EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
(YÜKSEK LİSANS TEZİ)
TRİPSİN İMMOBİLİZASYONU VE
KARAKTERİZASYONU
Ömer HABİB
Biyokimya Anabilim Dalı
Bilim Dalı Kodu: 405.05.01
Sunuş Tarihi: 22/08/2007
Tez Danışmanı : Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU
Bornova-İZMİR
1
1 GİRİŞ
1.1 Tripsin
Tripsin (3.4.21.4), serin proteaz sınıfından hidrolitik bir enzimdir.
Serin proteazlar aktif merkezlerinde esansiyel serin dizisinin varlığıyla
karakterize edilirler. Yapısal benzerliklerine göre birçok alt aileye
ayrılırlar. Bu gurup enzimler metabolizmada hormon aktivasyonu, kan
pıhtılaşması, sindirim, immün sistem aktivasyonu gibi çok çeşitli
proseslerde görev alırlar (Çizelge 1.1).
Çizelge 1.1 Bazı serin proteazlar ve metabolizmadaki görevleri.
Enzim
Kesim Yeri
Görevi
Trombin
Arg-Gly
Kan pıhtılaşması
Elastaz
Val-X
Bağ liflerinin yıkımı
Tripsin
Arg-X, Lys-X
Zimojen aktivasyonları ve protein yıkımı
Enteropeptidaz 6-Lys-|-Ile-7
Tripsinojen aktivasyonu
Asetil kolin
esteraz
Sinir uyarılarının sinaptik bölgelerden geçişi
Molekül ağırlığı 23722 Da olan tripsin, tripsinojen (Ma = 24409)
olarak adlandırılan uzun, inaktif öncü protein şeklinde pankreastan
salgılanır. Tripsinojen onikiparmak bağırsağına geldiğinde modifiye
edilir. Burada ikinci bir enzim “enterokinaz” mukozal membrandan
salgılanır ve aktif tripsin formunun açığa çıkmasını sağlar. Oluşan
2
trpisin daha sonra tripsinojenin aktivasyonunu gerçekleştirir. Yani
aktivasyon prosesi buradan sonra oto-katalitik olarak yürür (Şekil 1.1).
Şekil 1.1 Tripsinojen aktivayonu
Tripsin amino asit analizleri, proteinlerin sekanslama, haritalama
ve yapısal çalışmaları, doku kültür camlarından yapışmış hücrelerin
çıkarılması ve soya tripsin inhibitörlerinin saflaştırılması gibi geniş bir
uygulama alanına sahiptir. Tripsin, peptid bağlarını çok spesifik olarak
hidrolizlemesinden dolayı özellikle sekans çalışmalarında önemli bir
araç haline gelmiştir.
İmmobilize tripsin otolizi elimine etmesi, örneklerin proteaz
tarafından
kirletilmemesi,
uzaklaştırılabilirliği
ile
kontrollü
parçalamaya olanak sağlaması gibi avantajlarından dolayı uygulama
alanlarında serbest tripsine göre daha tercih edilir bir konuma gelmiştir
ve günümüzde ticari immobilize tripsin çeşitli firmalardan (Clontech,
Princeton Separation) temin edilebilmektedir.
3
Ayrıca son zamanlarda immobilize tripsin temelli kromatografik
kolonların sürekli akış sistemlerinde on-line proteoliz için immobilize
enzim reaktörleri olarak kullanımına yönelik çalışmalar ön plana
çıkmaya
başlamıştır.
çalışmalarında
Tripsin
parçalanan
reaktörlerinin
peptidlerin
protein
ayrılması
haritalama
ve
protein
identifikasyonunda ESI/MS/MS gibi sistemlerle birleştirilebilmesi
önemi arttırmaktadır. Bu alana yönelik çalışmalarda seçimlilik,
duyarlılık, düşük geri basınç ve substratın aktif merkeze diğer
taşıyıcılara göre daha yüksek oranda ulaşabilirliği nedeniyle silika
tabanlı taşıyıcılar tercih edilmektedir.
Bu tez kapsamında daha sonraki on-line proteoliz çalışmalarında
HPLC kolon dolgu maddesi olarak kullanılmak üzere silika tabanlı
taşıyıcılar üzerine tripsin immobilizasyonu gerçekleştirildi.
1.1.1 Substrat spesifikliği
Tripsin polipeptidleri spesifik dizilerin karboksil ucundan keser.
Bu aminoasit kalıntıları rasgele değildir; arginin ya da lizin gibi pozitif
yüklü aminoasit artıklarından sonra keser. Serin proteazlar, substrat
spesifikliğini oldukça etkileyen serin aktif bölgesine yakın “spesifik
cep” olarak adlandırılan bir susbstrat bağlama bölgesine sahiptir.
Tripsinde stratejik olarak alt kısmında karboksilat yan grubu bulunan
cep bağıl olarak daha uzun ve dardır. Kimotripsinde ise bu cep daha
geniş ve yüksüzdür fakat birçok hidrofobik grup içerir. Elastaz, tam
tersine, valin ve treonin yan zincirlerinden oluşmuş, daha sığ bir cebe
sahiptir. Şekil 1.2’de görüldüğü gibi bağlanma bölgesindeki değişimler
4
substrat spesifikliklerindeki değişimleri de açıklamaktadır (Whitford,
2005)
Şekil 1.2 Kimoptripsin, tripsin ve elastazın spesifik cepleri
1.1.2 Mekanizması
Serin proteazlar aktif merkezlerinde birbirine çok yakın bulunan
ve değişmeyen üç dizi ile yapısal benzerlik gösterirler. Bu aminoasitler
His57, Asp102 ve Ser195’tir ve hepsi birlikte hidrojen bağlarıyla
bağlanarak katalitik üçlüyü oluşturur. Primer dizide farklı yerlerde
bulunmalarına rağmen (Çizelge 1.2) aktif bölgede His57 ve Ser195 in
Asp102 yakın konumda bulunurlar (Şekil 1.3).
5
Çizelge 1.2 Bazı serin proteazlarda katalitik üçlünün primer dizideki yerleri.
Enzim
EC No
Ser
His
Asp/Glu
Kimotripsin
3.4.21.1
195
57
Asp 102
Tripsin
3.4.21.4
195
57
Asp 189
Subtilisin
3.4.21.62
221
64
Asp 32
Asetilkolin esteraz
3.1.1.7
200
440
Glu 327
Şekil 1.3 Katalitik üçlü
Peptit
bağının
hidrolizi
zor
bir
kimyasal
prosestir.
Katalizlenmeyen reaksiyonda su amid bağının karbonuna atak yapar.
Bu bağın polaritesinden dolayı C atomu elektronca fakirdir ve bu
6
nedenle elektronca zengin bir nükleofilin saldırısına karşı hassastır. Su
zayıf bir nükleofildir. Bu problemi çözmek için mümkün iki strateji
vardır: su daha iyi bir nükleofil olabilmesi için aktive edilir ve/veya
amid grubu nükleofilik atağa karşı daha hassas hale getirilir. Hidroliz
ile peptit yıkımını katalizleyen serin proteazlar tüm prosesi iki
basamağa bölerek bu sorunun üstesinden gelir; hem atak yapan
nükleofili ( Ser- OH ) hem de reaksiyondaki amid grubunu aktive eder.
Aktif merkeze giren substrat polipeptidinin spesifik cebe sterik
olarak uygun olan aminoasit kalıntısı cebe yerleşir. Spesifik bağlama
Ser195 ile parçalanacak bağın karbonil grubunun yaklaşmasına neden
olur. Normal koşullarda serinin –OH grubunun pK a ’sı çok büyüktür
(>10) fakat kimotripsinde His57’nin yakınlığı proton transferine ve
yüklü bir imidazol halkasının oluşmasına yol açar. Daha sonra,
His57’nin protonlanması hidrofobik bölgede bulunan Asp102’nin
negatif yükü (katalitik üçlünün son üyesi) tarafından stabilize edilir.
Peptid bağı parçalanmasının ilk adımı olarak, aktif serinde oluşan güçlü
bir nükleofil, karbonil grubuna saldırır. Nükleofil oluşumu, Asp102 ve
His57’nin
hidrojen
bağlanmasının
yol
bağı
açtığı
oluşturmasına
küçük
neden
konformasyonel
olan
substrat
değişiklikler
tarafından tetiklenir. Bu hidrojen bağının etkisiyle imidazol yan
zincirinin pKa’sı 7’den 11’e çıkararak bazlığı artar. İkinci bir azot
atomuna doğru yönlenen elektronlar daha güçlü bir baz oluşmasına yol
açıp, normalde reaktif olmayan Ser195 yan zincirinden proton
çekilerek kuvvetli bir nükleofil meydana gelmesini sağlar (Şekil 1.4).
7
Şekil 1.4 Serin proteazların katalitik mekanizması
Nükleofilik atak tetrahedral geçiş halinin oluşumuyla sonuçlanır
ve bunu da peptit bağının yarılması takip eder. Geçiş durumunda
karbonil oksijeni tek bağlı duruma gelir ve negatif yüklü duruma geçer.
Protein bu negatif yükü iki hidrojen bağıyla stabilize edecek şekilde
yapılandırılmıştır. Bu bölgeye oksianyon boşluk adı verilir (Şekil 1.5).
Peptid substratının N-terminal kısmı, enzime kovalent bağlı kalır ve
8
açil- enzim ara ürünü oluşur. His üzerinde yer alan Serin protonu, yeni
bir terminal oluşturmak üzere, bu bölgede enzime sıkı bağlanmayan
peptidin C-terminali tarafından alınır.
Şekil 1.5 Oksianyon boşluk
Tripsinde su açil-enzim ara ürününü hidrolizler. Su molekülü,
imidazol yan zincirine proton vererek açil ara ürünüyle ikinci bir
tetrahedral geçiş ara ürününü oluşturur. Bu ara ürün His57’den
Ser195’e proton transferinin bir sonucu olarak hidrolizlenir ki böylece
N-terminel peptidin ayrılmasıyla aktif merkez restore edilmiş olur.
Serin proteazlar, ping pong mekanizmasını izler; ilk önce substrat
enzime bağlanır, C-terminal ayrılmasını su molekülünün bağlanması ve
açil-enzim ara ürünü oluşumu izler. Açil enzim ara ürününün
hidrolizlenmesi sonucu N-terminalin ayrılması ile tamamlanır (Şekil
1.6) (Whitford, 2005).
9
Şekil 1.6 Serin proteazlar için ping pong mekanizması.
1.2 Enzim İmmobilizasyonu
İmmobilize enzimlerin kullanımı için birçok neden vardır. En
önemli ikisi:
a) Enzimin üründen kolaylıkla ayrılması,
b) Enzimin tekrar kullanımıdır.
Enzimin
üründen
kolaylıkla
uzaklaştırılması
enzim
uygulamalarını basitleştirir ve etkili reaksiyon teknolojilerine olanak
sağlar. Ayrıca enzimin tekrar kullanımı fiyat avantajı açısından da
önemlidir. İmmobilize enzim preparatlarının özellikleri hem enzim
hem de taşıyıcı materyalin özellikleri tarafından belirlenir (Şekil 1.7).
10
Şekil 1.7 İmmobilize enzimlerin karakteristikleri
Geçen yüzyılın ikinci yarısından itibaren değişik uygulamalar
için çözünür olmayan immobilize enzimlerin geliştirilmesine yönelik
birçok çalışma yapılmıştır. Şekil 1.8’de immobilize enzimlerin bazı
uygulama alanları gösterilmiştir (Tischer, 1999).
Şekil 1.8 İmmobilize enzimlerin uygulama alanları
11
Doğası ne olursa olsun, nasıl hazırlandığına bağlı olmaksızın,
herhangi bir immobilize enzim, esansiyel olan katalitik ve katalitik
olmayan fonksiyonlar üstelenen grupları içermelidir.
Taşıyıcı ayırmaya yardımcı olacak, enzimin tekrar kullanımına ve
prosesin kontrolüne olanak sağlayacak şekilde; enzim ise istenilen
aktivite, verimlilik, seçimlilik ve substrat spesifikliğine göre seçilir
(Şekil 1.9).
Şekil 1.9 İmmobilize enzimin katalitik ve katalitik olmayan fonksiyonları arasındaki
ilişki
Katalitik olmayan parametreler, taşıyıcının özellikle şekil,
büyüklük ve uzunluk gibi fiziksel ve kimyasal doğasıyla ilişkiliyken
katalitik parametreler ise aktivite, seçimlilik, kararlılık, pH ve sıcaklık
12
profilleri gibi katalitik fonksiyonlara bağlıdır. İmmobilize enzimler için
bu iki özelliğin seçimindeki genel kriterler çizelge 1.3’de verildi.( Cao,
2005).
Çizelge 1.3 İmmobilize enzimler için kriterler.
Parametreler
Gereksinimler
Katalitik olmayan Uygun partikül boyutu ve şekli
fonksiyon
Katalitik
fonksiyon
İmmobilize
enzim
Yararlar
Kolay ayırma ve reaksiyon
kontrolü
Yüksek aktivite
Yüksek verimlilik
Organik çözgenlere karşı yüksek
kararlılık
Gözenek çaplarında sabitlik
Yüksek kararlılık
Yüksek verimlilik
Geri kazanım
Biyokatalizör için düşük
maliyet
Geniş substrat spesifikliği
Substrattaki yapısal
değişimlere tolerans
Organik çözgenlerde kararlılık
Organik çözgen kullanımı ile
reaksiyon dengesinde kayma
Termal kararlılık
Sıcaklık yükselmesiyle kısa
reaksiyon zamanı
Operasyonel kararlılık
Düşük maliyet
Konformasyonel kararlılık
Enzim özelliklerinin
düzenlenmesi
Geri kazanım
Katalist için düşük maliyet
Geniş uygulama alanı
Proses değişimlerine tolerans
Tekrar üretilebilirlik
Kaliteli ürün garantisi
13
1.3 Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri
İmmobilize enzimlerin
kullanılır (Şekil 1.10).
hazırlanmasında
çeşitli
Şekil 1.10 Enzim immobilizasyon yöntemleri
yöntemler
14
1.3.1 Taşıyıcıya bağlama yöntemleri
Enzim immobilizasyon yöntemi, enzim aktif konformasyonu ve
gerekli katalitik esnekliğini sürdürmesine/korumasına izin verecek
şekilde seçilmelidir. Enzimin yapısal karakteristikleri hakkında bilgi,
yüksek performansta biyokatalizör elde etmek için yardımcıdır.
Temelde, enzimleri yüzeye immobilize etmek için dört yol vardır:
a) Enzim aktivasyonu ve taşıyıcıya bağlama. Bu yaklaşım
genelde aktivitede önemli bir kayba neden olur; çünkü proteinlerin,
yüksek reaktivitedeki kimyasal bileşiklerle modifikasyonu katalitik
veya yapısal açıdan esansiyel dizileri değiştirebilir. Ayrıca molekül içi
ya da moleküller arası çapraz bağlanmalar da göz önünde tutulmalıdır.
b) Destek materyalinin modifikasyonu ve aktivasyonu. Doğal
enzim, bir sonraki adımda bağlanır. Enzimlerin taşıyıcı yüzeye
kovalent bağlanmasında en önde gelen tekniktir.
c) Enzim üzerindeki fonksiyonel grup ve taşıyıcının bi- veya
multifonksiyonel ajanlarla bağlanması. Aynı zamanda molekül içi ve
moleküller arası çapraz bağlanmalara neden olur.
d) Biyospesifik grup içeren bir protein üretmek için enzimin
rekombinant DNA teknikleriyle modifikasyonu. Böylece biyoafinite
bağlama kullanılarak özel taşıyıcılara adsorplama gerçekleştirilebilir.
15
Taşıyıcı; elde edilen immobilize biyokatalizörün katalitik
olmayan özelliklerinin kolay kontrol edilebilmesini sağlar. Seçilen
taşıyıcı sadece enzim bağlanabilen fonksiyonel grubu için yapı iskelesi
görevini üstlenmekle kalmaz; bunun yanında fiziksel ve kimyasal
yapısı (gözenek boyutu, hidrofilik/hidrofobik dengesi, yüzey kimyası
vb.) enzimin katalitik özeliklerini önemli ölçüde etkiler. Bu bağlamda
taşıyıcı enzim modifikasyonunda kullanılıyor gibi düşünülebilir.
Enzim immobilizasyonunda doğal veya sentetik birçok organik
ve inorganik materyal kullanılmaktadır. Taşıyıcı, suda çözünmeyen katı
veya polimer olabilir. Enzim immobilizasyonunda en yaygın kullanılan
taşıyıcılar çizelge 1.4’te verilmiştir (Telefoncu, 1997).
Çizelge 1.4 Enzim immobilizasyonunda kullanılan taşıyıcılar.
Anorganik
Kil, cam
Silika jel
Bentonit
Aktif karbon
Metaller
Metaloksitler
Doğal polimerler
Selüloz
Nişasta
Dekstran
Albumin
Kitin/kitosan
Agar/agaroz
Sentetik polimerler
Polistiren türevleri
Poliakrilamid
Naylon
Oksiranlar
Metakrilat
16
1.3.1.1 Kovalent bağlama ile immobilizasyon
Taşıyıcıya kovalent bağlama enzim zincirindeki aminoasitlerin
taşıdığı fonksiyonel gruplar üzerinden gerçekleşir (Çizelge 1.5).
Çizelge 1.5 Kovalent bağlamada hedef amino asitler.
Kovalent immobilize enzim; taşıyıcı, ara kol ve enzim
bileşenlerinden oluşan bir kompozit olarak düşünülebilir (Şekil 1.11).
Taşıyıcıya kovalent olarak bağlanmış enzimin performansını etkileyen
özellikler şunlardır:
17
-
Taşıyıcının fiziksel ve kimyasal doğası.
-
Bağlanma kimyası.
-
İmmobilizasyon
konformasyonu.
-
Enzimin yönlenmesi.
-
Ara kolun uzunluğu ve doğası.
-
Enzimi bağlamak için kullanılan ortamın özellikleri.
-
Enzim ve taşıyıcı arasında oluşan bağ sayısı.
-
Taşıyıcı üzerinde veya içinde enzimin bozulması.
sırasında
ve
sonrasındaki
enzim
Şekil 1.11 Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanması: A; aktif amino asit dizisi, B;
taşıyıcının fonksiyonel grubu, C; taşıyıcı, D; ara kol.
18
Çizelge 1.6’da kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve
sakıncaları verilmiştir (Telefoncu, 1997).
Çizelge 1.6 Kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları
Kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları
Yararları
Reaktif taşıyıcıya enzim bağlanması
kolaydır ve bağlı olmayan enzim yıkama
ile uzaklaştırılabilir.
Katı taşıyıcıya bağlı katalizatör kullanışlıdır
(süzme veya santrifüjleme ile ayrılır).
Reaksiyon ortamından istenilen anda
uzaklaştırılabilir.
Ürünleri kirletmez.
Taşıyıcının yapısına bağımlı olarak yeni
spesifiklikler kazanabilir.
Sürekli sistemlere uygundur.
Değişik fiziksel formlarda (tabaka, partikül,
fiber vb.) üretilebilirler.
Sakıncaları
Enzim immobilizasyon koşullarından
etkilenebilir.
Bağlanma aktivite için zorunlu
aminoasit artıkları üzerinden
gerçekleşebilir.
Enzimin taşıyıcıya bağlanması özel
ve masraflı preparasyonları gerekli
kılabilir.
Polimer taşıyıcının sebep olduğu
sterik engellemeler nedeniyle aktivite
azalabilir.
19
1.3.1.2 Adsorpsiyon ile immobilizasyon
Enzim immobilizasyonunda kullanılan en eski ve en basit
yöntemdir (Şekil 1.12). Yöntem; yüzey aktif, suda çözünmeyen bir
adsorbanın enzim çözeltisi ile karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice
yıkanarak uzaklaştırılması temeline dayanır.
Şekil 1.12 Adsorpsiyon temelli immobilizasyon yöntemleri
Enzimlerin taşıyıcıya kovalent olmayan bağlanması şekil 1.13’de
gösterildiği gibi sınıflandırılabilir.
Spesifik olmayan fiziksel adsorpsiyon; enzimin bağlanması van
der Walls kuvvetleri, hidrojen bağları ve hidrofilik etkileşimler gibi
spesifik olmayan kuvvetlerle gerçekleştirilir.
-
Biyo-spesifik
adsorpsiyon;
immobilize ligandlar kullanılır.
enzimin
bağlanmasında
20
-
Afinite adsorpsiyon; ya immobilize boyalar ile ya da
immobilize metaller ile bağlanma gerçekleştirilir.
-
Elektrostatik etkileşim; taşıyıcı ve enzim arasındaki yük
etkileşimine dayanır. İyonik bağlama çok yumuşak koşullarda
gerçekleştiğinden enzimin konformasyonunda ve aktif merkezde
değişikliğe neden olmaz. Ancak enzim ile taşıyıcı arasındaki bağ
kovalent bağ kadar güçlü olmadığından enzim kaçışı söz konusudur.
-
Hidrofobik etkileşim; enzim ve taşıyıcı üzerindeki
hidrofobik bölgelerin etkileşimine dayanır.
Şekil 1.13 Enzimlerin yüzeye adsorpsiyonu A; Spesifik olmayan adsorpsiyon, B;
Biyospesifik adsorpsiyon, C; Hidrofobik veya iyonik adsorpsiyon.
Adsorpsiyon
yönteminin
yararları;
enzim
immobilizasyon
yönteminin basit oluşu, değişik biçim ve yükteki taşıyıcıları seçme
olanağı vermesi, bir yandan immobilizasyon gerçekleştirilirken diğer
yandan enzim saflaştırılmasına olanak sağlamasıdır. İşlem çok kolay
21
olduğu gibi çok yumuşak koşullarda gerçekleşmekte ve önemli ölçüde
enzim inaktivasyonuna neden olmamaktadır.
Yöntemin sakıncaları ise; her ne kadar immobilizasyon işlemi
kolaysa da optimal koşulların saptanması çok güçtür. Eğer enzim ile
taşıyıcı arasında kuvvetli bir bağlanma yoksa bu durumda desorpsiyon
sonucu enzim serbest halde reaksiyon ortamına geçmekte ve ürünlerin
kirlenmesine neden olmaktadır. Enzim desorpsiyonu özellikle subsrat
konsantrasyonunun yüksek olduğu durumlarda hiç istenmeyen bir
durumdur.
1.3.2 Çapraz bağlama yöntemleri
Küçük moleküllü bi- veya multi- fonksiyonel reaktifler enzim
molekülleri arasında bağlar yaparak sonuçta suda çözünmeyen
komplekslerin oluşmasını sağlarlar. Çapraz bağlama derecesi ve
immobilizasyon, protein ve reaktif konsantrasyonuna, pH’ya ve
immobilize edilecek enzime çok bağımlıdır. Moleküller arası
bağlanmalar yanında molekül içi bağlanmalar da söz konusudur. Bu
yöntem ile enzim immobilizasyonu genel olarak çözünmüş (a), kristal
(b),
püskürtülerek
kurutulmuş
(c)
ya
da
fiziksel
olarak
agregatlaştırılmış (d) enzimlerin direkt olarak çapraz bağlanmasıyla
gerçekleştirilir (Şekil 1.14).
22
Şekil 1.14 Çapraz bağlama yöntemleri
1.3.3 Tutuklama yöntemleri
Prensip olarak tutuklama enzim molekülünü belli bir ortamda
durmaya zorlamaktır. Enzim bulunduğu çevreden dışarı çıkamaz. Bu
işlem polimer matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi
yarı geçirgen membranlar içinde mikrokapsülleme ve miseller ile de
gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi, kovalent bağlama ve çapraz bağlama
ile immobilizasyondan ayıran en önemli özellik enzim molekülünün
fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmamış
olmasıdır
Polimer Matrikste Tutuklama
Yöntem, yüksek derecede çapraz bağlı bir polimerin enzim
çözeltisi içinde oluşturulması temeline dayanır. Polimerleşme sonucu
23
enzim molekülleri çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece
ana çözeltiye geçmeleri engellenmektedir (Şekil 1.15).
Şekil 1.15 Matrikste tutuklama
Mikrokapsülleme
Bu yöntem enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran
içinde tutuklanmasından ibarettir (Şekil. 1.16).
Enzimler daha çok kimyasal mikrokapsülleme ile immobilize
edilmektedirler. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu; sürekli ve
sürekli olmayan yarı geçirgen membran mikrokapsüllerde tutuklama
olmak üzere iki grupta incelenebilir. Sürekli mikrokapsüllerde çerçeve
membran katı, süreksiz mikrokapsüllerde (lipozomlar), ise bir sıvı
tabakadır.
İmmobilizasyonda
kullanılan
(membran) yarı geçirgen olması zorunludur.
çerçeve
maddesinin
24
Şekil 1.16 Mikrokapsülleme
1.3.4 Suda çözünen enzim immobilizasyonu
Suda çözünmeyen formda hazırlanan immobilize enzimlerin
aktivite ve spesifikliklerinde değişme olabilmektedir. Çünkü bu
enzimler, modifikasyona uğrayabildikleri gibi mikroçevreleri de
değişmektedir. Enzim çözeltisi bir membran ile ürün ve substrattan
ayrılırsa doğal durumda kalması sağlanmış olur. Bu amaçla
ultrafiltrasyon
ve mikrofiltrasyon
membranlarından yararlanılır.
Kofaktöre gereksinim duyan enzimlerin immobilizasyonu söz konusu
ise küçük molekülü olan kofaktörlerin yarı geçirgen membrandan
çıkmamaları için polietilen glikol (PEG) gibi suda çözünen polimerlere
kovalent bağlanması gerekir.
25
1.4 Enzim İmmobilizasyon Yöntemi ve Taşıyıcı Seçimi
İmmobilizasyon yönteminin seçiminde dört ana kriter göz önüne
alınmalıdır: güvenilirlik, maliyet, aktivitenin korunması ve kararlılık
(Çizelge 1.6).
İmmobilizasyon esnasında veya immobilizasyondan sonra enzim
aktif merkezinin zarar görmeyeceği bir yöntem seçilmelidir. Böyle bir
seçimin sağlıklı olabilmesi için enzimin yapısının çok iyi bilinmesi
gerekir. Enzim ile taşıyıcı arasında herhangi bir bağlanma söz konusu
ise ya bu bağlanmanın aktif merkez üzerinden gerçekleşmeyeceği
taşıyıcılar seçilmeli ya da immobilizasyon işlemi sırasında aktif merkez
korunmalıdır.
Çizelge 1.7 İmmobilizasyonda göz önünde bulundurulması gereken kriterler.
Enzim
Biyokimyasal Özellikler
Moleküler kütle, prostetik gruplar, protein yüzeyindeki
fonksiyonel gruplar, saflık
Kinetik Parametreler
Spesifik aktivite, pH ve sıcaklık profilleri, aktivite ve inhibisyon
için kinetik sabitler, çözgenlere karşı kararlılık, kontaminantlar
Taşıyıcı
Kimyasal Karakteristikler
Kimyasal temel ve komposizyon, fonksiyonel gruplar, kimyasal
kararlılık, por büyüklüğü, şişme özellikleri
Mekanik Özellikler
Partikül çapı, sedimentasyon sabiti, aşınma
İmmobilize
enzimler
İmmobilizasyon Metodu / Kütle Transfer Etkisi /
Kararlılık
Bağlı protein, aktif enzim verimi, gerçek kinetik parametreler,
difüzyon, operasyonel kararlılık, verimlilik
26
Enzim immobilizasyonu için değişik yöntemler kullanılabilir.
Bunların içinde aktivitenin en yüksek düzeyde korunduğu yöntemin
seçilmesi önemlidir. Ayrıca üretim için biyokatalizör açısından optimal
koşulların saptanmasında yalnız immobilizasyon yöntemi değil aynı
zamanda taşıyıcı ve reaktör tipi de önemli rol oynamaktadır (Şekil
1.17) (Cao, 2005).
Şekil 1.17 Enzim immobilizasyonu için genel prosedür
1.5 Silika
Silika (silikon dioksit) tetrahedral veya oktahedral SiO4’lerin
bağlanmasıyla oluşan inorganik bir polimerdir. Polimerin sonundaki
silisyum atomları hidroksil gruplarına bağlıdır. Silika amorf ve kristal
27
yapıda olabilir. 35 farklı kristal yapı bilinmektedir. HPLC kolon dolgu
maddesi olarak kullanılan silika amorf yapıdadır.
Silika nemli havaya maruz kaldığında yaklaşık % 5-10 (w/w) su
adsorblayan hidrofilik bir adsorbandır. Silika yüzeyi, Si atomlarıyla
koordinasyonuna göre üç çeşide ayrılan hidroksil grupları taşır: izole,
geminal ve yakın (hidrojen bağlarıyla bağlı). Bunlar IR spektroskopisi,
Si CP MAS NMR spektroskopisi ve diğer fizikokimyasal metodlarla
karakterize edilebilir. Tamamen hidroksillenmiş durumda, hidroksil
gruplarının yüzey konsantrasyonu, αOH, yaklaşık 8-9 μmol/m dir.
Genellikle adsorblanmış su vakumda 150 oC’ye maruz bırakılarak
silika yüzeyinden ayrılır.
Poröz silikanın çok yüksek sıcaklıkta su ya da su buharına maruz
bırakılması silikanın gözenek yapısında değişikliklere neden olur.
Bunun sonucunda, spesifik yüzey alanı azalır ve ortalama gözenek çapı
artar; ancak spesifik gözenek hacmi sabit kalır. Etkinin büyüklüğü,
ısıya ve hidrotermal işlemin süresine bağlıdır.
Yüzey hidroksil grupları pKa’sı yaklaşık 7,0 olan zayıf Bronsted
asitleridir. Ancak, tayin yöntemine göre pKa değerinin 2 ile 10 arasında
değişebileceği rapor edilmiştir. pKa değerlerinin geniş aralıklarda
değişmesinin nedeni silikadaki metal safsızlıklardır. Silikalar camdan
ya da önemli ölçüde sodyum, alüminyum titanyum vb. içeren kolloidal
silikadan üretilmiştir. Örnek olarak, alüminyum varlığında kuvvetli bir
Bronsted asiti olan Si-OH-Al oluşur.
28
Silika partiküllerinin net yükünün sıfır olduğu pH, pHzc ile
gösterilir ve pH 1,5 ile 3 arasında değişir. pHzc ’nin üzerindeki
değerlerde silika zayıf katyon değiştirici gibi davranırken; bu değerin
altında anyon değiştirici olarak davranır. Aşağıdaki iyon değişim işlemi
Allen ve Matijevic tarafından önerilmiştir:
Si-OH + M+ = Si-OM + H+
pH>8
Si-OH + OH = Si-O + H20
pH>8
Silika süspansiyonun pH’ı 3’ten 8’e çıktıkça yüzey giderek artan
negatif yükle yüklenir. Yüzey hidroksil gruplarının deprotonlanması
hızlı gerçekleşen bir prosesken, protonlama ise nispeten daha yavaştır.
pH 8’in üstünde silika, silikatlar halinde çözünür. Çözünürlük, pH
10’un üzerine çıktıkça üstel olarak artar.
Poröz silika, kullanımdan ve kimyasal modifikasyondan önce,
yüzey heterojenliğini azaltmak ve inorganik safsızlıkları uzaklaştırmak
için termal işlem ya da derişik asit çözeltisi (hidroflorik asit hariç) ile
muameleden oluşan bir aktivasyon işlemine tabi tutulur (Unger, 2002).
HPLC’de sıklıkla kullanılan silika matriksler sodyum silikatın
asitle muamelesi sonucu elde edilir. Silika yüzeyindeki silanol grupları
(Si-OH) onlara çok hidrofilik ve kolaylıkla modifiye edilebilen bir yapı
kazandırır. Silika matriksler sıkıştırılamaz ve bu nedenle HPLC
29
çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Ayrıca organik çözgenlerden
etkilenmezler ve mekanik olarak kararlıdırlar.
30
2. Materyal ve Metod
2.1 Materyal
Kullanılan
kimyasal
maddeler;
silikon
dioksit,
1-1’
karbonildiimidazol (CDI), 3aminopropil-silika jel, glutaraldehit, 2 (3,4
epoksisiklohekzil)
etil-silika
dimetilaminopropil)-N’-etil
disiklohekzil
karbodiimid
jel,
karbodiimid
(DCC),
süksinikanhidrit,
hidroklorür
N-hidroksisüksinimid
N-(3(EDC),
(NHS),
Coomassie Brillant Blue G250, N-benzoil-L-arginin-p-nitro anilid
(BAPNA), tripsin (1670 U/mg katı, 0,1 mg protein/mg katı) Sigma
Chemical Co.(St.Louis, CA)’den temin edilmiştir. Kullanılan diğer
kimyasallar analitik saflıktadır.
2.2 Tripsin Aktivite Tayini
Tripsin aktivitesi, sentetik bir substrat olan N-benzoil-L-argininp-nitroanilid (BAPNA) kullanılarak tayin edildi. Aktivite tayin yöntemi
Pritchett ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntemin (Pritchett et
al., 1981) tarafımızdan modifiye edilmiş halidir. Prosedürün temeli,
reaksiyon sonucu açığa çıkan p- nitro anilinin 410 nm’de
spektofotometrik tayinidir.
31
Serbest tripsin aktivite ölçümünde reaksiyon karışımı 2,72 ml 50
mM, potasyum fosfat tamponu (pH 7,5), 0,4 ml, 7,8 mM BAPNA ve
20 μl uygun tripsin preparatı (300 U) içerir. İmmobilize enzimin
aktivite ölçümünde ise reaksiyon karışımda; 20 μl serbest enzim yerine
10 mg immobilize tripsin preparatı kullanıldı. Reaksiyon karışımı,
37
o
C’de su banyosunda çalkalanarak 15 dakika inkübe edildi.
Reaksiyon 0,2 ml asetik asit (%99) ilave edilerek durduruldu. Açığa
çıkan p-nitro anilinin 410 nm’de absorbans okunarak spektrofotometrik
olarak belirlendi.
Bir tripsin aktivite birimi, optimum koşullarda dakikada 1 μmol
p- nitro anilinin açığa çıkaran enzim miktarı olarak ifade edilir (Unit ).
32
2.3 Protein Tayini (Bradford Metodu)
Tripsin preparatlarının ve immobilizasyon sonrası yıkama
sularının protein konsantrasyonlarının tayini Bradford (Bradford.,
1976) metodu ile gerçekleştirildi. Boya bağlama temelli yöntemlerin en
yaygını, Bradford tarafından geliştirilen ve Coomassie Brillant Blue
G-250 boyasının kullanıldığı yöntemdir. Yöntem, organik boyaların
asidik grupları ile proteinlerin bazik gruplarının (Lys, Arg) etkileşerek
renk oluşturmasını esas almaktadır.
Sığır serum albümininin (BSA), distile suda hazırlanmış 1
mg/ml’lik stok standart çözeltisinden 0,02-0,2 mg/ml konsantrasyon
aralığı ile hazırlanan standart grafiği kullanılarak örnek protein
konsantrasyonları hesaplandı (Çizelge 2.1).
Bradford reaktifi:
40 mg Coomassie Brillant Blue G250, %95’lik 50ml etanolde
çözülür, üzerine 55 ml % 88’lik fosforik asit ilave edilerek distile su ile
1 lt’ye tamamlanıp filtre edilir.
33
Çizelge 2.1 Protein Tayini (Bradford Metodu).
Standart
Kör
0,1 ml
Örnek
Distile su
Standart çöz.
0,1 ml
Örnek
0,1 ml
Reaktif
2 ml
2 ml
2 ml
Tüpler karıştırılıp oda sıcaklığında 10 dk bekletilir.
595 nm’de absorbans okunur.
2.4 Tripsin İmmobilizasyonu
Ticari olarak temin edilen tripsin silika tabanlı taşıyıcılar üzerine
kovalent bağlama yöntemi kullanılarak immobilize edildi.
Taşıyıcı olarak seçilen silikon dioksit, 3aminopropil-silika jel ve
2 (3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika jel, EDC, DCC, NHS ve
glutaraldehit gibi aktivasyon ajanları kullanılarak aktive edildi ve
aşağıda verilen çeşitli metodlar kullanılarak tripsin immobilizasyonu
gerçekleştirildi.
34
2.4.1 Silikon dioksit (Si) üzerine tripsin immobilizasyonu
1.yöntem (Si-CDI)
I. adım ( 1. ve 2. Yöntemler için ortak adım)
100 mg silikon dioksit
+
300 mg CDI / 5 ml DMSO (susuz)
25 oC’de karıştırılarak
2 saat İnkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si-CDI) DMSO ile yıkandı.
II. adım
Si-CDI
+
4 ml 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi (1 mg protein/ml)
25 oC’de gece boyu inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda
protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
Şekil 2.1 CDI ile aktiflenmiş silikon dioksitte tripsin immobilizasyonu
35
2.yöntem (Si-CDI-KaproikasitDCC/NHS)
II. adım
Si-CDI
+
0,05 mmol ε amino nkaproikasit / 5 ml 0,1 M pH 8,0
fosfat tamponu
4 oC’de 12 saat
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si –
kaproik COOH ) aynı tamponla
yıkandı
III. adım
Si –kaproik COOH
+
DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75
mmol) / 5 ml DMF
6 saat oda sıcaklığında
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si –
COO-NHS) DMF ile yıkandı
IV. adım
Si – COO-NHS
+
4 ml 0,1 M pH 7,0 MeIm7
tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mgprotein/ml )
4 oC’de 12 saat
inkübasyon
Santrifüj ardından çökelek
aynı tampon ile üst fazda
protein gözlenmeyinceye kadar
yıkandı.
36
Şekil 2.2 Si-CDI-Kaproikasit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
37
3.yöntem (Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS)
I. adım (3. ve 4. yöntemler için ortak)
100 mg silikon dioksit
+
10 mg süksinik anhidrit / 5 ml DMF
2 saat oda sıcaklığında inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si – COOH) DMF ile yıkandı
II. adım
Si – COOH
+
EDC (1 mg/ml) / NHS (0,1 mg/ml) / 5 ml MeIm7 tamponu
6 saat oda sıcaklığında inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) bidistile H2O ile yıkandı.
III. adım
Si – COO-NHS
+
4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg-protein/ml )
4 oC’de gece boyu inkübe edildi
Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda
protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
38
Şekil 2.3 Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
39
4. yöntem (Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS)
II. adım
Si – COOH
+
DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF’de
6 saat oda sıcaklığında
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) DMF ile yıkandı.
III. adım
Si – COO-NHS
+
4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg-protein/ml )
4 oC’de gece boyu
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda
protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
40
Şekil 2.4 Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
41
2.4.2 3 aminopropil-silika (Si APTES) üzerine tripsin immobilizasyonu
5. yöntem (Si APTES – Glutaraldehit)
I. adım
100 mg Si APTES
+
4,9 ml pH 8,0 fosfat tamponu
+
0,1 ml %25 glutaraldehit
25 oC’de 15 dk İnkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek bidistile H2O ile yıkandı.
II. adım
Si APTES – Glutaraldehit
+
4 ml pH 8,0 fosfat tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi (1mg-protein/ml )
4 oC’de gece boyu
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda
protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
42
Şekil 2.5 Si APTES – Glutaraldehit üzerine tripsinin immobilizasyonu
43
6. yöntem (Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS)
I. adım (6, 7 ve 8. yöntemler için ortak)
100 mg Si APTES
+
10 mg süksinik anhidrit / 5 ml DMF
2 saat oda sıcaklığında
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si – COOH) DMF ile yıkandı.
II. adım
Si – COOH
+
DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF
6 saat oda sıcaklığında
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) DMF ile yıkandı
III. adım
Si – COO-NHS
+
4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi. (1 mg-protein /ml)
4 oC’de 12 saat
Santrifüj sonrası çökelek
aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
44
Şekil 2.6 Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
45
7. ve 8. yöntem
II. adım
Si – COOH
+
4 ml 50 mM pH 7,2 HEPES tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg protein /ml )
4 oC’de 2 saat inkübasyon
7.yöntem (Si APTES –Süksinik
anhidrit-EDC/NHS)
+
20 mg EDC / 20 mg NHS
Oda sıcaklığında
2 saat inkübasyonun
ardından gece boyu
4 oC’de karıştırıldı
Santrifüj sonrası
çökelek aynı tampon
ile üst fazda protein
gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
8.yöntem ((Si APTES –Süksinik
anhidrit-EDC)
+
20 mg EDC
Oda sıcaklığında
2 saat inkübasyonun
ardından gece boyu
4 oC’de karıştırıldı
Santrifüj sonrası
çökelek aynı tampon
ile üst fazda protein
gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
46
Şekil 2.7 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
47
Şekil 2.8 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC üzerine tripsinin immobilizasyonu
48
9. yöntem (Si APTES-PEGSüksinik anhidrit-DCC/NHS)
I. adım
1 g PEG 6000
+
150 mg CDI / 5 ml DMSO
25 oC’de 2 saat
inkübasyon
Yıkama yapılmadan 150 mg
Si APTES üzerine ilave edildi.
4 oC’de 12 saat
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (silikaPEG) saf su ile yıkandı
II. adım
100 mg silika-PEG
+
10 mg süksinik anhidrit / 5 ml
DMF
2 saat oda sıcaklığında
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si –
PEG-COOH) DMF ile yıkandı.
III. adım
Si APTES –PEG-COOH
+
DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75
mmol) / 5 ml DMF
6 saat oda sıcaklığında
inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Si
APTES –PEG-COONHS)
DMF ile yıkandı
IV. adım
Si APTES –PEG-COONHS
+
4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi. ( 1 mgprotein/ml )
4 oC’de gece boyu
İnkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek
aynı tampon ile üst fazda protein
gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
49
Şekil 2.9 Si APTES-PEG-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
50
2.4.3 2(3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika jel (Silika
tripsin immobilizasyonu
epoksi)
üzerine
10.yöntem (Si epoksi)
100 mg Silika epoksi
+
4 ml 0,1 M pH 8,0 fosfat tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg-protein/ml )
4 oC’de gece boyu inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek aynı tampon ile üst fazda protein
gözlenmeyinceye kadar yıkandı.
Şekil 2.10 Si epoksi üzerine tripsinin immobilizasyonu
51
11. yöntem (Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS)
I. adım
100 mg Silika epoksi
+
5 ml 0,1 M pH 8,0 fosfat tamponu
+
0,05 mmol ε amino n- kaproikasit
4 oC’de 12 saat inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Silika epoksi –kaproik COOH) 50 mM pH 8,0
fosfat tamponu ile yıkandı.
II. adım
Silika epoksi –kaproik COOH
+
DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF
6 saat oda sıcaklığında inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek (Silika epoksi –kaproik COO NHS) DMF ile
yıkandı.
III. adım
Silika epoksi –kaproik COO NHS
+
4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu
+
1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg protein/ml )
4 oC’de 12 saat inkübasyon
Santrifüj sonrası çökelek üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar
yıkandı.
52
Şekil 2.11 Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu
53
2.5 Silika Üzerine İmmobilize Edilmiş Tripsinin Karakterizasyonu
Taşıyıcıya bağlama sonucu enzim molekülünün fiziksel ve
kimyasal özelliklerinin değişmesi doğaldır. Enzim molekülünün
hareket yeteneği sınırlanır, konformasyonu değişir, Kovalent bağlama
durumunda
yükü
ve
kimyasal
yapısı
değişir.
Teorik
olarak
immobilizasyondan sonra enzimin spesifik aktivitesinde düşme
beklenir. Fakat hiç değişmediği veya arttığı durumlarda söz konusudur.
İmmobilize ve serbest enzimlerin aktivitelerinin kıyaslanabilmesi
için taşıyıcıya bağlanan enzim miktarının bilinmesi gerekir. Bu amaçla
immobilizasyon öncesi ve sonrası enzim (serbest ve immobilize)
aktiviteleri belirlendi. Benzer şekilde serbest enzim ve immobilizasyon
sonrası yıkama sularında protein tayinleri Bradford yöntemine göre
gerçekleştirildi.
İmmobilizasyon verimleri gerek aktivite gerekse protein miktarı
cinsinden başlangıç ve yıkama sularındaki bağlanmayan enzim miktarı
arasındaki farktan hesaplanarak belirlendi. Test edilen 11 farklı
immobilizasyon
yöntem
sonuçları
kıyaslanarak
tripsin
immobilizasyonu için uygun metod olarak belirlendi ve bu metodla
gerçekleştirilen immobilize tripsin preparatlarında optimizasyon ve
karakterizasyon çalışmaları serbest enzimle kıyaslamalı olarak yapıldı.
54
2.5.1 İmmobilizasyon verimine protein miktarının etkisi
Enzimatik olarak yürüyen bir reaksiyonun hızı, reaksiyon
koşullarına bağlıdır. Bunlardan en önemlisi enzim konsantrasyonu
olup, diğerleri substrat konsantrasyonu, ortamın pH’sı ve sıcaklığı,
aktivatör ve inhibitörlerin varlığı olarak sıralanabilir.
İmmobilizasyon etkinliğine protein miktarının etkisini incelemek
amacıyla immobilizasyon için seçilen Si
APTES
–Süksinik anhidrit-EDC
yönteminde enzimin farklı protein miktarları (2-20mg / g taşıyıcı)
kullanılarak immobilizasyon gerçekleştirildi ve immobilizasyon için en
uygun protein miktarı belirlendi.
2.5.2 Sıcaklık
Tüm kimyasal reaksiyonlar gibi enzim katalizli reaksiyonlar da
sıcaklığa bağımlıdır ve reaksiyon hızı sıcaklıkla artar. Fakat bu artış
sürekli olmayıp belli bir derecenin üzerinde, inkübasyon zamanına
bağımlı olarak önce duraklama daha sonra da gerileme şeklinde kendini
göstermektedir.
Serbest ve immobilize enzim aktivitesine sıcaklığın etkisi
genellikle optimum eğrileri çizilerek belirlenir. Bu grafik bağıl
aktivitenin sıcaklık ile değişimini gösterir. Genellikle inkübasyon
süresi arttıkça termal denatürasyon nedeniyle optimum sıcaklık düşer.
İmmobilizasyon sonrası da enzimin optimum sıcaklığı genellikle
değişir.
55
Serbest
ve
immobilize
tripsin
aktivitelerinin
sıcaklığa
bağımlılığını belirlemek amacı ile 4-70oC sıcaklık aralığında (4, 10, 20,
30, 37, 50, 60, 70 oC) çalışıldı ve her iki formun optimum sıcaklık
değerleri belirlendi.
2.5.3 pH
Enzimler protein yapısındaki moleküller olduklarından katalitik
aktiviteleri çevre koşullarından oldukça etkilenmektedir. Bunlardan
biriside ortamın pH’ıdır. İnkübasyon ortamının pH’sı protein
molekülünün tamamının yük ve dissosiasyon durumu yanında aktif
merkezini de etkilemektedir. Bu nedenle pH-aktivite ilişkisinin
incelenmesi,
enzim
proteinlerinin
yapı
fonksiyon
ilişkilerinin
anlaşılması açısından faydalıdır.
pH’ın serbest ve immobilize enzim aktivitelerine etkisini
incelemek
için
inkübasyon
tamponunun
pH’ı
4-12
arasında
değiştirilerek standart koşullarda aktiviteleri ölçüldü. İnkübasyon
karışımlarının içerdiği tampon türü ve pH değerleri; asetat (pH 4 - 5),
sitrat (pH5 – 6), fosfat (pH 6 -7 -8 - 11 - 12), borat (pH 8 - 9 - 10). Her
bir pH değeri için iki örnek ve bir kör deneme yapıldı.
2.5.4 Substrat Konsantrasyonu
Serbest
ve
immobilize
tripsin
aktivitelerinin
substrat
konsantrasyonuna bağımlı değişimleri substrat olarak BAPNA
kullanılarak belirlendi. Bu amaçla hazırlanan denemede farklı
56
konsantrasyonlarda
(0,3–3
mM)
BAPNA
kullanılarak
standart
koşullarda aktivite tayini yapıldı.
2.6 Kararlılık Testleri
İmmobilize enzim preparatları özellikle endüstriyel proseslerde
kullanılacaklarsa en önemli kriterlerden birisi bu preparatların
kararlılığıdır. İmmobilize enzimin kararlılığından anlaşılan belirli
çalışma koşullarında enzim aktivitesinin zaman bağımlı olarak
korunmasıdır. Bu sıradaki enzim aktivite kaybı çeşitli nedenlere
dayanır. Bunlar, mikrobiyal yıkım, termal, pH veya kimyasal
inaktivasyon
olarak
sıralanabilir.
Bunun
dışında
taşıyıcının
parçalanması veya başka sebepler ile enzim kaçışı da aktivite kaybına
neden olur.
İmmobilize enzimin depo ve operasyonel kararlılıkları da önemli
parametrelerdir. Genellikle immobilize enzimlerin depo kararlılıkları
serbest enziminkinden daha iyidir. Ancak tersi durumlarla da
karşılaşılmaktadır. Depo kararlılığı uzun süre saklama durumunda
enzimin aktivite kaybının bir ölçüsüdür. Bu süre içinde enzimin
katalitik potansiyelinden yararlanılmaz yani enzim iş yapmaz. Halbuki
operasyonel kararlılık enzimin iş yapma süresince aktivitesindeki
değişmeyi gösteren bir parametredir. Operasyonel kararlılık ne kadar
yüksek ise enzimin katalitik potansiyelinden o ölçüde yararlanılabilir.
Operasyonel kararlılığın ölçüsü ise enzimin reaktördeki yarı ömrüdür
(t1/2). Yani enzim aktivitesinin yarısının kaybolması için geçen süredir.
57
2.6.1 Termal kararlılık
Enzimler protein yapıda oldukları ve ısıya karşı kararlı
olmadıklarından, sıcaklık yükseldikçe inkübasyon süresine bağımlı
olarak aktivite kaybı hızlanır. Sıcaklık sabit tutulsa bile yalnız
inkübasyon süresinin uzaması bile denatürasyon sonucu aktivite
kaybına neden olur. Eğer bir enzimin termal kararlılığı immobilizasyon
ile değişiyorsa böyle enzimlerin kullanımı pek çok alanda yaygın
olacaktır.
Termal kararlılığın belirlenmesi amacıyla, ayni miktar protein
içeren serbest ve immobilize enzimler 30 dakika boyunca farklı
sıcaklıklarda (4, 20, 10, 30, 40, 50, 60, 70 oC) inkübe edildi ve optimum
koşullarda aktiviteleri ölçüldü.
2.6.2 pH kararlılığı
Enzim aktivitesi üzerine pH kararlılığının etkisini incelemek
amacıyla farklı pH’lardaki (7, 8, 9, 10, 11, 12) tamponlarda serbest ve
immobilize enzim preparatları 30 dakika oda sıcaklığında bekletildi ve
optimum koşullarda aktiviteleri ölçüldü.
58
2.6.3 Depo kararlılığı
Depo kararlılığı, immobilize enzim uygulamalarını ilgilendiren
önemli bir parametre olup uzun süre saklama durumunda enzimin
aktivite kaybının bir ölçüsüdür.
Depo kararlılığını belirlemek için 4 oC’de aynı koşullarda
saklanan serbest ve immobilize enzimlerden belirli zaman aralıklarıyla
örnekler alınarak aktiviteleri optimum koşullarda tayin edildi.
2.6.4 Operasyonel kararlılık
Enzimlerin
operasyonel
kararlılığı,
immobilize
enzimlerin
endüstriyel uygulamalarında önemli bir parametredir. İmmobilize
enzimin operasyonel kararlılığı için, farklı tüplerde değişen inkübasyon
süreleriyle aktivite tayini yapıldı. Operasyon zamanı ile enzim
aktivitesindeki azalma arasındaki ilişki belirlenerek biyokatalizörün
yarı ömrü (t1/2) hesaplandı.
59
3. Sonuçlar ve Tartışma
3.1 Tripsinin Silika Tabanlı Taşıyıcılar Üzerine Kovalent Bağlama
ile İmmobilizasyonu
İmmobilize tripsin başlıca; peptit sentezi ve özellikle proteom
analizlerinin kilit adımı olan peptit haritalamada kullanılır ki; bu da
hastalık
teşhisi,
ilaç
etkileşimleri
için
potansiyel
hedefin
görüntülenmesi, rekombinant DNA teknolojisiyle üretilen proteinlerin
kalite kontrolü gibi alanlardaki çalışmalar için en önemli adımlardan
birisidir. Tripsin ile yapılan immobilizasyon çalışmaları oldukça
fazladır (Unen et al., 2001; Wu et al., 2004; Malmsten et al., 2000;
Bisswanger et al., 2001; Wu et al., 2005; Xi et al., 2004). Bu çalışmada
silika tabanlı taşıyıcıların yüzey kimyası değiştirilerek tripsin
immobilizasyonu için uygun şartlar belirlendi.
Taşıyıcıya kovalent bağlama ile enzim immobilizasyonunda ilk
adım
taşıyıcının
aktivasyonudur.
Çalışmamızda
silika
tabanlı
taşıyıcıların aktivasyonu için CDI, EDC, DCC ve glutaraldehit gibi
aktifleyici ajanlar kullanılarak tripsin immobilizasyonu gerçekleştirildi.
Her bir immobilizasyon yöntemi için aktivite ve protein cinsinden %
immobilizasyon
verimleri
hesaplandı.
Elde
edilen
sonuçlar
kıyaslanarak tripsin için uygun taşıyıcı ve immobilizasyon metodu
belirlendi. İmmobilize enzim ve serbest enzim için karakterizasyon
çalışmaları yapıldı. Bunun için optimum sıcaklık, optimum pH, termal
kararlılık, pH kararlılık, depo kararlılığı ve kinetik sabitleri belirlendi.
60
Tripsinin silika tabanlı taşıyıcılarda immobilizasyonuna ait
sonuçlar çizelge 3.1’de verildi. Çizelgeden görüldüğü gibi en yüksek
aktivite verimi Si
APTES
–Süksinik anhidrit-EDC (yöntem 8) ile elde
edildi. Bu nedenle bu yöntemle hazırlanan enzim preparatının
karakterizasyonu gerçekleştirildi.
Çizelge 3.1 Silika tabanlı taşıyıcılara tripsin immobilizasyonu için kullanılan
yöntemler.
Yöntem
% İmmobilizasyon
Verimi
Protein
Aktivite
1 Si-CDI
44
2
2 Si-CDI-Kaproikasit-DCC/NHS
34
2
3 Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS
39
2
4 Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS
33
1
5 Si APTES – Glutaraldehit
17
3
6 Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS
37
4
7 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS
100
6
8 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC
89
12
9 Si APTES-PEG-Süksinik anhidrit-DCC/NHS
32
3
10 Si epoksi
15
3
11 Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS
27
3
61
3.1.1 Taşıyıcının aktivasyonuna EDC miktarının etkisi
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid
(EDC),
polipeptid
sentezinde en yaygın kullanılan bağlama ajanlarından biridir.
Karbodiimidler, karboksilatları bir O-açilüre oluşturmak için aktive
ederek, karboksilik asitler ve aminler arasında amid bağlarının
oluşumunu katalizler (Pascual et al., 2003). Yöntem Hoare ve
Koshland (Hoare and Koshland, 1967) tarafından geliştirilmiştir.
Reaksiyon
basittir
ve
sulu
çözeltide
oda
sıcaklığında
gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, karbodiimidler oldukça kararsız
moleküllerdir; diğer fonksiyonel gruplarla örneğin sülfidril (Carraway
and Triplett, 1970) veya amino grupları (Kurzer et al., 1967), tirozin
(Carraway et al., 1968), su ve diğer bileşenlerle kolayca reaksiyon
verebilirler.
Taşıyıcı
(Si
APTES
–Süksinik
anhidrit)
aktivasyonu
için
kullanılacak olan uygun EDC miktarını belirlemek için gram taşıyıcı
başına değişen miktarlarda (0,25-2 mmol) EDC kullanılarak aktivasyon
gerçekleştirildi. Farklı miktarlarda EDC ile aktive edilmiş taşıyıcılara
100 mg tripsin preparatı (10 mg protein/g katı) kullanılarak
immobilizasyon yapıldı ve % immobilizasyon verimleri hesaplandı
(Çizelge 3.2). Gram taşıyıcı başına 0,25 mmol EDC oranında en
yüksek aktivite verimi elde edildi.
62
Çizelge 3.2 Farklı EDC/g taşıyıcı oranlarında immobilizasyon verimi.
EDC miktarı
(mmol/g
% İmmobilizasyon
Verimi
taşıyıcı)
Protein
Aktivite
0,25
88
15
0,5
88
12,2
1
89
11,8
1,5
88
11
2
91
10,8
Genellikle daha fazla aktivasyon ajanı kullanımı ile (aktiflenmiş
karboksil gruplarının sayısında artış), immobilizasyon veriminde ve
dolayısıyla enzim aktivitesinde artışı beklenir. EDC’nin fazlasının
kullanılmasıyla aktivite cinsinden % immobilizasyon veriminde
görülen düşme; sadece tripsin ve taşıyıcı arasında değil aynı zamanda
EDC’nin tamamen hidrolizinden önce tripsinler arasında da amid
bağlarının oluşabilmesiyle açıklanabilir.
Enzimin bir miktarının kendi içinde çapraz bağlanması
moleküllerin
konformasyonel
hareketlerini
sınırlayarak
enzim
aktivitesinde düşüşe neden olur. Literatürde benzer örnekler vardır
(Kan et al., 2005, Ferreira et al., 2003, Park et al., 2002, Yang et al.,
2004).
63
3.1.2 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının
belirlenmesi
Aktivasyon oranı belirlendikten sonra bağlanan proteinin
optimizasyonu için; taşıyıcı ve aktifleyici ajan miktarı sabit tutularak
farklı protein konsantrasyonlarında tripsin preparatları kullanılarak aynı
koşullarda immobilizasyon gerçekleştirildi.
Çizelge 3.3 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının
belirlenmesi.
Tripsin
Bağlanan
(mg protein / g
protein (mg/
taşıyıcı)
g taşıyıcı
2
% İmmobilizasyon Verimi
Protein
Aktivite
2
100
29,7
5
5
100
21,2
10
9,6
96
15,7
15
14,25
95
12,5
20
18,6
93
10,7
Enzim miktarı 2 mg’dan fazla olduğunda % immobilizasyon
veriminde düşme gözlendi. Aktivite cinsinden % immobilizasyon
verimindeki düşmeye rağmen taşıyıcıya bağlanan tripsin miktarı açık
bir şekilde artmaktadır (Çizelge 3.3). Bağlanan tripsin fazla olduğunda
enzimlerin sıklıkla bağlanması nedeni ile gerçekleşen yapısal
64
değişiklikler enzim ve substrat arasındaki etkileşimi engelleyebilir.
Sonuç olarak da; enzim aktivitesi düşebilir (Kan et al., 2005).
Bundan sonraki çalışmalara gram taşıyıcı başına 2 mg protein
içeren tripsin preparatı kullanılarak devam edildi.
3.2 İmmobilize Tripsinin Karakterizasyonu
3.2.1 Sıcaklık etkisi
Enzimlerin katalitik aktivitesi sıcaklığa bağımlıdır. Serbest ve
immobilize enzimlerin aktivitelerine sıcaklığın etkisi genellikle
optimum eğrileri çizilerek izlenmektedir. Bağıl aktivitenin sıcaklıkla
değişimini gösteren bu grafikten enzim için optimum sıcaklık değeri
belirlenir.
Sıcaklığın serbest ve immobilize tripsin aktivitesine etkisi bölüm
2.5.2’de açıklandığı gibi ayni miktar protein içeren serbest ve
immobilize enzimin aktivitelerinin farklı sıcaklıklarda standart
koşullarda ölçülmesiyle belirlenmiş ve bu ilişki Şekil 3.1’de verilmiştir.
65
Şekil 3.1 Serbest ve immobilize tripsin aktivitesinin sıcaklığa bağımlı değişimi
Genellikle hayvansal kaynaklı tripsinlerin optimum sıcakılık
değerleri 40-65 oC arasında değişmektedir (Guyonnet et al., 1999,
Ahsan , 2001, Venkatesh et al., 1998, Kishimura et al., 2002). Şekil
3.1’den görüldüğü gibi serbest ve immobilize enzim için optimum
sıcaklık değeri 50 oC olarak bulundu. Bu da immobilizasyon işleminin
tripsinin optimum sıcaklığında bir etkisi olmadığını göstermektedir.
Enzimler protein yapıdaki büyük ve oldukça komplike moleküllerdir.
Aktivitesinin korunması için üç boyutlu yapısı korunmalıdır.
Aktiviteye etki eden önemli parametrelerden biri de sıcaklıktır.
Reaksiyon hızı sıcaklık arttıkça artar. Fakat belirli sıcaklıktan sonra
enzim proteinin denaturasyonundan dolayı aktivitede düşme olur.
Enzimin maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık (optimum sıcaklık)
özellikle operasyonel bir parametre olması açısından önemlidir.
Literatürlerde çeşitli taşıyıcılarda immobilize edilmiş glukoz izomeraz,
66
lösin aminopeptidaz, kimotripsin, tripsin ve asparaginaz gibi bazı
enzimlerin
optimum
sıcaklıklarının
immobilizasyon
sonrasında
değişmediği örnekler mevcuttur (Önal, 2000).
İmmobilizasyondan sonra yapılan sıcaklık etkisi ile ilgili
çalışmalarda genellikle daha iyi bir yorum yapabilmek için Arrhenius
diyagramları oluşturulur. Bağıl aktivitelerin logaritması ile 1/T arasında
çizilen bu grafikten aktivasyon enerjileri (Ea) hesaplanır. Ea, bu grafiğin
eğimi ve genel gaz sabiti (R) ile doğru orantılıdır ve reaktant
molekülün ürüne çevrilebilmesi için sahip olması gereken minimum
enerji miktarıdır. Aktivasyon enerjisi immobilizasyon sonucu artar
veya azalabilir (Önal, 2000). Çizilen Arrhenius diyagramlarından
aktivasyon enerjisi (Ea), Ea = eğim x R (R=8,314 J.K-1.mol-1) formülü
kullanılarak hesaplanır.
Serbest ve immobilize tripsin için çizilen
Arrhenius diyagramlarından (Şekil 3.2) aktivasyon enerjisi serbest
enzim için 23,4 kjmol-1 ve immobilize enzim için ise 57,3 kjmol-1
olarak hesaplandı. İmmobilize enzim için aktivasyon enerjisinin yüksek
olması genellikle kullanılan enzim immobilizasyon yönteminin
özellikle kovalent bağlama yöntemlerinde enzim moleküllerinin
yapısında bazı değişiklikler yarattığı ve bu nedenle enzim katalizli
reaksiyonun engellendiği şeklinde açıklanmaktadır (Rashid and
Siddiqui, 1998; Krajewska et al., 1990).
67
(a)
Şekil 3.2 İmmobilize (a) ve serbest (b) enzime ait Arrhenius diyagramları
68
3.2.2 pH etkisi
Enzim aktivitesini etkileyen faktörlerden en önemlisi pH
etkisidir. Bir enzimin pH optimumu; reaksiyon süresi, sıcaklık, substrat
yapısı ve konsantrasyonu, kullanılan tamponun türü ve konsantrasyonu,
ortamın iyonik şiddeti, enzimin saflığı gibi bir seri deneysel
parametreye bağımlı bir değişkendir. Biyokimyasal reaksiyonlar in vivo
koşularda sulu ortamda gerçekleştiğinden pH enzimin yük durumunu
dolayısıyla aktivitesini çok etkiler. Hayvansal kaynaklı tripsinlerin
optimum pH değerleri genellikle 7,0-9,5 arasında değişmektedir
(Asgeirsson et al., 1989, Kishimura et al., 2002, Fengna et al., 2004)
Serbest ve immobilize tripsin aktivitesine pH etkisi ve optimum pH
bölüm 2.5.3’te açıklandığı gibi belirlenerek Şekil 3.3’de verilmiştir.
Serbest ve immobilize enzim için optimum pH sırasıyla 8,0 ve 9,0
olarak belirlendi.
69
(a)
(b)
Şekil 3.3 İmmobilize (a) ve serbest (b) tripsin aktivitesinin pH’ya bağımlı değişimi.
70
Enzimin immobilizasyonundan sonra pH değişimi üç faktör ile
açıklanabilir:
1.Destek materyalinin polianyonik veya polikatyonik karakteri
2.Enzim molekülünün immobilizasyon sırasında modifikasyonu
3.Enzimatik reaksiyon sonrası ürünlerin asidik ya da bazik
olmasıdır (Zihnioğlu, 1992).
İmmobilize enzimin optimum pH değerinin bazik bölgeye
kayması, Şekil 2.8’de görülen mekanizma ile taşıyıcıya amino
gruplarından bağlanan enzimin sahip olduğu pozitif yüklü grup
sayısında immobilizasyon sonrasında meydana gelen azalma nedeniyle,
enzimin daha polianyonik karakter kazanmasından kaynaklanmaktadır
(Fengna et al., 2004, Kilinc et al., 2002).
3.2.3 Substrat konsantrasyonun etkisi
İmmobilizasyon sırasında enzim proteinindeki konformasyonel
değişiklikler, sterik etkiler, mikroçevre etkileri ve difüzyon etkileri,
immobilize enzimlerin serbest enzimden farklı kinetik davranışlar
göstermesine neden olurlar. O nedenle immobilize enzimlerin kinetik
davranışlarının incelenmesi, kinetik sabitlerinin tayini ve serbest
enzimle kıyaslanması oldukça önemlidir. Serbest ve immobilize tripsin
aktivitelerinin substrat konsantrasyonuna bağlı değişimleri 0,3-3 mM
aralığındaki konsantrasyonlarda BAPNA kullanılarak belirlendi.
BAPNA konsantrasyonunun aktivite üzerine etkisi Şekil 3.4’te verildi.
71
(a)
(b)
Şekil 3.4 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin aktivitelerinin BAPNA
konsantrasyonununa bağımlı değişimleri.
72
Serbest
ve
immobilize
tripsin
aktivitelerinin
substrat
konsantrasyonuna bağlı değişimleri belirlendikten sonra kinetik
parametrelerin tayini için Lineweaver-Burk diyagramları çizildi (Şekil
3.5).
(a)
(b)
Şekil 3.5 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin Lineweaver-Burk diyagramı
73
Bilindiği gibi Km (Michaelis sabiti) bir enzimatik reaksiyonda,
reaksiyon hızının maksimum hızın yarısına ulaştığı andaki substrat
konsantrasyonunu ifade eder ve substratın enzime olan ilgisinin
ölçüsüdür. Yüksek bir Michaelis sabiti, yarı doygunluğa ulaşabilmek için
yüksek bir substrat konsantrasyonu gerektiğini ve enzimin adı geçen
substrata ilgisinin yüksek olmadığını gösterir. Çizelge 3.4’te immobilize
ve serbest enzimlerin kinetik parametreleri verildi.
Çizelge 3.4 Serbest ve immobilize enzimin kinetik sabitleri.
Serbest Enzim
Substrat
BAPNA
Km
İmmobilize Enzim
Km
V max
V max
(mM)
(μmol/dak/mg)
(mM)
(μmol/dak/mg)
0,56
9
0,6
2,1
Serbest tripsin için Km değerinin hayvansal kaynaklı tripsinler
(Guyonnet et al., 1999, Ahsan , 2001) ile benzer olduğu gözlendi.
Çizelge 3.4’te görüldüğü gibi serbest ve immobilize enzimlerin Km
değerleri arasında mertebe açısından önemli bir değişiklik yoktur.
İmmobilizasyon sonrasında enzimin Km değerinde bir değişim
olmaması
enzimin
katalitik
bölgesinin
immobilizasyondan
etkilenmediğini göstermektedir (Önal, 2000).
3.3 Kararlılık Testleri
İmmobilize enzimin stabilitesinden anlaşılan, belirli çalışma
koşullarında enzim aktivitesinin zamana bağımlı olarak korunmasıdır.
Enzimlerin kararlılığı denince proteinin konformasyonel kararlılığından
74
söz edilir. Enzimin termal, pH ve depo kararlılıkları büyük ölçüde
konformasyonel kararlılığı ile belirlenir ve denaturasyon sonucu da
inaktivasyon gerçekleşir. Enzim aktivite kaybı değişik nedenlere (pH
veya kimyasal inaktivasyon vb.) dayanır (Telefoncu,1997).
3.3.1 Termal kararlılık
Enzimlerin
kararlılığına
etki
eden
parametrelerden
birisi
sıcaklıktır. Genellikle enzimler düşük sıcaklıklarda daha kararlı
olurken, yüksek sıcaklıklarda hızla termal denatürasyon gerçekleşir.
Serbest ve immobilize tripsinin termal kararlılıkları bölüm 2.6.1’de
açıklandığı gibi belirlendi.
Şekil 3.6 Serbest ve immobilize tripsinin termal kararlılığı
75
Termal kararlılık denemeleri sonucunda immobilize enzimin
yüksek sıcaklıklarda bile aktivite göstermeye devam ettiği, serbest
tripsinin 70 °C sıcaklıkta aktivitesinin % 74’ünü kaybederken,
immobilize tripsinin ise % 23 oranında aktivitesini kaybettiği görüldü
(Şekil 3.6). Benzer olarak sığır pankreatik tripsini için yapılan
denemelerde enzimin 50 °C’ ye dek aktivitesini büyük ölçüde
koruduğu ve bu sıcakılığın üzerindeki sıcaklıklarda aktivitesini hızla
kaybettiği belirtilmiştir (Fernandez et al., 2005). Çeşitli immobilize
tripsin preparatlarının da 70-80 °C’ ye dek kararlı olduğu belirtilmiştir
(Montero et al., 2007, Fernandez et al., 2005).
İmmobilizasyon sonrasında enzimin termal kararlılığı artabilir,
azalabilir ya da hiç değişmez. Fakat genellikle immobilizasyon işlemi
enzimin termal kararlılığını arttırmaktadır (Telefoncu, 1997; Mitsutomi
et al., 1985; Hayashi et al., 1993).
3.3.2 pH kararlılığı
Enzimler protein olduklarından, kararlılıklarına etki eden her
faktör, proteinin sekonder, tersiyer ve/veya kuarter yapılarını etkiler.
Çoğu enzim, aşırı asidik ya da bazik koşullarda tersinmez
denatürasyona uğrar. Bir enzimin pH kararlılığı inkübasyon koşulları,
inkübasyon süresi, sıcaklık, tampon türü ve konsantrasyonu, substrat
konsantrasyonu ve iyonik şiddet gibi birçok faktör ile modifiye
edilebilir. Serbest ve immobilize tripsinin pH kararlılığı, bölüm
2.6.2’de açıklandığı gibi belirlendi.
76
Şekil 3.7 Serbest ve immobilize tripsinin pH kararlılığı
İmmobilize enzimin özellikle bazik bölgede (pH 8-12) serbest
enzime göre daha kararlı bir yapıya sahip olduğu görüldü. Hayvansal
kaynaklı tripsin genelde pH 6-9 arasında kararlıdır (Kishimura et al.,
2002, Fengna et al., 2004). Silika jel ile desteklenmiş kitosan
buncuklara immobilize tripsinin serbest enzime kıyasla bazik bölgede
daha yüksek bir kararlılık gösterdiği belirtilmiştir (Fengna et al., 2004).
3.3.3 Depo kararlılığı
Depo kararlılığı, özellikle immobilize enzimlerin uygulama alanı
ile ilgili önemli bir faktördür. Depo kararlılığı, enzimin saklama
koşullarına bağlı bir parametredir. Genellikle, suda çözünmez enzim
preparatları ya liyofilize edilerek ya da süspansiyon şeklinde 4-5 °C’de
saklanabilirler.
77
Serbest ve immobilize tripsinin depo kararlılıkları bölüm 2.6.3’de
anlatıldığı gibi belirlendi. Grafikten de görüldüğü gibi immobilize
tripsin,
40
gün
sonunda
aktivitesini
hâlâ
büyük
oranda
(~ %95) korurken serbest enzim % 61 oranında korumuştur. Monolitik
silika üzerine immobilize edilmiş sığır pankreatik tripsinin 6 ay
sonunda aktivitesini ~ %90 oranında koruduğu belirtilmiştir (Ota et al.,
2006).
Şekil 3.8 Serbest ve immobilize tripsinin depo kararlılığı
78
3.3.4 Operasyonel kararlılık
Operasyonel
kararlılık,
enzimin
iş
yapma
süresince
aktivitesindeki değişmeyi gösteren bir parametredir ve operasyon süresi
ve operasyon sıcaklığına bağlı olarak değişir. Ayrıca bir enzimin
katalitik potansiyeli operasyonel kararlılığı ile orantılıdır. Operasyonel
kararlılığın ölçüsü, enzimin reaktördeki yarı ömrüdür ve t1/2 ile ifade
edilir. Daha doğru bir tanımlama ile, enzim aktivitesinin yarısının
yitirilmesi için geçen zamandır ve şu eşitlikle hesaplanır:
Ar = A0 exp (-kD t)
t1/2 = 0,693 / kD
t operasyon süresini, kD bozunma katsayısını, A0 ve Ar ise
sırasıyla başlangıç ve t anındaki enzimatik aktiviteyi göstermektedir
(Calsavara, 2000). Yapılan hesaplama sonucunda enzimin yarı ömrü
(t1/2) yukarıdaki formülden yaklaşık 43 dakika olarak hesaplandı.
Literatürde benzer bir çalışmaya rastlanmadığı için kıyaslama
yapılamadı.
79
Şekil 3.9 İmmobilize tripsinin operasyonel kararlılığı
80
4. SONUÇ
Bu
çalışmada
tripsinin
çeşitli
silika
tabanlı
taşıyıcılarda
immobilizasyonu amaçlandı. Ticari olarak temin edilen tripsinin
immobilizasyonu kovalent bağlama yöntemi kullanılarak 11 farklı
immobilizasyon metodu kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan metodlar
arasında Si
APTES
–Süksinik anhidrit-EDC immobilizasyon verimleri çok
daha iyi olduğundan
bu
yöntemle
çalışılmasına
karar
verildi.
İmmobilizasyonda kullanılacak enzim miktarı 2 mg olarak tespit edildi.
Karakterizasyon işlemlerinde BAPNA substrat olarak kullanıldı.
Serbest ve immobilize enzim için optimum pH sırasıyla 8,0 ve 9,0 olarak
belirlendi. Optimum sıcaklık ise hem serbest enzim hem de immobilize
enzimde 50 °C olarak hesaplandı. Serbest ve immobilize enzim için
kinetik parametreler (Km ve Vmax) Lineweaver-Burk diyagramı
yardımıyla hesaplandı.
İmmobilize enzimin termal ve depo kararlılığının serbest enzime
kıyasla daha iyi olduğu bulundu. Operasyonel kararlılık testleri sonucu
yarılanma ömrü 43 dakika olarak tespit edildi.
Sonuç olarak bu tez kapsamında ticari tripsin ile hazırlanan
immobilize enzimin serbest enzime göre daha iyi özellik ve kararlılıklara
sahip olduğu görüldü. İmmobilize tripsinin kullanılmasının hedeflendiği
on-line proteoliz çalışmalarına geçmeden enzimin doğal substratlara karşı
davranışı ve organik çözgen kararlılığı incelenmelidir.
81
KAYNAKLAR DİZİNİ
Ahsan, M.N., Watabe, S., 2001, Kinetic and structural properties of two
isoforms of trypsin isolated from the viscera of Japanese anchovy,
Engraulis japonicus, Journal of Protein Chemistry 20(1):49-58.
Asgeirsson, B., Fox, J.W., Bjarnason, J.B., 1989, Purification and
characterization of trypsin from the poikilotherm Gadus morhua,
Europan Journal of Biochemistry, 180: 85-94.
Bradford, M.M., 1976, Analytical Biochemistry, 72: 248-254.
Bisswanger, H., Nouaimi, M., Klaus, M., Immobilization of trypsin on
polyester fleece via different spacers, 2001, Enzyme and Microbial
Technology, 29: 567-574.
Calsavara, L.P.V., Moraes, F.F., and Zanin, G.M., 2000, Thermal
stabılıty and anergy of deactıvatıon of free and immobılızed cellobıase,
Brazilian Journal of Chemical Engineering, 17: 4-7.
Cao, L., 2005, Carrier-bound Immobilized Enzymes Principles,
Application and Design, 128 p.
Cao, L., 2005, Immobilised enzymes: science or art?, Current Opinion in
Chemical Biology, 9:217–226
Carraway, K.L., Koshland, D.E.J., 1968, Reaction of tyrosine residues
in proteins with carbodiimide reagents, Biochimica et Biophysica Acta Elsevier, 200: 564-566.
82
KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam)
Carraway, K.L., Triplett, R.B., 1970, Reaction of tyrosine residues in
proteins with carbodiimide reagents, Biochimica et Biophysica Acta Elsevie, 160. 272-274.
Fengna, X., Jianmin, Wu., Zhishen, Jia., Xianfu, Lin., 2004,
Preparation and characterization of trypsin immobilized on silica gel
supported macroporous chitosan bead, Process Biochemistry, 40: 2833–
2840.
Fernandez, L., Gomez, L., Ramırez, H.L., Villalonga, M.L.,
Villalonga, R., 2005, Thermal stabilization of trypsin with glycol
chitosan, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 34: 14–17.
Ferreira, L., Ramosb, M.A., Dordick, J.S., Gil, M.H., 2003, Influence
of different silica derivatives in the immobilization and stabilization of a
Bacillus licheniformis protease, Journal of Molecular Catalysis B, 21:
189-199.
Guyonnet, V., Tłuscik, F., Long, P.L., Polanowski, A,, Travis, J.,
1999, Purification and partial characterization of the pancreatic
proteolytic enzymes trypsin, chymotrypsin, and elastase from the
chicken, Journal of Chromatogr A, 852(1):217-25.
Hayashi, T., Hyan, S., Cha, W. and Ikada, Y., 1993, Immobilization of
thiol proteases onto porous poly(vinyl alcohol) beads, Polymer Journal,
25(5): 489-497.
83
KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam)
Hoare, D.G., Koshland, D.E.J., 1967, A method for quantitative
modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins,
Journal of Biological Chemistry, 242: 2447-2453.
Kan, C., Kang, K., Yeung, A., Liu, D., 2005, The immobilization of
trypsin on soap-free P(MMA-EA-AA) latex particle, Materials Science
and Engineering, 26: 664-669.
Kilinc, A., Onal, S., Telefoncu, A., 2002, Chemical attachment of
porcine pancreatic lipase to crosslinked poly(vinyl alcohol) by means of
adipoyldichloride, Process Biochemistry, 38: 641-647.
Kishimura, H., Hayashi, K., 2002, Isolation and characteristics of
trypsin from pyloric ceca of the starfish Asterina pectinifera,
Comparative Biochemistry and Physiology, 132: 485-490.
Krajevska, B., Leszko, M., Zaborska, W., 1990, Urease immobilized
on chitosan membrane: preparation and properties, Journal of Chemical
Technology and Biotechnology, 23: 661-667.
Kurzer, F., Dauraghi-Zadeh, K., 1967, Advanced in the chemistry of
carbodiimides, Chemistry Reviews, 67: 107-152.
Malmsten, M., Larsson, A., 2000, Immobilization of trypsin on porous
glycidyl methacrylate beads: effects of polymer hydrophilization,
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 18: 277-284.
84
KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam)
Mitsutomi, M and Ohtakara, A., 1998, Immobilization of thermostable
α-galactosidase from Pycnoporus cinnabarinus on chitin and some
properties of the immobilized enzyme, Journal of Fermantation
Technology, 63(4): 325-329.
Montero, F.M.F., Silva, G.M.M., Silva, J.B.R., 2007, Immobilization
of trypsin on polysaccharide film from Anacardium occidentale L. and its
application as cutaneous dressing, Process Biochemistry, 42: 884–888.
Ota, S., Miyazaki, S., Matsuoka, H., Morisato, K., Shintani, Y.,
Nakanishi, K., 2006, High-throughput protein digestion by trypsinimmobilized monolithic silica with pipette-tip formula, Journal of
Biochemical and Biophysical Methods,(in press).
Önal, S., 2000, Karpuz (Citrullus vulgaris) α-galaktozidazının doğal ve
sentetik polimerlerde immobilizasyonu, Doktora Tezi, Ege Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü, 190 s
Park, S.W., Kim, Y.I., Chung, K.H., Hong, S.I., 2002, Covalent
immobilization of GL-7-ACA acylase on silica gel through silanization,
Reactive and Functional Polymers, 51:79-92.
Pascual, S., Haddleton, D.M., Heywood, D.M., Khoshdel, E., 2003,
Investigation of the effect of various Parameters on the synthesis of
oligopeptides in aqueous solution, European Polymer Journal, 39(8):
1559-1565.
85
KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam)
Pritchett, D.W., Young, S.Y., and Geren, C.R., 1981, Proteolytic
activity in the digestive fluid in larvae of Trichoplusia ni, Insect
Biochemistry, 11: 523-526.
Rashid, M.H and Siddiqui, K.S., 1998, Carboxy-group modification:
high temparature activation of charge-nuutralized and charge-reversed βglucosidase from Asperligus niger, Biotechnology and Applied
Biochemistry, 27: 231-237.
Telefoncu, A., 1997, İmmobilize Enzimler, Enzimoloji (Yaz Okulu),
Editör: A. Telefoncu, 193 s.
Tischer, W., Wedekind, F., 1999, Immobilized Enzymes: Methods and
Applications, 200: 96-136
Unen, D.J., Johan, F. J., David N. R., 2001, Sol-Gel immobilization of
serine proteases for application in organic solvents, Biotechnology and
Bioengineering,75: 154-158.
Unger, K.K., 2002, HPLC of Biological Macromolecules (2nd Edition),
15 p.
Venkatesh, R., Sundaram, P.V., 1998, Modulation of stability
properties of bovine trypsin after in vitro structural changes with a
variety of chemical, Protein Engineering, 11: 691-699.
Whitford, D., 2005, Protein structure and function, 212 p.
86
KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam)
Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang,
P., Xuc, Y., Wangc, H., 2004, Microfluidic enzymatic-reactors for
peptide
mapping:
strategy,
characterization,
and
performance,
Miniaturisation for Chemistry, Biology and Bioengineering, 4: 588 –
597.
Wu, J., Xi, F., Jia, Z., Lin, X., 2005, Preparation and characterization
of trypsin immobilized on silica gel supported macroporous chitosan
bead, Process Biochemistry, 40: 2833-2840.
Xi, F., Wu, J., 2004, Macroporous chitosan layer coated on non-porous
silica gel as a support for metal chelate affinity chromatographic
adsorbent, Journal of Chromatography A,1057: 41-47.
Yang, Y.M., Wang, J.W., Tan, R.X., 2004, Immobilization of glucose
oxidase on chitosan–SiO2 gel, Enzyme and Microbial Technology,
34:126-131.
Zihnioğlu, F., 1992, Isolation, purification and immobilization of UDPglucuronyl transferase, PhD Thesis, Ege Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, 169 s.
87
ÖZGEÇMİŞ
Adı, Soyadı
: Ömer HABİB
Doğum Tarihi
: 19/ 06/ 1981
Doğum Yeri
: GAZİANTEP
Medeni Hali
: Bekar
Uyruğu
: T.C.
İş Adresi
: Ege Üniversitesi
Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü
35100 Bornova/ İZMİR
E-mail
: [email protected]
Yabancı Dili
: İngilizce
Eğitim Durumu
:
Okul
Altıparmak İlköğretim Okulu, Bursa
A. Vefik Paşa Lisesi, Bursa
Fırat Üniversitesi, Elazığ
Ege Üniversitesi, İzmir
Derece
Yıl
Diploma
1987-1995
Diploma
1995-1998
B.Sc. (Kimya)
1998-2002
M.Sc. (Biyokimya) 2004-
88
BİLİMSEL TOPLANTILARDA SUNULAN BİLDİRİLERİN
LİSTESİ
1. “Proteolitik Aktivite Tayini için Coomassie-violet Boyalı Jelatin
Hazırlanması.”
Önal, S., Habib, Ö., Zihnioğlu, F., 18. Ulusal Biyokimya Kongresi, 1519 Mayıs 2004, Trabzon
2. “Toplam Protein Konsantrasyonu Tayininde Beş Farklı Metodun
Karşılaştırılması.”
Okutucu, B., Dinçer, A., Habib, Ö., Zihnioğlu, F., 19.Ulusal Biyokimya
Kongresi, 22-25 Nisan 2005, Antalya
3. “Selüloz Asetat-GOD
Karakterizasyonu.”
Kompozit
Membran
Hazırlanması
ve
Habib, Ö., Telefoncu, A., 20. Ulusal Kimya Kongresi, 4-8 Eylül 2006,
Kayseri
MAKALELER
1. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö., Zıhnıoglu, F., 2007, Comparison
of five methods for determination of total plasma protein concentration,
Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70: 709–711
ARAŞTIRMA PROJELERİ
“Tripsin İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu” Ömer HABİB, Ege
Üniversitesi Araştırma Fonu, (2005 Fen 049)
“Plasma Proteome; Determination of Specific Proteins in the
Development of Type 2 Diabetes by Two Dimensional Gel
Electrophoresis and Structure Analysis.” Figen Zihnioğlu, Seçil Önal,
Suna Timur, Ömer Habib, Erdal Duman, TÜBİTAK, 104T410
II
III
Sayın Ömer HABİB tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan
“Tripsin İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu” başlıklı bu çalışma E.Ü.
Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri
Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi’nin ilgili hükümleri uyarınca
tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve
/ /
tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile
başarılı bulunmuştur.
Jüri Üyeleri:
Jüri Başkanı : ...........................................
Raportör Üye: ...........................................
Üye
: ...........................................
İmza
.................................
.................................
.................................
IV
V
ÖZET
TRİPSİN İMMOBİLİZASYONU VE
KARAKTERİZASYONU
HABİB, Ömer
Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Anabilim Dalı
Tez Danışmanı: Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU
Ağustos 2007, 88 sayfa
Tripsin (3.4.21.4) peptidlerin lizin ve arginin artıklarının karbonil
ucundan hidrolizini katalizleyen, serin proteaz ailesinden bir
endopeptidazdır. Tripsin endüstriyel, biyomedikal ve biyoteknolojik
araştırmalarda sıklıkla kullanılmaktadır.
Doğal enzimlerin kararlılıklarını uzun süre koruyamamaları,
operasyon ve depolama koşullarında aktivitelerini çabuk kaybetmeleri,
organik çözgende denatüre olmaları nedeniyle kullanımları sınırlıdır.
Bunun yanında enzimin tepkime ortamından uzaklaştırılmasının zorluğu
bir başka problem olan ürün kirlenmesini de beraberinde getirir. Birçok
araştırmacı immobilize enzimlerin doğal enzimlere kıyasla geliştirilmiş
kararlılık ve enzimin kolayca uzaklaştırılabilirliği açısından büyük
avantajlara sahip olduğunu göstermiştir.
İmmobilize tripsin başlıca; peptit sentezi ve özellikle proteom
analizlerinin kilit adımı olan peptit haritalamada kullanılır ki bu da
hastalık teşhisi, ilaç etkileşimleri için potansiyel hedefin görüntülenmesi,
rekombinant DNA teknolojisiyle üretilen proteinlerin kalite kontrolü gibi
alanlardaki çalışmalar için en önemli adımlardan birisidir.
VI
Bu çalışmada silika tabanlı taşıyıcının yüzey kimyası değiştirilerek
tripsin immobilizasyonu için uygun şartlar belirlendi. İmmobilize
tripsinin optimum sıcaklık ve pH değerleri, termal, depo, operasyonel
kararlılıkları, kinetik sabitlerinin belirlenmesiyle karakterizasyonu
gerçekleştirildi.
Anahtar sözcükler: Tripsin, immobilizasyon, silika
VII
ABSTRACT
TRYPSIN IMMOBILIZATION AND CHARACTERIZATION
HABİB, Ömer
Master of Science Thesis, Biochemistry Department
Supervisor: Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU
September 2007, 88 pages
Tyripsin (3.4.21.4) is an endopeptidase from serine protease
family which catalysis hydrolysis peptides at the carbonyl group of lysine
and arginine residues. Tyripsin is commonly used in industrial,
biomedical and biotechnological researches.
Due to not being able to keep their stability for a long time,
loosing the activity quickly in operation and storage conditions and
denaturation in organic solvents,
the usage of natural enzymes are
limited. Furthermore, adversity of removing the enzyme from medium
of reaction causes product pollution. Many researchers find out that
immobilised enzymes have got great advantages from the point of
improved stability and removability of enzyme easily compared to the
natural enzymes.
VIII
İmmobilised tyripsin is mainly used in peptid synthesis and
peptide mapping which is the basic step of proteom analysis that is one of
the most important step for diagnostic, determination of the potential
target of drug interactions, quality control of the proteins produced by
recombinant DNA technology.
In this work, the suitable conditions for tyripsin immobilisation
were determined by changing the surface chemistry of silica based
carrier. İmmobilised tyripsin was characterized by the determination of
optimum temperature and pH, thermal, storage, operational stability and
kinetic constants.
IX
Keywords: Trypsin, immobilization, silica.
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans çalışmam boyunca görüş ve deneyimlerinden
yararlandığım sayın hocam Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU’na, beni bu
günlere getiren aileme ve tüm desteklerinden dolayı Gizem YILMAZ’a
teşekkürü bir borç bilirim.
Bu çalışma Ege Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından
desteklenmiştir (2005 FEN 049).
X
XI
XII
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET………………………………………………………………….V
ABSTRACT…………………………………………………………VII
TEŞEKKÜR………………………………………………………….IX
ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………XIII
ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………...XVI
SİMGELER VE KISALTMALAR…………………………………XVII
1.GİRİŞ…………………………………………………………………..1
1.1 Tripsin……………………………………………………………...1
1.1.1 Substrat spesifikliği…………………………………………..3
1.1.2 Mekanizması………………………………………………....4
1.2 Enzim İmmobilizasyonu……………………………………………9
1.3 Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri……………………………….13
1.3.1 Taşıyıcıya bağlama yöntemleri……………………………..14
1.3.2 Çapraz bağlama yöntemleri………………………………...21
1.3.3 Tutuklama yöntemleri………………………………………22
1.3.4 Suda çözünen enzim immobilizasyonu……………………..24
1.4 Enzim immobilizasyon yöntemi ve taşıyıcı seçimi………………..25
1.5 Silika………………………………………………………………26
2. MATERYAL VE METOD…………………………………………..30
2.1 Materyal…………………………………………………………..30
2.2 Tripsin Aktivite Tayini……………………………………………30
2.3 Protein Tayini (Bradford Metodu)………………………………..32
2.4 Tripsin İmmobilizasyonu…………………………………………33
2.4.1 Silikon dioksit (Si) üzerine tripsin immobilizasyonu…..….34
XIII
İÇİNDEKİLER (Devam)
2.4.2 3 aminopropil-silika (Si APTES) üzerine tripsin
immobilizasyonu………………………………………………....41
2.4.3 2(3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika jel (Silika epoksi) üzerine
tripsin immobilizasyonu…………………………………………..50
2.5 Silika Üzerine İmmobilize Edilmiş Tripsinin Karakterizasyonu…53
2.5.1 İmmobilizasyon verimine protein miktarının etkisi………..54
2.5.2 Sıcaklık……………………………………………………..54
2.5.3 pH…………………………………………………………..55
2.5.4 Substrat konsantrasyonu…………………………………...55
2.6 Kararlılık Testleri………………………………………………...56
2.6.1 Termal kararlılık…………………………………………..57
2.6.2 pH kararlılığı………………………………………………57
2.6.3 Depo kararlılığı……………………………………………58
2.6.4 Operasyonel kararlılık……………………………………..58
3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA………………………………………59
3.1 Tripsinin silika tabanlı taşıyıcılar üzerine kovalent bağlama ile
immobilizasyonu……………………………………………………..59
3.1.1 Taşıyıcının aktivasyonuna EDC miktarının etkisi………...61
3.1.2 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının
belirlenmesi……………………………………………………..63
3.2 İmmobilize Tripsinin Karakterizasyonu………………………...64
3.2.1 Sıcaklık etkisi……………………………………………...64
3.2.2 pH etkisi…………………………………………………...68
3.2.3 Substrat konsantrasyonun etkisi…………………………...70
XIV
İÇİNDEKİLER (Devam)
3.3 Kararlılık Testleri…………………………………………………..73
3.3.1 Termal kararlılık…………………………………………..74
3.3.2
pH kararlılığı……………………………………………75
3.3.3
Depo kararlılığı…………………………………………76
3.3.4
Operasyonel kararlılık…………………………………..78
4. SONUÇ………………………………………………………………80
KAYNAKLAR DİZİNİ………………………………………………...81
ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………….………87
XV
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil
Sayfa
1.1 Tripsinojen aktivayonu ……………………………………………..2
1.2 Kimoptripsin, tripsin ve elastazın spesifik cepleri………….……….4
1.3 Katalitik üçlü……………………………………………….………..5
1.4 Serin proteazların katalitik mekanizması…………………….……...7
1.5 Oksianyon boşluk …………………………………………….……..8
1.6 Serin proteazlar için ping pong mekanizması………………….……9
1.7 İmmobilize enzimlerin karakteristikleri…………………………….10
1.8 İmmobilize enzimlerin uygulama alanları………………………….10
1.9 İmmobilize enzimin katalitik ve katalitik olmayan fonksiyonları
arasındaki ilişki ………………………………………………….……..11
1.10 Enzim immobilizasyon yöntemleri ……….………………………13
1.11 Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanması …….……………………17
1.12 Adsorpsiyon temelli immobilizasyon yöntemleri …….…………..19
1.13 Enzimlerin yüzeye adsorpsiyonu……………………………….…20
1.14 Çapraz bağlama yöntemleri…………………...…………………..22
1.15 Matrikste tutuklama……………………………………...………..23
1.16 Mikrokapsülleme………………………...………………………..24
1.17 Enzim immobilizasyonu için genel prosedür……………………..26
2.1 CDI ile aktiflenmiş silikon dioksitte tripsin immobilizasyonu…….34
2.2 Si-CDI-Kaproikasit-DCC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………………..36
2.3 Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………………..38
XVI
ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam)
2.4 Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………………..40
2.5 Si APTES – Glutaraldehit üzerine tripsinin immobilizasyonu…….42
2.6 Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………………..44
2.7 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu…………………………………………………..……46
2.8 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………..………47
2.9 Si APTES-PEG-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………………..49
2.10 Si epoksi üzerine tripsinin immobilizasyonu………………..…….50
2.11 Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS üzerine tripsinin
immobilizasyonu………………………………………………..………52
3.1 Serbest ve immobilize tripsin aktivitesinin sıcaklığa bağımlı
değişimi……………………………………………………...………….65
3.2 İmmobilize (a) ve serbest (b) enzime ait Arrhenius
diyagramları…………………………………………………………….67
3.3 İmmobilize (a) ve serbest (b) tripsin aktivitesinin pH’ya bağımlı
değişimi………………………………………………………………....69
3.4 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin aktivitelerinin BAPNA
konsantrasyonununa bağımlı değişimleri………………….……………71
3.5 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin Lineweaver-Burk
diyagramı……………………………………………………………….72
XVII
ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam)
3.6 Serbest ve immobilize tripsinin termal kararlılığı………………….74
3.7 Serbest ve immobilize tripsinin pH kararlılığı……………………...76
3.8 Serbest ve immobilize tripsinin depo kararlılığı……………………77
3.9 İmmobilize tripsinin operasyonel kararlılığı………………………..79
XVIII
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge
Sayfa
1.1 Bazı serin proteazlar ve metabolizmadaki görevleri………………....1
1.2 Bazı serin proteazlarda katalitik üçlünün primer dizideki yerleri……5
1.3 İmmobilize enzimler için kriterler………………………………….12
1.4 Enzim immobilizasyonunda kullanılan taşıyıcılar………………….15
1.5 Kovalent bağlamada hedef amino asitler…………………………...16
1.6 Kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları ……………..18
1.7 İmmobilizasyonda göz önünde bulundurulması gereken kriterler….25
2.1 Protein Tayini (Bradford Metodu)………………………………….33
3.1 Silika tabanlı taşıyıcılara tripsin immobilizasyonu için kullanılan
yöntemler…………………………………………………………….…60
3.2 Farklı EDC/g taşıyıcı oranlarında immobilizasyon verimi………....62
3.3 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının
belirlenmesi…………………………………………………………63
3.4 Serbest ve immobilize enzimin kinetik sabitleri…………………....73
XIX
SİMGELER VE KISALTMALAR
Simge
Açıklama
.
t1/2
Yarılanma ömrü
Kısaltma
Açıklama
CDI
1-1’ karbonildiimidazol
EDC
N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etil
.
karbodiimid hidroklorür
DCC
Disiklohekzil karbodiimid
NHS
N-hidroksisüksinimid
BAPNA
N-benzoil-L-arginin-p-nitro anilid
DMSO
Dimetilsülfoksit
DMF
Dimetil formamid
MeIm
1-metil imidazol
Download

EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ