DNA Dizileme (Sekanslama)

T.C
GIDA TARIM VE HAYVANCILIK BAKANLIĞI
PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ
DNA Dizileme
(Sekanslama)
Dr. Eray ATIL
Vet. Hekim, Mikrobiyolog
Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü
Eğitim Bilgileri

Eğitim süresi
◦ 3 ay

Başlangıç Tarihi
◦ 08 Aralık 2013

Bitiş Tarihi
◦ 7 Mart 2014

Ülke
◦ İngiltere

Yer
◦ Leicester University

Bölüm
◦ Infection, Immunity and
Inflammation

Danışman
◦ Dr. Ahmet Yeşilkaya
2
PENDİK VETERİNER KONTROL
ENSTİTÜSÜ



Moleküler Genetik
Laboratuvarı
Kuruluş yılı : 2011
ABI Sistem
◦ ABI 3130 XL Genetik
Analizör

DNA Sekanslama
3
DNA Çeşitliliğinin Analiz
Edilmesinde Kullanılan Metotlar


Restriksiyon Enzimleri
PCR-RFLP
◦ (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism)

RAPD
◦ (Randomly Amplified Polymorphic DNAs)

AFLP
◦ (Amplified Fragment Lenght
Polymorphism)

VNTR
◦ (Variable Number Tandem Repeats)


DNA Dizileme
SNP
◦ (Single Nucletide Polymorphism)
…ACGTGACTGAGGACCGTG
CGACTGAGACTGACTGGGT
CTAGCTAGACTACGTTTTA
TATATATATACGTCGTCGT
ACTGATGACTAGATTACAG
ACTGATTTAGATACCTGAC
TGATTTTAAAAAAATATT…
4
DNA Dizileme Metotları



-
Sanger Metodu
Maxam&Gilbert metodu
True single molecule sequencing, Strand
sequencing ve diğer metotlar
Metodun Prensibi
- Enzimatik bir metod
- ddNTP lerin rastgele
DNA zincirine
bağlanmasına dayalıdır.
- DNA polimeraz ve primer
gerektirir.
- Jel elktroforez ya da
kapillar elektroforez
gerektirir
1980 Nobel Ödülü
5
Standart Dizileme Prosedürü (Sanger)
1)DNA tek zincir olarak hazırlanır
2)Karışım 4 normal deoksinükleotid içerir
(dGTP, dATP, dTTP, dCTP)
3)Aynı karışım 4 dideoksinükleotid herbiri
farklı floresan ile etiketlenmiş)
(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP)
4) DNA polimeraz
5)Buffer
6
DNA Dizileme Tipleri
Tek yönlü okuma
Çift yönlü okuma
Ters tek yönlü zincir okuma
7
Yeni Nesil DNA Dizileme Sistemleri
8
DNA Dizileme Kullanım Alanları










Genom haritalarının çıkarılması
Bireysel genotipin tanımlanması
DNA Polimorfizminin tespit edilmesi
Genetik çeşitlilik çalışmaları
Filogenetik çalışmalar
Ebeveyn ve akrabaların tespiti
Kantitatif özellikteki gen lokuslarının
saptanması
Hastalık ve genetik bozuklukların teşhisi
Adli tıp çalışmaları
Moleküler arkeoloji
9
DNA Dizileme (Şimdiye kadar yapıalanlar)
•
Viruslar
•
•
Bakteriler
•
•
2289 (Haemophilus influenza, 1.8 x 106
nt – 1995)
Ökaryotlar
•
•
3222 (Bacteriophage phi X 174, 5386
nt – 1977)
68 (S. cerevisiae 1.2 x 107 nt – 1995; H.
sapiens, 3 x 109 nt -2001)
Archaea
•
152 (Methanococcus jannaschi , 1.7 x
106 nt – 1996)
10
Moleküler Biyolojinin Temel Prensibi
James Watson’a göre
DNA
RNA
Protein
Elimizde genomik DNA varsa, dizinin ait olduğu tür hakkında bütün
bilgiye sahip olmalı mıyız ?
11
Filogenetik: Evrimsel
geçmiş
Evrimsel geçmiş
 Mutasyonlar
 Moleküler saat
 Kullanıldığı alanlar
◦ Genler arası etkileşim çalışmaları
◦ İlaçların dizaynı
◦ Aşı çalışmalarında suş değişilikliğinde
◦ Genetik ve bulaşıcı hastalıkların epidemiyolojisi
◦ Yeni genlerin tespiti

12
Filogenetik İlişki Ağaçları
64
62

Root
◦

◦
51

Node
◦

A/chicken/Turkey/Ipsala/563/2008
AM911090-Slovenia-06
DQ407519/Turkey/05
36
99
50
EF446771/Hungary/07
EF446779/Hungary/07
96
DQ323672/Russia/05
44
DQ449632/Russia/05
EF619990/Turkey/06
50
A/chicken/Turkey/Misinli ist582/2006
95
Mevcut ya da kaybolmuş türü işaret
eden birimdir.
65
A/chicken/Turkey/Hilvan ist271/2005
47 DQ434889/Russia/05
56
DQ449640/Russia/05
92
A/chicken/Turkey/Goncaaydin ist982/2006
A/chicken/Turkey/B.Cekmece ist980/2006
43
Ortak ataları olan her iki soydan birisi.
A/chicken/Turkey/Silivri ist962/2006
83
DQ358746/Russia/05
92

Distance scale
◦

Organizma ya da diziler arası farkları
temsil eden birimdir.
AM492165/Germany/06
79
DQ095617/Qinghai/05
A/bird/Turkey/Unye ist06/2006
78
A/seagull/Turkey/Cayeli ist04/2006
96
62
Topology
50
EF362418/India/06
EF362426/India/06
DQ864715/Russia/06
38
◦
EF619980/Turkey/05
A/chicken/Turkey/Sirapinar ist706/2006
Clade
◦
AM911100/Slovenia/06
58
Soy ve atasal ilişkiyi gösterir.
Mevcut dalda meydana gelen
değişiklikleri gösterir.
A/chicken/Turkey/Taflan ist15/2006
A/chicken/Turkey/Esetce ist986/2006
49
Bütün soy için ortak ata
Branch lenght
A/chicken/Turkey/Enez ist929/2006
59
94

EU443551/Czech Republic/06
52
Branch
◦
AM911076 /Slovakia/06
Ağacın dallanma biçimi
82
76
A/chicken/Turkey/Baklali ist955/2006
DQ864720/Russia/06
0.001
13
Filogenetik Network Analizi

Filogenetik ağaçlar
evrimsel model için
uygun olmadığında,

Kompleks evrimsel
biçimlerin görsel hale
getirilmesinde

Verilerin derinlemesine
incelenmesinde
kullanılır.
A phylogenetic network. The network was generated by Neighbor-Net for a
sequence-based data set comprising of Salmonella isolates.
Bryant et al. Algorithms for Molecular Biology 2007 2:8 doi:10.1186/1748-7188-2-8
14
Filogenetik Analiz Yaparken Kabul
Edilen Varsayımlar





Nükleotid dizisi hata içermemektedir.
Analizde kullanılan diziler homologdur.
Ortak evrimsel ilişkiye sahiptir.
Nükleotid dizileri arasındaki farklılıklar daha
büyük bir grubun temsilcisidir.
Her bir nükleotid için 4 olasılık vardır, Bir
nükleotidin diğer 3 nükleotide değişme olasılığı
eşittir(Jukes Cantor)
15
Dizi Analizi Gerekli Araçlar

Bioedit
◦ Dizilerin hizalanması, BLAST araştırması, plasmid çizimi, RE site haritalandırması,
ABI ve Beckman chromatogram dosyalarının görselleştirilmesi için kullanılır.
◦ http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

ChromasPro
◦ ABI ve Beckman kromatogram dosyalarının görselleştirilmesi, çoklu
kromatogram dosyalarının açılması hizalanması, enzim kesimi haritalandırılması,
ABI Genescan dosyalarının gösterilmesi için kullanılabilir.
◦ http://technelysium.com.au/?page_id=27

ClustalW2
◦ Çoklu dizilerin hizalanması için kullanılır.
◦ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
16
Moleküler evrim ve filogenetik
analiz için gerekli araçlar
◦ DnaSP
 Populasyon içi ve dışı dizi farklılaşması ve diğer populasyon
istatistiklerinin hesaplanmasında kullanılır.
 http://www.ub.edu/dnasp/
◦ MEGA
 Otomatik veya manuel dizi hizalaması, filogenetik ağaçlardan sonuç çıkarılması, web
tabanlı veritabanlarında araştırma yapmak, moleküler evrim ve evrimsel hipotezleri test
etmek için kullanılır.
 http://www.megasoftware.net/
◦ NETWORK
 DNA dizisi, STR, RFLP ve aminoasit verileri ile filogenetik ilişki örgüsü (median-joining
network) yapabilmek için kullanılır
 http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm
◦ SplitsTree4
 Dizi verilerinden evrimsel ilişki örgüsü yapar. (Alignment, distance ve ağaç setleri giriş
değeri olarak kullanılarak, split decomposition, neighbor-net, consensus network …
metotları ile çalışılabilir.
 http://www.splitstree.org/
17
Yardımcı Programlar


BLAST
◦ Dizileri arasındaki benzer bölgeleri tespit etmek,
benzerlikleri istatistiksel olarak hesaplamak, elde
edilen DNA veya protein dizilerini başka kaynaklarla
araştırmak için kullanılır.
◦ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
TreeView
◦ Yeniden Yapılandırılan filogenetik ağaçları
görselleştirmek için kullanılır.
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html
18
Teşekkür Ederim
İletişim:
Batı Mahallesi Erol Kaya Cad. No:1 34890, Pendik/İSTANBUL
Telefon: 0 216 390 12 80, Fax: 0 216 354 76 92
E-posta : [email protected]
19