rekombınant dna teknolojisi , suç cinayet bilimleri ve bioteknoloji
advertisement
1 T.C ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ İLE İLAÇ ÜRETİMİ HAZIRLAYAN ZÜBEYDE KATARTAŞ DANIŞMAN YRD. DOÇ. DR. DİLŞAD ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Bitirme Ödevi Mayıs 2011 KAYSERİ i “…………………………………………………………………………………………………… ……………………………………..” adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmış ve ………………………………………… Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Danışman Ad Soyad Ad Soyad İmza İmza ……………………………ABD Başkanı Ad Soyad İmza ONAY : Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı’nın ………....… tarih ve …………..…… sayılı kararı ile onaylanmıştır. ………. /……../ ….. Prof.Dr. Müberra KOŞAR Dekan ii İÇİNDEKİLER Kabul onay.....................................................................................................................................i Teşekkür ......................................................................................................................................iv Özet ............................................................................................................................................... v Abstract........................................................................................................................................vi Şekil listesi.................................................................................................................................. vii Kısaltmalar ............................................................................................................................... viii 1.GİRİŞ VE AMAÇ ..................................................................................................................... 1 2.GENEL TANIMLAR ............................................................................................................... 3 2.1.Rekombinant DNA Teknolojisinin Tarihçesi ve Tanımı .................................................... 3 2.1.1.Tarihçe ................................................................................................................................. 3 2.2. Rekombinant DNA’nın üretimi ........................................................................................... 7 2.2.3.Rekombinant DNA ve rekombinant DNA teknolojisi ..................................................... 8 2.2.1. DNA izolasyonu .................................................................................................................. 8 2.2.2.DNA’nın kesilmesi ve restriksiyon enzimleri ................................................................. 10 2.2.3. DNA’nın birleştirilmesi ve DNA ligazlar ....................................................................... 14 2.3.Klonlama vektörleri ............................................................................................................. 14 2.3.1. Plazmitler .......................................................................................................................... 15 2.3.2. Viral vektörler .................................................................................................................. 16 2.3.3. Kozmid Vektörleri ........................................................................................................... 17 2.3.4. BAC Vektöleri .................................................................................................................. 17 2.3.5. YAC Vektörleri ................................................................................................................ 18 2.4.Genin hücreye sokulması .................................................................................................... 19 2.5.Geni içeren hücrenin seçimi ................................................................................................ 19 2.6.Terapötik protein rekombinant üretimi ........................................................................... 19 2.7. rDNA’nın tıp ve eczacılık sektöründeki kullanımı .......................................................... 20 2.7.1. İnsülin üretimi .................................................................................................................. 21 2.7.2. Hayvanlarda farmasötik ürünler üretimi ...................................................................... 23 2.7.3. Rekombinant aşılar .......................................................................................................... 24 2.7.4. Adli tıpta kullanımı .......................................................................................................... 24 iii 2.7.5. Gen tedavisi ...................................................................................................................... 25 2.7.6. İnsan büyüme hormonu .................................................................................................. 26 2.7.7. Hemofili A hastalığı ......................................................................................................... 27 2.7.8. Interferon eldesi ............................................................................................................... 29 2.7.9. Eritropoetin ..................................................................................................................... 31 2.9.13. (G-CSF) nötrofil üretimini uyaran Granulocyte kolonlama uyarı faktörü .............. 31 2.9.14.İnterlökin ......................................................................................................................... 31 3.TARTIŞMA VE SONUÇ ....................................................................................................... 34 KAYNAKLAR ........................................................................................................................... 37 Özgeçmiş ..................................................................................................................................... 40 iv TEŞEKKÜR Bitirme ödevi çalışmalarımın her aşamasında benden bilgi ve deneyimlerini esirgemeyen, değerli danışmanım Yrd. Dr. Dilşad Onbaşılı’ya, Berrak Dumlupınar Altınsoy’a ve hayatımın her anında maddi manevi destekleri ile yanımda olan aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. v REKOMBINANT DNA TEKNOLOJİSİ İLE İLAÇ ÜRETİMİ ÖZET Modern biyoloji kavramıyla günümüzde ilk akla gelen tanımlardan olan Rekombinant DNA ya da Rekombinant DNA teknolojisi, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislikle kesilmesi ve elde edilen farklı biyolojik kaynaklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemine ve bu işlem sonucu üretilmiş olan yeni DNA molekülüne verilen isimdir. Ökaryot genlerin yapı ve fonksiyonlarını anlamaya yönelik ayrıntılı moleküler çalışmaları mümkün kılan bu teknoloji, araştırmaya farklı orjinlerden büyük DNA moleküllerini izole etme, kesme, yapıştırma, çoğaltma, tanıma, yapısını değiştirme ve canlı organizmalara tekrar geri kazandırma imkanı sağlamaktadır. DNA moleküllerine yapılabilecek sayısız müdaheleler sayesinde fenotipten genotipe ulaşılarak yeni bir genetik analiz yaklaşımıda elde edilmiştir. Yine bu teknoloji ile yeni varyantlar oluşturulup, genlerin etki düzeyleri değiştirilmekte, yeni genler eklenip, gen analizi yapılabilmektedir. Bu araştırmada, rekombinant DNA teknolojisini ana hatları ile tanıtıp bazı uygulama alanları anlatılacaktır. Anahtar sözcükler: Rekombinant DNA teknolojisi, rekombinant DNA, rDNA, restriksiyon enzimleri vi ABSTRACT Definitions come to our mind that the concept of modern biology today is the first recombinant DNA or recombinant DNA technology, DNA molecules are mostly derived from different biological species, genetic engineering, cutting and joining of DNA fragments obtained from different biological process and the new DNA molecule is produced as a result of this transaction is the name given .1970 'with the enzyme in the two different restriction enzymes, ligases, such as the discovery of concepts, this technology has emerged Structure and function of eukaryotic genes, this technology makes it possible to understand the detailed molecular studies, the study of DNA molecules isolated from different origins to a large, cut, paste, duplicate, recognition, change the structure of living organisms and provides the possibility of bringing back the skin. DNA molecules can be done thanks to the numerous interventions genotype phenotype was obtained by reaching a new approach to genetic analysis. With this technology created new variants of genes influence levels replaced, the new genes added to the gene analysis can be done. In this study, recombinant DNA technology to introduce some of the main lines applications will be explained Keywords: Recombinant DNA technology, recombinant DNA, rDNA, restriction enzymes vii ŞEKİL LİSTESİ ŞEKİL 1:Rekombinant DNA teknolojisiyle ilaç üretimi .............................................................. 8 ŞEKİL 2: Rekombinant DNA teknolojisinin işlem basamakları .................................................. 9 ŞEKİL 3: Restriksiyon enzimleri kesim noktalarının yerine bağlı olarak yapışkan veya kütuçlu fragment verebilirler. ................................................................................................................... 13 ŞEKİL 4: Restriksiyon enzimi fragmentleri jel elektroforezi yardımı ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır. ......................................................................................................... 14 ŞEKİL 5: Plazmid vektör ............................................................................................................ 17 ŞEKİL 6: YAC vektör ile kaynak DNA ..................................................................................... 20 ŞEKİL 7: Rekombinant plazmit oluşumu ................................................................................... 29 ŞEKİL 8: İmmünoafinite kromatografisi yöntemiyle saflaştırma .............................................. 31 viii KISALTMALAR DNA :Deoksiriboznükleik asit rDNA :Rekombinant DNA E.coli :Escherichia coli SDS :Sodyum dedosil sulfat cDNA :Komplementer-tamamlayıcı DNA PZR :Polimeraz zincir reaksiyonu EPO :Eritropoetin RNA :Ribonükleik asit GDO :Genetiği değiştirilmiş organizma mRNA :Messenger RNA A.B.D :Amerika Birleşik Devletleri TPA :Plazminojen dokusu aktive ettirici SCID :Ağır kombine immun yetmezlik, HBsAg :Hepatit B virüsüne karşı hormon RF :Replikatif form S.cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae TPA : Aktive ettirici plazminojen dokusu Kb : Kilobayt GH : İnsan büyüme hormonu FDA : Food and Drug Administration IFN :İnterferon PG : AML : Piyoderma Gangrezum Akut myeloid lösemi : 1 1.GİRİŞ VE AMAÇ Rekombinant DNA (rDNA) molekülleri ilk olarak 1972 yılında Stanford üniversitesinde bulundu (32). Bu kavram klasik biyoloji haricinde modern biyolojinin de ortaya çıkmasına sebep oldu. Klasik biyoloji ökoryotlarda ki bilinmeyenlerde çözüm üretememekteydi. Ökoryot gen ve yapıları anlamaya yönelik çalışmalarda rDNA ’nın bulunması çok önemli katkı sağladı ve halen de sağlamaktadır (22). Biyolojik değişimler ve genetik olayların gelişimine paralel olarak rekombinant DNA teknolojisinde birçok ilerleme yaşandı. Yeni teknolojilerin gelişimi, biyokimyasal tanımlı proteinlerin çoklu üretimi ile sonuçlanmakta olup, gerek tıp sektöründe gerekse de eczacılık sektöründe büyük potansiyel yaratmıştır. Rekombinant DNA teknolojisindeki süratli gelişme gen aktiviteleri ile ilgili çalışmalar yapmak için yeni fırsatlar ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği alanında yapılan çalışmalarla, gen aktarım teknolojilerinin önemi gün geçtikçe artmaktadır (8). Bu teknoloji ile genlerin analizi, değişimi yapılmaktadır. Artık fenotipten genotipe değil, genotipten fenotipe ulaşılabilmektedir. Doğada olmayan varyantların oluşumu, genlerin etki düzeylerinin değişimi, organizmalara yeni gen aktarımı vs. gibi birçok önemli olay gerçekleştirilmektedir. Bu ilerlemeler tabi ki eczacılıkta ve tıpta da önemli yer kazanmaktadır (21). Tıpta, birçok genetik bozuklukların ve hastalıkların teşhis ve tedavisinde önemli rol oynamaktadır. Eczacılıkta ise, farmasötik ürünlerin üretiminde önemli rol oynamaktadır (2). 2 Rekombinant DNA teknolojisinin tıp bilimine olan etkileri, son yirmi yıl içinde kalıtsal hastalıklara neden olan nükleotid değişimlerinin tanımlanması üzerinde yoğunlaşmış ve büyük başarılar elde edilmiştir. Günümüzde ise kanser, psikiyatrik, kardiyovasküler ve hormonel hastalıklar gibi sık rastlanan hastalıkların gelişiminde önemli bir yer tutan bu teknoloji, bireyler arasındaki metabolik farklılıklardan kaynaklanan nükleotit değişimleri de tanımlayabilmektedir (8). Biyofarmasötik sektör genel olarak moleküler biyoloji tekniklerine bağlı olup, manipülasyon için genetik mühendisliğini ve terapötik makromoleküllerden üretimini taban alır. Onaylı biyofarmasötik ürünlerinin çoğunluğu rekombinant yöntemlerle üretilmiş hücre hatlarında üretilen proteinlerdir. Örnekleri bir mühendislik hayvan hücresinde doğrultusunda eritropoetin (EPO) üretimi gibi rekombinant E. coli ve rekombinant S.cerevisiae üretimi içerir (8). Rekombinant DNA teknolojisinin diğer bir avantajı ise, zaman ve maliyet tasarrufuna izin vermekle beraber üretim sayısını da arttırmış olmasıdır. Bu durum ticari olarak da teknolojinin kullanılmasını teşvik etmektedir. Bu çalışmamızdaki amacımız, rekombinant DNA teknolojisinin kullanımı, uygulamaları, işlem aşamalarını ve bu teknolojinin önemli elemanlarını inceleyip tıp ve eczacılık alanındaki faydalarını araştırmaktır. 3 2.GENEL TANIMLAR 2.1. Rekombinant DNA Teknolojisinin Tarihçesi ve Tanımı 2.1.1.Tarihçe Dünyada hayatın başladığı kabul edilen 4.6 milyar yıl önce, DNA yaşamın hücresel metabolik aktivasyonlarını ortaya koyan genetik yapı olarak hizmet etmiştir.”GEN” terimi 1900 lü yıllara kadar kullanılmamasına rağmen genin fonksiyonu ile olan araştırma 1800 lü yıllarda başlamıştır. Gregor Mendel, Avusturyalı din adamı, manastırın bahçesinde yıllarca çalışmış, farklı bezelye varyetelerini melezlemiştir (1, 17, 31). 1972 yılında Stanford Üniversitesi’nde bu enzimler kullanılarak ilk “rekombinant” DNA molekülleri elde edilmiştir (32). Rekombinant DNA teknolojisi özellikle 1960'lı yılların sonlarına doğru DNA ile ilgili bazı enzimlerin etki mekanizmalarının anlaşılması sayesinde gerçekleştirilen bir dizi yöntemleri kapsamıştır. Bununla birlikte bu süreç 1940'lardan 70'lere kadar moleküler biyolojinin gelişmesini sağlayan bilgi birikimini de rekombinant DNA teknolojisinin temelini oluşturmuştur (1). Genetik çeşitlenme olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan rekombinant DNA teknolojisine (rDNA) ilişkin ilk çalışmalar, 1973 yılında başta Cohen olmak üzere bir araştırma grubunun önderliğinde in vitro koşullarda gerçekleşmiştir. Buna göre doğada eldesi imkânsız olan yeni gen düzenlemelerinin yapımı bu teknolojiyle sağlanabilmekte, bir canlının genotipi önceden belirlenebilmekte ve 4 yönlendirilebilmektedir. In vitro koşullarda oluşturulan yeni DNA moleküllerine önceleri "kimera" (aslan başlı, keçi gövdeli ve yılan kuyruklu mitolojik bir yaratık) adı verilmiştir. Bu kimeralar, birbirleriyle ilişkili olmayan ve farklı kökenler ait genleri içeren rekombinant DNA molekülleridir (1). Rekombinant DNA teknolojisi 1980' li yıllarda dev adımlarla ilerlemiş ve günümüzde adından en çok bahsedilen ve moleküler genetikte devrim yaratan bir bilim dalı olmuştur (22). Özellikle 1985' de ortaya atılan bir veya iki hücreden elde edilen DNA' nın birkaç saat içersinde çoğaltılarak 24 saatte genetik tanının konmasına olanak sağlayan Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) rDNA teknolojisi için belki en büyük gelişmelerden biri olarak kabul edilebilir (3 , 4). Rekombinant DNA teknolojisinin tarihçesi, ana hatlariyla kronolojik olarak şu sekilde verilebilir. 1869 - Friedrich Miescher hücre çekirdeginden izole ettigi asit karakterli maddeye "Nükleik Asit" adini vermistir. 1861'de Gregor Mendel ilk kez genlerin varligini bezelyelerde yaptigi çalismalarla ileri sürmüstür. 1869'da da Ren nehrinde bir sazanin sperminde DNA'nin bulunmasi; DNA Rekombinant Teknolojisinin baslangicini olusturmuştur. 1868'de Haeckel spermin nükleer (çekirdeksel) materyelden olustugunu belirterek; hücre çekirdeginin kalıtımdan sorumlu oldugunu ileri sürmüstür. 1909-Cinsiyet kromozomlarinin keşfi. 1910 - Thomas Morgan tüm kalıtsal özelliklerin kromozomlardan kaynaklandığını göstermiştir. 1941 - Bir genin, bir tek proteini kodladığı gösterildi (Beadle ve Tatum). 1944 - DNA'nin genetik bir molekül oldugu ve bakterinin kalıtımını değiştirme yeteneğinin oldugu belirlenmistir. (Avery, MacLeod, McCarthy; A.B.D.) 1946 - Bakteride genetik rekombinasyonun oluşturulması. 1949 - Orak hücreli aneminin, genetik olarak belirlenmesi. 1950 - Chargraff, DNA’nın adenin, guanin, sitozin, timin ve deoksiriboz'dan oluştuğunu göstermişti. 1953 - DNA’nın komplementer helikal yapısının hipotezi ortaya atılmıştır. "Nature" 5 isimli dergide, Nisan 1953'de J.D.Watson ve F.H. Crick yaklaşık 1000 kelimelik bir tetmişlerdir. McClintock transposable elemanları tarif etti. 1956 - DNA’nın genetik bilgiyi, baz dizileri ile aktardığının genetik deneylerle saptanması gerçekleştirilmiştir. Tjio ve Leuan, insanda 46 kromozom olduğunu belirlemişti. 1957 - John Kendrew, myoglobin proteininin 3 boyutlu yapısını saptamıştı. 1958 - DNA replikasyonunun, double heliksin komplementer dizilerinin ayrılması ile olduğu belirlenmiştir. DNA polimeraz I'in izolasyonu (tüpte DNA yapımını olası kılan enzim) gerçekleştirilmiştir. 1960 - RNA polimeraz (Tek zincir DNA üzerinde RNA zincirinin yapımını sağlayan enzim.) keşfedilmiştir. Messenger RNA’nın, amino asitten protein sentezi için gerekli olan bilgiyi taşıması bulunmuştur. 1961 - Sentetik mRNA molekülü (poly-U) genetik kodun ilk harflerinin çözümünde kullanılmıştır. 1962 - Watson ve Crick'in, 1953'de yaptıkları DNA’nın yapısı ile ilgili çalışmaları Nobel ödülünü kazanmıştır. 1965 - Küçük kromozomların (plazmid) antibiyotik direnç genlerini taşıdıkları belirlenmiştir. 1966 - Genetik kodun çözümlenmesi tamamlanmıştır. 1967 - DNA Ligase enzimi keşfedilmiştir. 1968 - M. W. Nirenberg, genetik kodun belirlenmesindeki çalışmaları nedeni ile Nobel ödülünü almıştır. 1970 - İlk Restriction Endonükleaz enzimi ve reverse transkriptaz enziminin keşfi gerçekleştirilmiştir (W. Arber, H. Smith, D. Nathans). 1971 - Retinoblastomada iki vurus teorisi öne sürülmüştür. (A. G. Knudson). 1972 - İlk rekombinant DNA molekülü DNA Ligase ve Restriction Endonükleazlar kullanılarak yaratılmıştır. 1973 - İlk klonlama plazmid vektörler kullanılarak gerçekleştirilmiştir (S. Cohen, H. Bayer). Rekombinant DNA tekniklerinin potansiyel olarak tehlikeli yeni 6 mikroorganizmaları yaratabileceği toplumda tartışılmaya başlanmıştır. 1974 - İlk kez rekombinant teknolojinin sınırlarının çizilme çalışmaları başlatılmıştır. 1975 - Spesifik DNA dizilerinin belirlenmesinde kullanılan Southern Blot teknigi bulunmuştur. G. Köhler ve C. Mistein monoklonal antikorları üretmek üzere hibridoma tekniğini tanımladılar. 1976 - Taq DNA polimeraz bulunmuştur. 1977 - DNA teknolojisi kullanılarak, ilk insan proteininin biosentezi gerçekleştirilmiştir. İlk Genetik Mühendislik (Genentech; A.B.D.) firması kurulmuştur. Memeli DNA’sını kapsayan rekombinant DNA molekülleri ilk kez yaratılmıştır. DNA moleküllerinin uzun bölgelerinin incelenebilmesi için hızlı dizi analiz yöntemleri geliştirilmiştir (MaxamGibert Teknigi). Split genler keşfedilmiştir. İlk insan viral antijeni (hepatit B) klonlanmıştır. 1978 - Restriction Endonükleazlar için Nobel Ödülü verilmiştir. Rekombinant teknoloji ile bir hormon olan "Somatostatin'in üretimi gerçekleştirilmiştir. RFLP ile hastalığa indirek yaklaşım modeli ileri sürülmüştür. 1979 - Onkologenlerin keşfi. Ayrıca DNA teknolojisi ile ilk teşhis gerçekleştirilmiştir. (Y. W. Kan). 1980 - İnsülin sentezi için ilk fabrikanın yapımına başlanmıştır. DNA dizi analizi ve ilk rekombinant DNA moleküllerinin yaratılması için Nobel Kimya ödülü verilmiştir. 1981 - Mitokondrial genomon dizisinin çözümlenmesi. 1982 - DNA teknolojisi ile üretilmiş ilk insan insülini, "Humulin" ismiyle piyasaya verilmiştir. 1983 - Bakteriofaj lambda DNA’sının tüm dizisinin belirlenmesi tamamlanmıştır. 1985 - "Polimeraz Zincir Reaksiyonu" tekniği gerçekleştirilmiştir (Mullis). Rekombinant teknolojisi ile üretilmiş ilk aşı olan "Hepatit B" asisi piyasaya verildi. 1986 - İnterferon-a'nin hairy-cell lösemide kullanımına izin verildi. 1988 - Transgenik Fare'nin (oncomouse) ABD'de patent aldı. İnsan Genom Projesinin başlaması.. 1989 - İlk kez genetik olarak yeniden yapılandırılmış lenfositler hastalarda kullanılmıştır. 1990 - İlk Gen Tedavisi, ADA enzim eksikliği gösteren bir çocukta gerçekleştirilmiştir. 7 1992 - Üçlü nükleotid genişlemesinin yeni bir patojenik mutasyon şekli olduğu gösterildi. 1993 - K. Mullis (A.B.D.) PCR tekniğinden dolayı Nobel Kimya Ödülünü; genetik şifreyi yeniden programlayarak proteinin yapımını araştıran M.Smith (Kanada) ile paylaşmıştır. Nobel Tip Ödülünü ise gen yapısının kesintisiz bir bütün değil, bölünmüş olduğunu ve genlerin nasil çalistigini gösteren R. Roberts (Ingiltere) ve P. Sharp (A.B.D.) almışlardır. 1995 - Nobel tip ödülünü erken dönem embriyo gelismesini kontrol eden önemli genetik mekanizmaları bulan C. Nüsslein-Volhard, E.F.Wies Chaus ve E. B. Lewis almışlar. 1997 - Helicobacter pylori genomunun tümüyle çözümlenmesi ve ilk kopyalama işlemi koyunda gerçekleştirilmiştir (2, 17, 19). 2.2. Rekombinant DNA’nın üretimi: Rekombinant DNA teknolojisinin esası çalışılan organizmadan izole edilen DNA’nın ilgili parçasının restriksiyon enzimleri ile kesildikten sonra bakteri plazmidleri gibi, kendisi çoğalabilen bir taşıyıcı DNA (vektör) içine entegre edilmesidir. Vektör DNA’sı ve içine eklenen DNA parçasının oluşturduğu yeni DNA molekülüne rekombinant DNA adı verilmektedir. Daha sonra bu molekül bakteri hücrelerine aktarılarak çok fazla miktarda üretimi sağlanmıştır. Bu işlemde yaygın olarak her bir bakteri hücresine bir rekombinant DNA molekülünü taşıyan tek bakteri kolonisi oluşturulur. Kolonideki her bir bakteri aynı rekombinant DNA’yı taşıdığından bu bakteri populasyonuna DNA klonu adı verilmiştir. Bu koloniye ait bakterilerin çoğaltılması ile istenen DNA parçasının sınırsız miktarda üretimi sağlamıştır (4, 21). Rekombinant DNA teknololjisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamına da denmektedir (1). 2.2.1.DNA izolasyonu Rekombinant DNA üretiminin ilk aşaması, çalışılan organizma DNA’sı ve vektör DNA’sının izolasyonudur. Genomik klonlama için yüksek moleküler ağırlıkta çekirdek DNA’sının bitkisel veya hayvansal dokulardan izole edilmesi gerekir. Her ne kadar izole edilen DNA daha sonra spesifik enzimlerle çalışılabilecek büyüklükte kesilse de, 8 izolasyon sırasında mekanik kırılmanın minumum düzeyde gerçekleştiğinden emin olunmalıdır. Ayrıca, bu DNA organel DNA’sı, RNA ve daha sonraki çalışmaları aksatacak, özellikle restriksiyon enzimlerinin çalışmasını durduracak, protein ve polisakkarit gibi kirleticileri de içermemelidir (22). İlaç Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi İnsan Hücresi Hormon DNAsı Rekombinant Plazmid DNAsı Rekombinant Bakteri Hücresi Hormon Bakteri Hücresi Plazmid DNAsı Rekombinant Hayvan Hücresi Rekombinant Hormon ŞEKİL 1: Rekombinant DNA teknolojisiyle ilaç üretimi (14) Temelde DNA izolasyonu hücre duvarı ve / veya hücre zarının SDS (sodyum dedosil sulfat) gibi deterjanlarla zayıflatılıp parçalanarak DNA’nın açığa çıkarılması, protein ve polisakkarit gibi kirleticilerin fenol-kloroform gibi organik çözücülerle, RNA’nın da RNaz enzimi ile ortamda uzaklaştırılması ve sonrasında DNA’nın tuz ortamında alkol ile çöktürülmesi basamaklarından oluşmaktadır, fakat çalışılan organizmaya göre bazı küçük değişiklikler söz konusu olabilir. Örneğin, bakteri duvarını parçalayan lizozim enzimi bitki hücre duvarını parçalayamaz, bu nedenle izolasyon öncesinde bitkisel dokuların sıvı azotta dondurulup pudra haline gelene dek öğütülmesi DNA miktar ve kalitesini arttırma açısından önemlidir (22). 9 ŞEKİL 2: Rekombinant DNA teknolojisinin işlem basamakları (34) Vektör DNA’larının izolasyon metotları, Sambrook ve ark. (1989) tarafından verilmiş olup kullanılan vektör tiplerine göre bazı değişiklikler göstermektedir. En yaygın vektör olan plazmitlerden DNA izolasyonu için kullanılan strateji genomik DNA izolasyonunki ile aynıdır. Plazmitleri içeren bakteriler besi ortamında büyütülür, santrifüjle toplanır, bakteri duvarları parçalanır, açığa çıkan DNA’dan proteinler ve RNA uzaklaştırıldıktan sonra DNA etanolle çöktürülür. Fakat burada dikkat edilmesi gereken konu plazmit DNA’sının bakteri kromozom DNA’sından ayrılması gerekliliğidir. Çünkü plazmit DNA’sına çok küçük miktarda bakteriyel DNA karışması dahi gen klonlama çalışmalarında istenmeyen sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, plazmit izolasyonu sırasında bakteri DNA’sını ortamdan uzaklaştıran çeşitli metodlar kullanılmaktadır. Bu metotlar plazmit DNA’sı ve bakteriyel DNA arasındaki yapı ve büyüklük farklılığına dayanmaktadır. En sık kullanılanları alkali denatürasyonu ve etidyum bromid-sezyum klorür yoğunluk gradienti santrifüjlemesidir (22). 10 Diğer bir vektör tipi olan fajların DNA’sı bakteri özütü yerine enfekte olmuş bakteri kültürünün büyütüldüğü besi yerinden rahatlıkla izole edilebilir. Fakat böyle bir kültürde milimetre başına düşen hücre dışı faj sayısının yeterince yüksek olması gerekmektedir. Dolayısıyla yeterli miktarda DNA eldesi içinde 1 ila 2 litrelik kültürler kullanılmalıdır. Santrifüjlenen kültürde bakteriler pellet halinde çökerken faj partikülleri sıvı ortamda kalır. Bu aşamadan sonra faj partikülleri polietilen glikol varlığında çöktürülür ve kapsidleri uzaklaştırılarak DNA açığa çıkarılır (22). İzole edilen çekirdek ve vektör DNA’larının nanogram veya mikrogram cinsinden miktarları spektrofotometrik yöntemle belirlenir. DNA kalitesi ve büyüklüğü ise agaroz jel elektroforezi ile gözlemlenir (22). 2.2.2. DNA’nın kesilmesi ve restriksiyon enzimleri Rekombinant DNA teknolojisi, DNA moleküllerini bir test tüpü içersinde manipüle etme yeteneğidir. Bu yeteneğin kaynağı ise ticari olarak üretilen enzimlerdir. Hücre içinde bu enzimler DNA replikasyonu, transkripsiyon, yabancı DNA’nın ortamdan uzaklaştırılması, mutasyona uğramış DNA’nın tamiri gibi birçok önemli işlere katılırlar, hücreden izole edildikten sonra da benzer ortam şartları sağlandığında aynı reaksiyonları katalizlemeye devam ederler. Restriksiyon enzimleri olarak adlandırılan ve bakterilerden izole edilen enzimler rekombinant DNA teknolojisinin vazgeçilmez öğeleridir (14, 22). Restriksiyon enzimi veya restriksiyon endonükleazı (kesme enzimi veya sınırlama enzimi de denir) çift zincirli DNA moleküllerindeki belli nükleotid dizilerini tanıyan ve her iki zinciri birlikte kesen bir enzim türüdür. Bu özel enzimler, bakteri ve arkelerde bulunurlar. Bu enzimler virüslere karşı bir savunma mekanizması olan restriksiyon modifikasyon sistemine aittirler. Bakteri içindeki görevleri hücre içine giren viral kaynaklı DNA’ları parçalamaktır. Bu işlem sırasında bakterinin kendi DNA’sı zarar görmez, çünkü başka bir enzim, metilasyon enzimi, tarafından metillenmiştir. Metilasyon DNA’yı restriksiyon enzimlerin kesiminden korur ve hücrenin kendi DNA’sını parçalamasını önler (32). Restriksiyon enzimleri, moleküler biyolojide "makas" diye de tabir edilebilirler. Bu enzimler kanat bölge arasında kalan bölgeyi çıkarır, işlem sonrası iki türlü parçalar oluşur. Kesim noktaları simetri merkezinde veya dışında olabilir ve buna bağlı olarak da küt veya yapışkan uçlu DNA fragmentleri verirler. Bazı restriksiyon enzimleri, Smal, 11 Haell gibi, çift kollu DNA’yı tanıma bölgelerinin orta kısımlarından keserek küt uçlar oluştururken, EcoRI, HindIII gibi bazı enzimler de çift kollu DNA’yı tanıma bölgelerinde 2 ya da 4 nükleotidlik tek zincirli uçlar oluşturacak şekilde kesmektedir. Enzim kesim noktasına bağlı olarak tek kollu uçlar 5’ ucunda oluşabileceği gibi 3’ucunda da oluşabilir. İşte bu uçlara genel olarak yapışkan uçlar denir, çünkü aynı enzimle kesilerek yapılmış yapışkan uçlar birbirinin tamamlayıcısı olduğundan bu bölgelerden tekrar birleşebilirler. Bazı enzimlerin tanıma bölgeleri farklı olduğu halde oluşturdukları yapışkan uçlar aynı nükleotit dizisine sahip olabilir. Sau3Al (tanıma dizisi GATC) ve BamHI (tanıma dizisi GGATCC) enzimleri 5’- GATC-3’ yapışkan uçlarını oluştururlar. Bunun anlamı Sau3Al ile kesilen bir DNA parçasının BamHI ile kesilen diğer bir DNA parçası ile birleşebileceğidir. Bu özellik rekombinant DNA teknolojisi için çok önemlidir. Bir DNA molekülünün aynı restriksiyon enzimi ile kesilmesi halinde her zaman aynı fragmentleri elde edilir ve bu fragmentler değişik amaçlarla kullanılabilir (şekil–3) (6). Sayıları 1200 civarında bulunan restriksiyon enzimleri 3 farklı grupta toplanmıştır: Tip I - II ve III. Bu enzimlerin tümü spesifik bir DNA dizisini tanırlar, fakat sadece Tip II restriksiyon enzimleri DNA’yı tanıma bölgesinin içinden keserler. Bu grup enzimler rekombinant DNA oluşturmada kullanılan en önemli enzim tipidir. Tip I ve III enzimleri ise DNA’yı tanıma bölgelerinin dışından keserler ve genetik mühendisliğinde kullanım alanları çok kısıtlıdır (22). Tip II restriksiyon enzimlerinin tanıma bölgeleri 4–8 baz dizisi uzunluğunda olabilir. Genelde bu tanıma bölgeleri palindromiktir, yani DNA’nın bir kolunda 5’→3’ yönündeki tanıma bölgesi dizisi, tamamlayıcı koldaki 5’→3’ tanıma bölgesi dizisiyle aynıdır (32). Bu enzimler, rekombinant DNA teknolojinin ana elemanlarından biridir ve bakteriyel endonükleazlardan olan enzimlerdir. Bu enzimler çift zincirli DNA’yı özgül nükleotid dizilerinden tanır ve keserler. Tanım bölgeleri 4 – 6 nükleotid genişliğinde olan enzimler bu teknolojide özellikle tercih edilirler. Bugün tanıma bölgeleri ve optimum çalışma koşulları bilinen 200’den fazla restriksiyon enzimi bulunmakta ve ticari olarak sağlanabilmektedir. Bir restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ne kadar geniş olursa, DNA molekülü üzerinde tekrarlanma şansı o kadar azalır ve DNA bu enzimle kesildiği 12 zaman da daha az sayıda fragment elde edilir. Tanıma bölgesi incelendiği zaman nükleotid sekansları yönünden bilateral simetriye sahip olduğu görülür (6, 22). Enzimler palindrom özellik gösteren yerlerde 4–6 çift baz içeren diziler oluşturmaktadır. Palindrom derken 5^→3^ okunma ve 3^→5^ okunma yönünde de aynı diziyi ifade edebilmesidir. Örnek verilecek olursa ATAT dizisi palindrom özellik göstermektedir. Makasların diğer özelliği ise Z çizerek kesmesidir (6). Şekil 3: Restriksiyon enzimleri kesim noktalarının yerine bağlı olarak yapışkan veya küt uçlu fragment verebilirler (6). Hücresel DNA, restriksiyon enzimlerinden bir veya birkaçı kullanılarak parçalandığı zaman, ortaya çıkacak fragmentlerden bir tanesi ilgilendiğimiz interferon genlerini taşıyor demektir. Bu fragmentlerin birbirinden ayrılması jel elektroferezi ile sağlanır. Tercihen agaroz jelde, elektrik akımının yardımı ile fragmentler büyüklüklerine göre birbirinden ayrılırlar (şekil- 4) (6). Kesilen gen parçaları plasmid DNA kullanılarak çoğaltılabilir. Bunun içinde plasmid DNA'nın yanında konakçı bir bakteri hücresi olması da şarttır. Ancak bakterinin kendi global DNA'sının üremesini durdurmak gerekir (6). 13 Şekil 4: Restriksiyon enzimi fragmentleri jel elektroforezi yardımı ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır (6). Konak bakteri hücresinde restriksiyon enzimleri seçici olarak yabancı DNA’ları keserler; bu sırada konak DNA’sı kesme enziminin etkinliğinden korunmak için bir değiştirme (modifikasyon) enzimi (metilaz) tarafından metillenir. Bu iki süreç toplu olarak kesme-değiştirme sistemi olarak bilinmektedir. Bir kesme enzimi DNA'yı kesmek için; ilki DNA çift sarmalının her şeker-fosfat omurgasından (örn. her zincirden) olmak üzere iki yarma (ensizyon) yapar (22). Restriksiyon enzimleri tek başlarına gen klonlama için yeterli değildir. Aynı enzimle oluşturulan yapışkan uçlar her ne kadar hidrojen bağları ile birbirlerine tutunsalar da hidrojen bağları iki DNA parçasının kalıcı şekilde birleştirilmesi, rekombinant DNA teknolojisi için önemli diğer bir enzim olan DNA ligaz tarafından gerçekleştirilir (22). 2.2.3. DNA’nın birleştirilmesi ve DNA ligazlar Restriksiyon enzim kesimi ile oluşturulmuş aynı yapışkan uç dizisini taşıyan DNA parçaları birbirleri ya da aynı restriksiyon kesim yapılmış başka DNA parçaları ile in vitro şartlarda birleştirilebilir. Bu işlem DNA ligaz enzimleri ile gerçekleştirilir ve ligasyon olarak bilinir. Ligaz enzimleri her hücrede bulunur, fakat labovatuarda 14 kullanılan ligazlar genelde ya normal E.coli hücrelerinden ya da T4 bakteriofajı ile enfekte edilmiş E.coli hücrelerinden izole edilirler. Hücrede DNA ligazlar, DNA replikasyonu sırasında oluşan fragmentlerini 3’- 5’ fosfodiester bağları ile birbirine bağlamada ve hasarlı DNA’ların tamirinde görev alırlar. Rekombinant DNA teknolojisinde ise ligaz enzimi ilgi duyulan DNA parçalarını vektör DNA moleküllerine in vitro şartlarda kovalent bağlarla bağlayarak rekombinant DNA elde edilmesinde kullanılır. DNA ligaz enzimi ATP varlığında birbirine geçici olarak hidrojen bağları ile tutunmuş yapışkan uç taşıyan DNA parçalarından birinin 3’ hidroksil ucuyla, vektörün 5’ fosfat ucu arasında 3’-5’ fosfodiester bağı oluşumunu katalizler (22). T4 DNA ligaz ile küt uç taşıyan DNA parçalarının da birleştirilmesi mümkündür. Fakat birleşecek uçların karşı karşıya gelme ihtimali az olduğundan başarı düşüktür, dolayısıyla çok yüksek DNA konsantrasyonları ile çalışılmasını gerektirir. Klonlama çalışmalarında eğer klonlanacak DNA küt uçlu ise kısa çift iplikli adaptör ya da bağlayıcı (linker) moleküller eklenir. Bu moleküller yapışkan uç meydana getiren, vektör DNA ile uyumlu bir restriksiyon enzimi kesim bölgesi içerirler (22). Buraya kadar DNA’ nın hedef organizmadan ve vektörden nasıl izole edildiğinden, rekombinant DNA molekülünün nasıl oluşturulduğundan bahsedildi. Bundan sonra ise rekombinant DNA eldesinin, molekül bir konakçı hücreye aktarılıp çoğaltılmadıkça bir anlamı yoktur. Bu aşamada en önemli kriter çalışılacak gen parçasının taşınacağı uygun bir klonlama vektörünün seçimidir. 2.3. Klonlama vektörleri Normalde restriksiyon kesimleri ile oluşturulmuş DNA parçaları doğrudan bakteri hücresine giremez. Dolayısıyla, vektör adı verilen bakteri içinde bağımsız çoğalabilecek başka bir DNA molekülüne eklenmesi gerekir. Klonlamada kullanılacak vektörler bazı özelliklere sahip olmalıdır. İlk olarak, vektör molekülü küçük olmalı ve bakteriden izolasyonu kolay olmalıdır. Vektör molekülü konakçıya uygun bir replikasyon merkezi taşımalıdır. Aksi halde vektör bakteri içinde çoğalamaz. Vektör DNA’sı üzerinde, ayrıca, vektörü taşıyan ve taşımayan konakçı hücreleri birbirinden ayırt etmeye yarayacak kolayca belirlenebilen bir seçici belirteç gen (genel antibiotiğe direnç geni, ya da konakçı da bulunmayan bir enzim geni) olmalıdır. Rekombinant DNA moleküllerinin oluşturulmasında klonlanacak DNA’nın büyüklüğüne ve 15 çalışmanın amacına bağlı olarak çok farklı tiplerde klonlama vektörleri kullanılmaktadır (22). 2.3.1. Plazmitler Plazmitler, bakteri içersinde kromozom DNA’sından bağımsız olarak kendi kendine çoğalabilen, çift zincirli, halkasal ekstra DNA molekülleridir. Plazmitler, doğal olarak tüm bakterilerde bulunur ve taşıdığı genlerle bakteriye bazı ekstra özellikler kazandırır. Örneğin, bazı bakteri plazmitleri, antibiotikleri inaktifleştiren enzimler kodlar. Plazmitler klonlama çalışmalarında kullanılmak üzere değiştirilerek yukarıda bahsedilen özellikler kazandırılır. Doğal plazmitlerden türetilerek kullanılan en yaygın plazmitler pBR322 ve pUC vektörleridir (22). Şekil 5: Plazmid vektör (14) pBR322 genel amaçlı kullanılan en eski plazmit vektörüdür ve 4361 baz çifti büyüklüğündedir. Yapısında seçici belirteç geni olarak amfisilin ve tetrasiklin antibiotiklerine direnç genleri bulunur. Her iki gen içinde klonlamada kullanışlı restriksiyon enzim kesim bölgeleri yer alır. Saflaştırılmış, kapalı pBR322 molekülleri herhangi bir antibiotik direnç geni içinde bulunan enzim kesim bölgesinden kesildiğinde yapışkan uçlu doğrusal DNA molekülleri meydana gelir. Bu doğrusal vektör molekülleri çalışılan organizmadan izole edilmiş ve aynı enzimle kesilerek yapışkan uç oluşturulmuş hedef DNA ile birleşebilir özelliktedir. Eğer kesim, tetrasiklin geni içinden yapılıp hedef DNA molekülü eklenmişse tetrasiklin geni inaktif duruma geldiği için bu vektörü taşıyan hücreler tetrasikline duyarlı olacaklarından ortamda seçilebilir (22). pUC vektör sistemleri daha da geliştirilmiş yapıdadır. Bu vektörler seçici belirteç geni olarak antibiotiğe direnç geninin yanında E.coli B-galaktosidaz geninin bir parçasını 16 taşır. E.coli B-galaktosidaz geni içinde farklı restriksiyon enzim kesim dizileri taşıyan birçok klonlama bölgesi bulunur. Bu bölgeye DNA klonlandığında genin yapısı bozulur ve bu plazmitleri içeren hücreler B-galaktosidaz substratı X-gal içeren ortamlarda çoğaltıldığında kolaylıkla seçilebilir. Plazmid vektörler 5-10 kb büyüklüğündeki DNA parçalarının klonlanmasında etkin şekilde kullanılabilirler (22). 2.3.2. Viral vektörler Plazmit vektörlerine 10 kb’dan daha büyük parçalarının etkin şekilde klonlanamaması nedeniyle viral vektörler geliştirilmiştir. Bunlardan en yaygın kullanılanı bakteriofaj lambda vektörüdür. Bir E.coli virusu olan lambda fajının genomu yaklaşık 45 kb büyüklüğündedir ve bunun yaklaşık 15 kb’lık kısmı faj DNA’sının E.coli kromozomuna entegrasyonunu sağlayan genleri içerir. Genomun ortasında bulunan bu bu restriksiyon enzimleri ile çıkarılıp yabancı DNA, DNA ligaz enzimi yardımıyla eklenebilir. Faj DNA’sı bu şekliyle de bakteriyi enfekte etme ve kendini bakteri içinde çoğaltma yeteneğine sahiptir. Lambda genomu doğrusaldır, fakat cos bölgesi denilen, genomun iki ucundaki 12 nükleotitlik tek kollu uçlar tamamlayıcı diziler taşıdığından bir biriyle birleşir ve halkasal yapı oluşturur. Dolayısıyla deney tüpünde plazmitle aynı yolla manipule edilerek transfeksiyon denilen bir yöntemle E.coli hücrelerine aktarılırlar (22). Klonlama vektörü olarak geliştirilen diğer bir viral vektör de M13 bakteriofajıdır. Bu virüsün bakteri hücresini enfekte eden tek zincirli DNA’sı bakteri içinde çift zincir oluşturur. Replikatif form (RF) olarak bilinen bu çift zincirli molekül bakteriden izole edilerek gen klonlamada kullanılabilir. Bu moleküller bakteri hücresine aktarıldığında normal RF, DNA gibi davranır ve kendisinin dolayısıyla da taşıyacağı yabancı DNA’nın tek zincirli kopyalarını oluşturur. M13 klonlama vektörleri tek zincirli DNA molekülü gerektiren Sanger dna dizi analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Viral vektörlere 10–15 kb büyüklüğünde DNA parçaları parçaları rahatlıkla klonlanana bilmektedir. Küçük bir E.coli plazmit vektörüne gama fajının cos dizisi eklenerek oluşturulurlar. Cos dizisi vektörün protein kılıf içine paketlenmesi için gerekli sinyal dizisidir. Bunun yanında bir kozmid vektörü bir replikasyon merkezi, bir antibiotiğe direnç geni ve çoklu klonlama yeri içerirler. Restriksiyon enzimi ile kesilen bir kozmid vektöre 35–45 kb büyüklüğünde DNA parçaları eklenebilir. Rekombinant kozmidler in vitro paketleme ile faj partikülleri gibi bakteriyi enfekte etme özelliğine sahiptirler. Fakat bakteri içine girdikten sonra yeni faj partikülleri oluşturmaz, bir plazmit gibi 17 replike olur. Dolayısıyla rekombinant DNA molekülleri faj plaklarından değil bakteri kolonilerinden elde edilir (22). 2.3.3. Kozmid Vektörleri Kozmid vektörler gama fajı ve plazmit DNA parçalarından oluşan hibrit vektör sistemleridir. Küçük bir E.coli plazmid vektörüne gama fajının cos dizisi eklenerek oluşturulurlar. Cos dizisi vektörün protein kılıf içine paketlenmesi için gerekli sinyal dizisidir. Bunun yanında bir kozmid vektörü bir replikasyon merkezi, bir antibiotiğe direnç geni ve çoklu klonlama bölgesi içerirler. Restriksion enzimi ile kesilen bir kozmid vektöre 35–45 kb büyüklüğünde DNA parçaları eklenebilir. Rekombinant kozmidler in vitro paketleme ile faj partikülleri içine paketlenir. kozmid DNA içeren partiküller gerçek faj partikülleri içine paketlenir. Kozmid DNA içeren partiküller gerçek faj partiküllerigibi bakteriyi enfekte etme özelliğine sahiptir. Fakat bakteri içine girdikten sonra yeni faj partikülleri oluşturmaz, bir plazmit gibi replike olur. Dolayısıyla Rekombinant DNA molekülleri faj plaklarından değil bakteri kolonilerinden elde edilir (22). 2.3.4. BAC Vektörleri Ökoryotik genomların analizini kolaylaştırmak amacıyla çok daha büyük DNA parçalarının klonlanabileceği vektörler geliştirilmiştir. Bunlardan bir tanesi de E.coli Ffaktör plazmiti temel alınarak oluşturulan Bakteri Yapay Kromozomlarıdır. Bu vektörler yaklaşık 100–300 kb büyüklüğündeki DNA parçalarını taşıyabilirler. Rekombinant BAC vektörleri standart rekombinant plazmit vektörleri ile aynı yolla oluşturulurlar, fakat normal transformasyon yoluyla bakteri hücrelerine aktarılamayacak kadar büyüktürler. Bu nedenle BAC vektörlerin bakteri hücrelerine aktarımı Elektroporasyon adı verilen bir teknikle gerçekleştirilir. Vektör DNA ve bakteri karışımı yüksek elektrik akımına maruz bırakılarak vektörlerin bakteri plazma zarından geçmesi sağlanır. BAC vektörleri düşük kopya aysısına sahip olduğundan taşıdıkları büyük DNA parçaları kaybedilmeden nesiller boyu kalır. Bununla birlikte yine düşük kopya sayısı özelliklerinden dolayı bakteri hücrelerinden izole edilen plazmit miktarı çok düşüktür (22). 18 2.3.5. YAC Vektörleri Çok büyük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılan en popüler vektör sistemi Maya Yapay Kromozomlarıdır. Bu vektörler kromozomlar temel alınarak hazırlanırlar. Her ökoryotik kromozom hücre döngüsünün S fazında üzerinde bulunan sentromer, iki telomer ve replikasyon bölgelerinin fonksiyonuyla etkin şekilde replike olur. Dolayısıyla, bir YAC vektörü oluşturmak için de maya hücresi içinde fonksiyon görebilecek iki telomer, bir sentromer ve bir replikasyon merkezine ihtiyaç vardır. Bunlara ek olarak bir ya da iki seçici belirteç geni ile yabancı DNA’nın ekleneceği en az bir enzim kesim noktası bulunmalıdır. YAC vektörleri maya hücrelerine direk olarak aktarılamazlar, öncelikle maya hücrelerinin dış duvarlarının uzaklaştırılması gerekmektedir. Yine de maya hücrelerine transformasyon başarısı ve klonlanmış DNA eldesi düşüktür. Ayrıca bazı YAC vektör tiplerinde aktarılan DNA, replikasyon sırasında yeniden düzenlenerek yeni dizi kombinasyonlarına dönüşebilmektedir. Tüm bu dezavantajlara rağmen YAC vektörlerien büyük DNA parçası taşıma kapasitesine sahiptir ve birçok genom projesinde fiziksel haritalama işlemlerinde yoğun şekilde kullanılmaktadır (22). ŞEKİL 6: YAC vektör ile kaynak DNA (11) 19 2.4. Genin hücreye sokulması Genin hücreye sokulması, plazmid ya da virüslerle, füzyon uygulaması, kimyasal yöntemlerle ve ya fiziksel yöntemlerle olmaktadır. Kimyasal yöntemde, Ca2(PO4)2 kullanılarak DNA tuzakladıktan sonra seçici bir ortamda yapılmaktadır. Fiziksel yöntemde ise, hücre çekirdeğine sokulacak cam mikropipetlerle DNA injeksiyonu yapılmaktadır. Bu yöntemle gen herhangi bir hücreye direkt olarak sokulabilmektedir (34). Fiziksel yöntemlerde, ya da eritrosit hayaletler (liderindeki hemoglobin ve diğer proteinler boşaltılmış, bütünlüğü korunmuş eritrosit membranları) kullanılarak içerdikleri DNA’nın hücre erimesi yöntemiyle diğer bir hücre ile birleştirilmesi yöntemi olarak uygulanmaktadır (34). 2.5. Geni içeren hücrenin seçimi Antibiyotiklere dirençlilik, seçici ortamlar hücre seçiminde etkilidir. Yabancı geni içeren hücre seçildikten sonra uygun koşullarda saklanabilir ya da arzu edildiğinde adı geçen geni üreten bir fabrika gibi kullanılabilir. Günümüzde değerli proteinlerin genleri ekspresyon vektörlerine klone edilmiş olarak mevcuttur. Hatta çeşitli firmalardan ücreti ödenerek temin edilebilmektedir (34). 2.6. Terapötik protein rekombinant üretimi Bugün rekombinant protein üretim teknolojisiyle özellikle ilaç endüstrisi için çok sayıda protein üretilmekte ve ilgili yöntemler optimize edilmektedir. Zira protein sentezinin yüksek maliyeti nedeniyle, en verimli şekilde gen ifadesinin düzenlenmesi gerekmektedir (35). Bir rekombinant protein üretimi, yani bir canlı hücrede arzu edilen yabancı bir gen ürününün büyük miktarda hedeflenen sentezi için çok sayıda ekspresyon sistemleri vardır. Bunlar, iyi bilinen organizmalar veya hücre hatlarının bir serisi (bakteriler, böcek hücreleri, mayalar, memeli hücreleri ) ile farklı promotorlar, seçimli markerler ve gerekirse füzyon partnerli değişik vektörleri içine alırlar. Moleküler biyolojik olarak bir rekombinant proteinin hazırlanması için, bir plazmid veya farklı bir vektör içine kodlanan genin girişi gerekmektedir. Bu vektör daha sonra seçilen hedef hücreye aktarılır (transformasyon veya transfeksiyon) ve konakçı hücre çoğaltılır. Promotora 20 göre genin ekspresyonu ya tüm çoğalma zamanı sırasında yada dışarıdan indüklenirse belirli bir zaman peryodundan sonra meydana gelir. Uygun ekspresyon sisteminin seçimi, yani en iyi gözüken ekspresyon vektörü/ konakçı hücre kombinasyonu işin ana kısmını oluşturur. Seçim, proteinin daha sonraki kullanım amacına göre yönlendirilir (33). Gerek protein gerekse farklı farmasötik ürün üretiminde en sık E.coli kullanılmaktadır. Çünkü genomu iyi bilinmekte, uygun suşu bulunabilmekte, kolay ve kısa sürede klonlama yapılabilmekte, basit ve ucuz kültür ortamı sağlanabilmekte, patojen olmamakta ve çok sayıda vektör bulabilmektedir (33). Uygun ekspresyon koşulları altında rekombinant protein fazla miktarda üretilebilir, ancak sürekli konakçı hücrenin kontamine edici proteinleri, üretime eşlik eder; bu yüzden hemen hemen bütün kullanma amaçları için ekspresyon ürününün saflaştırılması da dikkate alınmalıdır. Bu amaçla ekspresyon vektörünün uygun seçimi ve tasarımında afinite kromatografik yöntemler geliştirilmiştir (33). Bundan başka ilgili proteinin direkt veya füzyon proteini olarak ekspresyona uğrayıp uğramıyacağı ve nerede ekspresyon ürününün lokalize olması gerektiğine karar verilmelidir. Ekspresyon ürününün sekresyonu için gerekli olan N-terminal signal peptid için araya sokulan DNA’nın kodlanıp kodlanmamasına bağlı olarak, rekombinant protein salgılanmakta veya intraselüler olarak kalmaktadır (35). 2.7. rDNA’nın tıp ve eczacılık sektöründeki kullanımı: DNA’nın labovatuar ortamlarında manipule edildikten sonra çeşitli vektörler aracılığıyla aktif olcak şekilde organizmalara geri kazandırılması biyoloji biliminin birçok alanında ufku genişletmiştir. Bilim adamları şimdi daha önce hayal dahi edemedikleri araştırma ve ugulamaları gerçekleştirmektedir. Bu durum rekombinant DNA teknolojisinin kullanıldığı moleküler biyoteknolojiyi geleceğin en önemli bilim dalı yapmaka kalmamış, aynı zamanda çok büyük bir sanayi haline de getirmiştir. Rekombinant DNA teknolojisinin bazı örnek uygulamaları ve açıklamaları aşağıda belirtildiği gibidir (22). İnsülin (Diyabet hastaları için) Hayvanlarda farmasötik ürünler üretimi 21 Herbisitlere dayanıklı kültür bakterileri Rekombinant aşılar Adli tıpta kullanımı Transplantasyon Genetik Hastalıkların gen tabanlı çözüm yolu Faktör 8 Hemofili A Faktör 9 Hemofili B İnsan büyüme hormonu (GH) EPO (Anemi yani kansızlık tedavisi için)(eritropoeitin) 3 çeşit interferon Çok sayıda interlökin (G-CSF) nötrofil üretimini uyaran Granulocyte kolonlama uyarı faktörü Plazminojen dokusu aktive ettirici (TPA) (ADA) (SCID) Angiostatin, Endostatin Kansere karşı yapılan denemeler Paratroid hormonu Leptin Hücre (doku kültürü) HBsAg (Hepatit B virüsüne karşı hormon) (9, 22) 2.7.1. İnsülin üretimi Bu yöntem ile en önemli ve en çok yararlanılan ilaç üretimi, insan insülinidir; İlk 1921 de diyabet hastaları için kullanılan bu yöntem hayvanların pankreasından üretilen insülinle olmuştur (8). 1980’lerin başında ilk olarak uygulanmaya başlayan insülin, genetik mühendisliğinin ürünü olup sadece terapötik olarak denenmeye başlanmıştır. Düzinelerce biyoteknoloji şirketi kurularak rekombinant DNA teknolojisi ile tıpta tedavi amacıyla kullanılan 22 proteinlerin yapımına başlanmış, genetik değişikliğe uğratılmış Escherichia coli (E.coli) isimli bağırsak bakterisi tarafından üretilen insan insülini FDA tarafından onaylanarak pazara sunulan ilk ürün olmuştur (31). Hayvanların pankreasından elde edilen insülinin yanısıra son 10 yılda yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakterilere ve mayalara, insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretimi sağlanmıştır (31). Şeker hastalarında bu insülinle tedavi sonrası antikorların oluşması, insülinin biyosentezinin rekombinant DNA teknolojisiyle eldesinin önemini daha da artırmıştır. Ayrıca E.coli de rekombinant DNA teknoloji kullanımı hem verimliliği artırmış (yani üretimi daha kolay ve çoklu hale getirdi) hem de maliyetini yani insanlar için kullanım fiyatını oldukça aşağı çekmiştir. Bu sayede biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır (32) . İnsülinler en basit biçimde kısa, orta ve uzun etki süreli olmak üzere etki sürelerine göre sınıflandırılabilirse de enjekte edilen insülinin emilimi aynı kişide %25 oranında, kişiler arasında ise %50 ye varan oranda değişkenlik gösterebilmektedir (31). Bakteri DNA’larının ’’plazmit’’ adlı özel bir türü, özellikle molekül klonlamada kullanılmaktadır. Plazmitlerin, üzerlerinde bol gen bulunan (antibiyotiklere direnç geni gibi) küçük çembersel DNA molekülleri olup, bakterinin içinde, hiçbir sınıra bağımlı olmaksızın, kendilerini eşleyebilir, kendi kopyalarını izole edilebilirler. Bu özelliklerden dolayı, plazmitler molekül klonlamaya özellikle elverişli malzemelerdir. İkinci yöntemde ise, plazmit molekülü çemberi bir restriksiyon enzimi ile kesilerek açılır. Bu plazmit DNA’sı aynı biçimde ve aynı restriksiyon enzimi ile kesilerek, hayvan DNA’sı ile bir araya getirilip karıştırılır. Bu karışıma ligaz eklenir ve böylece hayvan DNA’sı, aynı biçimde aynı restriksiyon enzimi kesilerek, hayvan DNA’sı ile bir araya getirilip karıştırılır. Bu karışıma ligaz eklenir ve böylece hayvan DNA’sı bir bakteri plazmidi DNA’sına bağlanmış olur. Bu molekül, transformasyon denen bir süreçle bir bakteriye ilave edilebilir. Tek bir rekombinant molekülü taşıyan tek bir bakteri hücresi, hızla üreyerek kendisinin çok büyük sayılarda kopyasını hazırlayabilir. Bu şekilde hazırlanan bakteri hücrelerinin ‘insülin’ gibi hayvansal proteini üretmesi sağlanabilir. Üretilen genlerin bakteriden izole edilmesi kolayca gerçekleşebilir (23-32). Aktif insülinin yapısına bakıldığında iki polipeptit zincirinden oluşan (a=20 a.a,B=30 a.a) bir 23 hormondur. İki zincir S-S bağları ile bir arada tutulur. İnsülinin gen mühendisliği ile eldesi için değişik yaklaşımlar vardır. Bunlardan birincisinde somatostatin örneğinde olduğu gibi A ve B zincirlerine karşılık gelen sentetik DNA dizileri yapılmıştır. Her dizi bir ucunda BamHI ve diğer uçta EcoRI ile oluşturulan yapışkan uçlar taşımaktadır. Ayrıca her birine laktoz promotoru takılarak Pbr322’nin EcoRI, BamHI kesim noktaları arasına E.coli’ye verilmiş sentezlenen A ve B zincirleri kimyasal tepkime sonucu S-S bağları ile bir araya gelerek aktif insülini oluştururlar. Bu sıra doğrudan genomik DNA olabilir fakat protein kodlaması için mRNAdan da hareket edilebilmektedir. İkinci yaklaşımda; izole edilen insülin mRNA’sında ters transtriptaz enzimi ile cDNA yapılır. Uç kısımlara cD eklenerek kuyruklanmıştır. pBR 322 plazmidi de PstI noktasından kesime uğratılarak dG ile kuyruklandıktan sonra hazırlanan cDNA bu vektöre eklenmiştir. Elde edilen rekombinant vektör E.coli’ye verildiğinde proinsülin (ekstra sinyal peptidi taşıyan A+B zinciri) ampisilinaza bağlı olduğundan E.coli tarafından hücre dışına salgılanır (32). Ampisilinazın çıkarılmasından sonra elde edilen proinsülinin sinyal peptidi enzimatik yoldan ayrılarak aktif insülin elde edilir. Hedef terapötik protein ökaryotik ise, sonra sadece cDNA ekzon yanması olacak ise genomik DNA hem kodlanmış hem de kodlanmamış diziler içerebilir (32). İnsan insülini insanlardan elde edilmez, insan vücudunun yaptığı insülin moleküler yapısı ile aynı olacak şekilde üretilir. En modern insülin tipidir ve labovatuvar koşullarında tamamıyla aynısı olduğu için kullanıldığında vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinlerine göre çok daha azdır (32). 2.7.2. Hayvanlarda farmasötik ürünler üretimi Bakteri sistemleri prokaryot olduğundan ökoryot tabiattaki yüksek canlılara ait proteinlerin üretiminde ciddi problemler ortaya çıkmaktadır. Prokoryot sistemleri, ökoryot sistemleri modifiye edemezler ve tam fonksiyon için gerekli olan şekerleri ve fosfat gruplarını ekleyemezler. Daha da önemlisi proteinini fonksiyonu için mutlak gerekli olan protein kıvrılması ve bunun sonucunda ortaya çıkan üç boyutlu yapı, prokaryot hücrelerde iyi bir şekilde oluşmaz. Bu nedenle alfa -1 -antitripsin enzimi gibi bazı insan proteinleri hayvan sütünde üretilecek şekilde mühendisliğe tabi tutulurlar. Bu enzimin yetersizliği Avrupa soyundan insanlarda bir solunum rahatsızlığı olan emfisema hastalığını meydana getirmektedir. Bu enzimi kodlayan insan geni, bir süt 24 proteini genine eklenmiştir. Süt proteini genine ait promotor yeni genin sütte sınırlı olarak üretilmesini sağlamaktadır. Yeni kimerik gen in vitro döllenmiş koyun yumurtasına mikroenjeksiyonla aktarılır. Daha sonra bu döllenmiş yumurta taşıyıcı koyuna aktarılır. Ortaya çıkan transgenik koyunun sütünde yüksek konsantrasyonda fonksiyonel alfa–1-antitripsin üretilmektedir. Bu transgenik koyunlardan oluşan küçük bir sürü protein böylece bir kimyasal fabrika olarak çalışmaktadır (22). 2.7.3. Rekombinant aşılar Aşılar bağışıklık sisteminin bir zararlıya karşı antikorlar üretmesini tetiklemektedir. Klasik aşılar öldürülmüş ve ya üreyemez hale getirilmiş canlı organizmalardan elde edilmektedir. Rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen aşılar ise virüs ve ya bakterinin yüzey proteinlerinden bir veya birkaçını taşımaktadır. Bu protein veya proteinler, bağışıklık sistemini harekete geçiren antijenler olarak iş görmektedir. Bu şekilde tescil edilen ilk aşı Hepatit B virüsünün bir yüzey proteinini taşıyan aşıdır. Bu proteini kodlayan gen bir maya ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Maya sistemi kullanılarak ticari boyutta aşı üretimi yapılmaktadır. Bu ve diğer birçok proteinin bitkilerde üretilmesi şeklinde çalışmalarda gerçekleştirilmiş ve böylece bitkisel aşılar geliştirilmiştir (22). HBV genomunun 1979 yılında klonlanmasına ve nükleotid dizisinin okunmasına takiben özellikle yüzey antijeni ‘HBsAg’ içeren aşı elde etme çalışmaları başlatılmıştı. E.Coli ekspresyon sistemlerinde elde edilen rekombinant proteinlerin özellikle ‘a’ epitopunun doğru üçüncül yapısının sağlanamaması yüzünden koruyucu antikor eldesi sağlanamamıştır. 1982 yılında ‘S’ bölgesini içeren HBsAg’ ni bir mantar hücresi olan ‘S. cerevisiae’ de eksprese edilmiştir. Bu rekombinant proteinin maymunlarda ve daha sonra insanlarda gerçekleştirilen deneysel HBV infeksiyonuna karşı koruyucu immunglobulin üretecek etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu yalnızca ilk hepatit aşısı değil, ayrıca insanlık tarihinde uygulamaya sokulan ilk rekombinant aşı olma özelliğini taşımaktadır (35). Saccharomyces cerevisiae mantar hücresindeki bu başarıyı diğer mantar hücreleri ekspresyon sistemleri ile olan aşı denemeleri takip etmiştir. Bunların içinde özellikle iki tanesi ‘Pichia pastoris ve Hansenula polymorpha ‘ mantar hücreleri yüksek verimli sonuçlar vererek gelişmekte olan ülkelerdeki aşılama çalışmalarında maliyeti azaltma yönünden umut vericidir (35). 25 2.7.4. Adli tıpta kullanımı Polimeraz Zincir Reaksiyon (PZR) teknolojisindeki gelişmeler DNA’nın adli tıpta çok etkin bir araç olarak kullanımını gündeme getirmiştir. Bir damla kurumuş kandan, bir saç telinin dibindeki hücrelerden veya çok küçük doku parçalarından elde edilen DNA’nın karakterini ortaya çıkarmak mümkün olmaktadır. Bu amaçla orta kısmı, farklı insanlarda büyük ölçüde değişiklik gösteren ancak ortanın iki tarafında yüksek derecede benzerlik gösteren DNA bölgeleri kullanılmaktadır. Benzerlik gösteren bölgelerden geliştirilen DNA başlatıcıları ile yapılan DNA sentezi sonunda elde edilen yapılan suç mahallinden ve şüpheli şahıslardan elde edilen DNA’larla karşılaştırılmaktadır. Bu şekilde beş ve ya daha fazla bölgenin kullanılmasıyla 100.000 de bir veya milyonda bir hata ihtimali ile suçlular belirlenmektedir. Bu bölge sayısının daha da artırılması ile hata ihtimali daha da düşürülmektedir (22). 2.7.5. Gen tedavisi Ökoryotik gen klonlaması, ökoryotik gen ifade vektörlerinin oluşturulması ve memeli hücrelerine gen aktarma teknolojilerinde ki gelişmeler genetik hastalıkların gen tabanlı tedavisinin gerçekleştirilebileceği fikrini oluşturmuştur. Gen tedavisi, teorik olarak bir genin DNA dizisindeki mutasyonlardan kaynaklanan hastalık fenotipinin, mutasyonlu bazların ilgili genin doğal DNA dizisindekilerle yer değiştirmesi ve hasta bireye aktarılması sağlıklı fenotipin bireye kazandırılmasıdır. Günümüzde bu yöntem, somatik hücreler üzerinde gerçekleştiriliyor ise, somatik gen tedavisi olarak ifade edilmektedir. Somatik hücreler üzerinde yapılmasının temel sebebi, gen tedavi yönteminin henüz tam kontrollü olarak yapılamaması yani geliştirilme evresinde olmasıdır. Ayrıca insan eşey hücre gen tedavisinin bireyin gelecek nesilleri üzerinde oluşturabileceği sonuçlarının henüz bilinmemesi, günümüz bilimsel ahlak kurallarınca mümkün değildir. Sonuç olarak somatik gen tedavisi ile sadece belli dokuların genetik bozukluklarının tedavisi mümkündür. Yapılan deneyler bu dokunun tamamının transgenik yapılmasının gerekmediğini, belli bi miktar hücrenin transgenik hale gelmesinin tedavi için yeterli olabileceğini göstermiştir. Çeşitli genetik hastalıkların gen tabanlı tedavisi için iki temel yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar ex vivo gen tedavisi ve in vivo gen tedavisidir (22). 26 2.7.6. İnsan büyüme hormonu İnsan büyüme hormonu şu an piyasada bulunan ilaçların en önemlilerinden biridir. Ve gen transferi teknolojisi sayesinde büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Aksi takdirde rDNA teknolojisi olmadan önce büyüme hormonu, ceset yani kadavradan nakledilmiştir (8). Bu durumda deli dana hastalığı gibi birçok hastalığa ve çeşitli enfeksiyonlara sebebiyet vermekteydi. Bu sebeplerden dolayı birçok hasta bu yöntemi kullanmak istememiştir. Bu hormon 191 farklı amino asit bileşen kalıntı ihtiva etmektedir (8). İnsan büyüme hormonu da üretim olarak insüline çok benzemektedir (5). Restriksiyon enzimlerini kullanarak “gene splicing” DNA’nın istenilen bölgesinin kesilip çıkarılması ve kesilen parçanın ligaz enzimi kullanılarak “vektör’’adı verilen taşıyıcı bakterinin plazmidine yapıştırılması işlemlerini içermektedir. Daha sonra plazmid bakteri içine yerleştirilerek rekombinant DNA’nın normal hücresel aktivitesine devam etmesini ve ayrıca klonlanan genin ürününün o organizmada yüksek seviyede ifade edilmesini (sentezlenmesini) de sağlamaktadır (8). Bilim adamları, istedikleri geni ister tek hücreli, ister çok hücreli, isterse hücresiz (virüs türü) bir canlıdan yalıtmış olsunlar, bir bakterinin (örneğin E.coli'nin) plazmidinin kestikleri bölgesine yapıştırarak, onu bakteri hücresine yerleştirmişlerdir. Böyle bir bakteri hücresi, 15 saatte 1.000.000,000 sayıya ulaşacak biçimde hızla çoğalırken, rDNA'nın sentezlediği protein türünü de istenildiği kadar elde etme olanağını sunmaktadır. Böylece bakteriler organik kimya fabrikaları gibi çalıştırılmışlardır. Ayrıca, aynı maddenin sentezi, o bakterinin sokulduğu bitkide ya da hayvanda da sürecek, sokuşturulan gen, bakteriyi kullanarak, o bakterinin daha önce sentezlemeyi bilmediği proteinleri yetkinlikle sentezlemeye başlayacaktır (31). Son elli yıldır somatotropinlerin (büyüme hormonunun) süt sığırlarına enjekte edildiği takdirde süt verimini artırıcı (galaktopoietik) etki yaptığı bilinmektedir. Ancak bu hormonun galaktopoietik etkisi üzerine derinlemesine araştırmalar, 1980 li yıllardaki rekombinant DNA tekniğindeki gelişmelerin bir sonucu olarak mümkün olabilmiştir. Eksojenik sığır büyüme hormonunun galaktopoietik etkisi ilk defa 1937 yılında Rus bilim adamları Asimov ve Krouze tarafından tesbit edilmiş ve aııterior pituitaıy bezinden elde edilen extrakdın süt verimini artırdığı belirlenmiştir. Bu bulgular birçok araştırmacı tarafından yapılan çalışmalarla desteklenerek, süt verimini artırıcı etkinin 27 laktasyonun süt veriminin düşmeğe başladığı (maksimum noktadan sonraki) devrede daha etkin olduğu belirlenmiştir. Bir süre sonra bu galaktopoietik bileşiğin sığır anterior pituitary bezinde bulunan büyüme hormonu olduğu belirlenmiştir, İkinci dünya savaşı boyunca İngiliz bilim adamlan açlık problemini çözmek için somatoropinlerin eksrakte edilmesi için çalışmalarını yoğunlaştırmalarına rağmen ekstraksiyon işleminin pahalı ve 200 adet sığır pituitary bezinden ancak 1 ineğin bir günlük ihtiyacı olan büyüme hormonunun üretilebilmesi nedeniyle vazgeçilmiştir. Bu nedenle ancak kısa süreli araştırmalarda kullanılmak üzere büyüme hormonunun üretimi yapılmış ancak pratiğe intikal edememiştir (35). ŞEKİL 7: Rekombinant plazmit oluşumu (18) 2.7.6. Hemofili A hastalığı Hemofili A hastalığı 10.000 de 1 ortaya çıkan ve geni içerisindeki mutasyonlardan kaynaklanan bir hastalıktır. Hemofili A hastalığı kan içerisindeki FVIII düzeyine göre 3 değişik tipte sınıflandırılmaktadır ve bu Hastalığı gösterenlerin yarısından çoğu ağır tip 28 İmmünoafinite kromatografisi yöntemiyle saflaştırma 1. Faktör VIII'in, yalnızca Faktör VIII proteinine bağlanan antikorları içeren silindirden geçirilmesi. 2. Antikorlar Faktör VIII'i silindir içerisinde tutarken, gereksiz olan ve istenmeyen proteinler de ortamdan uzaklaştırılmış olur. 3. Saf Faktör VIII'in antikorlardan ayrılması sağlanır. Faktör VIII'ler toplanır ve dodurularak kurutularak ürün son haline getirilir ŞEKİL 8: İmmünoafinite kromatografisi yöntemiyle saflaştırma (12) 29 Hemofili A sınıfına girmektedir. Geni çok büyük bir gen olup (~180 kb) yapısal olarakta kompleks bir yapı göstermektedir (26 Ekzon). Bu gen X kromozomunun uzun kolu üzerinde Xq28 pozisyonunda yer almaktadır. Hemofili A hastaları insan kanından veya modifiye edilmiş hücre kültürlerinden elde edilen rekombinant FVIII in periyodik olarak damardan kana verilmesi ile tedavi edilmektedir. Son yıllarda hastalığın in vivo ve ex vivo gen terapisi yöntemleriyle tedavisi alanında önemli gelişmeler elde edilmiştir (12-13). Bu rekombinant DNA teknolojisi eczacılık endüstrisinin son 30 yıldaki büyümesine çok yarar sağlamıştır. Bu fenni gelişimler ve atılımlar tıp endüstrisine değişim ve dönüşüm şekliyle değer katmaktadır. 2.7.8. Interferon eldesi İnterferonlar hedef hücreler üzerinde antiviral, antitümöral ve immünmodülatör etki gösteren moleküllerdir. Antijenik, biyolojik ve kimyasal özellikleri dikkate alındığı zaman interferonlar üç grup halinde toplanabilirler. Lökosit veya alfa interferon (IFN-a), fibroblast veya beta interferon (IFN-b) ve immün veya gama interferon. Bu üç sınıf interferon molekülü hemen hemen tüm memelilerde mevcuttur. İnterferon a ve b aside dirençli ve virus tarafından indüklenebilen moleküller olduğundan bunlar hakkında daha fazla çalışma yapılabilmiş ve bilgi edinilmiştir. Bu iki tip inter cDNA feronun rekombinant DNA teknolojisiyle sentezlenmiş olması sayesinde yapıları ve aktiveteleri açıklanabilmiştir. IFN-gama ise diğer interferonlarla kros reaksion vermeyen, aside dirençsiz farklı bir moleküldür (5-6). Rekombinant interferon; hücrelerde bulunan interferon genlerinin izole edilip veya in vitro şartlarda sentezlenip, uygun taşıyıcı sistemler yardımıyla bakteriye aktarılması ve bu genlerin bakteride çoğaltılarak interferon molekülünün sentezlenmesi sağlanmıştır. Bu sentezde restriksiyon enzimleri önemli görev almaktadır. Sonraki işlem restriksiyon enzimleri, büyüklüklerine göre ayrıldıktan sonra prob kullanılarak interferon genini taşıyan fragmentin saptanmasıdır. Prob olarak radyoaktif işaretli interferon mRNA sı veya cDNA kullanılabilir. Memeli genomuna ait genlerin bakteriye aktarılıp, bakterinin genleriymiş gibi çoğaltılması olayı gen klonlaması olarak bilinmektedir. Ancak, memeli genomundan elde edilen genler, bakteride çoğalsalar bile her zaman bakteride ekspresse olmamaktadır. Çünkü bakteri ve ökoryotlarda genetik bilginin aktarımı sırasında farklı mekanizmalar işlemektedir. Genetik bilginin akımı sırasında, mRNA’nın sentezini 30 takiben ‘RNA splicing’ adı verilen bir mekanizma ile proteine çevrilmeyen intron bölgeler çıkarılmakta ve geri kalan ekzon bölgeler birleştirilerek olgun mRNA sentezlenmektedir. Oysaki bakteride böyle bir mekanizma bulunmadığından, memeli gen fragmetleri doğrudan bakteriye aktarılacak olursa, intron bölgelerin çıkarılarak fonksiyonel proteinin sentezlenmesi söz konusu değildir. Bu nedenle intron bölge içeren genlerden ürün elde etmek söz konusu olduğu zaman intron bölge içermeyen genler sentetik olarak oluşturulmaktadırlar (6). Rekombinant interferonlar her iki metodla da elde edilebilir. Alfa ve beta interferon genleri intron bölge içermediği için interferon sentezleyen hücrelerden mRNA izole edilip kısmi purifikasyonu yapıldıktan sonra revers transkriptaz enzimi ve DNA polimeraz yardımı ile cDNA hazırlanmaktadır. Bu cDNA’lar içermediği için bakteride proteine çevrilebilmektedirler. Değişik metotlarla hazırlanan interferon genlerinin bakteriye aktarılması ise özel vektörler aracılığıyla gerçekleştirilmektedir. Vektör olarak kromozomdan bağımsız çoğalabilen sitoplazmik plazmid veya viral DNA’lar kullanılmaktadır (6). Interferon alfa E.coli’de ilk kez üretildiği zaman hücre başına 50 molekül interferon eldesinin büyük başarı olarak değerlendirilmesine karşın, rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmelere paralel olarak bu miktar artmış ve ilk verimin bin katına çıkmıştır. Bu bakterileri verimli birer interferon fabrikası haline getirebilmek için değişik yöntemler uygulanmakta ve genin çalışmasını hızlandıracak özel promotor diziler de rekombinant vektörlere eklenerek 1 lt E.coli kültüründen mg düzeyinde interferon elde edilebilmektedir (6). Doğal kaynaklardan elde edilen IFN-alfa ve beta moleküllerinin bir kısmı glikoliz moleküllerdir. Bakteride sentezlenen interferonlar ise şeker ünitesi içermemektedirler. Glikolizasyonun antiviral aktivite için gerekli olmaması rekombinant interferonların önem kazanmasında rol oynamıştır. Glikolize olmayan alfa ve beta interferonlar antiviral aktivite gösterebilmektedirler. Söz konusu immün interferon olduğu zaman şeker ünitesi aktivite için şart olduğundan bakteride sentezlenen moleküllerin in vitro glikolizasyonu ve aktivasyonu gerekmektedir. Doğal ve rekombinant interferonlar yapısal olarak karşılaştırıldığında göze çarpan diğer bir özellik ise rekombinant lökosit interferonun, doğal interferondan 10 amino asit daha eksik olmasıdır. Bu fark aktiviteyi etkilememektedir (6). 31 2.7.9. Eritropoetin Eritropoetin (ya da EPO) eritrositler (alyuvar) için sitokin görevi gören bir glikoprotein hormondur. Hematopoetin ya da hemopoetin olarak da adlandırılmaktadır. Böbreklerde üretilmekte ve eritrosit üretiminin kontrolünden sorumlu tutulmaktadır (36). Eritropoetin, memeli hücre kültüründe rekombinant DNA teknolojisi ile üretilerek tedavi amaçlı olarak da kullanılmaktadır. Böbrek yetersizliğine ya da kanser kemoterapisine bağlı anemilerin (kansızlık) tedavisinde de yeri vardır. Ayrıca bisiklet yarışı, triatlon ve maraton koşusu gibi dayanaklılık gerektiren sporlarda doping amacı ile suiistimal edilmektedir (36). 2.7.10. (G-CSF) Granulocyte kolonlama uyarı faktörü Granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), insanlarda fibroblastlar, endotel hücreleri, makrofajlar, akut myeloid lösemi (AML) hücreleri gibi çeşitli hücreler tarafından veya rekombinant DNA teknikleri ile üretilen bir hematopoetik büyüme faktörüdür. Nötrofil yapımını uyardığı için, kemoterapiye bağlı nötropeniyi veya diğer nötropenik durumları iyileştirmek için kullanılmaktadır. G-CSF kullanımına bağlı farklı deri reaksiyonları bildirilmiştir ( 20). Rekombinant DNA teknolojisi halen, gıda olarak kullanılan bitkilerde hepatit B yüzey proteinini üretmek için kullanılmaktadır. Burada yatan fikir, bitki yapraklarının ya da meyvelerin ağız yoluyla alınan bir aşı kaynağı olarak kullanılmasıdır. Kronik nötropenili hastaların koloni uyarıcı faktörlerle ile tedavisi ile ilgili ilk çalışmayı Komiyana yapmıştır. Subkutan G-CSF tedavisi ile absolü nötrofil sayısının 3000/mm3 üzerinde korunması sağlanmıştır. Yapılan çalışlmalarda bu tedavinin ağır konjenital nötropenili hasta çocukların nötrofil sayıları üzerindeki etkisi teyit edilmiş, aynı zamanda enfeksiyonların iyileşlmesinde ve enfeksiyon oluşumunun azalmasındaki etkileri gösterilmiştir (20). 2.7.11. İnterlökin DNA aşıları, humoral ve hücresel immün yanıtların oluşturulmasında antijenlerin (antijen-spesifik immün tedavi) veya uyarıcı faktörlerin in vivo ekspresyonları için geliştirilmiş yeni bir yöntemdir. Bu yöntem aynı zamanda birçok hastalığın pre-klinik modellerinde koruyucu immünite geliştirilmesini de gündeme getirmiştir. DNA aşılarında proteinin kendisini, canlı bir ajanı veya bir patojenin zayıflatılmış formunu 32 kullanmak yerine patojen veya tümörlerin proteinlerini kodlayan genler kullanılmaktadır. Bu aşamada rekombinant DNA teknolojisi devreye girmektedir. DNA aşılarında (ve aynı zamanda gen tedavisinde) plazmit veya viral (retrovirüs, adenovirüs veya adeno ilişkili virüs kökenli) vektörler kullanılmaktadır. Plazmit vektörler güçlü bir viral promotor, ilgili gen, poliadenilasyon/transkripsiyonel terminasyon dizileri ve bakteriyel sistemde seçici bir marker gen taşımaktadır. Plazmit vektörler bakteride (E. coli) çoğaltılır, saflaştırılır, bir tuz solüsyonunda çözülür ve sonra da konakçıya enjekte edilir. Plazmit DNA, (mekanizması tam olarak açıklanamayan bir yolla) enjeksiyon bölgesindeki hücreler tarafından alınmaktadır. Plazmitler ökaryotik hücrelerde fonksiyonel olan replikasyon orijinleri taşımayacak şekilde hazırlanır; bu tür plazmitler ökaryotik hücrelerde ne çoğalırlar ne de kromozoma entegre olmaktadır (insersiyonel mutageneze neden olmazlar). Plazmit DNA’lar zararsız olup çok zayıf bir immünojeniteye sahiptirler (bu nedenle de sık aralıklarla uygulanabilirler). Enfeksiyoz olma potansiyeli yoktur, intravenöz yolla enjekte edildiklerinde toksisiteleri de yoktur. Viral vektörlere göre daha kolay hazırlanabilirler, yüksek saflıkta izole edilebilirler, proteinlere ve diğer biyolojik polimerlere göre de son derece dayanıklıdırlar. Viral kaynaklı vektör moleküllerinin transdüksiyon verimleri yüksek olmasına karşın üretim ve saflaştırılmalarındaki zorluk ve bir takım potansiyel problemler kullanımlarını kısıtlamaktadır. Diğer taraftan, plazmit DNA’lar güvenilirlikleri açısından viral vektörlere iyi bir alternatiftir. Toksisiteleri çok düşük olduğu gibi büyük ölçekli üretimleri de oldukça kolaydır. Plazmit DNA’lar kas içine, peritona ve deri altına enjekte edilebilirler. Deri altına enjeksiyon durumunda buradaki keratinositler, fibroblastlar ve dentritik hücreler plazmitleri daha verimli bir şekilde almaktadırlar. Plazmitler için dezavantaj ise transdüksiyon verimlerinin düşük olmasındadır. Transdüksiyon verimini yükselten uygulamalar (bir takım ligandlarla birlikte kullanım, elektroporasyon ve lipozom aracılı kullanım gibi) ile de bu sorun çözümlenebilmektedir. Lipozom aracılı gen aktarımında; plazmit DNA’lar polikatyonik lipidlerle karıştırılarak lipozom/ DNA kompleksleri oluşturulmaktadır. Bu yapıların hedef hücre zarı ile birleşerek gen aktarımını sağladığı düşünülmektedir. Bu amaçla kullanılan değişik lipit preparasyonları (DOPE, DOTMA, DOSPA, DDAB, DOGS, DOTAP, DMRIE gibi) ticari olarak mevcut olup lipozom/plazmit komplekslerinin hazırlanması da oldukça kolay olmaktadır. Bu yapılar non-immünojenik olup minimal sistemik toksisiteye sahiptir, çok sayıda hücre tipine gen aktarımı yapabilmektedir ve 33 aynı bireye tekrar tekrar uygulanabilmektedir. Kanser hücrelerinin immün sistem tarafından yok edilmesi (immünotedavi) amacı ile sitokin genlerinin kullanılması, kansere karşı pasif immünite (CD4+ ve CD8+ T hücrelerini aktive ederek) sağlamak veya aktif immüniteyi (antijenik determinantlarla immünizasyonla) uyarmak veya güçlendirmek içindir (26–27). Tablo1: 2000–2001 Rekombinant ilaç satışları (15) 2000-2001 Rekombinant ilaç satışları Kaynak: TEB Raporu, 2003 Yukarıdaki tabloda 2000–2001 yıllarının rekombinant ilaç satışları gösterilmektedir. Bu tabloda ortaya koymaktadır ki rekombinant ilaç gitgide artan oranlarda günümüz ilaç endüstrisine girmiş ve yer edinmiştir. 34 3.TARTIŞMA VE SONUÇ 1900 yıllarda Mendelin çalışmalarının yeniden keşfinden sonra genin doğası hakkında büyük bir bilgi patlaması olmuştur (18). Amerikalı James Watson, İngiliz Francis Crick ve birkaç biyolog araştırmacı 1953 yılında DNA’nın çift heliks yapısını incelediler. DNA kavramının, yaşamın geleneksel dili olduğunu bakterilerde, mantarlarda, bitki ve hayvanlarda yaptıkları çalışmalarla ortaya koymuşlardır. 1970’li yıllarda araştırmacılar, DNA'nın bir canlıdan kesilerek diğer canlıya yerleştirebileceklerini bulmuşlardır. Ve böylece rekombinant DNA teknolojisi ortaya çıkmıştır. Gelişmeler doğrultusunda araştırmacılar, insülin, hormon, interferon ve TPA (doku plasminogen aktifleştirici) gibi ilaçları tıp dünyasına sunmuşlardır (10). DNA’nın yapısının ve taşıdığı genetik kodun çözülmesinin ardından birçok biyolojik sırrın DNA’nın baz diziliminde saklı olduğu anlaşılmış ve moleküler düzeyde çalışmalar başlamıştır. Biyoteknoloji, organizmaların veya onların bileşiklerinin pratik uygulamaları ile ilgilenmektedir. Günümüzdeki uygulamalar; yeni ilaçların üretimi, transgenik bitki ve hayvanların elde edilmesi, biyolojik yakıt elde edilmesi, gen terapileri ve çevre kirliliğini önlemeyi içeren çok farklı araştırma alanlarını kapsamaktadır (28). Ekinci ve ark. (2010), 1973 ve sonrası ‘modern biyoteknoloji dönemi’ nin geliştiğini ve modern tekniklerin biyolojik sistemlere uygulanmasına ilişkin çalışmaları kapsadığını ve böylece, mutasyonlar ya da rekombinant DNA teknolojisi yardımıyla oluşturulan mutantların veya transgenik organizmaların, endüstride ve diğer alanlarda yoğun biçimde kullanılmaya başlandığını, bu bağlamda 20. Yüzyılın son yıllarında biyoteknoloji biliminin, uygulamalı ve disiplinler arası bir alan olarak tanımlandığını söylemektedirler (25, 29). Rekombinant DNA teknolojisi, DNA moleküllerini bir test tüpü içersinde manipüle etme yeteneğidir. Bu yeteneğin kaynağı ise ticari olarak üretilen enzimlerdir. Hücre içinde bu enzimler DNA replikasyonu, transkripsiyon, yabancı DNA’nın ortamdan 35 uzaklaştırılması, mutasyona uğramış DNA’nın tamiri gibi birçok önemli işlere katılırlar ve hücreden izole edildikten sonra da benzer ortam şartları sağlandığında aynı reaksiyonları katalizlemeye devam ederler. Restriksiyon enzimleri olarak adlandırılan ve bakterilerden izole edilen enzimler, rekombinant DNA teknolojisinin vazgeçilmez öğesidir (22). Rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen insan insülini bu teknolojiyle elde edilen ilk ticari sağlık ürünüdür. Büyük ölçekli rekombinant DNA çalışmaları veya rekombinant DNA ürünlerinin ticari gelişimi için federal kurallar dahilinde bu ürün üzerinde çalışmalar başlatılmıştır. Büyük ölçekli çalışmalarda, kimlik ve böyle bir ürünün güvenliğinin kanıtı için atılan adımlar açıklanmıştır. Rekombinant DNA teknolojisi, temel çalışmalar, yaşam bilimleri ve araştırmalarla, ticari uygulamalar, iyi ekonomik şartlar ve yatırım sermayesinin durumu ile kontrol edilmiştir (32). Hayvan insülinleriyle diabet tedavisinden yarım asır sonra 1980’li yılların başlarında rekombinant DNA teknolojisi ve gelişmiş protein kimyası ile insan insülini hazırlanmıştır. Bir sonraki adım olarak, son on yıl içinde, insülin analogları, tedavi edici özelliklerinin iyileştirilmesi amacı ile yerli protein yapısını değiştirerek inşa edilmiştir. Orta, hızlı ve uzun etkili preparatlar ile imkansız olan kan şekerini düzenleme işi artık mümkün olmaktadır. İlk klinik kullanımda insülin analogu lispro, gilisemik kontrolün hipoglisemik etki ile olabileceğini göstermiş ve teorik bilgiyi doğrulamıştır. İki yeni insülin analogu aspart ve insülin glargin, yakın zamanda A.B.D.’de klinik kullanım için onaylanmış ve diğer analogları da yoğun test altından geçirilmiştir (32). Vajo ve ark. (2001)’ na göre yeni kısa etkili analogların tanıtımı ve gerçek anlamda ilk uzun etkili analogların gelişimi ile süreklilik ve daha az değişkenlik ile üretim hatta belki de seçici eylem analoglarının gelişimi mümkün olacak, özel hasta özellikleri ve hedeflenen daha bireysel tedavi stratejileri geliştirmelerine yardımcı olacak, glisemik kontrolle daha fazla gelişmeler elde edilecektir (23). Gen teknolojisiyle biyoteknolojideki ilerlemeler zararlılara ve soğuğa dayanıklı bitki türleri, daha çok üreyebilen ve gelişkin çiftlik hayvanları üretimine başarılı olmuştur. Genetik olarak farklı domates türleri, rafta kalma süresi uzun olan varyetelerin gelişmesini sağlamıştır. 1990 yıllarında Amerikada daha da ileri gidilerek İnsan Genom Projesi gündeme getirilmiş ve insan genlerinin tüm haritasının yapılması planlanmıştır. Bu projenin yaklaşık değeri yılda 200 milyon dolar olup 2005 yılında bitirilmesi 36 planlanmaktadır. Cystic fibrosis, orak şekilli hücre anemisi ve Huntingon's chorea gibi birçok hastalık için DNA kodları kromozomlarda yer alan özel bölgelerde kodlanmış olduğu bu sayede bulunmuştur (25). Ergün (2010)’e göre, gen tedavisi, tedavi amaclı olarak hücreye bir genin aktarılması olarak tanımlanırken, tedavinin amacı ise, mutant (farklanmıs: değisime uğramıs) fenotipi duzelterek hastanın iyileştirilmesidir. Germ hücrelerine gen kopyasının aktarılması (germinal genoterapi) yeni mutasyon yaratma riski tasıdığı ve olusan mutasyonun da yeni kuşaklara aktarılma riski olduğu için, etik olarak uygun bulunmadığını söylemektedir (30). Sonuç olarak rekombinant DNA teknolojisi, hızlı, ekonomik ve adet bazında daha çok ürün eldesini mümkün kılmaktadır. Bu doğrultuda kullanım olarak rekombinant ilaç tüketimi yıldan yıla artmaktadır. Gen transferindeki birkaç risk haricinde bu yöntem günümüze ve geleceğe faydalı ve umut olacak bir teknolojidir. 37 KAYNAKLAR 1) http://tr.wikipedia.org/wiki/Rekombinant_DNA_teknolojisi Moleküler Genetik 2 Prof. Dr. Güler Temizkan 2) http://www.medicine.ankara.edu.tr/internal_medical/pediatrics/molgen/index.php?PgId=41 3) http://www.medicine.ankara.edu.tr/internal_medical/pediatrics/molgen/index.php?PgId=70 4) http://www.cyber-warrior.org/forum/rekombinant-dnateknolojisi_341171,0.cwx 5) Petska S: The human interferons- From protein purification and sequence to cloning and expression in bacteria: Before, between and beyond, Arch Biochem Biophys 1983 ; 221:1 6) Ayter Ş:İnterferonların rekombinant DNA teknolojisi ile eldesi, Ankem Derg 2 (No 3) 1988; ss 213-220 7) Arslan K., Akyüz B: Gen Transfer Teknolojileri, Erciyes Üniv Vet Fak Derg 6 (1) 2009; 77-82 8) Shivanand P., Noopur S., Recombinant DNA technology: Applications in the field of biotechnology and crime sciences, March-April 2010 9) http://www.nkfu.com/genetigin-dunyada-ve-turkiyede-ki-tarihsel-gelisimi/ 10) http://bloomberg.blogcu.com/genetigin-dunyada-ve-turkiyedeki-tarihi/7524930 11) http://bteml.biotek.ankara.edu.tr/wiki/images/d/dd/Molekuler_Genetik_Hafta8.p df 12) http://www.hemofili-dunyasi.com/az_hemofili.aspx?id=39&fmb=1 13) Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. 1985; Gene 33,pp 103-119 14) http://fens.sabanciuniv.edu/biyotek05/docs/10Sep/2-Mehmet%20Ozturk.ppt 15) Ekici A., Timur M. ve Bağış H., Transgenik canlılar ve aquakültürdeki önemi. E.Ü Su Ürünleri Dergisi, 2006 ; 23: ss 211-214 38 16) Ekinci, M.S., Akyol, İ., Karaman, M., Ozkose, E.,. Hayvansal biyoteknoloji uygulamalarında güncel gelişmeler. KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 2005; 8:89-95 17) http://yunus.hacettepe.edu.tr/~coner/GEN/02/genetik.htm 18) http://www.genbilim.com/content/view/2358/32/ 19) SANDRA L. BLETHEN, PHD, MD; VIRGINIA V. WELDON, MD Am J Dis Child., 1982; 136(8): pp 669-671. 20) Akman ve ark.,Akut Miyeloid Lösemili Bir Olguda G-CSF’e Ba¤l› Atipik Piyoderma Gangrenozum Turkderm 2006; 40: 139-41 21) Rhein R.,Lu M,.Wang Y., Restriction mapping in nanofluidic devices,May 12 2005 22) Moleküler Biyoloji, geliştirilmiş 2. Baskı, Yıldırım A., Bardakçı F. ve ark.,: ‚ ‘Rekombinant DNA teknolojisi bölüm 13, Nobel yayın 2010 ;ss 471-502 23) Vajo Z.,Fawcett J. ve Duckworth W., Recombinant DNA Technology in the Treatment of Diabetes: Insulin Analogs,2001; pp 706-717 24) http://www.textara.com/genetik-genetiksel-genetig-genetim-nedir?page=0%2C6 25) Kuiper M, Sanches R, Bignon YJ and Farzaneh F. B7.1 and Cytokines. Habib NA. 26) Güzel A. Fare lizozim ve interlökin-2 genlerinin klonlaması ve malign melanomada anti-tümoral DNA aşısı olarak kullanılması, Doktora Tezi, Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Endtitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı , 2006 27) Peron JM, Shurin MR and Lotze MT. Cytokine Gene Therapy of Cancer. Lattime EC and Gerson SL. Gene Therapy of Cancer. Academic Press, USA. 1999 28) Smith, 1996; Kappes, 1999; Gijs ve Harry, 2002; Lyson, 2002; Braun, 2002 29) Ekinci M., Akyol İ. ve ark.,Hayvansal Biyoteknoloji Uygulamalarında Güncel Gelişmeler, 2005, ss 89-95 39 30) http://www.teb.org.tr/images/upld2/ecza_akademi/makale/20110113034105gen _tedavi.pdf 31) http://makinecim.com/bilgi_1586_Insulin-Uretimi 32) http://www.haticemergen.com/FileUpload/ks106265/File/restriksiyon_enzimler. ppt#257,2,ENZİMLER 33) http://www.proteinengineering.ege.edu.tr/SUNUMLAAR/Protein%20salinimiKufrevioglu-Agustos-%202007.pdf 34) http://www.yunus.sumae.gov.tr/2010/03/05.pdf 35) Yanar M, Rekombinant büyüme hormonu ve süt sığırlarında süt verimi, yem alımı üzerine etkileri, Atatürk Ü. Zir. Fak. Der.1996; 27,ss 461-465 36) http://tr.wikipedia.org/wiki/Eritropoetin 40 ÖZGEÇMİŞ Zübeyde KATARTAŞ,1988 yılında Kayseri’de doğdu.İlköğretimine 1993 yılında Özel Özhamurkar İlköğretim Okulu’nda başladı, Özel Yılmaz Akansu İlköğretim Okulu’nda devam etti ve bu okulda bitirmiştir..Orta öğretimini Özel Atlas Koleji’nde, lise eğitimini 2006 yılında Sami Yangın Anadolu Lisesi’nde tamamladı. Lisans eğitimi olarak ilk 3 dönem Ankara Üniversitesi Eczacılık daha sonra da Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’ne geçmiş olup şuan son dönem eğitimindedir. Adres: Yıldırım Bayezıd mah .Kızılırmak cad. Olgunlar sk. Koru 2 sitesi No:16 Melikgazi/ Kayseri
