Metabolizmaya Dayalı Sayımlar 1

Metabolizmaya Dayalı Sayımlar 1
Velittin GÜRGÜN, A. Kadir HALKMAN
01. Genel Bilgiler
02. Redüktaz (İndirgeme) Testleri
02.01. Metilen Mavisi İndirgeme Testi
02.02. Resazurin İndirgeme Testi
02.03. Tetrazolyum Tuzlan indirgeme Testi
03. Kimyasal Yöntemler
04. Fiziksel Yöntemler
05. Metabolizmaya Dayalı Diğer Yöntemler
01. Genel Bilgiler
Mikroorganizmalar, gelişmeleri sırasında ortamda bulunan bazı maddeleri kullanarak yeni
ürünler meydana getirirler. Tüketilen ve/ veya meydana getirilen ürünlerin kantitatif olarak
ölçülmesi ile mikrobiyel gelişme hakkında bilgi edinilebilir. Bu ölçümler, basit olarak
gelişmenin olup olmadığını gösterebileceği gibi, ölçümlerin daha önce hazırlanmış standartlar
ile kıyaslanması sonucu dolaylı olarak mikroorganizma sayısı da belirlenebilir. Bu yaklaşım
ile metabolizmaya dayalı sayım yöntemlerinin aslında standarda dayalı yöntemler olduğu
görülecektir. Daha önce «standarda dayalı sayım yöntemleri bölümünde hücre sayısı artışının
ölçülmesi ile yapılan sayım yöntemleri açıklanmıştır. Bu bölümde ise metabolik aktivite
sonunda ortamda meydana gelen değişmelerin çeşitli şekillerde ölçülmesine dayalı sayım
yöntemleri verilecektir.
02. Redüktaz (İndirgeme) Testleri
Mikroorganizmalar, organik ve inorganik bileşiklerin biyokimyasal reaksiyonları ile enerji
elde ederler. Enerji kaynağı okside olurken bir başka bileşik redükte olur. Oksidasyon redüksüyon reaksiyonları olarak bilinen bu reaksiyonlar elektron transferinden ibarettir. Bir
bileşen elektron kaybettiğinde okside olur, buna karşın elektronu kabul eden bileşen ise
redükte olur. Oksijen bu reaksiyonlarda yer almayabilir.
Bileşenler, elektron verme eğilimlerine göre, Oksidasyon - redüksüyon potansiyellerinde
farklılık gösterirler. Oksidasyon - redüksüyon potansiyeli «redoks potansiyeli» olarak da
bilinir. Redoks potansiyeli bir potansiyometrede ölçülerek volt olarak belirlenir.
Redoks potansiyeli, potansiyometrik belirlemenin dışında, indikatör veya boyalar yardımı ile
de saptanabilir. Pek çok bileşiğin rengi okside ya da redükte olduğunda değişir.
Metabolizmasını sürdüren bir ortama böyle bir indikatör ilave edildiğinde, elektron transferi
nedeniyle bunun (dolayısıyla ortamın) rengi değişir.
1
"Mikrobiyolojide Sayım Yöntemleri; 2. Baskı. Prof. Dr. Velittin Gürgün, Doç. Dr. Kadir Halkman. 1990.
Gıda Teknolojisi Derneği Yayın no 7. Ankara" adlı kitaptan derlenmiştir.
1
İndikatörün veya boyanın renk değişimi, mikroorganizma kültürünün metabolik gücüne
bağlıdır. Kültürdeki hücre sayısı arttıkça, indikatör veya boya daha kısa süre içinde renk
değiştirir. Bir diğer deyiş ile redüksüyon süresi kültürdeki hücre sayısı ile ters orantılıdır. Bu
durumda redüksüyon süresi ortamdaki mikroorganizma sayısı hakkında bilgi verebilir.
Redüktaz Testleriyle Kültürel Sayım Yöntemlerinin Kıyaslanması
Redüktaz testleri genel olarak kültürel sayıma göre daha kısa, mikroskobik sayıma göre daha
uzun sürer. Bu testler ile bulunan mikroorganizma sayısı, kültürel sayım ile bulunandan farklı
olabilir. Bunun başlıca nedenleri;
a) zincir yapmış bakteriler bir koloni oluştururken, zincirdeki her bakteri metabolizmasını ayrı
olarak sürdürür, dolayısıyla redüktaz testleri ile daha yüksek sayı elde edilir.
b) Kültürdeki bazı mikroorganizmalar çeşitli hasarlar sonucu çoğalma ve dolayısı ile koloni
yapma özelliklerini kaybedebildikleri halde, metabolizmalarını sürdürme özelliklerini
koruyorlarsa, yine redüktaz testleri ile kültürel sayıma oranla daha yüksek sayım sonucu elde
edilir.
c) Bazı gıdalarda ise, redüksiyon yapan enzimler doğal olarak bulunabildiği için, bu tip
gıdalardaki mikroorganizma yükü, indirgeme yöntemiyle belirlendiğinde daha yüksek
değerler elde edilir,
d) Buna karşın gelişme ortamındaki bazı değişiklikler (pH, sıcaklık vs) metabolitik aktiviteyi
olumsuz yönde etkileyebildiği halde, koloni oluşmasında ve bunların sayılmasında etkili
olmayabilir. Bu durumda ise, redüktaz testi ile olduğundan daha az sayı elde edilir.
Çok sayıda oksidasyon - redüksüyon indikatörü varsa da, bunlardan en çok kullanılanları
metilen mavisi, resazurin ve tetrazolyum tuzlarıdır. Redüktaz testleri, yanlış olarak, boya
indirgeme yöntemleri adı ile de bilinirler. Bunun nedeni uygulamada en yaygın olarak
kullanılan yöntemin metilen mavisi indirgeme testi olmasıdır. Bununla beraber resazurin ve
tetrazolyum tuzları boya değildirler.
02.01. Metilen Mavisi İndirgeme Testi
Çiğ sütlerdeki mikrobiyel yükün belirlenmesinde çok kullanılan bir yöntemdir. Bakterilerin
redüktaz faaliyeti sonunda metilen mavisinin löko hale geçerek rengini kaybetmesi
(dekolorize olması) için geçen sürenin çizelge ile kıyaslanmasıyla materyaldeki mikrobiyel
yükün belirlenmesi, bu yöntemin prensibini oluşturur.
Metilen mavisinin indirgenme süresine göre sütteki tahmini bakteri sayısı.
İndirgenme süresi
20 dakikadan az
20 dakika - 2 saat
2 - 5 saat
5-10 saat
> 10 saat
Bakteri sayısı/ml
2,0x107 'den fazla
4,0X10 - 2,0X107
5,0X105 - 4,0X106
5,0x105 'den daha az
5,0x104' den daha az
Sütün niteliği
Çok kötü
Kötü
Orta
İyi
Çok iyi
Testin uygulanışında, 10 ml süt ile 1 ml stok metilen mavisi çözeltisi (50 ppm w/v) deney
tüpünde karıştırılır ve 37 °C' daki su banyosuna konulur. İnkübasyon sırasında tüp, 30 dakika
2
aralıklarla karıştırılarak sütteki yağın dağılması sağlanmalıdır. Aksi halde bakteriler yağın
içinde, yağ da tüpün üstünde toplanma eğilimi gösterdiğinden gerçek değerden daha uzun bir
indirgeme süresi elde edilir.
Metilen mavisi indirgeme testinde dekolorizasyon süresi üzerine etki eden başlıca faktörler
aşağıda özetlenmiştir.
-Metilen mavisi, bakteriler üzerinde gelişmeyi önleyici (inhibisyon) etki yapar. Bu etki boya
konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Dolayısıyla metilen mavisinin süt içindeki son
konsantrasyonu 5 ppm 'den fazla olursa indirgenme süresi normalden daha uzun olur.
-Metilen mavisinin inhibisyon etkisi karanlığa oranla ışıkta ve özellikle direk güneş ışığı
altında daha fazla olur.
-Sütte bulunan çeşitli bakterilerin redüktaz aktiviteleri farklıdır. Örneğin koliform grup
bakterilerin redüktaz aktiviteleri diğer bakterilere göre daha yüksektir. Bu durumda eğer sütte
koliform grup bakterilerin sayısı yüksek ise kısa bir dekolorizasyon süresi elde edilecek,
dolayısıyla olduğundan daha fazla sayıda bakteri tahmin edilecektir.
-Testten önce sütün tutulduğu sıcaklık derecesi, deneyin yapıldığı sıradaki ortam sıcaklığı,
metilen mavisi ilavesinden sonra materyal sıcaklığının 37 °C'a ulaşma süresi ve sütte bulunabilecek diğer inhibitör maddelerin varlığı gibi faktörler de süre üzerinde etkili olabilir.
Metilen mavisi indirgeme testi çiğ süt dışında, dondurma gibi süt ürünlerinde, ısıl işlem
görmüş gıdalarda ve kıymada mikrobiyel yükün belirlenmesinde kullanılabilir.
02.02. Resazurin İndirgeme Testi
Bu test çiğ sütlerin mikrobiyel kalitesini belirlemede metilen mavisi indirgeme testi yerine
kullanılabilmektedir.
Redüksiyon sırasında 2 temel renk değişimi olur. Bunlardan birincisi; başlangıçta mavi olan
rengin leylaktan açık pembeye kadar değişen farklı renklere dönüşmesidir. Bu aşamada
resazurinin indirgenmesi elektron transferinden değil phenoxazine çekirdeğindeki azota
gevşek bağlanmış oksijen atomunun kaybından ileri gelmektedir. Resazurinin pembe renkli
resorufine dönüşme reaksiyonu atmosferik oksijen tarafından geri döndürülemez. İkinci renk
değişiminde ise, pembe renk kaybolur ve dekolorizasyon görülür. Bu reaksiyon ise atmosferik
oksijen tarafından geri döndürülebilir.
Çiğ sütlerdeki mikrobiyel yükün belirlenmesi amacıyla 10 ml süte % 0,05 konsantrasyondaki
resazurin çözeltisinden 0,1 ml ilave edilip karıştırılır ve 37 °C 'da su banyosunda inkübasyona
bırakılır. Bu testte dekolorizasyon için gerekli süre değil, 1 saat içinde olan renk değişimi esas
alınır. Buna göre mavi renk çok iyi, menekşe - pembe renk iyi, pembe renk orta, açık pembe
renk kötü ve beyaz renk çok kötü sütleri göstermektedir. Renk değişimi gözle izlenebileceği
gibi, standart renkleri içeren Lovibond komperatörü ile de kıyaslanabilir.
Resazurin indirgeme testi; sıvı ve kurutulmuş yumurta, dondurulmuş et, dondurulmuş
sebzeler ve taze kümes hayvanları eti gibi gıdaların da mikrobiyel yüklerini ve/veya
kalitelerini saptamak için kullanılabilir.
#
##
3
02.03. Tetrazolyum Tuzları indirgeme Testi
Gıda analizlerinde, çeşitli tetrazolyum tuzları arasında, bakterilere diğerlerine oranla daha az
toksik etki yaptığı için, 2,3,5 trifenil tetrazolyum klorür (TTC) kullanılmaktadır. TTC okside
durumunda iken renksiz olmasına karşın redükte olduğunda (formazan) yoğun pembe
pigmentler oluşturur.
TTC redüksüyon testi, pastörize süt ve kremanın depolama ömrünün tahmin edilmesinde
kullanılır. Benzer şekilde, yüzey kontaminasyonu TTC çözeltisinin püskürtülmesi ile
belirlenebilir. TTC püskürtülen yüzeylerde bakteri bulunan bölgeler pembe pigmentlerin
oluşumu ile anlaşılır.
03. Kimyasal Yöntemler
Gıdalar, biyokimyasal değişmelere uğrayabilecek pek çok kimyasal bileşenden oluşmuşlardır.
Gıdalarda bulunan çeşitli kimyasal bileşenler, gıdanın cinsi, mikroorganizmaların varlığı ve
reaksiyonlar sonunda meydana gelen ürünlerin cinsine göre arzu edilen veya edilmeyen
biyokimyasal değişmelere uğrarlar.
Gıdalarda meydana gelen temel değişmeler enzimler tarafından katalize edilir. Bu enzimler
gıdada doğal olarak bulunan doku enzimleri olabileceği gibi, mikroorganizmalar tarafından da
oluşturulabilirler. Burada görülen metabolik aktivitenin derecesi mikroorganizma sayısı
hakkında bilgi verebilir.
Meydana gelen metabolik ürünlerin cinsi ve miktarı; gıdanın cinsi (protein, karbohidrat, yağ),
mikroorganizmanın cinsi (proteolitik, sakkarolitik, lipolitik), oksijen varlığı, sıcaklık ve
gıdada bulunabilecek inhibitörlerin varlığına bağlıdır.
Bir kimyasal madde veya bileşiğin gıdadaki mikroorganizma varlığını göstermesi için belirli
kriterlere sahip olması gerekir. Bu kriterlere göre indikatör olarak kullanılacak kimyasal
madde; a) sağlam gıda maddesinde hiç bulunmamalı ya da çok az olmalı, b) gıda maddesinde
bozukluğa neden olan mikroflora tarafından meydana getirilmiş olmalı, c) hatalı pozitif sonuç
alınmayacak şekilde basit ve çabuk bir şekilde kantitatif olarak belirlenebilmeli, d) gıda üzerinde yarayışlı bir fonksiyonu bulunmamalı ve e) düşük kalite ile düşük işleme teknolojisini
birbirinden ayırmaya elverişli olmalıdır.
Bu yapı altında gıdalardaki mikrobiyel yükün belirlenebilmesi için kullanılabilecek başlıca
kimyasal maddeler; amonyak, trimetil amin, dımetil amin, toplam uçucu asitler, serbest yağ
asitleri, suda çözünmeyen asitler (oleik, palmitik), organik asitler (laktik, pürivik, süksinik),
indol, etil alkol, furfurol, hidrojen sülfit, toplam indirgen maddeler, uçucu indirgen maddeler,
histamin, diasetil ve asetil metil karbinoldür.
Bununla beraber, bu maddelerden hiç birisi tüm gıdalardaki mikroorganizma sayısını
belirlemek amacıyla yeteri kadar başarı ile kullanılamazlar. Genel olarak, toplam uçucu asitler
ve toplam indirgen maddeler gibi kimyasal maddeler grubunun belirlenmesi; amonyak, indol,
alkol gibi tek bir maddenin belirlenmesine oranla mikrobiyel yük hakkında daha doğru sonuç
verirler.
4
Kimyasal indikatörlerin tayini ile mikroorganizma sayısını belirlemede önemli bir sorun, bu
indikatörlerin pek çoğunun, zaman içinde miktarlarında önemli değişiklikler meydana
gelebilmesidir.
Gaz ya da gaz-likit kromatografisi, bakteri türlerine göre değişik cins ve miktarlarda
oluşturulan metabolik ürünlerin kantitatif ayrımında kullanılmakta, böylece materyaldeki
mikroorganizma sayısı belirlenebilmektedir.
CO2 Üretiminin Ölçülmesi
Mikroorganizmalar metabolizmaları sırasında oksijen tüketir ve metabolik ürün olarak CO2
meydana getirirler. CO2 üretiminin belirlenmesinde kullanılan bir yöntem 14C ile markalanmış
glikozdan üretilen 14CO2'in radyoaktivitesinin ölçülmesidir.
14
CO2'in belirlenme süresi ile orijinal inokulumün logaritması orantılıdır. Radyoaktif CO2
tayin yöntemi, sularda koliform grup bakterilerin, biftekteki ve portakal suyundaki
bakterilerin belirlenmesi, kan örneklerinin ve sıvı gıdaların mikrobiyel analizi için
kullanılabilir.
04. Fiziksel Yöntemler
Mikrobiyel metabolizma sonucu ortaya çıkan değişiklikler, fiziksel analiz yöntemleri ile de
belirlenebilir. Bu yöntemler ile genel olarak kaba tahminler elde edilebilir.
Sıvı yumurtalardaki fluoresans, bazı bakterilerin gelişmesi ile ilgilidir. Örneğin pyoverdin,
Pseudomanas bakterileri tarafından oluşturulan bir fluoresant pigmenttir ve dondurulmuş
yumurta ve tavuk karkasında saptanabilir.
Proteinlerin parçalanma ürünleri olarak amonyak ve amin gibi bazı temel bileşenler meydana
gelirken, pH yükselir. Buna karşın karbohidratlar fermente olduğunda, pH düşer. Genel olarak
hiç bozulmamış (taze) bir gıdanın pH'sı ile, aynı gıdada fark edilebilecek bozukluğun
meydana geldiği anda 0,3 - 0,5 pH birimini geçmeyecek kadar bir pH farkı oluşur. pH
değişiminin belirlenmesi ile de mikrobiyel yük hakkında bilgi edinilebilir. Belirli koşullar
altında saf halde üretilen bazı mikroorganizmalar için pH değişiminin belirlenmesi veya,
fermenterde üretim sırasında nötralizasyonda kullanılan alkalinin tüketim miktarının
ölçülmesiyle mikroorganizma sayısı tahmin edilebilir.
Proteinlerin su tutma kapasiteleri pH ile ilgilidir. Bazı gıdalarda mikrobiyel sayı ile
proteinlerin su tutma kapasitesi arasındaki ilgi üzerinde pek çok çalışmalar yapılmaktadır.
Örneğin et bozulurken yani mikroorganizma sayısı artarken, pH da değişeceği için, bıraktığı
su miktarında da artış olur.
Küçük ısı değişmelerinin ölçülmesi tekniği anlamına gelen mikrokalorimetri bakteriyel
gelişmenin kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmesinde ve hatta identifikasyonda
kullanılabilir. Yöntemin esası, tüm mikroorganizmaların metabolik aktivitelerinin sonucu
olarak ısı üretmeleri ve belirli üretme koşullarında meydana getirdikleri ısının sabit olmasıdır.
Meydana gelen ısı artışı; fermenterlerdeki sıcaklığın doğrudan ölçülmesi ve/veya fermenter
soğutma suyundaki sıcaklık değişmesinin ölçülmesi gibi yöntemlerle belirlenebilir.
5
05. Metabolizmaya Dayalı Diğer Yöntemler
Gram negatif (G-) bakterilerin meydana getirdiği endotoksinler, limulus amebosit lizatı ile jel
meydana getirirler. Bu jelin analizi ile çeşitli gıdalardaki Gram negatif bakterilerin sayısının
belirlenmesi üzerinde çalışmalar yapılmaktadır.
Mikroorganizmaların metabolik aktivitelerinin gelişme ortamında yapmış olduğu değişiklik
elektriksel sistemler ile ölçülebilir. Bu yöntem dondurulmuş gıdalardaki mikroorganizma
sayısının tahmininde kullanılabilir.
6