doxorubicin içeren manyetik albumin
advertisement
ÖZEL EGE L SES DOXORUB C N ÇEREN MANYET K ALBUM N NANOPART KÜLLER N HAZIRLANMASI VE LAÇ TA INIMINDA KULLANIM OLANAKLARININ ARA TIRILMASI HAZIRLAYAN Ö RENC LER: DANI MAN Ö RETMEN: Barkın Özyamaner (11A) Turu san afak (11A) Mesut Esen ZM R 2011 ÇER K L STES PROJEN N AMACI……………………………………………………………………………. 3 1.G R …………………………………………………………………………………………. 3 2.YÖNTEM……………………………………………………………………………………... 7 2.1. PROTE N TAY N ………………………………………………………………………… 7 2.2. Albumin nanopartiküllerinin sentezlenmesi……………………………………….. 8 2.3. Optimum albumin konsantrasyonunun belirlenmesi……………………………. 9 2.4. Doxorubicin standart grafi inin hazırlanması…………………………………….. 10 2.5. Albumin nanopartiküllerine doxorubicin yüklenmesi………………………….. 10 2.6. Doxorubicin enkapsülasyonu üzerine pH etkisi………………………………….. 11 2.7. Doxorubicin içeren manyetik albumin nanopartiküllerinin sentezlenmesi….. 11 2.8. n vitro ilaç salınımı…………………………………………………………………….. 11 3. SONUÇLAR VE TARTI MA………………………………………………………………. 12 3.1. Albumin standart grafi i……………………………………………………………….. 12 3.2. Doxorubicin standart grafi i…………………………………………………………... 12 3.3. Nanopartikül hazırlama ve hazırlanılan nanopartiküllerine ilaç yükleme ko ullarının optimizasyonu……………………………………………………………. 13 3.4. Nanopartiküllerden doxorobicin salımı……………………………………………… 16 4. TE EKKÜR………………………………………………………………………………….. 17 5. KAYNAKLAR………………………………………………………………………………… 18 PROJEN N AMACI Kanser tüm dünyada hızla artmakta ve ölüm nedenlerinin ba lıca sebepleri arasında yer almaktadır. Son istatistiksel bilgilere göre 2020 yılında dünyadaki kanser hastası sayısının 15 milyondan fazla olaca ı belirtilmi tir. Ço u kanser türleri lokalizasyonuna ve evrelerine ba lı olarak cerrahi müdahele, radyoterapi ve/veya kemoterapi gibi uygulamalarla tedavi edilebilmektedir. Antrasiklin bir antibiyotik olan doxorubicin en geni kullanım alanına sahip ve gerek tek bir ajan gerekse kombinasyonlu biçimde intravenöz olarak hastaya uygulanan antikanser ilaçlardan biridir. Ba ta over kanseri olmak üzere, meme, akci er, tiroid kanseri, yumu ak doku sarkomaları ve bazı tür lösemilerin tedavisinde kullanılır. Doxorubicinin düzensiz kalp atı ları, kalp yetmezli i gibi istenmeyen birçok yan etkisi vardır. Bunun yanısıra a ız yaraları, sindirim problemleri, saç dökülmesi, el ayak sendromu di er yan etkileri arasında yer almaktadır. Doxorubicinin belirtilen yan etkilerinin giderilmesi amacıyla günümüzde klinik uygulamalarda kullanılmakta olan lipozamal doxorubucin ve PEG-lipozomal doxorubucin türevleri olu turulmu fakat yan etkiler tamamen ortadan kaldırılamamı tır. laç uygulaması sırasında el ve ayaklara so uk kompres uygulanmasına ra men özellikle yapılan ikinci tedavi sonrası el ve ayaklarda yanıklar, su toplanması, i me ve iyile meyen yaraların yanında a ız içinde beslenmeye engel olabilecek büyüklükte yaralar ve yutkunma güçlü ü gözlenmektedir. Doxorubucinin yan etkilerini azaltmak için geli tirilmi lipozomal PEG-Doxorubucinin de bu gibi yan etkileri ortadan kaldırmakta yetersiz olması, ve yan etkilerinin hastanın ya am kalitesini dü ürmesi nedeniyle, hedef hücreye gönderilebilecek doxorubucin türevinin hazırlanması çalı mamızın temelini olu turmaktadır. Bu amaçla, albumin kullanılarak nanopartiküller hazırlanmı ve hedeflenen bölgeye ilacın ta ınımı için nanopartiküllere manyetik özellik kazandırılmı tır. 1.G R Nanoteknoloji, nanometre ölçe indeki objeleri ele alan bir teknolojiyi sunar. Nanopartiküllerin; yükleme kapasitesinin fazla olması, immün sistem tarafından tanınmaması dolayısıyla hedefe daha etkili bir biçimde ula mak amacıyla yüzeylerinin çe itli moleküller ile modifiye edilebilmesi, kan beyin bariyeri ve hücreler arası sıkı ba lantılar gibi fizyolojik bariyerlerden geçi i sa layabilecek ekilde dizayn edilebilmesi, polimer kaplı süperparamanyetik materyallerin manyetik rezonans görüntülemeye olanak sa layarak partiküllerin diagnostik uygulamalarda kullanılabilmesi, bir ligand ile konjugasyon aracılı ıyla oldukça spesifik doku hedeflendirmesini mümkün kılması gibi özellikleri bulunmaktadır (Ak, 2010, Soloviev, 2007). laç ta ıyıcı sistemler olarak nanopartiküller, polimer, metal veya seramik materyallerinden olu abilir. Kullanılan materyale ve üretim metoduna ba lı olarak ekil ve büyüklükleri de i en partiküllere farklı özellikler kazanmaktadır. Lipozomlar, katı lipid partkülleri, miseller, küreler, dendrimerler, konjugatlar, hidrojeller vb. bu konuda ara tırılan sistemlerdendir (Wang,et all.,2008) ( ekil 1). ekil 1. Ara tırmaları süren terapötik nanopartiküler platformlardan bazıları (a) lipozom (b) polimer-ilaç konjugatı (c) polimerik nanopartikül (d) dendrimer (e) demir oksit nanopartikülü Kırmızı noktalar hidrofilik ilaçları, mavi noktalar hidrofobik ilaçları göstermektedir (4). Polimerik nanopartiküller, kontrollü ilaç salımı ve hastalı a spesifik lokalizasyon sa laması amacıyla karakteristikleri ve yüzey kimyası de i tirilerek üretilebilir (Singh and Lillard, 2009). Polimerik nanopartiküllerin hazırlanmasında do al ve sentetik polimerler kullanılmaktadır. Do al polimerler, proteinler (albumin, jelatin vb.) ve polisakkaritler (aljinat, kitosan, dekstran vb.) olmak üzere iki gruptan olu maktadır. Sentetik polimerler ise önceden sentezlenen ( polianhidrit, polikaprolakton-PCL, polilaktik asit-PLA, poli laktik-ko-glikolik asitPLGA vb.) veya hazırlama sırasında sentezlenen polimerlerden polisiyanoakrilat-PACA vb.) olu maktadır (Ak, 2010). Nanoteknolojik ilk ilaç ta ıma sistemi 1960’larda tanımlanan ve daha sonra lipozomlar olarak kabul edilen lipid vezikülleridir. Ardından çe itli organik ve inorganik biyomateryaller ilaç ta ıma sistemi olarak ara tırılmı tır. Kontrollü salım yapan ilk polimer sistemi 1976’da tanımlanırken, 1980’de pH de i imlerine cevap vererek ilaç salımı yapabilen daha kompleks bir sistem olan ve hücre-spesifik hedefleme gerçekle tiren lipozomlar sentezlenmi tir. 1987 de uzun süre sirkülasyonda kalan ilk modifiye lipozomlar tanımlanmı tır. Ardından polietilen glikolün (PEG) lipozomların ve polimerik nanopartiküllerin sirkülasyon zamanını uzattı ı belirlenmi tir. 1995 de ise gerekli onaylar alınarak polietilen glikol ba lı lipozomal doxorubicin AIDS ili kili Kaposi Sarkoması tedavisinde kullanılmaya ba lanmı tır (Farokhzad and Langer 2009). Bazı ilaç ta ıyıcı sistemler günümüzde klinik uygulamalarda kullanılmakta olup çe itli formları ara tırılmaya ve çalı ılmaya devam etmektedir (Wang,et all.,2008). Kanser, kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücrelerin orjinden veya primer bölgeden vücudun di er bölgelerine invazyonu ve yayılmasıyla karakterize olan bir hastalık grubudur. Kanserin büyüme sinyallerinin kendi kendini yönetmesi, hücrelerin büyüme inhibisyon sinyallerinden ve apoptosisten kaçması, limiti olmayan bölünme potansiyeli, anjiogenez, invazyon ve metastaz olmak üzere ayırıcı özellikleri oldu u bilinmektedir (Pecorino, 2006). Kanser tüm dünyada hızla artmakta ve ölüm nedenlerinin ba lıca sebepleri arasında yer almaktadır. Son istatistiksel bilgilere göre 2020 yılında dünyadaki kanser hastası sayısının 15 milyondan fazla olaca ı belirtilmi tir (Kairemo, et all., 2008). Ço u kanser türleri lokalizasyonuna ve evrelerine ba lı olarak cerrahi müdahele, radyoterapi ve/veya kemoterapi gibi uygulamalarla tedavi edilebilmektedir. Kemoterapi uygulamasında farmakolojik olarak aktif kanser ilacı tümör dokusuna dü ük spesifite ve doza ba ımlı toksisitesi ile ula ır. Kullanılan ço u antikanser ajan tümör hücreleri ile sa lıklı hücreleri birbirinden ayıramaz, dolayısıyla sistemik toksisiteye ve yan etkilere neden olur. Bu durum ilacın alınabilen maksimum dozunu sınırlar. Ayrıca hızlı eliminasyon ve geni bir alana yayılım ilacın fazla miktarda uygulanmasını gerektirir ancak bu durum ekonomik de ildir ve istenmeyen etkilerin ortaya çıkmasına sebep olur. Nanopartiküler ilaç ta ıyıcı sistemlerin daha etkili ve daha az zararlı olması bu problemlerin bazılarını ortadan kaldırır (Sinha, et all., 2006). Hedeflenen tümör dokusuna nanopartiküllerin ula abilmesi için elimine olmadan dola ımda uzun süre kalmaları gerekmektedir. Yüzey modifiye olmayan veya hidrofobik nanopartiküller dola ımda iken büyüklük ve yüzey karakteristiklerine ba lı olarak ba lıca karaci er ve dalak olmak üzere mononükleer fagositik sistem (MPS) tarafından yakalanırlar. Bu sorunu ortadan kaldırmak için nanopartiküller hidrofilik polimerler ile kaplanabilirler, böylece partiküller makrofajlarca yakalanmaktan korunurlar. Hidrofilitenin artırılması ayrıca partikülü suda daha çözünür yapmasının yanında enzimatik degradasyona kar ı daha az hassas olmasını ve böylece biyouyumlulu unun artmasını sa lar (Wang, et all., 2008). lacı hedef hücreye göndermenin bir yolu da fiziksel hedeflemedir. Fiziksel hedefleme, dı arıdan verilen uyarılar ile ilacın vücut içerisindeki spesifik bir bölgede yo unla masını sa layan yeni bir hedefleme tekni idir (Vasir and Labhasetwar, 2005). Manyetik alan ve ultrases uygulanarak gerçekle tirilir. Manyetik hedeflendirme yakla ımı manyetik ilaç ta ıyıcısına ba lı veya ta ıyıcıya enkapsüle edilmi bir terapötik ajanın intravenöz enjeksiyonu ve dı arıdan lokalize manyetik alan uygulamasıyla tümör dokusuna yönelmesini kapsar ( ekil 2). Manyetik cevap veren ilaç ta ıyıcıları genellikle magnetit, demir, nikel, kobal vb. gibi materyaller içerir. laç ta ıyıcıları ise manyetik lipozomlar, mikroküreler, nanoküreler ve koloidal demir oksit solüsyonları olabilmektedir. ekil 2. Manyetik hedefleme stratejisi(11) Antrasiklin bir antibiyotik olan doxorubicin en geni kullanım alanına sahip ve gerek tek bir ajan gerekse kombinasyonlu biçimde intravenöz olarak hastaya uygulanan antikanser ilaçlardan biridir. Ba ta over kanseri olmak üzere, meme, akci er, tiroid kanseri vs., bazı yumu ak doku sarkomaları ve bazı tür lösemilerin tedavisinde kullanılır. ekil 3’de gösterildi i gibi yapısında tetrasiklin halkası ve bu halkaya glikozidik ba ile ba lı daunozamin ekeri içerir (Waterhouse, et all., 2001). O OH O OH O O OH O H3C O OH CH3 OH NH2 ekil 3. Doxorubicinin yapısı Doxorubicinin düzensiz kalp atı ları, kalp yetmezli i gibi istenmeyen birçok yan etkisi yanında a ız yaraları, sindirim problemleri, saç dökülmesi, el ayak sendromu (PPE) gibi di er yan etkileri de vardır (Devoti, 2006, Jung, 2001). stenmeyen bu etkiler yanı sıra bir di er önemli konu ilaç dirençlili idir. Doxorubicinin belirtilen yan etkilerinin giderilmesi amacıyla günümüzde klinik uygulamalarda kullanılmakta olan lipozamal doxorubucin ve PEGlipozomal doxorubucin türevleri olu turulmu fakat yan etkiler tamamen ortadan kaldırılamamı tır. Doxorubicinin bu türevleri kalp rahatsızlıklarının azalmasını sa lamı fakat tedavi gören hastalarda özellikle el-ayak sendromu olarak bilinen yanıklar, yaralar, a ızda olu an yaralar, sindirim problemlerini önleyememi tir. laç uygulama sırasında el ve ayaklara so uk kompres uygulanmasına ra men özellikle yapılan 2. tedavi sonrası el ve ayaklarda yanıklar( ekil 3), su toplanması, i me ve iyile meyen yaraların yanında a ız içinde beslenmeye engel olabilecek büyüklükteki yaralar ve yutkunma güçlü ü tedavinin bazı yan etkileridir. Doxorubucinin yan etkilerini ortadan kaldırmak için geli tirilmi lipozomal PEGDoxorubucinin de bu gibi yan etkileri ortadan kaldırmakta yetersiz olması ve yan etkilerinin hastanın ya am kalitesini dü ürmesi nedeniyle, hedef hücreye gönderilebilecek doxorubucin türevinin hazırlanması çalı mamızın temelini olu turmaktadır. Bu amaçla, farklı ba lanma bölgeleriyle ilaçları ba lama kapasitesine sahip olan, dü ük molekül kütleli bir protein, albumin kullanılarak nanopartiküller hazırlanmı ve hedeflenen bölgeye ilacın ta ınımı için nanopartiküllere manyetik özellik kazandırılmı tır. ekil 3. Lipozomal-Doxorubucin Yan Etkisi, El-Ayak Sendromu 2. YÖNTEM Sı ır serum albumini (BSA) Sigma ve glutaraldehit (%25) Merck ve doxorubicin Deva firmasından ticari olarak sa landı. Çalı mada kullanılan di er kimyasallar da analitik saflıktadır. Manyetik partikül hazırlanması amacıyla kullanılan Fe3O4 partikülleri Hacettepe Üniversitesinde sentezlendi. 2.1. Protein tayini Çalı mamızda protein miktar analizleri Bradford yöntemi kullanılarak yapıldı (Bradford, 1976). Bradford reaktifi 40 mg Coomassie-Brilliant Blue G-250’nin tartılıp % 98’lik 50 ml etanolde çözülmesi ve üzerine 55 ml % 88’lik fosforik asit ilave edilerek distile su ile 1 litreye tamamlanmasıyla hazırlandı. 0,02, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20 mg/ml konsantrasyonlarda bovin serum albumin (BSA) çözeltileri olu turuldu ve 0,05 ml çözelti üzerine 1 ml Bradford reaktifi eklenerek 10 dakika oda sıcaklı ında inkübe edildi. Süre sonunda Perkin Elmer UV/VIS spektrofotometrede 595 nm’de absorbanslar ölçülerek konsantrasyonlara kar ılık absorbansların esas alındı ı standart grafi i çizildi. Örnek analizlerinde de aynı yöntem uygulandı ve standart grafi i denklemi kullanılarak ölçülen absorbanslara kar ılık albumin konsantrasyonları hesaplandı. 2.2. Albumin nanopartiküllerinin sentezlenmesi Albumin nanopartikülleri Weber ve arkada larının, Langer ve arkada larının geli tirdikleri yöntemlerin modifikasyonu ile desolvasyon metodu kullanılarak gerçekle tirildi (Weber, et all., 2000, Langer, et all., 2003). Albumin 1 ml distile suda çözüldü ve 480 rpm hızla orbital karı tırıcı üzerinde 4 ml etanol, pompa (ERC HPLC Pump 64) yardımıyla 1 ml/dk akı hızında eklendi. Elde edilen karı ım içerisine % 8’lik glutaraldehit çözeltisinden 0,588µl/ mg BSA olacak ekilde eklendi. 24 saat oda sıcaklı ında çalkalamaya bırakılan albumin nanopartikülleri süre sonunda eppendorf tüplerine alınarak 13000 rpm’de 3x20 dk Beckman Mikrofuge E cihazında santrifüjlendi. Üst faz bir tüpe alınarak ayrıldı ve eppendorf tüplerinin içerisine 1’er ml distile su eklenerek 13000 rpm’de 2x20 dk santrifüjlenerek yıkama i lemi yapıldı. Santrifüj sonrasında üst faz 1. yıkama suyu olarak ayrı bir tüpe alındı ve nanopartiküller aynı i lemlerle ikinci defa yıkandı. 2. yıkama suyu da bir tüpe koyulup nanopartiküller +4 ºC’ye kaldırılarak depolandı. 2.3. Optimum albumin konsantrasyonunun belirlenmesi 25, 50, 75, 100 mg/ml albumin konsantrasyonlarında nanopartiküller hazırlanılarak optimum albumin miktarı belirlendi. Üst faz ve yıkama sularında Bradford yöntemi kullanılarak protein tayinleri yapıldı ve desolvasyon % de erleri a a ıdaki formül kullanılarak hesaplandı. Desolve albumin (mg) = Eklenen toplam albumin (mg) – Desolve olmayan albumin (mg) Nanopartikül olu turan albumin miktarı yüzdesi ise desolve albumin miktarının eklenen toplam albumine bölünüp 100 ile çarpılmasıyla a a ıdaki formülde gösterildi i gibi hesaplandı. % Desolvasyon = Elde edilen nanopartiküllerin boyutları ise zeta boyut ölçüm cihazı ile (Malvern dynamic laser scattering zeta sizer Nano SZ, zmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü) belirlendi. 2.4. Doxorubicin standart grafi inin hazırlanması Doxorubicinin UV/VIS spektrofotometrede dalga boyu taraması yapıldı ve maksimum absorbans verdi i dalga boyu 480 nm oldu u saptandı. lacın 0.010, 0.015, 0.025, 0.0375, 0.050 mg/ml konsantrasyonlarda çözeltileri hazırlanarak standart grafi i çizildi. 2.5. Albumin nanopartiküllerine doxorubicin yüklenmesi 0,5, 1, 2, 2,5 mg/ml doxorubicin kullanılarak hazırlanılan nanopartiküllerde ilaç enkapsülasyon verimleri incelenerek optimum doxorubicin konsantrasyonu belirlendi. Doxorubicin ve albumin 1 ml distile suda çözülerek nanopartiküller olu turuldu. 24 saat sürenin ardından santrifüj i lemlerine geçildi ve süpernatantlar doxorubicin analizi yapmak üzere ayrı bir tüpe alındı. Üst faz ve yıkama sularında doxorubicin miktarları analizlendi. Albumin nanopartikülleri içerisinde enkapsüle edilen doxorubicin miktarı, a a ıda belirtilen formül kullanılarak hesaplandı. Enkapsüle doxorubicin (mg) = Eklenen toplam – Enkapsüle olmayan doxorubicin (mg) doxorubicin (mg) lacın enkapsülasyon verimi ise enkapsüle doxorubicin miktarının eklenen toplam doxorubicine bölünüp 100 ile çarpılmasıyla a a ıdaki formülde gösterildi i gibi hesaplandı. % Enkapsülasyon verimi = laç yüklü nanopartiküllerin boyutları zeta boyut ölçüm cihazı ile ölçüldü. 2.6. Doxorubicin Enkapsülasyonu üzerine pH etkisi Optimum olarak seçilen oranlarda doxorubicin (1 mg/ml) ve albumin (25 mg/ml) tartılarak pH= 2-9 aralı ında pH de eri NaOH ve HCl kullanılarak ayarlanmı distile suda çözüldü ve nanopartikül her bir pH de erinde sentezlendi. Doxorubicin enkapsülasyon verimleri hesaplanarak maksimum enkapsülasyon veriminin saptandı ı pH de eri optimum pH olarak belirlendi. 2.7. Doxorubicin içeren manyetik albumin nanopartiküllerinin sentezlenmesi Manyetik ajan olarak seçilen Fe3O4 Chen ve arkada larının çalı masında belirtilen oranlar(18) dikkate alınarak kullanıldı. Buna göre 25 mg albumin, 1 mg doxorubicin ve 10 mg Fe3O4 1 ml pH’ı 6,5 olarak ayarlanmı d-suda çözüldü standart ko ullarda nanopartiküller sentezlendi. 2.8. n Vitro laç Salımı 1ml doxorubicin içeren manyetik nanopartikül süspansiyonu 12000 molekül kütleli maddelere geçirgen gözenek boyutuna sahip diyaliz torbasına konularak 10 ml pH 5.0 ve fizyolojik pH de eri olan 7.4’ e ayarlı saf su içeren reaktöre yerle tirildi ve 200 rpm hızla çalkalayıcı su banyosunda 37 o C de inkübe edildi. Belirli zaman aralıklarında suda doxorubicin tayinleri yapılarak nanopartikülden doxorubicin salımı belirlendi. 3. SONUÇLAR VE TARTI MA 3.1. Albumin Standart Grafi i Bradford yöntemiyle 0-0.2 mg/ml aralı ında BSA kullanılarak çizilen standart grafi i kullanılarak albumin miktarları belirlendi. ekil 4. Albumin Standart Grafi i 3.2 Doxorubicin Standart Grafi i Doxorubicinin dalga boyu taraması UV/V S spektrofotometre kullanılarak yapıldı ve 480 nm de Doxorubicinin maksimum absorban verdi i saptandı. 0-0.05 mg/ml aralı ında Doxorubicin kullanılarak çizilen standart grafi i kullanılarak tüm denemelerde Doxorubicin konsantrasyonları saptandı ( ekil 5). ekil 5. Doxorubicin Standart Grafi i 3.3 Nanopartikül Hazırlama ve Hazırlanılan Nanopartiküllere laç Yükleme Ko ullarının Optimizasyonu Farklı miktarlarda albumin kullanılarak hazırlanılan nanopartiküllerde desolvasyon % de erleri her bir albumin oranı için hesaplandı ve örneklerin partikül boyutları zeta potansiyel ile saptandı. Albumin miktarı 100 mg/ml alındı ında desolvasyon yüzdesi 91.6 de erine yükselsede nanopartikül boyutlarındaki görülen artı nedeniyle tercih edilmemi tir. 25 mg/ml albumin konsantrasyonunda desolvasyon % de eri 83.4 olarak saptanmı tır. 50 mg/ml albumin konsantrasyonunda ise bu de er 84.5’ dir. Desolvasyon % de erinde fazla artı olmaması nedeniyle a ırı albumin kullanımına gerek duyulmamı ve partikül boyutları yakla ık 120 nm olarak saptanan 25 mg/ml albumin konsantrasyonu sonraki denemeler için tercih edilmi tir. ekil 6’ da 25 mg/ml albumin konsantrasyonu kullanılarak hazırlanılan nanopartikül boyutlarının yarıçapının 61.58 oldu u görülmektedir. ekil 6. 25 mg/ml Albumin Konsantrasyonunda Hazırlanılan Nanopartikül Boyutu Optimum albumin konsantrasyonu ve farklı miktarlarda (0,5, 1, 2, 2,5 mg/ml) doxorubicin kullanılarak hazırlanılan nanopartiküllerde ilaç enkapsülasyon verimleri incelenerek optimum doxorubicin konsantrasyonu belirlendi. ekil 7. Doxorubicin Konsantrasyonunun Etkisi ekil 7’ de görüldü ü gibi, 1 mg/ml konsantrasyonunun üzerinde Doxorubicin kullanılarak nanopartikül hazırlanıldı ında enkapsülasyon veriminde büyük artı gözlenmemi tir. laç miktarı olarak bu nedenle 1 mg/ml konsantrasyon de eri seçilmi tir. Optimum albumin (25 mg/ml) ve Doxorubicin(1 mg/ml) kullanılarak farklı pH de erlerinde hazırlanılan nanopartiküllerde ilaç enkapsülasyon verimleri verilmi tir. ekil 8. pH Etkisi ekil 8’ de Enkapsülasyon veriminin maksimum oldu u 6,5 de eri optimum pH olarak seçilmi tir. Fe3O4 kullanılarak manyetik albumin nanopartikülleri hazırlanmı ve manyetik nanopartikül içerisine Doxorubicin enkapsüle edilmi tir. Hazırlanılan ilaç içermeyen, ilaç içeren ve manyetik özellik gösteren nanopartiküller ekil 9’ da fotograflanmı tır. ekil 10’ da ise hazırlanılan manyetik nanopartiküllere magnet yakla tırıldı ında gözlenen manyetik özellik gösterilmi tir. ekil 9. Nanopartiküller ekil 10. Manyetik Nanopartiküller 3.4. Nanopartiküllerden Doxorubicin Salımı Doxorubicin içeren manyetik nanopartikül süspansiyonu 10 ml pH de eri 5.0 ve 7.4’ e ayarlanmı saf suya kar ı diyalizlendi 37oC çalkalayıcı su banyosunda belirli zaman aralıklarında doxorubicin miktarı ölçülerek ilaç salım yüzdesi her bir pH de eri için belirlendi. Nanopartiküllerin diyaliz torbasına konularak hazırlanılan reaktör fotografları görülmektedir. Kanser, kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücrelerin orjinden veya primer bölgeden vücudun di er bölgelerine invazyonu ve yayılmasıyla karakterize olan bir hastalık grubudur. Kanserin büyüme sinyallerinin kendi kendini yönetmesi, hücrelerin büyüme inhibisyon sinyallerinden ve apoptosisten kaçması, limiti olmayan bölünme potansiyeli, anjiogenez, invazyon ve metastaz olmak üzere ayırıcı özellikleri oldu u bilinmektedir. Ço u kanser türleri lokalizasyonuna ve evrelerine ba lı olarak cerrahi müdahele, radyoterapi ve kemoterapi gibi uygulamalarla tedavi edilebilmektedir. Kemoterapi uygulamasında farmakolojik olarak aktif kanser ilacı tümör dokusuna dü ük spesifite ve doza ba ımlı toksisitesi ile ula ır. Kullanılan ço u antikanser ajan tümör hücreleri ile sa lıklı hücreleri birbirinden ayıramaz, dolayısıyla sistemik toksisiteye ve yan etkilere neden olur. Bu durum ilacın alınabilen maksimum dozunu sınırlar. Ayrıca hızlı eliminasyon ve geni bir alana yayılım ilacın fazla miktarda uygulanmasını gerektirir ancak bu durum ekonomik de ildir ve istenmeyen etkilerin ortaya çıkmasına sebep olur. Nanopartiküler ilaç ta ıyıcı sistemlerin daha etkili ve daha az zararlı olması bu problemlerin bazılarını ortadan kaldırır. Hedeflenen tümör dokusuna nanopartiküllerin ula abilmesi için elimine olmadan dola ımda uzun süre kalmaları gerekmektedir. Yüzey modifiye olmayan veya hidrofobik nanopartiküller dola ımda iken büyüklük ve yüzey karakteristiklerine ba lı olarak ba lıca karaci er ve dalak olmak üzere mononükleer fagositik sistem (MPS) tarafından yakalanırlar. Bu sorunu ortadan kaldırmak için nanopartiküller hidrofilik polimerler ile kaplanabilirler, böylece partiküller makrofajlarca yakalanmaktan korunurlar. Hidrofilitenin artırılması ayrıca partikülü suda daha çözünür yapmasının yanında enzimatik degradasyona kar ı daha az hassas olmasını ve böylece biyouyumlulu unun artmasını sa lar. lacı hedef hücreye göndermenin bir yolu da fiziksel hedeflemedir. Fiziksel hedefleme, dı arıdan verilen uyarılar ile ilacın vücut içerisindeki spesifik bir bölgede yo unla masını sa layan yeni bir hedefleme tekni idir. Manyetik alan ve ultrases uygulanarak gerçekle tirilir. Manyetik hedeflendirme yakla ımı manyetik ilaç ta ıyıcısına ba lı veya ta ıyıcıya enkapsüle edilmi bir terapötik ajanın intravenöz enjeksiyonu ve dı arıdan lokalize manyetik alan uygulamasıyla tümör dokusuna yönelmesini kapsar. Doxorubicin, ba ta over kanseri olmak üzere, meme, akci er, tiroid kanseri vs., bazı yumu ak doku sarkomaları ve bazı tür lösemilerin tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kanser ilacıdır. Doxorubicinin düzensiz kalp atı ları, kalp yetmezli i gibi istenmeyen birçok yan etkisi yanında. a ız yaraları, sindirim problemleri, saç dökülmesi, el ayak sendromu gibi ya am kalitesini dü ürücü yan etkileri de vardır. Bu çalı mada, yan etkilerin ortadan kaldırılması amacıyla kanser hücresine hedeflenen manyetik nanopartiküller sentezlenerek ilaç salımı incelenmi tir. Nanopartiküller albumin kullanılarak desolvasyon metoduyla sentezlenmi nanopartikül hazırlanılmasında optimum ko ulların tespiti amacıyla albumin konsantrasyonunun etkisi incelenerek ilaç konsantrasyonunun, pH’ ın ilaç yükleme verimi üzerine etkileri ara tırılmı tır. 25 mg/ml albumin konsantrasyonunda desolvasyon % de eri 83.4 olarak saptanmı ve bu konsantrasyonda hazırlanılan nanopartiküller farklı oranlarda ilaç yüklemesi yapılarak ilaç enkapsülasyon verimleri saptanmı tır. Enkapsülasyon veriminin %85 oldu u 1 mg/ml konsantrasyonunda Doxorubicin kullanılarak nanopartiküller hazırlanmı ve enkapsülasyon verimi en yüksek pH 6.5’ de erinde gözlemlenmi tir. Optimum ko ullarda hazırlanılan Doxorubicin yüklü nanopartiküllerin boyutları zeta potansiyel kullanılarak saptanarak farklı pH ortamlarında ilaç salımı izlenmi tir. Fizyolojik pH 7.4 dür. Kanser doku çevresinde pH de erinin dü tü ü literatür verilerinde belirtilmi tir (Ak, 2010, Pecorino, 2006). Bu nedenle pH 5 olan ortamda da ilaç salımı izlenmi tir. TE EKKÜR Proje Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Laboratuarlarında gerçekle tirilmi tir. Teorik ve laboratuar desteklerinden dolayı Doç.Dr. enay anlıer, Asistan Güliz Ak ve Habibe Yılmaz’a te ekkür ederiz. Çalı malarımız sırasında bize danı manlık yapan Biyoloji ö retmenimiz Mesut Esen’e, Bilim Kurulu E Ba kanımız Dr. Ay e Türker’e, bize her konuda destek olan okul yöneticilerimize ve ailelerimize te ekkür ederiz. KAYNAKLAR Ak, G., (2010). Folat-PEG-Doxorubicin türevinin sentezlenerek teknesyumla i aretlenmesi ve kanser görüntüleme ajanı olarak kullanım olanaklarının ara tırılması, Ege Üniversitesi Yüksek Lisans tezi, danı man Doç.Dr. enay anlıer. Soloviev, M., (2007), Nanobiotechnology today: focus on nanoparticles, Journal of Nanobio technology, 5(11), 1-3. Wang, X., et all., (2008), Application of Nanotechnology in Cancer Therapy and Imaging, A Cancer Journal For Clinicals, 58(97). Zhang, L., et all., (2008), Nanoparticles in Medicine:Therapeutic Applications and Developments, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 83, 761-769. Singh, R. And Lillard J.W., (2009), Nanoparticle-based targeted drug delivery, Experimental and Molecular Pathology, 86, 215-223. Farokhzad, O.C. and Langer, R., (2009), Impact of nanotechnology on drug, American Chemical Society Nano, 3(1), 16-20. Pecorino, L., (2006), Molecular Biology of Cancer-Mechanism, Targets and Therapeutics, Oxford University Press Inc., New York, 243. Kairemo, K., et all., (2008), Nanoparticles in Cancer, Current Radiopharmaceuticals, 1, 3036. Sinha, R., et all., (2006), Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated naoparticles for drug delivery, Molecular Cancer Therapeutics, 5(8), 1909-1917. Vasir, J.K. and Labhasetwar, V., (2005), Targeted drug delivery in cancer therapy, Technology in Cancer Research and Treatment, 4(4), 363-374. http://www.physorg.com/news 80837449.html Waterhouse, D.N., Tardi, P.G., Mayer, L.D. and Bally M.D., 2001. A comparison of liposomal formulations of doxorubicin with drug administered in free form-changing toxicity profiles, Drug Safety, 24(12):903-920). Devoti, J.M., (2006), The Cellular Basis of Cancer, 10-21, Cancer Drugs, Triggle, D.J.(Ed.), Infobase Publishing, New York, 136. Jung, K. and Rezska, R., (2001), Mitochondria as subcellular targets for clinically useful anthracyclines, Advanced Drug Delivery Reviews, 49:87-105. Bradford, MM, (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein Utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248-254. Weber, C., et all., (2000), Desolvation process and surface characterization of protein nanoparticles, International Journal of Pharmaceutics, 194:91-102. Langer, K., Balthasar, S., Vogel, V., (2003), Dinauer., von Briesen. H., Schubert.D., Optimization of the preparation process for human serum albumin (HSA) nanoparticles, International Journal of Pharmaceutics, , 257, 169-180. Chen, D., Tang, Q., Xue, W., Xiang, J., Zhang, L., Wang, X., (2010), The preparation and characterization of folate-conjugated human serum albumin magnetic cisplatin nanoparticles, Journal of Biomedical Research, , 24(1), 26-32.
