MOLEKÜLER ANAL‹ZLER ‹ - Turkish Journal of Pathology

TÜRK PATOLOJ‹ DERG‹S‹ • 18 (3-4): 61-63 (2002)
· 61
(The Turkish Journal of Pathology)
MOLEKÜLER ANAL‹ZLER ‹Ç‹N HÜCRE ÖRNEKLEMES‹NE
BAfiLARKEN: LAZER YARDIMLI M‹KROD‹SEKS‹YON
VE B‹R DOWN-STREAM UYGULAMASI
Dr. Hüseyin BALO⁄LU, Dr. Turgut AYDIN, Dr. fiükrü YILDIRIM, Dr. Zafer KÜÇÜKODACI, Dr. ‹smail YILMAZ
ÖZET: Patoloji biliminin modern uygulamalar›nda moleküler düzeyde bilgi ihtiyac› her geçen gün biraz daha ön plana ç›kmaktad›r. Tan› amaçl› biyolojik örneklerden kompleks moleküler uygulamalar ile süzülen bilgiler h›zla artmaktad›r. Patoloji biliminin kulland›¤› yöntemlerin do¤ru uygulamalar›, hemen daima do¤ru
örnekleme ile bafllar. Kullan›lan teknik mikrohibridizasyon, genomik ekspresyon paterni ya da mutasyon taramas› gibi moleküler düzeyli bir inceleme ise, bafllang›ç örneklerindeki hedef, spesifik tek bir hücreye kadar küçülebilmektedir. Bir çok sofistik moleküler test yönteminin de¤eri de, test için kullan›lan DNA,
RNA ya da proteinin sadece hedef hücrelerden izole edilmifl, yani di¤er hücrelerin kontamine etmedi¤i pür bir materyal olup olmay›fl› ile yak›ndan iliflkilidir.
Bu anlamda amaca yönelik hücre örnekleme uygulamalar› özelik gösterir. Bu yaz›da en küçük insan hücresinin, gland, follikül, glomerül gibi fonksiyonel yap›lanmalar›, rutin tan›sal histo/sito-patoloji uygulamalar›yla haz›rlanm›fl örneklerden görsel kontrol dahilinde seçerek toplama yöntemi olan lazer yard›ml› mikrodiseksiyon ve bu diseksiyonla elde edilen hedef hücrelerden ç›kart›lan DNA’n›n DOP-PCR ile amplifiye edilmesi, takiben de insitu hibridizasyon için probDNA haz›rlamas› örneklenmifltir.
ANAHTAR KEL‹MELER: Moleküler patoloji, mikrodiseksiyon, PCR, ISH, DNA
SUMMARY: INTRODUCTION TO CELL SAMPLING FOR MOLECULAR ANALYSIS: LASER CAPTURE MICRODISSECTION AND A DOWN-STREAM APPLICATION. The need for high-level molecular knowledge in modern pathology applications is rising everyday. Related data yield very rapidly by applying complex
molecular techniques to the diagnostic biologic materials. The accurate application of methods in pathology depends on optimum material sampling. If the chosen technique is a molecular level application such as micro-hybridization, genomic expression, or mutation screening, the sampling target goes as small as a
single specific cell. The value of most sophisticated molecular testing methods will be limited if the input DNA, RNA or protein is not derived from pure population of target cells or is contaminated by non-target cells. In this article, the microdissection technique for even the smallest cell of the human body or the functional units such as gland, follicle and glomerulus in prepared material from the biologic material sampled for rutin cyto/histo-pathologic diagnosis under the visual control is detailed, and subsequent DNA-probe preparation for insitu hybridization following DOP-PCR amplification of extracted DNA is demonstrated.
KEY WORDS: Molecular pathology, microdissection, PCR, ISH, DNA
G‹R‹fi
Moleküler düzeyde detay bilgisi artt›kça normal hücre
geliflimi, dokular›n ve sistemlerin normal yap›lan›fl› (morfogenezis) ile, bunlar›n patolojik lezyonlara de¤iflimi (patogenezis) merak uyand›rmakta ve süreçte yer alan tüm
kritik genlerin ekspresyon paternleri incelenmektedir. Bu
incelemeler polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve modifikasyonlar›, mikrohibridizasyon yöntemleri ve mutasyon
tarama tekniklerinde sa¤lanan geliflmeler sayesinde, biyopsi örneklerinden ekstrakte edilen DNA ve RNA’ da h›zl› ve tekrarlanabilir olarak yap›labilmektedir. Ancak detayl› genomik analizler için, dokunun bilefleni olarak hücreler
hem biyokimyasal ve fiziksel olarak çevrelerindeki di¤er
hücrelerden, hem de uzak kaynakl› stimuluslardan etkilendiklerinden, hedeflenen hücre(ler)in, bulundu¤u ortamdan izole edilerek tek tek incelenmesi gerek flart olmufltur.
Ço¤u moleküler test yönteminin de¤eri, test için kullan›lan
DNA, RNA ya da proteinin sadece hedef hücrelerden izole edilmifl, yani di¤er hücrelerin kontamine etmedi¤i pür
bir materyal olup olmay›fl› ile yak›ndan iliflkilidir. Lazer
yard›ml› mikrodiseksiyon (Lazer capture microdissectionLCM) biyopsi örneklerinden haz›rlanan kesitlerdeki/yaymalardaki hedef hücrelerin spesifik olarak ayr›mlanarak,
sonraki incelemelerde kullan›lmak üzere toplanmas›n›
sa¤layan bir yöntemdir.
TEKN‹K
Biyopsi örneklerinden haz›rlanan preparatlardan hücre diseksiyonu ve diseke edilen hücrelerin sonraki uyguGATA Haydarpafla E¤itim Hastanesi, Patoloji Servisi
lamalarda kullan›labilmesini sa¤layan birkaç teknik vard›r.
Bunlardan ilki, haz›rlanan örnekteki istenmeyen k›s›mlar›n ablasyonundan sonra lamda kalan k›sm›n mekanik
olarak toplanmas› esas›na dayan›r (1,2). Bu uygulamalarda kalan k›sm›n preparattan toplanmas› ifllemi kontaminasyon aç›s›ndan dikkatle yap›lmas› gereken ayr› bir mikromanüplasyondur. ‹kinci kategori yöntemler, uygun bir
araç (pipet, i¤ne, b›çak, vb) kullanarak, mikroskop alt›nda,
hedef alan›n manuel olarak diseksiyonu ve diseke edilen
hedefin toplanmas› esas›na dayan›r (1,3). Üçüncü kategori ise LCM tekni¤idir (5). LCM ilk olarak 1996 y›l›nda
Amerikan Ulusal Sa¤l›k Enstitüsünde gelifltirilmifltir. Bu
sistemde ›fl›k mikroskopik incelemelerin yap›labildi¤i bir
mikroskoba entegre edilmifl lazer ›fl›n›, mikroskop alan›nda belirlenen hedefe yönlendirilmektedir. Hedefin üzerine
yerlefltirilen polimer film, üzerine lazer ›fl›n› düfltü¤ü noktalarda hemen s›v›laflarak alt›ndaki hedef hücrelere yap›fl›p solid hale geçmektedir. Membran›n kesit yüzeyinden
kald›r›lmas› ile de hedef hücreler toplanm›fl olmaktad›r
(fiekil 1). Fonksiyonel bir dizayn ile integre edilen optik
mikroskop ve lazer ile yap›lan mikrodiseksiyon birçok
avantaj sa¤lamaktad›r. Rutin patolojik tan› için örneklenen
biyopsilere kolayl›kla uygulanabilmektedir. Örnekler rutin
doku ifllemleri ile haz›rlan›p, istenilen bir yöntemle boyanabilir. Gözlemci ›fl›k mikroskop büyütmelerini kullanarak
örne¤i inceleyebilir. Örnek içinde 1 m m’ye kadar küçük
çapta hedefler seçilebilir. Yani tek hücre diseksiyonundan
kompleks organel yap›lar›na kadar de¤iflik boyutlu mikroskopik hedefler diseke edilebilir (Resim 1). Seçilen alan
diseke edildikten sonra geride kalan doku ayn› ifllemde,
ya da baflka uygulamalarda kullan›labilir flekilde kal›r (Resim 1, ABC-II). Morfolojik korelasyon ifllem sonuna kadar
18 (3-4)
TÜRK PATOLOJ‹ DERG‹S‹
fiekil 1: Lazer yard›ml› mikrodiseksiyon tekni¤i
sa¤lan›r. Diseke edilen k›sm›n toplanmas› tek hamlede
membran›n doku yüzeyinden kald›r›lmas› ile yap›ld›¤›ndan, manuel toplama yap›lan yöntemlerde görülen kontaminasyon riski yoktur. Lazer membran› eritirken fotonik bir
reaksiyon olufltu¤undan ve termofilik bir membran kullan›ld›¤›ndan DNA, RNA ve proteine zarar verecek yükseklikte ›s› oluflmaz. Diseksiyon membran›ndaki hücreler
DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu için kullan›lacak tampon solüsyonlar›na kolayca kar›fl›rlar. Di¤er flartlarda
membrandan kolayca ayr›l›p kaybolmaz.
UYGULAMA
Sunulan örnek uygulamada, endometriyal lezyon
spektrumundaki lezyonlar›n arflivlenmifl parafin bloklar›
D‹SEKS‹YON ÖNCES‹
kullan›lm›flt›r. Bloklardan haz›rlanan 8 m m’lik kesitler, Hematoksilen Eozin yöntemi ile boyan›p lamel kapat›lmadan
özel bir optik düzelticiyle incelenmifltir. Hedeflenen gland
yap›lar›/hücreler LCM ile 1-20 m m çapl› lazer demetleri ard›fl›k k›sa peryotlarla (0,1-1 saniye) aktive edilerek diseke
edilmifltir (LCM-Arctrus, CA, USA) (Resim 1). Membrana
aktar›lan hücrelerden sonraki uygulamalarda kullan›lmak
üzere genomik DNA izolasyonu yap›lm›flt›r. ‹zole edilen
genomik DNA’n›n dansitesi ve püritesi saptanarak ihtiyaç
duyulan DNA miktar› için kaç adet gland/hücre diseksiyonu gerekece¤i optimize edilmifltir. Hedef hücrelerin say›s›n›n çok az (örne¤in 1-10 hücre) oldu¤u durumlarda izole
edilen genomik DNA, DOP-PCR (Degenerated Oligonucleotid Primed - Polimerase Chain Reaction) tekni¤i ile üniversal olarak amplifiye edlmifl, daha sonra hibridizasyon
D‹SEKS‹YON SONRASI
1
HEDEF HÜCRELER‹
2
3
A
Resim 1: LCM’un
parafin kesitlerde
uygulan›fl›
B
C
MOLEKÜLER ANAL‹ZLER ‹Ç‹N HÜCRE ÖRNEKLEMES‹NE BAfiLARKEN: LAZER YARDIMLI M‹KROD‹SEKS‹YON VE B‹R DOWN-STREAM UYGULAMASI
· 63
(The Turkish Journal of Pathology)
için kullan›lmak üzere nick translation tekni¤iyle green
spektrum floresanla iflaretlenmifltir (Resim 2).
SONUÇ
Sonuç olarak, amaca yönelik hedeflenmifl hücreleri
rutin sitolojik ve histolojik tan› örneklerinden selektif olarak
ayr›larak DNA, RNA ve protein hedefli moleküler analizlere yönlendirmek için kolay ve ideal bir yöntem olarak lazer
yard›ml› mikrodiseksiyon (LCM) yöntemini kullanabilmekteyiz.
KAYNAKLAR
1.
2.
Resim 2: LCM ile diseke edilen hücrelerden ekstrakte edilen genomik
DNa, DOP-PCR ile amplifiye edilmifl DNA’n›n (1), floresan ile
iflaretlenmesi (2), iflaretli DNA problar›n›n pürifikasyon için
filtrelenmesi (3), insitu hibridizasyon içih haz›r floresan iflaretli
DNA problar› (4)
3.
4.
Shibata D, Hawes D, Li ZH, Hernandez AM, Spruck CH and Nichols
PW. Specific genetic analysis of microscopic tissue after selective
ultraviolet radiation fractionation and the polymerase chain reaction.
Am J Pathol 1992; 141: 539-543.
Becker I, Becker KF, Rohrl MH, Minkus G, Schutze K, Hofler H.:
Single-cell mutation analysis of tumors from stained histologic slides.
Lab Invest; 1996 Dec;75(6):801-7.
Bohm M, Wieland I, Schutze K, Rubben H: Microbeam MOMeNT:
non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol 1997; 151: 63-67.
Bonner R F, Emmert-Bruck M, Cole K, Phoida T, Chuaqui R, Goldstein S, Liotta L A: Laser Capture Microdissection. Science 1997; 278:
998-1001