincil yapısı analiz edilmiştir ve bu programdan elde edilen verilere göre FnENO modelinin ikincil yapısında % 45,73 oranında alfa heliks, % 7,39 oranında beta dönüşü, % 16,17 rastgele döngüler, % 30,72 oranında beta yaprak kısımlarının bulunduğu belirlenmiştir (Şekil 3. 27). (A) (B) Şekil 3. 27 SOPMA programına göre FnENO model proteinin ikincil yapı sonuçları (A) Proteinin ikincil yapısının aminoasit dizisine göre belirlenen yüzdeleri (B) Proteinin aminoasit dizinin ikinci yapıda verilen renklere göre sıralanışı. Modellenmiş proteinin muhtemel ilaç bağlanabilecek cep bölgeleri Q-SiteFinder [74] ve DoGSiteScorer [75] programları ile belirlenmiştir. Q-SiteFinder programı ile 5 farklı hedef bölge bulunmuştur (Şekil 3.28). DoGSiteScorer programı ile de 14 farklı hedef 70 bölge belirlenmiştir. DoGSiteScorer programı verilerine göre P0 bölgesinin ilaç skoru 0.88 olarak bulunmuştur ve en iyi ilaç hedef bölgesi olarak seçilmiştir (Şekil 3. 29). P0 bölgesi, Q-SiteFinder programından elde edilen sonuç ile karşılaştırıldığında Bölge 1 ile aynı olduğu görülmektedir. Belirlenen cep bölgesinin ilaç skoru 1’e yakın ise ilaç geliştirilmesine daha uygun olduğu bilinmektedir [75]. Bu nedenle model proteinin cep bölgelerinin ilaç tasarımına uygun olduğu görülmektedir. Şekil 3. 28 Model proteinin aktif bölgelerinin Q-SiteFinder görüntüsü. Açık mavi: Bölge 1, açık yeşil: Bölge 2, koyu yeşil: Bölge 3, koyu mavi: Bölge 4, gri: Bölge 5. Şekil 3. 29 Model proteinin aktif bölgelerinin DoGSiteScorer görüntüsü. Şekilde protein üzerindeki 14 farklı cep bölgesinin fiziksel özelikleri ve ilaç skoru verilmiştir. Protein modeli üzerinde en iyi ilaç hedefi olarak belirtilen bölge (P0) açık mavi renkte gösterilmiştir. 71 3.2.10 F. nucleatum Enolazının Süperimpozisyonlarının Yapılması ve Root-MeanSquare Deviation (RMSD) Değerlerinin Belirlenmesi FnENO’nun modellenmesi için kullanılan kalıp protein EhENO ile süperimpozisyon çalışmaları MolSoft-ICM Browser 3.7-2d programı kullanılarak yapılmıştır (Şekil 3. 30) Şekil 3. 30 FnENO ve EhENO enzimlerinin aminoasit dizilerinin süperimpozisyonu. Kırmızı: FnENO, Gri: EhENO Daha sonra Fusobacterium nucleatum’un konağı olan insanın kas, beyin ve akciğer hücrelerinin enolaz enzimlerinin üç boyutlu yapıları Protein Data Bank [66] tan bulunmuştur Bu yapılar ile FnENO’nun yapısı eşleştirilmiş ve süperimpozisyonları MolSoft-ICM Browser 3.7-2d ile yapılmıştır (Şekil 3. 31) Yapılan süperimpozisyon çalışmalarında insan kas ve beyin hücreleri enolaz enzimlerine ek olarak akciğer hücresi enolaz enzimi de eklenmiştir. H.sapiens enolaz1 (insan akciğer enolazı)’in gen bankası kayıt numarası X66610.1’dir. Root-mean-square deviation (RMSD) değeri SuperPose programı ile belirlenmiştir. İki protein yapısının kıyaslanması sonucu ortaya çıkan root-mean-square deviation değeri süperimpozisyonu yapılmış proteinlerin atomları arasındaki uzaklıkları belirlemektedir [76]. Belirlenen RMSD değerleri de Çizelge 3.7’de gösterilmiştir. RMSD değeri sıfıra ne kadar yakınsa iki protein birbirine yapısal olarak o kadar benzemektedir. Bu nedenle, H. sapiens enolaz3 (insan kas spesifik beta enolaz izoform 1) FnENO proteinine en çok benzeyen protein olarak belirlenmiştir. 72 Şekil 3. 31 Üç farklı insan enolaz dizileri ile FnENO’nun aminoasit dizilerinin süperimpozisyonları. Kırmızı: FnENO Mavi: HuENOβ (H. sapiens enolaz3 (İnsan kas spesifik beta enolaz izoform 1)) Yeşil: HuENOγ (H. sapiens enolaz2 (İnsan nöron spesifik gamma-2 enolaz)) Sarı: HuENOα (H. sapiens enolaz1 (İnsan akciğer enolazı)) Çizelge 3. 7 RMSD değerleri Global RMSD (Å) FnENO-HuENOα FnENO-HuENOβ FnENO-HuENOγ RMSD 2.73 2.57 2.82 Eşleşen Atomlar 2756 2763 2773 73 BÖLÜM 4 DEĞERLENDİRME VE ÖNERİLER Enolaz enzimi F. nucleatum dahil her canlıda oksijensiz solunumun gerçekleştirilebilmesi açısından çok önemli bir enzimdir. Glikolitik yolak üzerinde pirüvat üretimi sırasında 2- PGA’nın PEP’e dönüşümünü katalizlemektedir [34]. Ayrıca; bu enzim arkebakteri, öbakteri ve ökaryot canlılar dahil çok çeşitli kaynaklarda incelenmiş ve yüksek oranda korunmuş olduğu görülmüştür. Bu koruma özellikle katalitik bölgelerde belirgindir ve çeşitli türlerde benzer kinetik özelliklere sahip enzimlerin bulunmasına neden olmaktadır [79]. Patolojik açıdan bu enzim değerlendirildiğinde ise fibronektin bağlayıcı aktiviteye sahip olup bakteri adhezyonuna katkı sağlayabilmektedir. Ayrıca; önemli bir diğer patolojik özelliği plazminojen bağlayıcı reseptörlere sahip olmasıdır [40], [42]. Yapılan araştırmalarda Borrelia burgdorferi, Streptococcus pneumoniae, Leishmania mexicana, Pneumocystis carinii gibi çeşitli canlılardaki enolaz enziminin plazminojen bağlama özelliklerinin olduğu görülmüştür [80], [81], [82]. Elde edilen bu bilgilere göre F. nucleatum enolaz enziminin de plazminojen bağlama aktivitesine sahip olabileceği düşünülmektedir. F. nucleatum’un canlılığını sürdürebilmesi için kritik bir öneme sahip olan enolaz enziminin ek olarak bu bakterinin patogenezinde de aktif rol oynadığı düşünülmektedir. Bu nedenle periodontal hastalıklarda geliştirilebilecek yeni tedavi yöntemleri için bu enzim hedef molekül olarak kullanılabilecektir. Bu tez çalışmasında F. nucleatum enolaz enziminin literatürde ilk defa gen klonlaması, ifade edilmesi 74 yapılmış ve saf olarak elde edilen enzimin kinetik karakterizasyonu ve homoloji modellemesi ile yapısal karakterizasyonu yapılmıştır. F. nucleatum enolazını kodlayan gen dizisinin 1302 baz çiftinden oluştuğu klonlama sırasında belirlenmiştir. Bu gen bölgesi ekspresyon vektörüne aktarılırken tasarlanan spesifik primerler sayesinde protein dizisine 6xHis-tag bölgesi eklenmiştir. Eklenen bu dizi ile birlikte elde edilen protein SDS-PAGE analizinde görüldüğü gibi hücre lizatının süpernatantında çözünür halde üretilmiş ve saflaştırma sonrasında yapılan aktivite deneylerinde proteinin aktif olarak elde edildiği belirlenmiştir. Kinetik karakterizasyon öncesi yapılan optimum pH deneyinde F. nucleatum enolaz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği pH değeri 8,5 olarak belirlenmiştir. Literatür taraması sonucunda diğer bakteriyel enolazlar ile kıyaslandığında F. nucleatum enolazının optimum pH değerinin literatürdeki değerlere yakın olduğu görülmüştür. [38], [39], [83], [84], [85], [86], [87], [88]. Termostabilite deneyinde ise belirlenen sıcaklık aralıklarında zaman ve sıcaklık artışına göre enzim aktivitesinin düşmesi beklenmekteydi. Ancak yapılan deneyde 30-600C sıcaklık aralığında beklenene göre çok daha az bir düşüş görülmüş ve bu sıcaklık aralığında enzimin aktif bir şekilde bulunduğu belirlenmiştir. Literatürde Brucella abortus enolaz enzimi gibi bu sıcaklık aralığında aktivitesini koruyabilen enzim türleri mevcuttur [39]. F. nucleatum enolaz enziminin farklı substrat konsantrasyonlarında kinetik analizi yapılmış ve Grafit 3.0 programı kullanılarak Km ve Vmax değerleri belirlenmiştir. Hesaplamalara göre bu değerler; Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1, kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1 olarak bulunmuştur. Çizelge 3. 8‘de verilen farklı türlerde bulunan enolaz enzimlerinin kinetik parametreleri, ilk kez bu çalışma ile belirlenen F. nucleatum enolaz enziminin kinetik değerleri ile karşılaştırılmıştır. Km değeri diğer türlere göre çok fazla değişmemektedir ve bu türlere göre belirlenen değer aralığı içerisinde bulunmaktadır. Vmax değerine bakıldığında türlere göre belirlenen değerler arasında farklılıkların ve 10-200 kat arasında değişen değerlerin bulunduğu tespit edilmiştir. 75 Çizelge 3. 8 Farklı türlerdeki enolaz enzimlerinin 2-PGA için kinetik değerlerinin karşılaştırılması Enzim Kaynağı Km (mM) Vmax pH Kaynak Kaynak Tarihi Thermotoga maritima 0.07 - 0.03 - pH 7-8 [83] 1995 E.coli 0,1 - pH 8,1 [84] 1971 Desulfovibrio vulgaris 0,136 - pH 8.0 [38] 2004 Bacillus subtilis 0.67 - pH 8.1– 8.2 [85] 1998 pH 8.5 [39] 2012 pH 7.0 [86] 2009 pH 6.8 [87] 2006 pH 7.0 [88] 2007 pH 8,5 Bu çalışmada 2013 Brucella abortus A19 Streptococcus suis Leuconostoc mesenteroides Streptococcus mutans Fusobacterium nucleatum 2,0 2,47 2.61 9,5 0,4825 0,178 mM.l-1.min-1 2.32 mM. l-1.min-1 2.91 mM.min-1.mg-1 31.0 mM.min-1.mg-1 0,1587 Son olarak; F. nucleatum enolaz enziminin homoloji modellemesi yapılarak proteinin üç boyutlu yapısı belirlenmiştir. Üç boyutlu yapısının belirlenmesi ile birlikte bu proteini inhibe edebilmek için ilaç bağlanabilecek muhtemel cep bölgeleri belirlenmiştir. Yapılan bu çalışmalar ile ileride F. nucleatum enolaz enzimi hedef olarak seçilebilecek ve yeni ilaç tasarımları için bu bölgeler kullanılabilecektir. F. nucleautum’un konağı olan Homo sapiens enolaz dizileri ile eşleştirmeler yapılmış ve süperimpoziyonları belirlenmiştir. Yapılan çalışmalar ile konak ile bakteri enolazı arasındaki farklılıklar belirlenmiş ve hedef olarak seçilebilecek bölgeler bulunmuştur. Bu tez çalışması ile FnENO proteininden elde edilen sonuçların kullanılmasıyla; -Konak ve bakteri enolazı ile yapılan eşleştirmeler göz önüne alınarak; FnENO enziminin belirlenen aminoasit dizisi farklılıkların aktiviteye ne derece etki ettiğinin çalışılması ve inhibitör çalışmalarında hedef bölge olarak kullanılabilecek dizilerin belirlenmesi -Moleküler docking ile inhibitör çalışmalarının yapılması ve elde edilen inhibitörlerin enzimin aktivitesi üzerindeki rölünün belirlenmesi 76 - Yeni ilaç tasarımına yönelik olarak proteinin, inhibitörler ile etkileştirilmesi ve in vivo çalışmalarının yapılması - Enolazın fibronektin bağlayıcı ve plazminojen bağlayıcı reseptör özelliği incelenerek F. nucleatum’un koloni oluşturması, hücrelere adhezyonu ve immün yanıta olan etkileri ile ne derecede ilişkili olduğunun araştırılması önerilmektedir. 77 KAYNAKLAR [1] Orbak, R. ve Zihni, M., (2006), “Periodontal Hastalığın Başlangıç Tedavisi, Karşılaşılan Komplikasyonlar ve Bu Komplikasyonların Giderilme Stratejileri”, Atatürk Üniv. Diş Hek. Fak. Derg. 16:3, 33-41 [2] Albandar, J. M., (2002), “Global Risk Factors and Risk İndicators For Periodontal Diseases”, Periodontology 2000, 29, 177–206 [3] Armitage, G. C., (2004), “Periodontal Diagnoses and Classification of Periodontal Diseases” Periodontology 2000, 34, 9-21 [4] Hatem, A. E., (2012). “Epidemiology and Risk Factors of Periodontal Disease, Periodontal Diseases – A Clinician's Guide, Dr. Jane Manakil” (Ed.), ISBN: 978953-307-818-2, InTech. [5] Van Dyke, T. E. ve Dave, S., (2005), “Risk Factors for Periodontitis”, J Int Acad Periodontol; 7(1): 3–7. [6] Löe, H., Theilade, E. ve Jensen, SB., (1965). “Experimental gingivitis in man” Journal of Periodontology, 36: 177-187. [7] Genco, R. J. ve Borgnakke, W. S., (2013). “Risk factors of Periodontal Disease” Periodontology 2000, 62: 59–94. [8] Dye, B.A., (2012). “Global Periodontal Disease Epidemiology”, Periodontology 2000, 58: 10–25. [9] Peterson, P.E. ve Ogawa, H., (2005). “Strengthening the Prevention of Periodontal Disease: The WHO Approach”, J. Periodontol., 76(12): 2187-2193. [10] Petersen, P. E., (2003). “The World Oral Health Report 2003: continuous improvement of oral health in the 21st century–the approach of the WHO Global Oral Health Programme.” Community Dentistry and Oral Epidemiology, 31(s1): 3-24. [11] AAP Board of Trustees, (2011). “Comprehensive Periodontal Therapy: A Statement by the American Academy of Periodontology”, J Periodontol., 82(7): 943-949. [12] Efeoğlu, A., “Periodontal Kemik Cerrahisi”, http://www.istanbul.edu.tr/dishekimligi/dersnotlari/Periodontal_Kemik_Cerr ahisi.pdf, 14 Kasım 2013. 78 [13] Bolstad, A. I., Jensen, H. B. ve Bakken, V., (1996). “Taxonomy, Biology, and Periodontal Aspects of Fusobacterium nucleatum”, Clinical Microbiology Reviews, 9(1): 55–71. [14] Al-Haroni, M., Skaug, N., Bakken, V. ve Cash, P., (2008). “Proteomic analysis of ampicillin-resistant oral Fusobacterium nucleatum.” Oral Microbiol Immunol, 23: 36–42. [15] Kapatral, V., Anderson, I. ve Ivanova N., (2002). “Genome Sequence and Analysis of the Oral Bacterium Fusobacterium nucleatum Strain ATCC 25586”, Journal Of Bacteriology, 184(7): 2005–2018. [16] Karpathy, S. E., Qin, X., Gioia, J., Jiang, H. Y., Liu, Y., Petrosino, J. F., Yerrapragada, S., Fox, G. E., Kinder Haake, S., Weinstock, G. W. ve Highlande, S. K., (2007). “Genome Sequence of Fusobacterium nucleatum Subspecies Polymorphum — a Genetically Tractable Fusobacterium.” PLoS ONE, 2:8, e659. [17] Signat, B., Roques, C., Poulet, P. ve Duffaut, D., (2011). “Role of Fusobacterium nucleatum in Periodontal Health and Disease”, Curr. Issues Mol. Biol., 13: 2536. [18] Han, Y. W., Shi, W., Huang, G. T.-J., Kinder Haake, S., Park, No-H., Kuramıtsu, H. ve Genco, R. J., (2000). “Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells”, Infection And Immunity, 68(6): 3140–3146. [19] Dabija-Wolter, G., Sapkota, D., Cimpan, M. R., Neppelberg, E., Bakken, V. ve Costea, D. E., (2012). “Limited in-depth invasion of Fusobacterium nucleatum into in vitro reconstructed human gingiva”, Archives of Oral Biology, 57: 344 – 351. [20] Gaetti-Jardim Júnior, E., Rui Luvizotto, M. C. ve Avila-Campos, M. J., (2000). “Virulence of Oral Fusobacterium nucleatum from Humans And Non-Human Primates in Mice”, Brazilian Journal of Microbiology, 31: 146-150. [21] Haraldsson, G., (2005). “Oral commensal Prevotella species and Fusobacterium nucleatum: Identification and potential pathogenic role.”, Faculty of Medicine of the University of Helsinki, Helsinki. [22] Bradshaw, D. J., Marsh, P. D., Watson, G. K. ve Allison, C., (1998). “Role of Fusobacterium nucleatum and Coaggregation in Anaerobe Survival in Planktonic and Biofilm Oral Microbial Communities during Aeration”, Infection And Immunity, 66(10): 4729-4732. [23] Kremer, B. H.A. ve Martijn van Steenbergen, T.J., (1999). “Peptostreptococcus micros coaggregates with Fusobacterium nucleatum and non-encapsulated Porphyromonas gingivalis”, FEMS Microbiology Letters, 182: 57-61. [24] Chew, J., (2010). “Protein expression in Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 Biofilm Cells Induced by an Alkaline Environment”, The degree of Doctor of Philosophy, The University Adelaide, South Australia. 79 [25] Settem, R. P., Taher El-Hassan, A., Honma, K., Stafford, G. P. ve Sharmaa, A., (2012). “Fusobacterium nucleatum and Tannerella forsythia Induce Synergistic Alveolar Bone Loss in a Mouse Periodontitis Model”, Infection and Immunity, 80(7): 2436–2443. [26] Han, Y. W., Ikegami, A., Rajanna, C., Kawsar, H. I., Zhou, Y., Li M., Sojar, H. T., Genco, R. J., Kuramitsu H. K. ve Deng C. X., (2005). “Identification and Characterization of a Novel Adhesin Unique to Oral Fusobacteria”, Journal Of Bacteriology, 187(15): 5330–5340. [27] Afra, K., Laupland, K., Leal, J., Lloyd, T. ve Gregson, D., (2013). “Incidence, risk factors, and outcomes of Fusobacterium species bacteremia”, BMC Inf. Dis., 13(1): 264. [28] Avila-Campos, M. J.,, Rivera, I. N. ve Nakano, V., (2006).“Genetic diversity of oral Fusobacterium nucleatum isolated from patients with different clinical conditions”, Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 48(2): 59-63. [29] Arat, Y.O., Shetlar, D.J. ve Rose, J.E., (2004). “Blindness From Septic Thrombophlebitis Of The Orbit And Cavernous Sinus Caused by Fusobacterium nucleatum”, Arch Ophthalmol, 122:652–654. [30] Han, Y.W., Fardini, Y., Chen, C., Lacampo, K.G., Peraino, V.A., Shamonki, J.M. ve Redline, R.W., (2010). “Term stillbirth caused by oral Fusobacterium nucleatum”, Obstet. Gynecol., 115:442–445. [31] Castellarin, M., Warren, R.L., Freeman, J.D., Dreolini, L., Krzywinski, M., Strauss, J., Barnes, R., Watson, P., Allen-Vercoe, E., Moore, R.A. ve Holt, R.A., (2012). “Fusobacterium nucleatum infection is prevalent in human colorectal carcinoma”, Genome research, 22: 299-306. [32] Kostic, A.D., Gevers, D., Pedamallu, C.S., Michaud, M., Duke, F., Earl, A.M., Ojesina, A.I., Jung, J., Bass, A.J., Tabernero, J., Baselga, J., Liu, C., Shivdasani, R.A., Ogino, S., Birren, B.W., Huttenhower, C., Garrett, W.S. ve Meyerson, M., (2012). “Genomic analysis identifies association of Fusobacterium with colorectal carcinoma”, Genome research, 22: 292-298. [33] Nyfors, S., Kononen, E., Syrjanen, R., Komulainen, E. ve Jousimies-Somer, H., (2003). “Emergence of penicillin resistance among Fusobacterium nucleatum populations of commensal oral flora during early childhood”, J. Antimicrob. Chemother., 51:107–12. [34] Pancholi V., (2001). “Multifunctional α -enolase: its role in diseases”, Cell. Mol. Life Sci., 58, 902–920. [35] Capello, M., Ferri-Borgogno, S., Cappello, P. ve Novelli, F., (2011). “α-enolase: a promising therapeutic and diagnostic tumor target,” FEBS Journal, 278(7): 1064–1074. [36] Diaz-Ramos A., Roig-Borrellas A., Garcia-Melero A. ve Lopez-Alemany R., (2012). “alpha-Enolase, a multifunctional protein: its role on pathophysiological situations”. J Biomed Biotechnol 2012: 156795. doi: 10.1155/2012/156795. 80 [37] Pelicano, H., Martin, D.S., Xu, R.H. ve Huang, P., (2006). “Glycolysis inhibition for anticancer treatment”. Oncogene, 25: 4633–4646. [38] Kitamura, M., Takayama, Y.,Kojima, S., Kohno, K., Ogata, H., Higuchi, Y. ve Inoue, H., (2004). “Cloning and expression of the enolase gene from Desulfovibrio vulgaris (Miyazaki F)”, Biochim. Biophys. Acta, 1676:172–181. [39] Han, X., Ding, C., Chen, H., Hu, Q. ve Yu, S., (2012). “Enzymatic and biological characteristics of enolase in Brucella abortus A19”, Mol Biol Rep., 39(3): 270511. [40] Esgleas, M., Li Y., Hancock, M.A., Harel, J., Dubreuil, J.D. ve Gottschalk, M., (2008). “Isolation and characterization of alpha-enolase, a novel fibronectin-binding protein from Streptococcus suis”, Microbiology 154: 2668– 2679. [41] Sha, J., Erova, T.E., Alyea, R.A., Wang, S., Olano, J.P., Pancholi, V. ve Chopra, A.K., (2009). “Surface-expressed enolase contributes to the pathogenesis of clinical isolate SSU of Aeromonas hydrophila”, J. Bacteriol., 191:3095–3107. [42] Redlitz, A., Fowler, B.J., Plow, E.F. ve Miles, L.A., (1995). “The role of an enolase-related molecule in plasminogen binding to cells”, Europ. J. Biochem., 227: 407–415. [43] Promega, pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems Technical Manual, http://www.promega.co.uk/resources/protocols/technical-manuals/0/pgemt-and-pgem-t-easy-vector-systems-protocol/, 15 Nisan 2013. [44] Thermo Scientific, aLICator Ligation Independent Cloning and Expression System, http://www.thermoscientificbio.com, 02 Mayıs 2013. [45] The National Center for Biotechnology Information (NCBI), Nucleotide sequence, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, 16 Nisan 2013. [46] Sambrook, J. ve Russell, D.W., (2001), Molecular Cloning A Laboratory Manual I-II-III, Third Edit., CSHL Press, New York. [47] Promega, Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Technical Bulletin, http://www.promega.co.uk, 26 Nisan 2013. [48] QIAGEN, QIAprep®Miniprep Handbook, 2009, Cat. No: 27104, Germany. [49] Promega, Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Technical Bulletin, https://www.promega.com, 02 Nisan 2013. [50] Align Sequences using ClustalW2 EBI, Multiple Sequence Alignment, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2, 17 Nisan 2013. [51] Akat, A., (2010). Theileria annulata’nın enolaz enzimini kodlayan genin ilaç ve aşı tasarım çalışmalarında kullanılmak üzere izolasyonu, klonlanması ve analiz edilmesi, Yüksek Lisans Tezi, YTÜ, Fen Bilimleri Ens., İstanbul. [52] Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. ve Kumar, S., (2011) “MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods.” Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739. 81 [53] Shoemark, DK., (2000). The kinetic characterization of the lactate dehydrogenase enzyme from Plasmodium falciparum, Doctor of philosophy thesis, Department of biochemistry, University of Bristol, Bristol. [54] Laemmli, U.K., (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227: 680-685. [55] Qiagen, QIAexpressionist: A handbook for high-level expression and purification of 6xhis-tagged proteins, http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAexpressionist_ EN.pdf, 20 Mayıs 2013. [56] Peptide Properties Calculator- Northwestern University, Peptide property calculator, http://www.basic.northwestern.edu/biotools/proteincalc.html, 20 Mayıs 2013. [57] Grimsley, G.R. ve Pace, C.N., (2003). Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons. Inc., New Jersey. [58] Pal-Bhowmick, I., Sadagopan, K., Vora, HK., Sehgal, A., Sharma, S. ve Jarori GK., (2004). “Cloning, Over-Expression, Purification and Characterization of Plasmodium falciparum Enolase”, Eur. J. Biochem., 271: 4845-4854. [59] Kushwaha, S., Singh, P. K., Rana, A. K. ve Misra-Bhattacharya, S., (2011). “Cloning, expression, purification and kinetics of trehalose-6-phosphate phosphatase of filarial parasite Brugia malayi”, Acta tropica, 119(2): 151-159. [60] Enzyme kinetics, Chapter 10, http://www.uscibooks.com/changten.pdf, 21 Kasım 2013. [61] Rogers A. and Gibon Y., (2009). “Enzyme kinetics: theory and practice.” In plant metabolic Networks (pp. 71-103). Springer New York. [62] Walsh, R., “Alternative Perspectives of Enzyme Kinetic Modeling.”, http://cdn.intechopen.com/pdfs/36518/InTechAlternative_perspectives_of_enzyme_kinetic_modeling.pdf, 22 Kasım 2013. [63] Leatherbarrow, R.J., (1992). "GraFit Version 3.0", Erithacus Software Ltd., Staines, UK. [64] Bishop Taştan A. Ö., Beer, T. A. P. ve Joubert, F. (2008). “Protein homology modelling and its use in South Africa”. South African Journal of Science, 104: 1-2, 2-6. [65] NCBI,PSI Blast, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 5 Kasım 2013. [66] ProteinDataBank, X-ray Resolution, http://www.rcsb.org/pdb, 6 Kasım 2013. [67] Align Sequences using Clustal Omega EBI, Multiple Sequence Alignment, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/, 7 Kasım 2013. [68] Eswar, N., Marti-Renom, M. A., Webb, B., Madhusudhan, M. S., Eramian D., Shen, M., Pieper, U. ve Sali, A., (2006). “Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics”, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30. 82 [69] HyperChem molecular modeling, Homology modelling for HyperChem, http://www.molfunction.com/software1.htm, 11 Kasım 2013. [70] Colovos C. ve Yeates TO., (1993), “Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions.”, Protein Sci., 2(9):1511-9. [71] Wiederstein M. ve Sippl M. J., (2007). “ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins”, Nucleic Acids Research, 35: 407–410. [72] Lovell, S. C., Davis, I. W., Arendall III W. B., de Bakker P. I. W., Word J. M., Prisant M. G., Richardson, J. S. ve Richardson, D. C., (2003), “Structure Validation by Cα Geometry: φ, ψ and Cβ Deviation”, PROTEINS: Structure, Function, and Genetics, 50:437–450. [73] Geourjon, C. ve Deléage, G., (1995). “SOPMA: Significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments.”, Cabios 11, 681-684. [74] Q-SiteFinder, Faculty of Biological Sciences, University http://www.modelling.leeds.ac.uk/qsitefinder/, 13 Kasım 2013. [75] Volkamer, A., Kuhn, D., Grombacher, T., Rippmann, F. ve Rarey, M., (2012). “Combining global and local measures for structure-based druggability predictions. “ J. Chem. Inf. Model.”,52: 360-372. [76] Maiti, R., Van Domselaar G. H., Zhang H. ve Wishart D. S., (2004) "SuperPose: a simple server for sophisticated structural superposition" Nucleic Acids Res. 1; 32 (Web Server issue): W590W594. [77] Hansen L.H., Knudsen S. ve Sorensen S.J., (1998). “The effect of the lacY gene on the induction of IPTG inducible promoters, studied in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens”, Curr. Microbiol., 36: 341-347. [78] Hosaka T., Meguro T., Yamato I. ve Shirakihara Y., (2003). “Crystal structure of Enterococcus hirae enolase at 2.8 A resolution”, J Biochem., 133(6):817-23. [79] Hannaert, V., Albert, M. A., Rigden, D. J., Theresa da Silva Giotto, M., Thiemann, O., Garratt, R. C., Roy, J. V., Opperdoes F. R. ve Michels, P. A. M., (2003). “Kinetic characterization, structure modelling studies and crystallization of Trypanosoma brucei enolase.” European Journal of Biochemistry, 270(15): 3205-3213. [80] Vanegas, G., Quiñones, W., Carrasco-López, C., Concepción, J. L., Albericio, F. ve Avilán, L. (2007). “Enolase as a plasminogen binding protein in Leishmania mexicana.” Parasitology research, 101(6): 1511-1516. [81] Fox, D., ve Smulian, A. G. (2001). “Plasminogen-binding activity of enolase in the opportunistic pathogen Pneumocystis carinii.” Medical Mycology, 39(6), 495-507. [82] Toledo, A., Coleman, J. L., Kuhlow, C. J., Crowley, J. T. ve Benach, J. L. (2012). “The enolase of Borrelia burgdorferi is a plasminogen receptor released in outer membrane vesicles.” Infection and immunity, 80(1): 359-368. 83 of Leeds, [83] Schurig, H., Rutkat, K., Jaenicke, R. ve Rachel, R. (1995). “Octameric enolase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima: purification, characterization, and image processing.” Protein Science, 4(2): 228-236. [84] Spring, T. G. ve Wold, F. (1971). “The purification and characterization of Escherichia coli enolase.” Journal of Biological Chemistry, 246(22): 6797-6802. [85] Brown, C. K., Kuhlman, P. L., Mattingly, S., Slates, K., Calie, P. J. ve Farrar, W. W. (1998). “A model of the quaternary structure of enolases, based on structural and evolutionary analysis of the octameric enolase from Bacillus subtilis.” Journal of protein chemistry, 17(8): 855-866. [86] Feng, Y., Pan, X., Sun, W., Wang, C., Zhang, H., Li, X., Ma, Y., Shao Z., Ge, J., Zheng, F., Gao, G., F. ve Tang, J. (2009). “Streptococcus suis enolase functions as a protective antigen displayed on the bacterial cell surface.” Journal of Infectious Diseases, 200(10): 1583-1592. [87] Lee, J. H., Kang, H. K., Moon, Y. H., Cho, D. L., Kim, D., Choe, J. Y., Honzatko R. ve Robyt, J. F. (2006). “Cloning, expression and characterization of an extracellular enolase from Leuconostoc mesenteroides.” FEMS microbiology letters, 259(2): 240-248. [88] Jones, M. N. ve Holt, R. G. (2007). “Cloning and characterization of an αenolase of the oral pathogen Streptococcus mutans that binds human plasminogen.” Biochem. Biophys. Res. Commun., 364(4): 924-929. 84 ÖZGEÇMİŞ KİŞİSEL BİLGİLER Adı Soyadı : Sinem YAKARSÖNMEZ Doğum Tarihi ve Yeri : 20.12.1990 -EMİNÖNÜ Yabancı Dili : İngilizce E-posta : [email protected] ÖĞRENİM DURUMU Derece Alan Okul/Üniversite Mezuniyet Yılı Lisans Biyomühendislik Yıldız Teknik Üniversitesi 2012 Lise Sayısal (Fen-Matematik) Gazi Anadolu Lisesi 2008 YAYINLARI Bildiri 1. Yakarsonmez S, Cayır E, Sarıyer E, Milward MR, Cooper PR, Turgut-Balik D. (2013). Cloning and sequence analysis of enolase gene from Fusobacterium nucleatum. , 2nd International Congress of Molecular Biology Association of Turkey, Istanbul, Turkey, 22-23 November 2013. 85