kanser dosyası

2012
KANSER DOSYASI
Kanser konusunda bugüne kadar yaptığımız bazı çalışmaların özetini içermektedir.
İçindekiler
1. DENEYSEL KISIM ....................................................................................................................... 2
1.1. Yöntemler ..................................................................................................................................... 2
1.1.1. Tripan (Trypan) sayımı ........................................................................................................... 2
1.1.2. MTT analizi ............................................................................................................................ 2
1.1.3. WST analizi ............................................................................................................................ 2
1.1.4. Caspase-3 aktivite tayini ........................................................................................................ 2
1.2. Deney Grupları ............................................................................................................................. 2
1.2.1. Ön Denemeler ....................................................................................................................... 3
1.2.2. Seri Çalışmalar ....................................................................................................................... 3
1.2.3. Tübitak Tarafından Yapılan Test ............................................................................................ 3
2. SONUÇLAR VE TARTIŞMA .......................................................................................................... 4
2.1. Ön Denemeler .............................................................................................................................. 5
2.2. Seri Çalışmalar .............................................................................................................................. 6
2.2.1. Kontrol Grubu Deneyi............................................................................................................ 6
2.2.2. Kanser Hücre Deneyleri ......................................................................................................... 7
2.2.2.1. PC12: Sıçan böbreküstü bezi feokromositoma (adrenal gland pheochromocytoma)
kanser hücreleri ........................................................................................................................... 7
2.2.2.2. C8: İnsan beyin kanser monosit/makrofaj mikroglia...................................................... 7
2.2.2.3. A549: İnsan akciğer karsinoma....................................................................................... 8
2.2.2.4. 293T: İnsan böbrek kanser hücreleri .............................................................................. 9
2.2.2.5. GC-4 SPC: Fare testis kanser hücreleri ......................................................................... 10
2.2.2.6. MDA-231: İnsan meme kanser hücre soyu .................................................................. 10
2.2.3. Mekanizma Tayini................................................................................................................ 12
2.2.3.1. Caspase-3 Aktivite Tayini .............................................................................................. 12
3. SONUÇ ................................................................................................................................... 13
1
1. DENEYSEL KISIM
1.1. Yöntemler
Hücre testlerinde canlılık oranı ve metabolik aktivite tayini için Tripan sayımı, MTT analizi ve WST
analizleri yapılmıştır. Mekanizma anlamak için ise Caspase-3 aktivite tayini yapılmıştır.
1.1.1. Tripan (Trypan) sayımı
24, 48 ve 72 saat uygulamadan sonra ölü hücreler Tripan boyası ile boyanarak mikroskop altında
sayım yapıldı.
1.1.2. MTT analizi
24, 48 ve 72 saat uygulamaları sonucu canlı kalıp metabolik aktivite göstermeye devam eden
hücrelerin sayılması için MTT protokolü uygulandı. Analiz, metabolik olarak aktif hücrelerin sarı
tetrazolium MTT molekülünün mor formazan kristallerine kesilmesine dayanır. Oluşan formazan
kristalleri suda çözdürülüp renkli çözelti oluştururlar. Oluşan rengin şiddeti çok kuyulu tarama
spektroskopisinde (scanning multiwell spectrophotometer, ELISA reader) ölçülür. Kristallerin
çözünmesi için SDS deterjanını kullanıldı. Sonra, 96 kuyulu plate’ler mikroplate okuyucu tarafından
okundu.
1.1.3. WST analizi
MTT analizi ile aynı prensipte çalışır. Tek farkı, tetrazolium MTT yerine “WST-1 Cell Viability Reagent”
kullanıldı. Kesilme sonucu oluşan kristaller suda çözündüğünden surfactant (SDS) eklenmedi. MTT ve
WST analizleri tripan sayımı ile ilişkilendirilmiştir. Tripan sayımında sadece ölü veya sadece yaşayan
hücreler görülürken, MTT ve WST analizlerinde metabolik aktivite de analiz edilmektedir.
1.1.4. Caspase-3 aktivite tayini
Caspase-3 proteini apoptoza giden hücrelerde aktive olan bir proteindir. Bu nedenle Caspase-3
aktivite tayini ile hücre ölüm mekanizmasının apoptozla olup olmadığı anlaşılır. 293T (İnsan böbrek
kanser hücreleri) hücrelerindeki anti-aktif caspase-3 antikorunu kullanarak immünohisto kimyasal
yöntemlerle caspase-3 aktivitesine bakıldı.
1.2. Deney Grupları
Geliştirdiğimiz molekül B1 ve B2 olarak 2 bileşenden oluşmaktadır. B1 ve B2 bileşenlerinin farklı
oranlarda birleşimiyle M, M0, M1 ve M2 moleküllerini tasarladık.
Deneylerde kullanılan örnekler aşağıdaki gibidir.
Kontrol: Hiçbir bileşen uygulanmayan örneklerdir.
B1: B1 bileşeni
B2: B2 bileşeni
B3: B2 modifikasyonu ile geliştirdiğimiz farklı bir molekül
B4: B2 modifikasyonu ile geliştirdiğimiz farklı bir molekül
M3: B1 ile B3 molekülü bire bir konjügatı
M4: B1 ile B4 molekülü bire bir konjügatı
CPT: Kemoterapi ajanı Camptothecin
2
B3 ve B4 molekülleri B2 molekülünün farklı (modifiye) bir türüdür ve B2 molekülünün kimyasal
mekanizmasını anlama açısından üretilmiştir.
1.2.1. Ön Denemeler
Projenin başlangıcında test ettiğimiz ilk hücre türleridir. Sağlıklı hücre olarak insan lenfosit hücreleri,
kanser hücre soyu olarak ise ishikawa uterus kanser hücre soyu denemeleri yapılmıştır.
1.2.2. Seri Çalışmalar
Ön denemeler başarılı olduktan sonra gerekli doz ayarlamaları ve hücre çeşitlemelerinin yapıldığı
testlerdir. Deneylerde kullanılan hücreler aşağıdaki gibidir.
Madin Darby canine kidney (MDCK): Kanser olmayan köpek böbrek epital hücresi.
PC12: Sıçan böbreküstü bezi feokromositoma (adrenal gland pheochromocytoma) kanser hücreleri
C8: İnsan beyin kanser monosit/makrofaj mikroglia
A549: İnsan akciğer karsinoma
293T: İnsan böbrek kanser hücreleri
GC-4 SPC: Fare testis kanser hücreleri
1.2.3. Tübitak Tarafından Yapılan Test
MDA-231: İnsan meme kanser hücre soyu üzerinde sitotoksisite testi yapılmıştır. Deneyler Tubitak
tarafından yapılmıştır. İlgili detaylar Ek-1’de sunulan Tübitak raporunda verilmiştir.
3
2. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Her hücre tipi için Tripan ve MTT veya WST analiz sonuçları verilmiştir. MTT ve WST sonuçları
mikropipet okuyucu tarafından okunan kuyulardaki absorbans değerleri üzerinden hesaplanmıştır.
Her bir zaman noktası için (24, 48 ve 72 saat) deney gruplarındaki değerler kontrol grubuna göre
normalleştirilmiştir (oranlanmıştır, normalized). Bu nedenle kontrol grubu ayrı olarak gösterilmeyip
her bir zaman noktası için %100 olarak gösterilmiştir.
Tripan hücre sayıları her bir zaman noktasında hesaplanmış ve grafik olarak verilmiştir. Ayrıca, aynı
zaman noktaları için ölüm yüzdeleri kontrol grubuna göre normalleştirilerek hesaplanmıştır. Bu hesap
için aşağıdaki formül kullanılmıştır:
(100 x Ölü hücre / toplam hücre)= (her bir grup için ölüm yüzdesi)
(Her bir grup için ölüm yüzdesi) – (kontrol grubunun ölüm yüzdesi )= Normalleştirilmiş ölüm yüzdesi
Bu nedenle kontrol grubun ölüm yüzdesi %0 olarak alınmıştır.
Bazı yaşayan hücre sayısı grafikleri için başlangıç hücre sayıları da grafiklerin üzerinde başlangıç
(starting) çizgileri ile gösterilmiştir. Bu çizgi, hücrelerin deneye başlanma saylarını gösterir. MTT, WST
ve tripan sayımlarında hücreler deney moleküllerimizle muamele edilmeden önce 24 saat inkübe
edilmiştir. Madde uygulama esnasında hücrelerin aktif büyüme periyotunda bulunmasına dikkat
edilmiştir.
4
2.1. Ön Denemeler
Sağlıklı hücreler olarak inan lenfosit hücreleri (Şekil 2.1), kanser hücreleri olarak ise ishikawa uterus
kanser hücreleri (Şekil 2.2) kullanılmıştır. 24, 48 ve 72. Saatlerde canlı hücrelerin sayımı yapılmıştır.
Şekil 2.1: Sağlıklı lenfosit hücreleri testi
Şekil 2.2: Ishikawa: uterus kanser hücreleri testi
Ishikawa hücrelerinde sitotoksik etki görüp, sağlıklı hücrelerde M1 molekülünde sitotoksik etki
görmeyince birçok hücre türünde yaptığımız testleri içeren seri çalışmalara başladık.
5
2.2. Seri Çalışmalar
2.2.1. Kontrol Grubu Deneyi
Kontrol grubu olarak MDCK (Madine Darby Canine Kidney) hücreleri kullanılmıştır (Şekil 2.3).
Şekil 2.3: MDCK: Madine Darby Canine Kidney hücreleri MTT testi
Bu hücreler normal hücrelerdir M1 molekülünün ve CPT kemoterapi ilacının normal hücrelere etkisini
görüp karşılaştırmak için kullanılmıştır. MTT analizlerinde CPT kemoterapi ilacının normal hücrelerin
çoğunu öldürdüğü fakat M1 molekülünün hücreler üzerinde sitotoksik etki göstermediği
görülmektedir.
Bu çalışmamızda, mekanizmayı anlamak için çeşitli türevlendirmelerde bulunduk. B1 ve B2
bileşenlerini çeşitli oranlarda ve farklı kimyasal bağlarla bağlayıp yaptığımız türevlendirmeleri M
ve M0 olarak isimlendirdik. Bu türevlendirmeler bize mekanizma açısından çok önemli bilgiler sağladı
ve sonrasında M2 molekülünü tasarlamamızı sağladı.
6
2.2.2. Kanser Hücre Deneyleri
2.2.2.1. PC12: Sıçan böbreküstü bezi feokromositoma (adrenal gland pheochromocytoma)
kanser hücreleri
24, 48 ve 72 saat uygulamadan sonra Trypan canlı hücre sayısı ölçülmüştür (Şekil 2.4).
Şekil 2.4: PC12: Sıçan böbreküstü bezi feokromositoma (adrenal gland pheochromocytoma) kanser hücreleri
M1 molekülü ile yaptığımız çalışmalara, PC12: Sıçan böbreküstü bezi feokromositoma hücreleri ile
devam ettik. B2 bileşeni hücre büyümesini baskılamış, 72 saatte ise hafif bir düşüş göstermiştir. CPT
molekülü ise 24 saatte önemli bir sitotoksik etki göstermemesine rağmen 48. saatte büyük oranda
sitotoksik etki gösterdi. Fakat 72 saatte tekrar canlılık oranı artış gösterdi. M1 molekülünde ise hücre
canlılık oranı 48 saatte büyük oranda azalmış, 72 saatte ise tam ölüm sağlanmıştır. Sonuç olarak M1
molekülü B2 bileşeninden ve CPT’den daha yüksek sitotoksik etki göstermiştir.
2.2.2.2. C8: İnsan beyin kanser monosit/makrofaj mikroglia
24, 48 ve 72 saat uygulamadan sonra Tripan canlı hücre sayısı ölçülmüştür (Şekil 2.5).
Şekil 2.5: C8: İnsan beyin kanser monosit/makrofaj mikroglia
7
B1 bileşeni 24, 48 ve 72 saatte büyük oranda sitotoksik etki göstermiştir. M1 ve CPT gruplarında ise,
tripan sayımları bütün hücrelerin 24. saatte öldüğünü göstermiştir. Sonuç olarak, C8 hücrelerinin test
ettiğimiz bütün moleküllere karşı hassas olduğu gözlemlenmiştir.
2.2.2.3. A549: İnsan akciğer karsinoma
24, 48 ve 72 saat uygulamadan sonra Tripan hücre sayımı testi yapılmıştır (Şekil 2.6). Daha sonra çift
doz uygulama ile WST analizi de yapılmıştır (Şekil 2.7).
Şekil 2.6: A549: İnsan akciğer karsinoma Tripan Sayımı
Şekil 2.7: A549: İnsan akciğer karsinoma: Çift doz WST analizi
8
WST ve tripan analizleri M1 molekülünün tek başına B1 ve tek başına B2’ye göre belirgin olarak daha
etkili olduğunu göstermiştir. B1 ve B2 moleküllerinin beraber kullanımı (M1), ölüm oranını büyük
oranda arttırmıştır. Tripan sayımı M1 molekülü için 72. Saatte tamamiyle ölümü (total death)
göstermiştir. Ayrıca sadece bu hücre tipi için çift doz (6 mg/ml) uygulama da denenmiştir. Normal
doza göre aynı korelasyon görülmüştür. Fakat canlı hücre sayısı sıfıra yakın seviyeye düşmüştür.
Mekanizma anlama açısından türevlendirmelere devam edilmiştir. B3 ve B4 türevlendirmeleri ile
birlikte, onların B1 bile olan bileşiklerini temsil eden M3 ve M4 türevlendirmelerinin de sitotoksik
etkilerine bakılmıştır. M3 ve M4 moleküllerinin 24, 48 ve 72 saatlerdeki sitotoksik etkileri bize daha
sonraki çalışmalarda yol göstererek M2 molekülünü tasarlamamızı sağladı.
2.2.2.4. 293T: İnsan böbrek kanser hücreleri
24, 48 ve 72 saat uygulamadan sonra WST analizi yapılmıştır (Şekil 2.8) .
Şekil 2.8: 293T: İnsan böbrek kanser hücreleri
WST analizleri M1 molekülünün CPT’ye göre daha fazla sitotoksik etki göstermiştir. B1 bileşeni de
CPT’ye göre daha fazla sitotoksik etki göstermiş fakat M1 molekülünün sitotoksik etkisi çok daha
fazladır.B2 bileşeni ise hücre proliferasyonunu sağlamıştır. B2 bileşeni hücre proliferasyonunu
sağlarken, B1 bileşeni ve M1 molekülünün sitotoksik etki göstermesi çalışma mekanizmasını anlama
açısından önemli bilgiler edinmemizi sağlamıştır.
9
2.2.2.5. GC-4 SPC: Fare testis kanser hücreleri
24, 48 ve 72 saat uygulamadan sonra WST analizi yapılmıştır (Şekil 2.9).
Şekil 2.9: GC-4 SPC: Fare testis kanser hücreleri
WST analizleri M1 ile sadece B1 ve sadece B2 bileşenleri arasında belirgin bir etki farkı olduğunu
göstermiştir. M1 molekülü kullanıldığında hücre ölüm oranı büyük oranda artmış, 72. saatte tam
ölüm (total death) gözlemlenmiştir. M1 molekülü CPT molekülünden daha fazla sitotoksik etki
göstermiştir.
2.2.2.6. MDA-231: İnsan meme kanser hücre soyu
Oldukça yayılmacı bir meme kanseri türü olan MDA-231 insan meme kanser hücre soyları üzerinde
deneyler yapılmıştır. Bu testte, daha önce kullandığımız M1 molekülü ile birlikte, yeni geliştirmiş
olduğumuz M2 bileşiğini de kullandık.
Tasarlanan M1 ve M2 moleküllerinin MDA-231 kanser hücre soyları üzerindeki 24, 48 ve 72 saatteki
etkileri belirlenmiştir. Elde edilen veriler Ek-1'de bulunan 13.06.2012 tarihli Tübitak Raporu
sayfa 5'deki tabloda bulunmaktadır. Bu veriler yine aynı raporda sayfa 5 ve 6 da grafik haline
getirilmiştir. Tablo ve grafiklerdeki %1 uyguama oranı 1mg/ml son derişime denk gelmektedir.
Bu tablodaki veriler, anlaşılması kolay olması için aşağıdaki grafiklerde gösterilmiştir (Şekil 2.10,
Şekil 2.11, Şekil 2.12):
10
Şekil 2.10: M1 ve M2 maddelerinin farklı dozlardaki uygulamaları. Bu tabloda 24 saat uygulama
Şekil 2.11: M1 ve M2 maddelerinin farklı dozlardaki uygulamaları. Bu tabloda 48 saat
Şekil 2.12: M1 ve M2 maddelerinin farklı dozlardaki uygulamaları. Bu tabloda 72 saat
11
Grafiklerde görüldüğü gibi düşük dozlarda bile 24. ve 48. saatlerde kanser hücreleri sayısında ciddi bir
azalma olmuştur. Aşağıda en etkin 3 farklı M1 ve M2 dozlarını içeren ve kanser hücrelerinin
sayılarındaki azalmayı yukarıdaki grafiklere göre özetleyen bilgiler verilmiştir. Sayılardaki azalma
hiçbir ilaç uygulanmayan kanser hücreleri ile karşılaştırılarak hesaplanmaktadır.
3 numaralı doz uygulama sonuçları
24. saatte, M1 molekülünün 3 numaralı doz miktarında hücre sayısı %64 oranında azalmıştır. M2
molekülünde ise %74 azalmıştır. 48. saatte, M1 molekülünün 3 numaralı doz miktarında hücre sayısı
%55 oranında azalmıştır. M2 molekülünde ise %84 azalmıştır. 72. saatte, M1 molekülünün 3 numaralı
doz miktarında hücre sayısı %50 oranında azalmıştır. M2 molekülünde ise %85 azalmıştır.
6 numaralı doz uygulama sonuçları
24. saatte, M1 molekülünün 6 numaralı doz miktarında hücre sayısı %86 oranında azalmıştır. M2
molekülünde ise %91 azalmıştır. 48. saatte, M1 molekülünün 6 numaralı doz miktarında hücre sayısı
%96 oranında azalmıştır. M2 molekülünde ise %98 azalmıştır. 72. saatte, M1 molekülünün 6 numaralı
doz miktarında hücre sayısı %99,4 oranında azalmıştır. M2 molekülünde ise %99,8 azalmıştır.
10 numaralı doz uygulama sonuçları
24. saatte, M1 molekülünün 10 numaralı doz miktarında hücre sayısı %91 oranında azalmıştır. M2
molekülünde ise %95 azalmıştır. 48. saatte, M1 molekülünün 10 numaralı doz miktarında hücre sayısı
%98,5 oranında azalmıştır. M2 molekülünde ise %98,7 azalmıştır. 72. saatte, M1 ve M2
moleküllerinin uygulandığı tüm hücreler ölmüştür.
2.2.3. Mekanizma Tayini
Kanser hücrelerindeki apoptozu gözlemlemek için Caspase-3 aktivite tayini yapılmıştır.
2.2.3.1. Caspase-3 Aktivite Tayini
B1 ve B2 bileşenleri, M1 molekülü ve Camptothecin’in negatif kontrolle karşılaştırmalı olarak 293T
(İnsan böbrek kanser hücreleri) üzerinde Caspase-3 aktivite tayini testleri yapılmıştır (Şekil 2.13).
Şekil 2.13: 293T: İnsan böbrek kanser hücreleri Caspase-3 aktivite tayini
Şekil 2.13’deki fotoğraflar 24. saatte 1,7x optik yakınlaştırma altında çekilmiştir. Caspase-3 aktivitesi
B1, M1 ve CPT uygulanmış gruplarda (C-E) gözlenmiş fakat kontrol grubu ve B2 grubunda
gözlemlenmemiştir.
M1 ve B1 örneklerinde gözlenen Caspase-3 aktivitesi, geliştirdiğimiz moleküllerin apoptoz
mekanizmasını da aktifleştirdiğini göstermektedir.
12
3. SONUÇ
Deneylerimiz boyunca B1 ve B2 bileşenleri baz olmak üzere birçok molekül tasarladık. İlk
çalışmalarımızda en etkili formülasyon olarak M1 molekülünü geliştirdik ve birçok deneyimizi M1
molekülü üzerinden gerçekleştirdik. M1 molekülü, tek başına B1 ve tek başına B2’den çok daha etkili
olduğu görülmüştür. M1 molekülü, böbrek, akciğer, testis, beyin, uterus, meme ve böbreküstü bezi
kanser tipleri üzerinde öldürücü etkisi göstermektedir.
Ayrıca, böbrek kanser hücreleriyle yapılan caspase-3 aktivite tayinlerinde, geliştirdiğimiz M1
molekülünün kanser hücrelerini apoptoz mekanizmasıyla öldürdüğü gözlemlenmiştir.
Geliştirdiğimiz moleküllerin en önemli özelliklerinden birisi kanser hücrelerine karşı sitotoksik etki
gösterirken kanser tipi olmayan hücreler üzerinde sitotoksik etki göstermemesidir. Yaptığımız
denemelerde M1 molekülü kanser tipi olmayan MDCK (ve lenfosit) hücrelerine karşı sitotoksik etki
göstermemiş fakat CPT molekülü MDCK hücreleri üzerinde sitotoksik etki göstermiştir. Bu yüzden,
tasarladığımız moleküller kemoterapi ilaçlarına göre çok daha üstün özellikler göstermiştir.
Geliştirdiğimiz moleküllerin en önemli özelliklerinden bir diğeri ise istediğimiz yönde
türevlendirilebilmesidir. Ön ve seri çalışmalarımızdan edindiğimiz tecrübeler üzerine M2 molekülünü
tasarladık ve Tübitak’ta yapılan testlerde M1 ve M2 molekülünü birlikte analiz ettirdik.
Tübitak’ta yaptırılan test sonuçlarına göre M1 ve M2 molekülleri için elde edilen verilerin çoğunda
yüzde canlılık oranları kontrolün (100 rakamının) oldukça altındadır. Özellikle 6 ve 10 numaralı
uygulamalarda (6mg/ml ve 10mg/ml) kanser hücrelerinin ölüm oranı %99’lar seviyesindedir. Bir diğer
ifadeyle her iki molekül de MDA-231 hücrelerine karşı ölümcül etki göstermekle birlikte M2 molekülü
daha etkili olmuştur. Bu etki farkı moleküllerin ne kadar geliştirilebilir olduğunun ispatıdır. Çünkü M2
molekülü M1 molekülünü türevlendirerek üretilmiştir. Aynı şekilde, yapacağımız diğer
türevlendirmeler ile etki hızını ve etkili olduğu kanser hücresi türünü değiştirmemiz mümkündür.
13