proje sonuç raporu yazımında - İzmir Kâtip Çelebi Üniversitesi

T.C.
İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ
KOORDİNASYON BİRİMİ
Karadeniz Kıyılarında Dağılım Gösteren Pomatoschistus (Gobiidae,
Cuvier, 1816) Cinsine ait Türlerin Moleküler Filogenisi
Proje No: 2014-1-ÖDÜL-40
Proje Türü
Üniversite Dışı Proje Ödülü
SONUÇ RAPORU
Proje Yürütücüsü:
Prof. Dr. Semih ENGİN
Su Ürünleri Fakültesi/Temel Bilimler Bölümü
Doç. Dr. Yusuf Bektaş
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi/Temel Bilimler
Bölümü
Yrd. Doç. Dr. Erhan Irmak
Su Ürünleri Fakültesi/ Temel Bilimler Bölümü
Dilruba Seyhan
Su Ürünleri Fakültesi/ Temel Bilimler Bölümü
Tolga Akdemir
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi Teknik Bilimler MYO / Motorlu Araçlar ve
Ulaştırma Teknolojileri Bölümü
Arif Can Keskin
Su Ürünleri Fakültesi/ Temel Bilimler Bölümü
Mayıs 2016
İZMİR
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
ÖZET……………………………………………………………………………………..
1
ABSTRACT……………………………………………………………………………...
2
1. GİRİŞ………………………………………………………………………………….
3
2. GEREÇ VE YÖNTEM………………………………………………………………..
5
2.1. Örnekleme İstasyonları ve Yöntemi………………………………………………..
5
2.2. DNA İzolasyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu……………………………………
5
2.3. Filogenetik Analizler……………………………………………………………….
7
3. BULGULAR…………………………………………………………………………..
9
4. TARTIŞMA SONUÇ…………………………………………………………………
15
5. REFERANSLAR……………………………………………………………………..
17
6.EKLER………………………………………………………………………………...
20
TABLOLAR DİZİNİ
Sayfa No
Tablo 1. Çalışmada kullanılan dizin analizi primerleri………………………………….
6
Tablo 2. Referans türlere ait dizilerin BOLD erişim numaraları………………………..
9
Tablo 3. Tür içi genetik farklılıklar ……………………………………………………..
10
Tablo 4. Tür-içi, türler-arası ve familya içi genetik uzaklıklar………………………….
11
Tablo 5. Türler arasındaki ikili dizin farklılığı değerleri ………………………………..
13
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa No
Şekil 1. Agaroz jel elektroforezi…………………………………………………………
6
Şekil 2. Agaroz jel elektroforezinde DNA ve PCR ürünlerinin kontrolü……………….
7
Şekil 3. Agaroz jel elektroforezinde PCR ürününün kontrolü………………………….
8
Şekil 4. Pomatoschistus ve Knipowitchia türlerine ait COI geni dizileri arasındaki
ilişkiyi gösteren NJ metoduyla oluşturulan filogenetik ağaç……………………………
12
Şekil 5. Pomatoschistus ve Knipowitchia türlerine ait COI geni dizileri arasındaki
ilişkiyi gösteren ML metoduyla oluşturulan filogenetik ağaç…………………………....
14
ÖZET
Bu çalışmada, Karadeniz’de dağılım gösteren kum kayabalığı popülasyonlarının genetik
tanımlanması hedeflenerek Karadeniz, Marmara ve Ege denizi kıyılarımızda yayılış gösteren
Pomatoschistus genusuna ait türlerin filogenetik özellikleri ortaya konulmuştur.
Ülkemiz Karadeniz kıyılarından (Sinop, Rize, Amasra istasyonlarından), Marmara denizi
kıyılarından (Erdek ve Saros Körfezi istasyonlarından) ve Ege denizi kıyılarımızdan (Dikili
istasyonundan) kum kayabalığı türleri SCUBA dalış yöntemiyle örneklenmiştir. Tür
tanımlanmasında önem arz eden morfolojik, habitat ve davranışsal özellikleri dikkate alınarak
gruplanan örnekler DNA barkodlama yöntemi ile moleküler tanımlanmaları yapılmıştır.
DNA barkodlama çalışmalarından elde edilen veriler yardımıyla filogenetik ilişkiler
belirlenmiştir. Buna göre ülkemiz Karadeniz kıyılarında, Pomatoschistus marmoratus türü ile
ülkemiz Karadeniz kıyılarında daha önce varlığı bildirilmemiş olan P. bathi türünün dağılımı
belirlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Gobiidae, Pomatoschistus, Pomatoschistus bathi, Pomatoschistus
marmoratus, DNA barcoding, filogenetik
1
ABSTRACT
In this study, it is aimed to reveal accurate molecular identification of sand gobies distributed
in the Southern Coasts of Black Sea. Due to this, phylogenetic relationships of
Pomatoschistus species which are distributed in Black Sea, Sea of Marmara and Aegean Sea
are studied. Samples are collected from Black Sea (Sinop, Rize, Amasra), Sea of Marmara
(Saros Gulf, Erdek) and Aegean Sea (Dikili) by SCUBA diving. Morphological differences,
habitat and behaviour features were considered and molecular identification has done by DNA
Barcoding.
As a results of the analysis, occurrence of Pomatoschistus bathi in the Black Sea is revealed.
Key words: Gobiidae, Pomatoschistus, Pomatoschistus bathi, Pomatoschistus marmoratus,
DNA barcoding, phylogenetic
2
1.GİRİŞ
Gobioidei alt takımı 270 cins ve 2210 türle (Teleostei: Perciformes: Gobioidei), tür sayısı
bakımından omurgalılar arasında oldukça önemli bir yere sahiptir (Nelson, 2006). Gobioidei
alt takımı 9 familyadan oluşmakta olup en kalabalık familyasını 210 cins ve 1950 tür ile
Gobiidae familyası oluşturmaktadır (Van Tassel vd., 2011).
Gobiid türleri 93 türle
Kuzeydoğu Atlantik, Akdeniz ve Karadeniz ihtiyofaunasının en kalabalık grubunu
oluştururken (Kovačić ve Patzner, 2011), ülkemiz sularında ise 45 denizel tür ile en geniş
familyadır (Bilecenoğlu vd., 2014; Engin vd., 2014, Engin vd., 2015).
Günümüze kadar pek çok çalışmanın konusunu oluşturan bu türlerin sistematiği, morfolojik
benzerlikleri, küçük boyutları ve kriptobentik yaşam şekilleri nedeniyle hala çok
anlaşılamamıştır. Morfolojik karakterler kullanılarak yapılan sınıflandırma çalışmalarının
çevresel etkilerin altında değişim göstermesi, fenotipik varyasyonun genetik etkinin altında
olması, tür içi ve türler arası varyasyonlar, türlerin morfolojik olarak birbirine oldukça
benzemeleri ve familyaya ait bildirilen tür sayısının sürekli olarak güncellenmesi bu familya
için moleküler tabanlı çalışmaların önemini arttırmaktadır. Ekolojik ve evrimsel anlamda
oldukça önemli türler olmalarına rağmen Gobiid türlerinin ‘tür içi’ ve ‘türler arası’ filogenetik
ve morfolojik ilişkileri hala tam olarak anlaşılamamıştır (Rüber ve Agorreta, 2011). Avrupa
ve ülkemiz sularında içerdiği tür sayısı bakımından baskın bir yere sahip olan Pomatoschistus
cinsinin Akdeniz sularında 10, Karadeniz de ise 2 türü bulunduğu rapor edilmiştir. (Keskin,
2010; Bilecenoğlu vd., 2014). Gobiidae familyasında, bu cinse ait türlerin daha da küçük
boyutlarda olmaları, morfolojik benzerlikleri ve benzer sığ habitatları tercih etmeleri türlerin
birbirinden ayırmada karşılaşılan zorluklar olarak sıralanabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı
ülkemiz kıyılarında Pomatoschistus cinsine ait türler arasındaki taksonomik ilişkileri konu
alan bir çalışma bulunmamaktadır. Bu cinsin bireyleri, oldukça sığ sularda yaşamaları,
yerleşik yaşam tarzları ve ekolojik değişimlere olan duyarlılıkları ile insan etkileşiminden en
yüksek düzeyde etkilenen ‘indikatör’ balıklardır. Ayrıca bulundukları kıyı ekosistemlerinin en
küçük omurgalı canlılarını oluşturmadırlar. Ayrıca küçük omurgasızlar ile ekonomik değeri
yüksek yada nesli tehdit altındaki demersal balıkların besinini oluşturmalarıyla da yüksek
ekolojik öneme sahiptirler (Engin ve Seyhan, 2009; 2010). Bu nedenle Gobiidae familyası ait
tür çeşitliliği ve taksonomik ilişkiler iyi bilinmeli uygun koruma stratejileri belirlenmelidir.
Türlerin ve doğal populasyonların korunmasında ki temel unsur genetik çeşitliliğin
korunmasından geçmektedir. Bununla beraber, canlılar yaşadıkları ortamda insanların doğayı
3
kötü kullanmasından kaynaklanan bir seleksiyona maruz kalmakta ve bu tip seleksiyon
baskılarına sadece genetik olarak güçlü populasyonlar karşı koyabilmektedir. Genetik olarak
güçlü populasyonların varlığını sürdürmesi, ancak populasyonların gen havuzlarının
korunmasıyla mümkün olabilir. Yapay seçilim baskısının minumum seviyeye indirilmesi ve
populasyonlar arasındaki gen akışının devamlılığının sağlanması, populasyonların devamlılığı
için oldukça önemlidir. Aksi takdirde genetik çeşitlilikte meydana gelen azalmalar
populasyonlarda şiddetli hasarlara sebep olabilmekte ve populasyonların yok olmasıyla
sonuçlanabilmektedir.
Karadeniz’de Pomatoschistus cinsine ait 2 türün varlığından bahsedilmektedir (Fricke ve
ark., 2007; Keskin, 2010; Bilecenoğlu vd., 2014). Güney Karadeniz Kıyısal Ekosisteminde
Kriptobentik ve Epibentik İhtiyofaunanın Belirlenmesi adlı ve 112 T 924 numaralı TUBİTAK
projesi kapsamında yapılan arazi çalışmalarında Pomatoschistus marmoratus türünün
Karadeniz kıyılarında yaygın olarak bulunduğu, bununla birlikte bazı istasyonlarda,
P.
marmoratus’ dan farklı olarak zeminden yaklaşık 70- 80 cm yukarıda serbest yüzebilen ve
daha küçük boyutlarda olan Pomatoschistus sp. populasyonlarına da rastlanmıştır. Bahsi
geçen populasyonlardan elde edilen örnekler cins seviyesine kadar morfolojik olarak
tanımlanabilmiştir. Ancak bu kum kaya balığı populasyonlarının, daha önce Karadeniz’den
Fricke ve ark. (2007), Keskin (2010) ve Bilecenoğlu vd (2014) tarafından rapor edilmiş olan
P. marmoratus ve Pomatoschistus minutus’a morfolojik olarak benzerlik göstermediği
belirlenmiştir. Bu gerekçe ile moleküler tanımlamaya ihtiyaç duyulmuştur.
4
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Örnekleme İstasyonları ve Yöntemi
Bu çalışmada analiz edilen Karadeniz örnekleri TUBİTAK 112T924 numaralı ve ‘Güney
Karadeniz Kıyısal Ekosisteminde Kriptobentik ve Epibentik İhtiyofaunanın Belirlenmesi’ adlı
proje kapsamında araştırılan istasyonlardan (Amasra, Sinop, Rize) elde edilmiştir. Ayrıca tür
tespiti ile genetik ilişkilendirmede maksimum seviyede doğruluğu sağlayabilmek amacıyla
diğer kıyılarımızla (Erdek, Saros Körfezi, Dikili) birlikte toplam 6 istasyondan bireylere ait
doku örnekleri toplanmıştır. Örneklemeler SCUBA tekniği ile dalarak yapılmıştır. Dalışa ya
kıyıdan başlanmış, ya da kiralanacak tekne yardımıyla dalış noktasına gidilerek kıyıya doğru
çalışma gerçekleştirilmiştir. Örneklemeler 1-5 m, 6-10 m, 10-15 m ve 20-30 m derinlik
aralıkların da yapılmıştır. Toplanan balık örnekleri, fiziksel ve biyolojik bozulmayı önleme
amacıyla ayrı ayrı etiketlenmiş ve plastik örnek kutularına alınmıştır. Örnekler DNA
degradasyonunu önlemek amacıyla %95’ lik etil alkol içinde fikse edilmişlerdir. Balıkların,
metrik, meristik ve familyaların kendilerine özel morfolojik özellikleri kullanılarak türleri
Whitehead vd. (1986), Fisher vd. (1987) ve Miller (1986) göre belirlenmiştir. Tür tayinleri
gerçekleştirilen balıkların genetik analiz için doku ve yüzgeç örnekleri alınarak ve % 95’lik
etil alkolde eppendorf tüpler içerisinde +4 ° C’de muhafaza edilmiştir. Bunun dışında balık
örneklerinden yaş doku örnekleri alınıp bu örnekler derin dondurucuda (-20 ° C) muhafaza
edilmiştir.
2.2. DNA İzolasyonu ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Doku örneklerinden DNA izolasyonu için PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Life
Technologies) kullanılmış ve üreticinin önerdiği protokol izlenmiştir. İzole edilen DNA
örneklerinin kalite ve miktarı %1’lik agaroz jelde kontrol edilmiş (Şekil 1,2,3) ve tüm
örneklerin DNA konsantrasyonlarının standardize edilmesi amacı ile DNA konsantrasyonu 50
ng/µl olacak şekilde sulandırılmıştır.
Çalışmada, son yıllarda DNA barkodlama çalışmalarında kullanılan ve standartlaşmış bir gen
bölgesi olan mitokondri sitokrom oksidaz alt ünite I (COI) geni evrensel primerler
kullanılarak artırılmıştır.
5
Tablo 1. Çalışmada kullanılan dizin analizi primerleri
Bölge Primerler
COI
Primer Sırası
Referans
FishF1
5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’ Ward vd., 2005
FishR1
5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’
Ward vd., 2005
Şekil 1. Agaroz jel elektroforezi
Mitokondri COI geninin PCR ile arıtımında; 95 oC’de 2 dakika ilk zincir ayrılması işlemi
uygulanmıştır. Bunu takiben amplifikasyon işlemi 94 oC’de 30 sn zincir ayrılması, 54°C’de 30
sn primer bağlanması, 72 °C’de 1 dakika zincir uzaması aşamalarını içeren zaman profili 35
döngü olacak şekilde uygulanmış ve 72 °C’de 10 dakika son uzama safhası izlenmiştir. Elde
edilen PCR ürünü ise % 1’lik agaroz jelde saflığı ve konsantrasyonu kontrol edilmiş ve
sonrasında DNA dizi analizi için ticari firmalara gönderilmiştir.
6
2.3. Filogenetik Analizler
Elde edilen DNA dizilerinin göz ile kontrolü BioEdit (Hall, 1999), hizalanması ClustalW
(Thompson vd., 1994) programı ile gerçekleştirilmiştir.
Şekil 2. Agaroz jel elektroforezinde DNA ve PCR ürünlerinin kontrolü
DNA barkod bölgesi dizileri hizalanan türlerin akrabalık derecelerini öğrenebilmek için
yapılan istatiksel analiz ve filogenetik ağaç oluşturmada MEGA 6 (Tamura ve ark., 2013)
programları kullanılmıştır. Türler arası ve tür içi genetik farklılıklar, ikili dizin uzaklıkları ve
Neighbor Joining (NJ) ağaç topolojileri K2P uzaklık matrisi kullanılarak 1000 tekrarlı
bootstrap (seç-bağla) testleri ile birlikte yapılmıştır.
7
Şekil 3. Agaroz jel elektroforezinde PCR ürününün kontrolü
8
3. BULGULAR
Pomatoschistus cinsine ait bireylere ait mitokondri DNA COI geni kısmi dizisi nükleotid
dizisi (652 bç), ülkemizi çevreleyen denizlerimizde toplam 6 farklı lokaliteden örneklenen 44
birey için DNA dizin analizine tabi tutulmuştur. Çalışılan türler için COI geni nükleotid
pozisyonlarından 228’sı değişken, 209’u parsimonik bilgi verici ve 424’ü korunmuş bölge
olarak saptanmıştır.
Elde edilen COI dizilerinde hizalama sonrasında insersiyon, delesyon ve stop kodunu tespit
edilmemiştir. BOLD veri tabanından karşılaştırma için kullanılan sekanslar ise Tablo 1’ de
verilmiştir.
Tablo 2. Referans türlere ait dizilerin BOLD erişim numaraları
Referans Türler
BOLD giriş numarası
P. microps
BNSF274-278
P. tortonesei
CSFOM104-105-GBGC9174-76
P. norvegicus
BGNBS027-28-BNSF017-18-286
P. lazanoi
FCFPW200-204
P. minutus
BGNBS007-9-10-11-42-46
P. pictus
BGNBS009-012
K. byblisa
FFMBH1193-2103-2104-2110-2112
K. ephesi
FFMBH889-894-895
K. mermere
FFMBH1178-1179-1180-1192-898
K. milleri
FFMBH2051-52-53-57-92
K. montenegrina
FFMBH258-259-260-265-266
K. panizzae
FFMBH020-053-055-057-060
9
Filogenetik ağaçların oluşturulmasında güvenilirliği sağlamak için 1000 tekrarlı bootstrap
(seç-bağla) testleri yapılmıştır. Yapılan analizlerde T bazının ortalama oranı % 27.4 olarak, A
bazının ortalama oranı 21.4 olarak saptanmıştır. C bazının ortalama oranı %31.2 olarak ve son
olarak G bazının ortalama oranı %20 olarak belirlenmiştir. G-C bazlarının oranlarına
bakıldığında ortalama oran % 51.2 olarak belirlenirken A-T bazlarının oranı ise % 48.8 olarak
saptanmıştır. DNA Barkod analizlerinin temel matrisi olan Kimura 2 Parameter modeline
(Kimura, 1980) göre elde edilen komşu katılım (Neigbour Joining) ve maksimum olasılık
(Maximum Likelihood) metotlarına dayalı filogenetik ağaçları ise Şekil 3 ve 4 de verilmiştir.
Ağaç kolları üzerinde verilen mesafeler genetik değişimi ifade etmektedir. Analiz edilen
dizilerde tür içi genetik farklılığa bakıldığında en uzak haplogrubun GenBank’tan temin
edilen P. lazanoi türüne ait olduğu (0.9 %) belirlenmiştir (Tablo 2). Bunun yanı sıra analiz
edilen tüm türler arasındaki ortalama genetik uzaklık %17.21 olarak hesaplanmıştır. Tür-içi,
türler-arası ve aile içi genetik uzaklıklar ise Tablo 3’ de verilmiştir.
Tablo 3. Tür içi genetik farklılıklar
P. microps
P. tortonesei
P. norvegicus
P. lazanoi
P. minutus
P. pictus
P. bathi (Erdek,Saros, Dikili)
P.bathi (Amasra, Sinop, Rize)
P. marmoratus
K. byblisa
K. ephesi
K. mermere
K. milleri
K. montenegrina
K. panizzae
Distance
0,0032
0,0054
0,0026
0,0097
0,0023
0,0024
0,0064
0,0030
0,0021
0,0038
0,0011
0,0013
0,0006
0,0000
0,0019
Standart Error
0,0016
0,0020
0,0013
0,0026
0,0012
0,0013
0,0017
0,0010
0,0008
0,0018
0,0010
0,0009
0,0006
0,0000
0,0011
Türler arası en düşük genetik uzaklık %2.41 olarak hesaplanmış olup K. montenegrina ve K.
panizzae türleri arasında tespit edilmiştir. Pomatoschistus türleri arasında ki en düşük. genetik
mesafe ise %4.93 ile P. lazanoi ve P. norvegicus türleri arasında görülmüştür. Tür- cins
geçişlerindeki en düşük genetik uzaklık ise %16.65 olarak tespit edilmiştir (Tablo X).
10
Karadeniz kıyılarında morfolojik olarak cins seviyesinde tür tayini yapılabilen ve P. sp. Olar
ak analiz edilen türün bireyleri ise analiz edilen tüm ağaç topolojilerinde P. bathi taksonuyla
aynı kolda homojen bir şekilde dağıldığı görülmüştür. Türün diğer türlerle genetik uzaklığına
bakıldığında ise % 0.5 ile P. bathi türüne en yakın tür olduğu tespit edilmiştir (Tablo 4).
Türler arası varyasyonun (Tablo 3) çok altında kalan bu değer ile Pomatoschistus,sp. olarak
analiz edilen türün P. bathi olduğu moleküler olarak doğrulanmıştır.
Tablo 4. Tür-içi, türler-arası ve familya içi genetik uzaklıklar (%)
Genetik Uzaklık
Min. Uzaklık
Max. Uzaklık
Tür-içi
0.00
0.9
Türler arası
2.4
24.6
Familya içi
24.6
32.1
11
Şekil 4. Pomatoschistus ve Knipowitchia cinslerindeki türlere ait COI geni dizileri arasındaki ilişkiyi gösteren NJ metoduyla oluşturulan
filogenetik ağaç.
12
Tablo 5. Türler arasındaki ikili dizin farklılığı değerleri
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
P. tortonesei
2
P. pictus
0,162
3
P. norvegicus
0,201
0,163
4
P. minutus
0,203
0,171
0,108
5
P. microps
0,121
0,167
0,173
0,170
6
P. marmoratus
0,170
0,230
0,207
0,227
0,130
7
P. lazanoi
0,200
0,137
0,049
0,109
0,172
0,215
8
P. bathi
0,244
0,215
0,193
0,206
0,242
0,220
0,188
9
P. bathi (Karadeniz)
0,248
0,219
0,196
0,208
0,245
0,220
0,192
0,006
10
K. panizzae
0,216
0,174
0,181
0,207
0,212
0,240
0,180
0,203
0,208
11
K. montenegrina
0,204
0,177
0,172
0,207
0,198
0,224
0,166
0,189
0,194
0,024
12
K. milleri
0,223
0,191
0,185
0,208
0,225
0,238
0,187
0,208
0,212
0,046
0,056
13
K. ephesi
0,202
0,185
0,187
0,204
0,214
0,243
0,193
0,221
0,226
0,053
0,064
0,046
14
K. mermere
0,204
0,179
0,183
0,226
0,212
0,240
0,178
0,192
0,198
0,039
0,040
0,059
0,059
15
K. byblisa
0,218
0,193
0,185
0,198
0,224
0,250
0,190
0,212
0,217
0,062
0,069
0,047
0,038
0,065
16
G. niger
0,275
0,265
0,291
0,321
0,246
0,271
0,282
0,280
0,284
0,291
0,285
0,314
0,310
0,292
15
0,313
13
Şekil 5. Pomatoschistus ve Knipowitchia cinslerindeki türlere ait COI geni dizileri arasındaki
ilişkiyi gösteren ML metoduyla oluşturulan filogenetik ağaç
14
4. TARTIŞMA SONUÇ
Bu
çalışma
ile
Gobiidae
familyasında
bulunan
ve
birbirlerine
olan
morfolojik
benzerliklerinden dolayı tür tespitinde zorluklar yaşanan Pomatoschistus türlerinin filogenetik
ilişkileri belirlenmiştir.
Türlere özgü DNA profillerini ortaya çıkaran DNA barkodlama yöntemi, mitokondri
DNA’nın 600-700 baz çifti uzunluğundaki standart bir bölgesinin hızlı ve doğru ekilde tür
tanımlamada kullanılmasına dayanmaktadır (Hebert ve Gregory, 2005). Bugüne kadar yapılan
birçok çalışmada karmaşık gruplara ait bir çok canlı türünde %98-100 seviyelerinde
moleküler tanımlama başarıyla gerçekleştirilmiştir (Hebert vd., 2003a; Ward vd. 2005;
Hajibabaei vd., 2006; Smith vd. 2006; Aravind vd., 2007). DNA barkodlama çalışmalarında
COI geninin standart barkod geni olarak seçilmesindeki asıl neden, birden fazla tür için
göstermiş olduğu belirgin ayrım gücü ve tür içi ile türler arasındaki uzaklığın çakışmadığı
tipik varyasyon modelidir (Hebert vd. 2003a). COI barkod bölgesi için bildirilen tür içi
varyasyon sınırı ise genelde %2 in altında olmakla beraber (Hebert vd. 2003a; Hebert vd.
2003b; Ward, 2012; Viswambharan vd. 2013; Knebelsberger vd. 2014) bu çalışmada tür içi
varyasyon ortalama % 0.3 olarak tespit edilmiştir. Gobiid türleri ile yapılan çalışmalarda ise
bu değerin ortalama
% 0.37, türler arası farklılığın ise % 3.7 olabileceği bildirilmiştir
(Knebelsberger ve Thiel, 2014). Çalışmamızda elde edilen veriler literatürdeki sonuçlarla
benzerlik göstermekle birlikte, tür içi varyasyonun sınırları bakımından farklılık gösterdiği
gözlemlenmiştir. Bunun sebebinin ise örnekleme istasyonlarının diğer çalışmalara nazaran
daha kısıtlı bir coğrafik alanda tutulması ya da Gobiid türleri içerisinde daha önce varlığı
rapor edilen kriptik çeşitlilikten kaynaklandığı düşülmektedir.
DNA barkodlama yöntemiyle yapılan moleküler analizlerin sonucunda tür tanımlanmasında
zorluk yaşanan bu populasyonlara ait bireylerin Karadeniz’den daha önce rapor edilen P.
marmoratus ve P. minutus türlerine olan genetik uzaklığı sırasıyla %22.05 ve %20.83 olarak
tespit edilmiştir. Bununla birlikte bu örneklerin % 0.6 genetik uzaklıkla en yakın ilişkili
olduğu türün P. bathi olduğu görülmüştür. Pomatoschistus cinsi içinde türler arası genetik
farklılık % 4.93 olarak belirlenmiş ve bu türe ait elde edilen genetik uzaklık değerinin
saptanan türler arası uzaklıktan çok düşük olduğu ve tür içi varyasyon sınırlarının da içinde
kaldığı saptanmıştır. Bahsi geçen diziler ayrıca diğer kıyılarımızdan elde edilen P. bathi
bireyleri ile hem NJ hem ML topolojilerinde aynı taksonda yer almıştır ve böylelikle
moleküler tanımlama başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma ile literatürde
15
(Bilecenoğlu vd., 2014) Karadeniz kıyılarımızda varlığı bildirilen P. marmoratus’un yaygın
bir şekilde rastlanırken P. minutus türünün varlığı belirlenememiştir. Ülkemiz Karadeniz
kıyılarında P. bathi türünün dağılım gösterdiği ise ilk defa bu çalışma ile belirlenmiştir.
16
REFERANSLAR
Aravind K, Ravikanth G, Shaanker RU, Chandrashekara K, Kumar ARV, Ganeshaiah KN. 2007.
DNA barcoding: An exercise in futility or utility? Current Science. 92(9):1213-1216.
Bilecenoğlu, M., Kaya, M., Cihangir, B., Çiçek, E. 2014. An updated checklist of the marine fishes
of Turkey. Turk J Zool. 38: DOI: 10.3906/zoo-1405-60.
Engin, S. & Seyhan, K. 2009. Biological characteristics of rock goby Gobius paganellus, in the South
eastern Black Sea. Acta Ichthyologica et Piscatoria, 39(2) 111-118.
Engin, S. & Seyhan, K. 2010. Age, growth, reproduction and diet of the Flatsnout Goby Neogobius
platyrostris in the south-eastern Black Sea Coast. Zoology in the Middle East 50, 59-66.
Engin, S., Keskin A. C., Akdemir, T. 2015. First record of Lebetus guilleti (Le Danois, 1913)
(Gobiidae) from the Sea of Marmara. Acta Ichthyologica et Piscatoria. 45 (1): 85–87.
Engin, S., Keskin A. C., Akdemir, T., Seyhan, D. 2014. First record of the goby Buenia affinis Iljin,
1930 (Gobiidae) from the Aegean Sea and Sea of Marmara. Zoology in the Middle East DOI:
10.1080/09397140.2014.970380. Vol. 60, Iss. 4.
Fischer, W., M. Scheider, M. L. Bauchot,, 1987, Fiches FAO d’Identification des espéces pour les
besoins dela péche. Mediterranée et Mer Noire. Zone de péhe 37. Vertebres. Vol. 2: 14061417.
Fricke, R., Bilecenoglu, M. and Sarı, H.M. 2007. Annotated checklist of fish and lamprey species
(Gnathostomata and Petromyzontomorphi) of Turkey, including a Red List of threatened and
declining species, Stuttgarter Beitr. Naturk.,Ser. A, Nr. 706:1-172.
Hajibabaei M, Smith MA, Janzen DH, Rodriguez JJ, Whitfield JB, Hebert PDN. 2006. A Minimalist
Barcode Can Identify A Specimen Whose DNA Is Degraded. Molecular Ecology Notes.
6:959-964.
Hall, T.A., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program
for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41, 95–98.
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003a. Biological identifications through DNA
barcodes. Proceedings Of The Royal Society B: Biological Sciences. 270:313-321.
17
Hebert PDN, Gregory TR. 2005. The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy. Systematic Biology.
54(5):852-859.
Hebert PDN, Ratnasingham S, Dewaard JR. 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase
subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings Of The Royal Society B:
Biological Sciences. 270:96-99.
Keskin, Ç. 2010. A review of fish fauna in the Turkish Black Sea. J. Black Sea/Mediterranean
Environment Vol. 16(2): 195-210.
Kimura, M., 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution through
comparative studies of nucleotide sequences, J. Mol. Evol., 16, 111–120.
Knebelsberger T, Landi M, Neumann H, Kloppmann M, Sell AF, Campbell PD, Laakmann S,
Raupach MJ, Carvalho GR, Costa FO. 2014. A reliable DNA barcodereference library for the
identification of the North European shelf fish fauna. Molecular Ecology Resources. 14:
1060–1071.
Knebelsberger, T. and Thiel, R. 2014. Identification of gobies (Teleostei: Perciformes:
Gobiidae) from the North and Baltic Seas combining morphological analysis and
DNA barcoding. Zoological Journal of Linnean Society. 172: 831-845.
Kovačić, M. and Patzner, R. A. 2011.North-Eastern Atlantic and Mediterranean Gobies. In: The
Biology of Gobies, R.A. Patzner, J.L. Van Tassell, M. Kovačić and B.G. Kapoor (eds.),
Science Publisher Inc., Enfield, pp. 177-206.
Miller, J.P., 1986. The Family of Gobiidae. In: Whitehead, P.J.P., Bauchot, M.L., Hureau, J.C.,
Nielson, J., Tortonese, E. (Eds.), Fishes of the North Eastern Atlantic and of the
Mediterranean, UNESCO, Paris, pp. 1019–1085.
Nelson, J. 2006. Fishes of the World. John Wiley and Sons, Inc., New York. 4th edition.
Rüber, L.J. and A. Agorreta. 2011. Molecular Systematics of Gobioid Fishes. In: The Biology of
Gobies, R.A. Patzner, J.L. Van Tassell, M. Kovačić and B.G. Kapoor (eds.), Science
Publisher Inc., Enfield, pp. 23-50.
Smith MA, Woodely NE, Janzen DH, Hallwachs W, Hebert PDN. 2006. DNA barcoding reveal
cryptic host-specificity within the presumed polyphagous members of a genus of parasitoid
flies (Diptera, Tachinidae). Proceedings of the National Academy of Science of the United
States of America. 103:3657-3662.
18
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729.
Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap
penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22, 4673–4680.
Van Tassell, J. L., Tornabene, L., Taylor, M. L. 2011. A History of Gobioid Morphological
Systematics In: The Biology of Gobies, R.A. Patzner, J.L. Van Tassell, M. Kovačić and B.G.
Kapoor (eds.), Science Publisher Inc., Enfield, pp. 23-50.
Viswambharan D, Pavan-Kumar A, Singh DP, Jaiswar AK, Chakraborty SK, Nair JR, Lakra WS.
2013. DNA barcoding of gobiid fishes (Perciformes, Gobioidei). Mitochondrial DNA.
doi:10.3109/19401736.2013.834438.
Ward RD. 2012. FISH-BOL, a case study for DNA barcodes.In: Kress WJ, Erickson DL, eds. DNA
barcodes: methods and protocols. Berlin: Springer Science+Business Media, LLC 2012,
Methods in Molecular Biology vol. 858, 423–439.
Ward, R.D., Zemlak, T.S., Innes, B.H., Last, P.R., Hebert, P.D.N., 2005. DNA barcoding Australia’s
fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological
Sciences 360, 1847–1857.
Whitehead, P. J. P., M. L. Bauchot, J. C. Hureau, J. Nielsen, E. Tontonese, (Editors), 1986, Fishes of
the North-Eastern Atlantic and the Mediterranean. Volume II., pp. 517-1007, Paris, UNESCO
19
EKLER
Proje çalışmasından elde edilen veriler ve sonuçlar kullanılarak üretilmiş yayınlar:
Engin S., Irmak E., Seyhan D. 2016. New record of the thermophilic Cephalopholis taeniops
(Osteichthyes: Serranidae) in the Aegean Sea. Zoology in the Middle East, 2016
http://dx.doi.org/410.1080/09397140.2016.1173908.
20