Herbisitlere Dayanıklı Bitkilerin Geliştirilmesi

HERBİSİTLERE DAYANIKLI
TRANSGENİK BİTKİLERİN
GELİŞTİRİLMESİ
ÖZGE ÇELİK
HALİÇ ÜNİVERSİTESİ
MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK
BÖLÜMÜ
Kültür bitkilerinde
• Hastalık
• Hayvansal zararlılar gibi çeşitli etmenlerin
meydana getirdiği ürün kayıpları ele alındığında yabancı
otların
etkisinin
en
yüksek
seviyede
olduğu
gözlenmektedir.
Dünya bazında yabancı ot ve hastalık etmenlerinin
oluşturduğu kayıplar (milyon ton)
Ürün çeşidi
Elde edilen
ürün
Yabancı ot
kayıpları
Hastalık
kayıpları
Hububat
433.903
54.349
50.589
Sebzeler
201.691
23.718
31.137
Meyveler
66.567
2.462
12.825
Bağlar
50.697
7.909
16.937
Başlıca amaç, yabancı otların oluşturdukları olumsuz etkileri ekonomik zarar
seviyesinin altında tutmaktır.
Yabancı ot mücadelesinde kulanılan başlıca yöntemler
• Mekanik savaş yöntemleri: Çapalama, elle yolma, toprak işleme
ve su altında bırakma
• Fiziksel savaş yöntemleri: Isı ve ışınlardan yararlanma
• Biyolojik savaş yöntemleri: Bir canlı populasyonunu, bakteriler,
böcekler, balıklar ve mantarlar gibi diğer canlı organizmalar
aracılığıyla azaltmak için kullanılan yöntemler
• Kimyasal savaş yöntemleri: Sentetik veya doğal yabancı ot
öldürücüler (herbisitler) kullanılarak yürütülen mücadele yöntemleri
Herbisit olarak kullanılan bir kimyasalın ticari açıdan herbisit
olarak nitelendirilebilmesi için şu faktörler göz önünde
bulundurulmalıdır.
• Geniş bir yabancı ot populasyonuna karşı etkin olması
• Kültür bitkisine, memelilere ve omurgasız canlılara karşı toksik etki
göstermemesi
• Toprakta kalıcılığının kısa olması
• Üretim maliyetinin düşük olması
Herbisitler, hedef olan bitkiye zarar verdiklerinden dolayı, bitki üzerinden
beslenen ve barınan tün canlıları olumsuz etkilemektedirler.
Herbisitler genellikle bitkilere özgün biyokimyasal yoları etkilerler (örn:
fotosentez aktivitesi).
Bunun dışında değişik etki mekanizmaları olan farklı grup herbisitler
mevcuttur.
Herbisitlerin Etken Maddeleri ve Etki Mekanizmaları
Etkili Madde
Etkilediği Sistem
Hedef Protein
Sulfonilurea
Alifatik aminoasit sentezi
Asetolaktat sentaz
Imidazolinon
Alifatik aminoasit sentezi
Asetolaktat sentaz
Gliosat
Aromatik aminoasit sentezi
5-enolpürivil-şikimat-3fosfat sentaz (EPSPS)
Phosfinotrisin (PPT)
Glutamin sentezi
Glutamin sentaz
Triazin
Fotosistem II
QB proteini
Bromoxinil
Fotosistem III
QB proteini
Bipiridilumlar
Fotosistem I
Ferrodoksin
Fenoksiasetik
asitler (2,4-D)
?
?
Dinitroanilinler
Hücre bölünmesi
Tübülin
Bipiridilumlar,
paraquat, diquat
Fotosistem I
Elektron transfer sistemi
Kullanılan herbisitin yabancı otlara maksimum zararı verirken, kültür
bitkisini ise minimum seviyede etkilemesi istenmektedir.
Kültür bitkilerine herbisitlere karşı dayanıklılık kazandırılması
yönünde yapılan çalışmalarda başlıca 3 değişik strateji
izlenilmektedir.
1)Hedef molekülün modifikasyonu
2)Hedef molekülün fazla üretimi
3)Etken maddenin detoksifikasyonu
İlk ikisinde herbisitin etkilediği hedef molekülün aktif
maddeden korunmasına yönelik olup, son stratejide ise aktif
maddenin farklı bir bileşiğe çevrilerek etkenliğinin ortadan
kaldırılması amaçlanmaktadır.
Hedef Molekülün Modifikasyonu
Hedef genin kültür bitkisinden izolasyonu
Hedef genin maniplasyonu
Maniplasyonu yapılan genin, gen aktarım vektörlerine
klonlanması
Vektör aracılığıyla hedef genin bitki hücrelerine aktarımı
Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi
HEDEF MOLEKÜLÜN FAZLA ÜRETİMİ
Herbisite dayanıklı organizmanın belirlenmesi
Hedef genin bu organizmadan izolasyonu
Hedef genin gen aktarım vektörlerine klonlanması
Vektör aracılığıyla hedef genin bitki hücrelerine aktarımı
Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi
Bu strateji kullanılarak
ALS genleri ile sulfonilurea tipi herbisitlere dayanıklı transgenik bitkiler
geliştirilerek tarla denemeleri yapılmıştır (Brande ve Miki, 1993).
Aynı strateji fotosistem II QB proteinini etkileyen triazin tipi herbisitler için de
uygulanmıştır.
Triazine dayanıklı yabancı otlardan ve syanobakterilerden izole edilen psbA
geni tütüne aktarılarak atrazine dayanıklı bitkiler elde edilmiştir (Smeda ve
ark., 193).
Farklı bir uygulama, memelilerde ilaçları metabolize eden P450
monooksigenaz enziminin sentezinden sorumlu genin tütüne aktarılması
ile herbisite dayanıklılık kazandırılmasıdır.
Son uygulanan strateji ise hedef molekülün yapısı, aktarılan sentetik
RNA/DNA molekülleri ile değiştirilmektedir.
Bu strateji kullanılarak immidazolün bazlı herbisitlere dayanıklı transgenik
mısır bitkileri geliştirilmiştir.
İkinci stratejide, bitkilerdeki hedef molekül bazı genetik
maniplasyonlar sonucu daha fazla üretilmektedir. Böylece, herbisit
aktif maddesinin varlığında bile hedef molekülün sorumlu olduğu
hücresel fonksiyonlar yerine getirilebilmektedir.
• Bu yöntemle petunyada yapılan çalışmada EPSPS aktivitesi 20 kez
arttırılarak glifosata tolerans sağlanmıştır.
• Darıdan izole edilen EPSPS geni buğdaya aktarılarak elde edilen
kallus dokusunun glifosata dayanıklılık gösterdiği bildirilmiştir.
Son strateji ise, bitkiye herbisitin aktif maddesini detoksifiye eden yeni
bir enzim sentezlettirilmesidir.
Bu amaçla, detoksifikasyon yapan enzimin sentezinden sorumlu gen
bitkilere aktarılmakta, bu sayede de herbisitin aktif maddesi hedef
molekülü etkileyemeyen bir bileşiğe çevrilmekte, dolayısıyla molekül de
herbisitin varlığında bile normal hücresel işlevini yürütebilmektedir.
Bitkilere 2,4-D detoksifikasyonunu mümkün kılan bakteri orijinli
monooksigenaz enzimi sentezlettirilerek bu herbisite dayanıklı tütün ve
pamuk bitkileri geliştirilmiştir (Lyon ve ark., 1989).
Gram pozitif toprak bakterileri olan Streptomyces hyproscopicus ve
Strepromyces viridochromogenos suşları fosfonotrisil-alanil-alanin
yapısında bir tripeptid üretir.
Bu bileşik Bialafos adında bir antibiyotiktir.
Bialafos, hücre içinde peptidaz aktivitesi ile hidrolizi sonucu ortaya çıkan
fosfinotrisin (PPT), glutamin aminoasidinin bir analoğu olup aminoasit
biyosentezinde rol alan glutamin sentetaz (GS) enziminin rakip
inhibitörüdür.
PPT, bakteri, bitki ve hayvan hücrelerinde GS enzimlerini inhibe edebilir
ve bu nedenle etkili bir herbisit olarak kullanılmaktadır.
GS enzimi, glutamik asit ile amonyumun tepkimeye girerek glutamini
oluşturduğu tepkimeyi katalizleyen bir enzimdir.
Bitkilerde GS enzimi, nitratın indirgenmesi, aminoasit degradasyonu ve
fotorespirasyon sonucu ortaya çıkan NH4*nın asimilasyonunu sağlayan
tek enzimdir
GS aktivitesi durduğunda hücrelerde NH4* birikimi gözlenmekte ve bu
da hücrelerde dolayısıyla bitki üzerinde kısa sürede ölümcül etki
yapmaktadır.
PPT, toprak bakterileri tarafından metabolize edilebildiğinden çevrede
yaratabileceği toksik etkiler minimal seviyede kalmaktadır.
PPT’ye DAYANIKLI TRANSGENİK BİTKİ GELİŞTİRİLMESİ
PPT’nin kontrakt etkili total herbisit olması, yani seçiciliğinin olmaması
yaygın olarak kullanımını etkileyen en önemli faktördür. Bu nedenle
PPT’ye dayanıklılık gösteren kültür bitkilerinin geliştirilmesi yönünde
birçok çalışma gösterir.
1)GS enziminin miktarının arttırılması
2)PPT’nin hücre içindeki detoksifikasyonunun sağlanması
Bialafos,
Streptomyces
hyproscopicus
ve
Strepromyces
viridochromogenos suşları tarafından üretilmektedir. Bu suşlarda,
PPT’nin biyokimyasal sentez yolları detaylı olarak incelenmiştir.
Biyosentezin 10. kademesindeki enzim, hem biyosentezin devamını
sağlamakta hem de PPT’yi asetilasyon youyla etkisiz hale getirmektedir.
Bu suşlar kendilerini ürettikleri antibiyotiğin öldürücü etkisinden
korunmak amacıyla PPT detoksifikasyonunu mümkün kılan fosfinotrisin
–N-asetiltransferaz (PAT) enzimini sentezlenmektedir.
PAT enziminin sentezinden sorumlu olan bar ve pat genleri sırası S.
hyperuscipicus ve S. nhardocchromogenes suşlarından izole ve
karakterize edilmişlerdir.
Her 2 gen aminoasit dizileri açısından %85, nükleotid dizileri seviyesinde
ise %87 homoloji göstermekte, 183 aminoasitlik proteinler sentezlemekte
ve PPT’yi asetile edebilmektedirler.
Bar geninden sentezlenen PAT enzimi, 22-23 kDa ağırlığında bir
enzimdir.
GEN AKTARIM ÇALIŞMALARI
PPT’ye dayanıklı transgenik bitki eldesinde pat
karşılaştırıldığında bar geni daha çok çalışma yapılmaktadır.
geni
ile
Hedef bitkilere bar geni aktarılmakta ve üretilen transgenik çeşitler
PPT’yi detoksifiye eden BAR enzimini sentezleyebildiklerinden dolayı,
herbisite maruz kaldıklarında PPT’den etkilenmemektedirler.
Bugüne kadar PPT’ye dayanıklı tütün, domates, patates, şeker pancarı,
buğday, A.thaliana, çeltik, mısır, arpa, bezelye ve karanfil elde edilmiştir.
Farklı gen aktarım yöntemleri kullanılmakta ve farklı promotör ve
terminatör bölgeleri kullanılmıştır.
Genellikle kullanılan promotörler, karnabahar mozaik virüsü 35S sentezini
kontrol eden promotördür.