ankara üniversitesi fen bilimleri enstitüsü doktora tezi bazı bitki
advertisement
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ BAZI BİTKİ EKSTRELERİNİN ANTİMİKROBİYAL, ANTİOKSİDAN VE SİTOTOKSİK ETKİLERİYLE, KANSERLİ DOKULARDA ADENOZİN DEAMİNAZ ENZİMİ ÜZERİNE ETKİSİ Lütfiye Yasemin KOÇ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her hakkı saklıdır i TEZ ONAYI Lütfiye Yasemin KOÇ tarafından hazırlanan “Bazı Bitki Ekstrelerinin Antimikrobiyal, Antioksidan ve Sitotoksik Etkileriyle, Kanserli Dokularda Adenozin Deaminaz Enzimi Üzerine Etkisi” adlı tez çalışması 24/12/2012 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ Ankara Üniversitesi, Biyoloji ABD Jüri Üyeleri : Başkan: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK Ankara Üniversitesi, Biyoloji ABD Üye : Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ Ankara Üniversitesi, Biyoloji ABD Üye : Prof. Dr. Mustafa KAVUTÇU Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyokimya ABD Üye : Prof. Dr. Reyhan ÇOLAK Ankara Üniversitesi, Biyoloji ABD Üye : Doç. Dr. Ayten Çelebi KESKİN Kırıkkale Üniversitesi, Biyoloji ABD Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. İbrahim DEMİR Enstitü Müdürü i ÖZET Doktora Tezi BAZI BİTKİ EKSTRELERİNİN ANTİMİKROBİYAL, ANTİOKSİDAN VE SİTOTOKSİK ETKİLERİYLE, KANSERLİ DOKULARDA ADENOZİN DEAMİNAZ ENZİMİ ÜZERİNE ETKİSİ Lütfiye Yasemin KOÇ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ Doğal bitkiler ile ilgili pek çok çalışma yapılmış olmasına rağmen bitki türlerinin antimikrobiyal, antioksidan, sitotoksik aktivite ve Adenin Deaminaz Enzim (ADA) aktivitesini de kapsayan çalışmalar yaygın değildir. Bu tez ile Türkiye’ de yayılış gösteren Lupinus albus L, Phlomis kurdica, Coriandrum sativum L, Tymbra spicata var. spicata L. ve Hypericum calycinum L. bitki türlerinin etanol ve methanol özütlerinin biyolojik aktiviteleri araştırılmıştır. Öncelikle, bitki özütlerinin yüzde verimliliğine bakılmış ve en verimli tür H. calycinum olarak bulunmuş, antimikrobiyal aktivite denemelerinde P. kurdica, T. spicata var. spicata, H. calycinum’un etkili olduğu, bakteri türlerinin ise Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus olduğu saptanmıştır. Bitkilerin antioksidan aktiviteleri incelenmiş ve T. spicata var. spicata, P. kurdica, H. calycinum’un oldukça yüksek aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. En fazla toplam çözünebilen fenolik maddeye sahip türler H. calycinum ve T. spicata var. spicata bitkileri olarak belirlenmiştir. Daha sonra bitki özütleri, HeLa serviks ve MCF-7 meme kanser hücre hatlarına MTT testi uygulanarak hücre canlılıklarına etkileri belirlenmiştir. En fazla aktiflik gösteren H. calycinum’un meme ve serviks kanser hücre hatlarına ilave olarak PC3, DU145, LNCaP prostat kanser hücre hatlarına etkisi araştırılmış ve PC3 hücrelerine, DU145 hücrelerinden daha etkili olduğu gözlenmiştir. Hücre canlılığının 0,5 mg/ml’lik konsantrasyonun %50 oranında azalttığı gözlenirken, uygulanan bitki özütünün zamana bağlı bir şekilde hücre canlılığında azalmaya neden olduğu da saptanmıştır. Bu bitkinin MCF-7 meme kanseri hücreleri için ilk 48 saat boyunca sitostatik etki gösterdiği bulunmuştur. H. calycinum özütünün MCF-7 meme kanser hücrelerinde mitokondri aracılığı ile oluşturulan apoptotik hücre yolağındaki etkilerinin gösterilmesi amacı ile özüt uygulanmış hücre hatları propidyum boyama (PI), DNA kondensasyonunu görebilmek için DAPI, mitokondri membran bütünlüğünün yitirilmesini anlamak amacıyla da DiOC6 ile boyanarak ışık/floresan mikroskobuyla hücreler incelenmiştir. Sonuç olarak özütlerin apoptotik potansiyele sahip olduğu ve hücre ölümünü tetiklediği gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlar, bitki özütünün meme kanseri hücre dizilerinde hücre ölümünü arttırdığını göstermiştir. PARP kesimi sonuçları ise ortaya çıkan sonuçları desteklemiştir. H. calycinum’un etanol ve metanol özütleri normal ve tümörlü dokularda yapılan ADA aktivite ölçümlerde, ADA aktivitesininde oldukça önemli derecede azalma gösterdiği gözlenmiştir. Bu nedenle, çalışmada kullanılan bitkilerin terapotik etkileri olabileceği sonucuna varılmıştır. 2012, 169 sayfa Anahtar Kelimeler: Bitki ekstraktı, antimikrobiyal aktivite, antioksidan aktivite, sitotoksisite, adenin deaminaz ii ABSTRACT PhD Thesis SOME PLANT EXTRACTS ANTIMICROBIAL, ANTIOXIDANT AND CYTOTOXIC EFFECTS, CANCER TISSUES ON THE ENZYME ADENOSINE DEAMINASE Lütfiye Yasemin KOÇ Ankara University, Institute of Science Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ Although many studies were made on natural herbs, those involving the antimicrobial, antioxidant and cytotoxic activity as well as Adenine Deaminase Enzyme (ADA) activity of the herb species are rather rare. This paper researches the biological activities of ethanol and methanol extracts of Lupinus albus L, Phlomis kurdica, Coriandrum sativum L, Tymbra spicata var. Spicata L. and Hypericum calycinum L. herb types, which are prevalent in Turkey. Initially, the percentile efficiency of the herb extracts was analyzed and the most efficient species was found to be H. calycinum. In the antimicrobial activity tests performed thereafter, it was detected that the herbs P. kurdica, T. spicata var. spicata, and H. calycinum were effective against bacteria and that the bacteria types that they were most effective on were Bacillus subtilis, Bacillus. cereus, and Staphylococcus aureus. The antioxidant activities of the herb species were analyzed and it was observed that the herbs T. spicata var. spicata, P. kurdica, and H. calycinum had quite high activity. The species having the highest quantity of total soluble phenolic matter were found to be the herbs H. calycinum and T. spicata var. spicata. Then the herb extracts were applied on HeLa cervix and MCF-7 breast cancer cell strands by means of MTT test to determine their effects on the cell vitalities. The herbs were subjected to further tests depending on their levels of activity. The effect of H. calycinum extract, which presented in the highest activity, on the strands of PC3, DU145 and LNCaP prostate cancer was investigated in addition to the cell strands of breast and cervix cancer. It was observed that the herb extracts were more effective on PC3 cells than on DU145 cells. While it was observed that a concentration of 0.5 mg/ml reduced cell vitality by 50%, it was also detected that the administered herb extract caused a time-dependent reduction in cell vitality. This herb extract was found to have a cytostatic effect during the first 48 hours for MCF-7 breast cancer cells. In order to demonstrate the effects of H. calycinum extract on the apoptotic cell pathway by activating the apoptosis formed by the mitochondria of MCF-7 breast cancer cells, the cell lines administered with the extract were stained by propidium iodide staining (PI) and the cells were analyzed under the light/fluorescent microscope. In conclusion, it was shown that the extracts had apoptotic potential and triggered the cell death. In order to better understand their apoptotic potentials, the cells treated with the herb extracts were stained with DAPI and DNA condensation was determined. The obtained results indicated that the herb extract increased cell death in breast cancer cell strands. PARP cleavage results also supported the conclusions through modeling cell death using PI and DAPI fluorescent probes. In ADA activity measurements on normal and tumor tissues with ethanol and methanol extracts of H. calycinum, it was observed that the ADA activity showed substantial decrease in the tissues treated with herb extracts. Therefore, it was concluded that such herbs could have therapeutic effects. 2012, 169 pages Key words: Herb extract, antimicrobial activity, antioxidant activity, cytotoxicity, adenine deaminase iii TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım boyunca yakın ilgi ve desteğini gördüğüm, bilgi ve birikimleri ile bana yol gösterici olan tez danışmanım Prof. Dr. Cumhur Çökmüş’e, çalışmalarımın yönlendirilmesinde yardımcı olan hocalarım Prof. Dr. Mustafa Akçelik ve Prof. Dr. Mustafa Kavutçu’ya, bu süreçte özverili bir şekilde her türlü bilgi ve birikimini paylaşan tezimde ve mesleki gelişimimde çok büyük katkısı olan Yrd. Doç. Dr. Elif Damla ARISAN’a, çalışmalarımda yardımlarından dolayı Prof.Dr. Serdar Öztürk’e, Hayallerimi unutturmadan ilerlememi sağlayan, hoşgörüleri ve özverileri ile hayatımdaki en büyük desteğim, hiçbir zaman haklarını ödeyemeyeceğim Prof. Dr. Leyla Açık’a ve Prof. Dr. Mahmut Koç’a, Başından sonuna kadar hep yanımda olan, mutluluk ve huzur içinde yaşamımı devam ettirmemi sağlayan arkadaşlarım Burçe Ataç Moğol’a, Türker Sert’e, Uzm. Bio. Didem Torun’a, Uzm. Bio. Burcu Bali’ye, Yeliz Dalgıç Polattaş’a, Tutku Kurt Bayyurt’a, Miray Vurmay’a, Ozan Kayadelen’e, Müge Ersoy’a, Yağmur Öner’e, Betül Aydın’a, Ayrıca, her adımımda yanımda olan, hayallerimi devam ettirmem için manevi desteklerini usanmadan gösteren başta annem, babam ve ağabeyim olmak üzere tüm aileme Ve her zaman hissedeceğim babanneciğime En içten dileklerimle teşekkür ederim… Lütfiye Yasemin Koç Ankara, Aralık 2012 iv SİMGELER DİZİNİ ADA AIDS AIF AMP Apaf-1 AR ATP BRCA1 BRCA 2 CAK CDK DFF DHT DNA FADD GSH-Px HPV IAP IGF IMP NADPH NGF PARP PSA PUFA RO˙ ROO˙ ROT SAH SAM SOD TeBG TNFR-1 TRADD Adenozin Deaminaz Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu Apoptozis İndükleyici Faktör Adenozin Monofosfat Apoptotik Proteaz Aktive Edici Faktör-1 Androjen Reseptörü Adenozin Trifosfat Göğüs Kanseri Yatkınlık Geni 1 Göğüs Kanseri Yatkınlık Geni 2 Siklinleri Aktive Eden Kinaz Siklin Bağımlı Kinazlar DNA Fragmante Edici Faktör Dihidrotestosteron Deoksiribonükleik Asit Fas İlişkili Ölüm Birimleri Glutatyon Peroksidaz Human Papilloma Virüs İnsan Papilloma Virüsü Apoptoz İnhibitör Protein İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü İnozin Monofosfata Nikotinamid Adenin Dinükleotit Fosfat Nöron Büyüme Faktörü Poli-Adenozin Difosfat RibozPolimeraz Prostat Spesifik Antijen Çoklu Doymamış Yağ Asitleri Akloksil Radikali Peroksil Radikali Reaktif Oksijen Türleri S-Adenozil Homosisteine S-Adenozil Metiyonin Süperoksit Dismutaz Testosteron-Östradiol Bağlayan Globülin Tümör Nekroz Faktör Reseptörü-1 TNFR-1 İlişkili Ölüm Birimleri v İÇİNDEKİLER TEZ ONAYI ...................................................................... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. ÖZET......................................................................................................................................ii ABSTRACT ......................................................................................................................... iii TEŞEKKÜR ........................................................................................................................ iv SİMGELER DİZİNİ ............................................................................................................ v İÇİNDEKİLER ................................................................................................................... vi ŞEKİLLER DİZİNİ ............................................................................................................. x ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................... xiv 1. GİRİŞ ................................................................................................................................ 1 2. KURAMSAL TEMELLER ............................................................................................. 4 2.1 Kanser ............................................................................................................................. 4 2.2 Apoptozis......................................................................................................................... 7 2.3 Prostat Kanseri ............................................................................................................. 12 2.4 Meme Kanseri............................................................................................................... 18 2.5 Serviks Kanseri ............................................................................................................ 20 2.6 Kanser ve Adenozin Deaminaz Enzimi ...................................................................... 22 2.7 Serbest Radikaller ve Antioksidanlar ........................................................................ 27 2.8 Serbest Radikaller ........................................................................................................ 27 2.8.1 Reaktif oksijen türleri ............................................................................................... 28 2.8.1.1 SüperOksit (O2–) radikali ...................................................................................... 30 2.8.1.2 Hidrojen peroksit (H2O2)....................................................................................... 32 2.8.1.3 Hidroksil radikali (·OH) ........................................................................................ 33 2.8.1.4 Hipoklorik asit (HOCl) .......................................................................................... 33 2.8.1.5 Peroksil ve alkoksil radikalleri ............................................................................. 34 2.8.1.6 Singlet oksijen (1O2) ............................................................................................... 34 2.8.2 Reaktif azot türleri .................................................................................................... 34 2.8.2.1 Nitrik oksit (NO) .................................................................................................... 34 2.8.3 Serbest radikallerin etkileri ..................................................................................... 36 2.9 Antioksidanlar .............................................................................................................. 39 2.9.1 Enzimler ..................................................................................................................... 43 2.9.1.1 Süperoksit dismutazlar (SOD) .............................................................................. 43 2.9.1.2 Katalazlar................................................................................................................ 43 2.9.1.3 Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ........................................................................... 44 2.9.1.4 Glutatyon redüktaz (GSH-Red) ............................................................................ 44 2.9.1.5 Glutatyon S-transferaz (GST) ............................................................................... 45 2.9.2 Enzimatik olmayan antioksidanlar ......................................................................... 45 2.9.2.1 E vitamini (α-tokoferol) ......................................................................................... 45 2.9.2.2 Karotenoidler.......................................................................................................... 45 2.9.2.3 Glutatyon (GSH) .................................................................................................... 46 2.9.2.4 α-Lipoik asit ............................................................................................................ 46 2.10 Çalışmada Kullanılan Bitkilerin Sistematiği ve Özellikleri ................................... 46 2.10.1 Lupinus albus L. ...................................................................................................... 46 2.10.2 Coriandrum sativum L. ............................................................................................ 48 vi 2.10.3 Phlomis L. kurdica RECH. FIL. ............................................................................. 49 2.10.4 Thymbra spicata L. var. spicata ............................................................................... 50 2.10.5 Hypericum calycinum L. .......................................................................................... 53 3. MATERYAL METOT .................................................................................................. 56 3.1 Materyaller ................................................................................................................... 56 3.1.1 Çalışmada kullanılan bitki türleri ........................................................................... 56 3.1.2 Mikroorganizmalar ................................................................................................... 56 3.1.3 Kullanılan kimyasal maddeler ve ekipmanlar ....................................................... 56 3.1.4 Antimikrobiyal aktivite için kullanılan kimyasal maddeler ve çözücüler ........... 57 3.1.5 Antioksidan aktivite için kullanılan kimyasal maddeler ve çözücüler ................. 58 3.1.6 Hücre hatları için kullanılan kimyasal maddeler ve besiyerleri ........................... 59 3.1.7 Çalışmada kullanılan hücre hatları ......................................................................... 59 3.1.8 Çalışmada kullanılan çözeltiler ................................................................................ 60 3.1.9 Hücre kültüründe kullanılan malzemeler ............................................................... 60 3.1.10 Hücre kültüründe kullanılan cihazlar................................................................... 61 3.1.11 ADA aktivitesi ile ilgili kimyasal maddeler .......................................................... 62 3.2 Yöntem .......................................................................................................................... 62 3.2.1 Bitki özütlerinin hazırlanması ................................................................................. 62 3.2.2 Antimikrobiyal aktivite belirleme yöntemi ............................................................. 63 3.2.2.1 Disk kuyucuk yöntemi ........................................................................................... 63 3.2.2.2 Besiyerlerinin hazırlanması .................................................................................. 63 3.2.2.3 Bitki özütlerinin disk kuyucuk yöntemi ile antimikrobiyal aktivitelerinin tayini ....................................................................................................................... 63 3.2.2.4 Aktif bulunan bitki özütlerinin minimal inhibitör konsantrasyonlarının belirlenmesi............................................................................................................ 64 3.2.3 Özütlerin antioksidan özelliklerinin tayini ............................................................. 64 3.2.3.1 DPPH radikal süpürücü etki tayini ...................................................................... 64 3.2.3.2 Toplam fenolik içerik miktar tayini ..................................................................... 65 3.2.4 Kanserli hücre dizilerinde sitotoksisitenin belirlenmesi ........................................ 66 3.2.4.1 Bitki özütünün hücre kültürü için hazırlanması ................................................. 66 3.2.4.2 Hücre kültürü ve hücre sayımı ............................................................................. 66 3.2.4.3 Hücre canlılık testi (MTT testi) ............................................................................ 66 3.2.4.4 Hücre sağ kalım eğrisinin belirlenmesi ................................................................ 67 3.2.4.5 Hücre ölümünün propidyum iyodür (PI) boyama ile belirlenmesi ................... 67 3.2.4.6 Apoptotik hücrelerin DAPI boyaması ile belirlenmesi ....................................... 68 3.2.4.7 Mitokondri membran potansiyelindeki değişimin belirlenmesi (Δψm) ............ 68 3.2.5 Protein İzolasyonu..................................................................................................... 68 3.2.6 Western blotlama ...................................................................................................... 69 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ........................................................................................ 70 4.1 Bitki Özütlerinin Hazırlanması ve Yüzde Verimlilik Hesaplanması ...................... 70 4.2 Antimikrobiyal Aktivite Sonuçları ............................................................................. 71 4.2.1 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütsinin antimikrobiyal aktivite sonuçları ............................................................................................................... 71 4.2.2 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivite sonuçları ............................................................................................................... 75 vii 4.2.3 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivitesi ............................................................................................................... 78 4.2.4 T. spicata var. spicata etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivite sonuçları ................................................................................................. 83 4.2.5 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivite sonuçları ................................................................................................. 89 4.3 DPPH Radikal Süpürücü Aktivite.............................................................................. 94 4.3.1 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi ........... 94 4.3.2 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi...................................................................................................................... 95 4.3.3 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi...................................................................................................................... 97 4.3.4 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi .................................................................................................... 99 4.3.5 H.calycinum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi.................................................................................................................... 100 4.4 Toplam Fenolik İçerik Miktarlarının Belirlenmesi ................................................ 102 4.5 L. albus, C. sativum, T. spicata var. spicata, P. kurdica ve H. calycinum Bitki Özütlerinin çeşitli Kanser Hücreleri Üzerindeki Etkisinin MTT Hücre Canlılığı Testi ile Belirlenmesi ................................................... 105 4.5.1 Hücre canlılık testi ile sitotoksik etkinin belirlenmesi ......................................... 105 4.5.1.1 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi................................................................................................... 105 4.5.1.2 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi .................................................................................. 107 4.5.1.3 T. spicata var. spicata bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi..................................................................... 108 4.5.1.4 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi .................................................................................. 110 4.5.2 H. calycinum bitki özütlerinin PC3, DU145, LNCaP prostat kanseri, MCF-7 meme kanseri, HeLa serviks kanseri hücre dizilerinde hücre canlılık testi ve sağ kalım eğrilerinin belirlenmesi ................................................................ 113 4.5.3 P. kurdica ve H. calycinum bitkisi etanol ve metanol özütlerinin uygulanan kanser hücre hatlarında morfolojik değişimlerin ters bakışlı ışık ve floresan mikroskobunda gösterimi .......................................... 117 4.5.3.1 P. kurdica bitkisinin metanol özütünün uygulanması sonucu kanser hücre hatlarında oluşan morfolojik değişimlerin ters bakışlı ışık ve floresan mikroskobunda gösterimi .................................................................................. 118 4.5.3.2 H. calycinum bitkisinin metanol özütünün uygulanması sonucu kanser hücre hatlarında oluşan morfolojik değişimlerin ters bakışlı ışık ve floresan mikroskobunda gösterimi.................................................................... 123 4.5.3.3 Apoptotik sürecin moleküler belirteçler ile gösterilmesi .................................. 125 4.6 ADA Aktivitesi Ölçümü ............................................................................................. 126 5. TARTIŞMA ve SONUÇ .............................................................................................. 129 KAYNAKLAR ................................................................................................................. 136 viii EKLER..............................................................................................................................150 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………………… 151 ix ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 2008 yılında sıklıkla görülen kanserlerin dünya haritasında gösterimi ............................................................................................................ 5 Şekil 2.2 Türkiye’de sık görülen kanserlerin bölgelere göre dağılımı .............................. 6 Şekil 2.3 Hücre döngüsü ve siklin bağımlı kinazlar ......................................................... 7 Şekil 2.4 Apoptotik yolakların şematik olarak gösterilmesi ........................................... 10 Şekil 2.5 Erkek üreme sisteminin anatomisi ................................................................... 13 Şekil 2.6 2007 yılında ABD’ de yaşayan erkeklerde kansere yakalanma verileri.............................................................................................................. 14 Şekil 2.7 Prostat hücrelerinde androjen sinyaline bağlı olarak androjene cevap genlerinin anlatımında meydana gelen değişimlerin şematik olarak gösterilmesi ............................................................................. 16 Şekil 2.8 Meme ve bölümleri .......................................................................................... 18 Şekil 2.9 Serviks ve bölümleri ........................................................................................ 21 Şekil 2.10 HPV enfeksiyonu ve serviks kanserine geçiş ................................................ 22 Şekil 2.11 Adenin, adenozin ve adenozin monofosfat’ın kimyasal yapısı ..................... 22 Şekil 2.12 Adenozin yıkımı ............................................................................................ 24 Şekil 2.13 Homosisteinin ADA aracılığıyla inozine indirgenmesi. ................................ 25 Şekil 2.14 Serbest radikallerin hücredeki etkileri ........................................................... 36 Şekil 2.15 Reaktif türlerin kanser gelişimini kolaylaştırmasına neden olan bazı yollar ........................................................................................................ 38 Şekil 2.16 Pürin ve pirimidin bazları üzerine ∙OH radikalinin etkisiyle oluşan ürünler .................................................................................................. 39 Şekil 2.17 Oksidatif strese karşı enzimatik savunma mekanizmaları ............................. 43 Şekil 2.18 L. albus bitkisi ve tanesi................................................................................. 47 Şekil 2.19 C. sativum bitkisi. .......................................................................................... 48 Şekil 2.20 Phlomis kurdica bitkisi .................................................................................. 50 Şekil 2.21 Thymbra spicata var. spicata bitkisi............................................................. 52 Şekil 2.22 Hypericum calycinum bitkisi ......................................................................... 54 x Şekil 4.1 C. sativum bitkisinin etanol özütünün kuyucuk yöntemi ile B. subtilis bakterisi üzerinde oluşturduğu zonlar ................................................. 72 Şekil 4.2 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütülerinin S. aureus bakterisi üzerinde kuyucuk yöntemi ile oluşturtuğu zonlar ............................ 75 Şekil 4.3 P. kurdica bitki özütünün antimikrobiyal etkisi .............................................. 78 Şekil 4.4 T. spicata var. spicata bitki özütünün S. aureus bakterisi üzerine antimikrobiyal etkisini gösteren inhibisyon zonları ........................................ 83 Şekil 4.5 H. calycinum bitkisinin etanol özütünün S. aureus bakterisi üzerine antimikrobiyal etkisi ........................................................................... 89 Şekil 4.6 L. albus etanol, metanol özütü ve standartının % inhibisyon değerleri ........................................................................................................... 95 Şekil 4.7 C. sativum etanoli metanol özütü ve starndardın % inhibisyon değerleri ........................................................................................................... 97 Şekil 4.8 P. kurdica bitkisinin etanol, metanol özütleri ve standardın DPPH süpürücü etkisi..................................................................................... 98 Şekil 4.9 T. spicata var. spicata bitkisinin etanol, metanol özütleri ve standardın DPPH süpürücü etkisi .................................................................. 100 Şekil 4.10 H. calycinum bitkisinin etanol, metanol özütleri ve standardın DPPH süpürücü etkisi ................................................................................. 101 Şekil 4.11 Gallik asit standart grafiği ............................................................................ 103 Şekil 4.12 Bitki özütlerinin gallik asit eşdeğeri olan fenolik madde miktarları (Yatay eksen bitki özütlerini gösterirken dikey eksen Gallik asit eşdeğer düzeylerini mg/g düzeyinde gösterir) ................. 104 Şekil 4.13 L. albus bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin HeLa serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. ..................................................................................................... 106 Şekil 4.14 L. albus bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. ..................................................................................................... 106 Şekil 4.15 C. sativum metanol ve etanol özütlerinin HeLa serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi.......................... 107 Şekil 4.16 C. sativum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme kanseri hücre dizilerinde bağıl hücre canlılığına ilişkin xi beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. ..................................................................................................... 108 Şekil 4.17 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin HeLa hücreleri üzerine etkisinin MTT hücre canlılığı testi ile gösterilmesi. Kolon grafik beş biyolojik tekrarlı deneyin ortalama sonuçları olarak sunulmaktadır. ................................................... 109 Şekil 4.18 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 hücrelerinde etkisinin MTT hücre canlılığı testi ile gösterilmesi. Kolon grafik beş biyolojik tekrarlı deneyin ortalama sonuçları olarak sunulmaktadır. ................................................... 109 Şekil 4.19 P. kurdica metanol ve etanol özütlerinin HeLa serviks serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi ...................................................................................................... 110 Şekil 4.20 P. kurdica metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. ..................................................................................................... 111 Şekil 4.21 P. kurdica ve C. sativum bitkilerinin metanol ve/veya etanol özütlerinin MCF-7 meme kanseri hücreleri sağ kalım potansiyeli üzerine etkisinin gösterilmesi. .................................................. 112 Şekil 4.22 P. kurdica ve C. sativum bitkilerinin metanol ve/veya etanol özütlerinin (10 ng/ml, IC50 yaklaşık değer) HeLa serviks kanseri hücreleri sağ kalım potansiyeli üzerine etkisinin gösterilmesi. ................................................................................................ 113 Şekil 4.23 H. calycinum etanol özütünün doza, zamana bağlı olarak hücre canlılığına etkisi .......................................................................................... 114 Şekil 4.24 H. calcinum metanol bitki özütü doza bağlı olarak hücre canlılığına etkisi .......................................................................................... 114 Şekil 4.25 H. calycinum etanol ve metanol özütlerinin doza bağlı MCF-7 hücre canlılığına etkisi ................................................................................ 115 Şekil 4.26 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin uygulamalarının MCF-7 hücrelerinin proliferasyonuna etkileri ................. 116 Şekil 4.27 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin doza bağlı olarak HeLa serviks kanseri hücre canlılığına etkileri ....................... 117 Şekil 4.28 HeLa hücre hatlarının uygulama öncesi morfolojik görünümleri ve kontrol hücrelerinde hücre ölümünün PI boyaması ile gösterilmesi. ........................................................................... 118 xii Şekil 4.29 HeLa hücre dizilerine doza bağlı P. kurdica metanol özütü uygulamasıyla hücre ölümünün PI boyaması ile gösterilmesi. ................... 119 Şekil 4.30 HeLa serviks hücrelerinde bitki özütünün uygulanmasından önce DiOC6 boyama gerçekleştirilmesi. ..................................................... 120 Şekil 4.31 HeLa serviks kanseri hücrelerine uygulanan farklı dozlardaki P. kurdica metanol özütünün etkileri. ......................................................... 121 Şekil 4.32 Uygulama gerçekleştirilmemiş HeLa kontrol hücrelerinde DAPI boyamasının gösterimi ...................................................................... 122 Şekil 4.33 HeLa hücre dizilerine farklı dozlarda uygulanan P. kurdica metanol özütünün etkilerinin DAPI boyaması ile gösterimi ....................... 123 Şekil 4.34 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MCF-7 meme kanser hücrelerinin apoptotik hücre yolağına etkilerinin gösterilmesi ................................................................................................. 124 Şekil 4.35 MCF-7 meme kanser hücrelerinde H. calycinum metanol ve etanol özütlerinin uygulamasının mitokondri membran potansiyeline etkilerinin görüntüleri ........................................................... 124 Şekil 4.36 H. calycinum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme kanser hücrelerinde etkilerinin DAPI ile gösterilmesi (üst sıra 20X, alt sıra 40X) .......................................................................... 125 Şekil 4.37 PARP ve Kaspaz-9 parçalanmasının Western Blotlama yöntemi ile gösterimi................................................................................... 126 xiii ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Bazı serbest radikal türleri ........................................................................... 29 Çizelge 2.2 Organizmada bulunan temel antioksidan savunma sistemleri ..................... 40 Çizelge 2.3 Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar .......................................... 42 Çizelge 4.1 Çalışmada kullanılan bitki tür adları ve toplandığı yerler ........................... 70 Çizelge 4.2 Çalışmada kullanılan bitki türlerinin % verimlilikleri ................................. 71 Çizelge 4.3 C. sativum bitkisinin etanol özütünün kuyucuk yönteminde oluşturduğu zon çapları sonuçları .............................................................. 73 Çizelge 4.4 C. sativum bitkisinin metanol özütünün kuyucuk yönteminde oluşturduğu zon çapları sonuçları .............................................................. 74 Çizelge 4.5 L. albus bitkisinin etanol özütünün kuyucuk yönteminde oluşturduğu zon çapları sonuçları .................................................................................. 76 Çizelge 4.6 L. albus bitkisinin etanol özütünün MIC (mg/ml) değerleri ........................ 77 Çizelge 4.7 P. kurdica bitkisinin etanol özütünün oluşturduğu inhibisyon zonları ........ 79 Çizelge 4.8 P. kurdica bitkisinin metanol özütünün oluşturduğu inhibisyon zonları ..... 81 Çizelge 4.9 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MIC (mg/ml) değerleri ..................................................................................................... 82 Çizelge 4.10 T. spicata var. spicata bitkisinin etanol özütünün oluşturduğu inhibisyon zonları ...................................................................................... 84 Çizelge 4.11 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol özütlerinin oluşturduğu inhibisyon zonları ...................................................................................... 86 Çizelge 4.12 T. spicata var. spicata bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MIC (mg/ml) değerleri ....................................................................................... 88 Çizelge 4.13 H. calycinum bitkisinin etanol özütünün oluşturduğu inhibisyon zonları ........................................................................................................ 90 Çizelge 4.14 H. calycinum metanol özütlerinin oluşturduğu inhibisyon zonları ........... 92 Çizelge 4.15 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MIC değerleri....... 93 Çizelge 4.16 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri ...................................................................... 94 Çizelge 4.17 L. albus bitki özütlerinin IC50 değerleri ..................................................... 95 xiv Çizelge 4.18 C. sativum bitkisinin etanol özütlerinin % DPPH radikali süpürücü aktivtesi değerleri ....................................................................................... 96 Çizelge 4.19 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri ............ 97 Çizelge 4.20 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri........................................................................ 98 Çizelge 4.21 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri ........... 99 Çizelge 4.22 T. spicata var. spicata etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri .......................................................... 99 Çizelge 4.23 T. spicata var. spicata bitkisinini etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri ................................................................................................... 100 Çizelge 4.24 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri ........................................................ 101 Çizelge 4.25 H.calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri ....... 102 Çizelge 4.26 Çalışmada kullanılan bütün bitkilerin IC50 değerleri ............................... 102 Çizelge 4.27 Etanol ve metanol özütlerinin fenolik içerik tayini için UV-Vis spektrofotometrede 760 nm dalga boyunda elde edilen absorbans değerleri ................................................................................................... 103 Çizelge 4.28 Bitkilerin gallik asit eşdeğeri olan fenolik madde içerikleri .................... 104 Çizelge 4.29 Çeşitli dokularda ADA enzimi aktivitesi ................................................. 127 xv 1. GİRİŞ Geçmişten günümüze kadar insanlık için bitkiler hem besin hem de ilaç kaynakları olmuştur. Bazı tıp çevrelerince bitkilerin tıbbi yararlarının oransal büyüklüğü reddedilse de, insanoğlunun var olduğu günden bu yana vücudunda hissettiği herhangi bir rahatsızlıktan ötürü çare aradığı kapı doğa ve özellikle de bitkilerdir. “Alternatif Tıp” veya “Tamamlayıcı Tıp” olarak adlandırılan bu çare arayışı geçtiğimiz yüz yılda dikkate değer olup bitkiler üzerinde yapılan çalışmalara hız verilmiştir (Kulkarni 2000). Yüksek yapılı bitkiler, havadan, sudan ve minerallerden güneş enerjisiyle primer ve sekonder metabolitler üreten yenilenebilir biyokimyasal fabrikalardır. İnsanoğlu artan yiyecek, endüstriyel hammadde, ilaç, pestisit, çeşni ve esans gereksinimleri için bitkilere yönelmeye ve onları değiştirmeye başlamıştır. İlkel tarımcılıktan bu yana insanoğlu kendi ihtiyaçlarına yönelik olarak bitkileri kullanmıştır (Pauls 1995). Son 150 yıldır geliştirilen çok sayıdaki teknik ile tarımda da modern bilim kullanılmaya başlamıştır. Son 50 yıldır tarımdaki gelişim, genel olarak daha önce değinilen “Biyoteknoloji” nin özellikle “Bitki Doku Kültürü” ve “Genetik Mühendisliği”nin gelişimiyle desteklenmiştir. Bitkilerin yetiştirildiği çevre, bitki işlevi üzerinde çok güçlü bir etkiye sahiptir. Çevresel faktörler, bitkinin yaşam döngüsü boyunca tepki esnekliği sağlamak, gelişim programını hızla değiştirmek ve etkilemek için ipucu olarak kullanılmışlardır (Bowles ve Leyser 1994). Bitkiler bizim için karbonhidrat, yağ ve protein kaynağıdır. Ayrıca, bitkiler insanlar için besinsel öneminin dışında başta ilaç sanayi olmak üzere kimya, kozmetik ve zirai mücadele sektörlerinde de önemlidir. Bitkilerdeki sekonder metabolizma sonucu oluşan; alkaloidler, fenilpropanoidler, terpenoidler, kuinonesler ve steroidler gibi kimyasal maddelere de Sekonder Metabolitler ya da “Doğal Ürünler” denmiştir. Sekonder metabolitlerin öncül maddeleri genellikle primer metabolizmanın ürünlerinden ve ara maddelerinden sağlanır. Bitki hücresi mevcut karbonun hepsini primer aktiviteler için kullanmadığı zaman sekonder metabolitlerin oluşumunu teşvik eder (Collins-Pavao vd. 1996). Bitkilerde ilaç yapımında kullanılan kimyasal maddeleri oluşturan ham maddelerin bulunması çalışmaları bitkileri doğadan değil de doku kültür yöntemleri 1 kullanılarak üretim yapılması sonucu onları ekonomik açıdan daha cazip hale getirmiştir (Sökmen ve Gürel 2001). İlk yazılı tarih kaynaklarında, hastalıkların tedavisinde bitkilerden yiyecek veya çeşitli droglar hazırlayarak yararlandıkları belirtilmiştir. Bugün bile dünya nüfusunun % 64’ü bitkileri tedavi amaçlı kullanmaktadır (Sökmen ve Gürel 2001). Yaklaşık olarak 20.000 bitki türünün tıbbi olarak kullanıldığı tahmin edilmektedir (Phillipson 1990). Ülkemizde en yaygın drog türü bitki çayı olmuştur. Gelişmiş ülkelerde ise reçete ile satılan ilaçların %25’ini bitkilerden köken alan kimyasal maddeler oluşturmaktadır (Collin ve Edwards 1998). Bu kimyasal maddeler arasında alkaloidler, anti kanserojen aktiviteleri sebebiyle en önemlileridir. Kanser, dünya çapında en önemli ölümcül hastalıklardan biridir ve her yıl 6 milyondan fazla vaka rapor edilmektedir. Bitkiler aracılığı ile tıp alanında tedavi edici ilaçlar ve teşhis metotları; kanser gibi hastalıkların tedavisinde büyük mesafeler kat edilmesini sağlanmıştır (Kulkarni 2000). Son yıllarda bitkiler ve bitkilerin hastalık tedavisindeki rolü ile ilgili pek çok araştırma yapılmaktadır. Bu çalışmada Fabaceae familyasına ait Lupinus albus L, Lamiaceae Familyasına ait Phlomis L. kurdica RECH. FIL, Apiaceae/Umbelliferae familyasına ait Coriandrum sativum L, Lamiaceae (Labiatae) familyasına ait Tymbra spicata var. spicata L. ve Clusiaceae (Guttiferae) familyasına ait Hypericum calycinum L. bitkilerinin biyolojik aktivitelerini araştırmak amaçlanmıştır. Çalışılan bitkilerden Coriandrum sativum ve Lupinus albus bitkisinde tohumlar kullanılmış, Coriandrum sativum tohumları aktardan temin edilirken Lupinus albus tohumları araziden toplanmıştır. Bunun için bitkilerin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal, antioksidan ve sitotoksik etkileri incelenmiştir. Özütlerin 25, 50 ve 100 mg/ml konsantrasyondaki antimikrobiyal etkileri agar kuyucuk, antioksidan etkileri 2,2’-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) süpürücü aktivite ve Folin-Ciocalteu reaktifli fenolik içerik tayini yöntemleriyle araştırılmıştır. Özütlerin sitotoksik etkileri androjen bağımlı (LNCaP) ve androjen bağımsız prostat (DU145, PC3) meme (MCF-7) ve serviks kanseri (HeLa) hücre dizilerinde MTT (3-(4,5dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolyum bromid) yöntemiyle incelenmiştir. Hücre kültüründe yüksek sitotoksik etkili özüt/özütlerin kanser hücre dizileri üzerine farklı süredeki sağ kalımlarına bakılmıştır. Mevcut sitotoksik etkinin kanser hücrelerinde 2 apoptozu tetikleyip tetiklemediğini araştırmak amacıyla propidyum iyodür (PI), DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) 3’,3’diheksiloksakarbosiyanin iyodür (DiOC6) floresan boyama yöntemleri kullanılmıştır. Bunlara ilaveten Western Blotlama yöntemiyle apoptotik yolağın önemli biyomarkırları olan aktif poli (ADP riboz) polimeraz (PARP) ve kaspaz-9 proteinlerinin mevcudiyeti araştırılmıştır. Son olarak da en aktif bitki olan H. calycinum bitkisinin çeşitli dokularda Adenin Deaminaz Enzimi (ADA) üzerine etkisi incelenmiştir. 3 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Kanser Kanser, hücrenin büyümesi ve farklılaşmasını etkileyen mutasyonlar sonucu oluşan ölümcül bir hastalıktır. Kontrolsüz hücre büyümesi, farklılaşması ve anormal hücrenin yayılması şeklinde tarif edilebilir. Genlerde meydana gelen bir seri mutasyon sonucu kontrolsüz olarak bölünmeye uğrayan bir hücrenin meydana getirdiği primer tümör hücreleri pek çok farklı fenotipik özellikler kazanır. Bu değişimler tümör hücrelerinin kontrolsüz ve sınırsız olarak çoğalmalarına neden olur. Çevrelerinden bağımsız olarak yaşayabilen bu hücreler, başka dokulara hareket edebilme (metastaz) özellikleri nedeniyle diğer doku ve organlarının işlevlerini de etkilemektedirler. Bir kitle ya da tümör oluşumuna neden olan hücre çoğalmasına neoplazi denir. Neoplazinin kansere dönüşmesi kontrolsüz büyümesi ve metastaz özelliği sonucu ortaya çıkar. Tümörler metastaz yapmıyorlarsa iyi huylu tümör olarak adlandırılır (Hanahan ve Weinberg 2000). Kanser hücrelerini normal hücrelerden ayıran bir takım özellikler vardır. Bunlar; Normal hücrelerdeki ihtiyaç halinde görülen hücre çoğalması, kanser hücrelerinde kontrolsüz ve ihtiyaç dahilinde olmaksızın gerçekleşmektedir Kanser hücresi, dokuya özgü olan yapısal özelliğini ve morfolojik yapısını kaybetmiş olup, normal hücrelere göre küçük ancak nükleusları daha büyüktür. Kanserleşen dokuda, bölünen hücrelerde normal farklılaşma gerçekleşmez. Kanserleşen hücrelerin arasında dokuya özgü temas inhibisyonu oluşmaz. Kanserleşen hücrelerde apoptoz mekanizması engellenmiştir. Kanserleşen hücrenin metabolizması değişmiştir. Genellikle şeker alınımı artmış ve anaerobik solunum oranı yükselmiştir. Kanserleşen hücrelerin enzimlerinde miktar ve işlev bakımından değişiklikler oluşur. Kanserleşen hücrenin antijenik özellikleri değişmiştir (Dilsiz 2009). 4 Kanserler, hücre tipine göre genellikle dört gruba ayrılmaktadır. Kanserin iki tipi olan lösemiler ve lenfomalar beyaz kan hücreleri olan lökosit ve lenfositlerin gereğinden fazla üremesinden dolayı oluşmaktadır. Sarkomalar, kas, kemik ve kıkırdak gibi embriyolojik mezodermden gelişen dokuların tümörleridir. Karsinomalar kanserlerin %85’ini oluşturmakta ve bunlar bezler, meme, deri ve ürogenital dokulardan (prostat, rahim ağzı gibi) köken almaktadır (Dilsiz 2009). 2008 yılında dünyada sıklıkla görülen kanserler Şekil 2.1’de verilmiştir (www.cancerresearchuk.org/cancer-info/ cancerstats /world/the-global-picture/). Şekil 2.1 2008 yılında sıklıkla görülen kanserlerin dünya haritasında gösterimi Sağlık Bakanlığınca hazırlanan bir raporda 2011 yılı içinde 110 bini erkek, 65 bini kadın olmak üzere 175 bin kanser vakası olduğunu belirtmiş ve coğrafik bölgelere göre sık rastlanan kanserleri Şekil 2.2’de görüldüğü gibi belirtmiştir. Verilere göre kadınlarda sık görülen kanserler; meme, tiroid, kolorektal, uterus korpusu, mide, akciğer, over, non-hodgkin lenfoma, beyin ve serviks kanserleriyken erkeklerde ise akciğer, prostat, mesane, kolorektal, mide, larinks, non-hodgkin lenfoma, pankreas, beyin ve böbrek olarak belirtilmiştir (http://www2.tbmm.gov.tr/d24/7/7-3626sgc.pdf 2012). 5 Şekil 2.2 Türkiye’de sık görülen kanserlerin bölgelere göre dağılımı Genetik anormallikler sonucu ortaya çıkan bu olaylar hücre çoğalması/ölümü dengesini bozduğu için dokunun hemostatik dengesini de bozmaktadır. Hücre döngüsü, apoptozis, DNA tamiri gibi anahtar rol oynayan mekanizmalardan sorumlu olan protoonkogen ve tümör baskılayıcı genlerde meydana gelen bir seri mutasyon kötü huylu fenotipin ortaya çıkmasına neden olur (Rohrbeck ve Borlak 2009). İlave olarak büyüme faktörleri ve reseptörleri, transkripsiyon faktörleri, mitojenik aktivite gibi önemli hücresel sinyal iletim basamaklarında oluşan bozuklukların da kanser oluşumunda ve ilerlemesinde önemli olduğu belirlenmiştir (Sanovic vd. 2009). Kanser tedavisi birçok zorluk içermektedir. Bunlardan en çok karşılaşılanı hücrelerin ilaca karşı savunma özellikleri kazanarak ilaç direnci oluşturması, kullanılan ilaçların normal hücreleri etkilemesi ve hücrelerin o bölgeden uzaklaştırılmasına rağmen kolayca metastaz yapabilme özellikleridir. Tedavi amacıyla kullanılan ilaçlar ya da radyoaktif ışınların hedefi direkt hücreler olup buradaki DNA’nın replikasyon özelliğine ket vurma yönündedir. Ancak bu tip tedavi uygulamalarının da kemik iliği işlevinin engellenmesi, mide bulantısı, kusma ve saç dökülmesi, vb. yan etkileri mevcuttur (Mesquita vd. 2009, Demirtaş vd. 2009). 6 2.2 Apoptozis Ökaryotik hücre döngüsü hücre büyümesi, DNA’nın iki katına çıkarılması ve iki katına çıkan kromozom ve hücre muhtevasının yavru hücrelere dağıtılmasından oluşur. Hücre muhtevasının iki katına çıktığı G1 fazı, DNA sentezinin yapıldığı S fazı, G2 fazı ve mitozun gerçekleştiği M fazından oluşur. Hücreler mitoza girmeden önce G2 fazında büyümeye ve içeriklerini artırmaya devam ederek bölünme için hazır hale gelirler. Hücre bölünmesi ile de birbiriyle aynı olan 2 yavru hücre meydana gelir (Johansson ve Persson 2008). Hücre döngüsünün düzenlenmesi, protein kinazların aktivasyonu hücre içi ifade düzeyleri büyüme faktör sinyalleri ve hücresel mekanizmalar tarafından düzenlenir (Pines 1995). Hücrelerin bir fazdan diğerine geçişinde anahtar rol oynayan düzenleyici proteinlere Siklin Bağımlı Kinazlar (CDK) denir. Şekil 2.3’de görüldüğü gibi farklı CDK’lar hücre döngüsünün farklı noktalarında farklı siklinlere bağlanarak döngünün ilerlemesini sağlarlar (http://journals.prous.com/journals/dof/ 20032809/html/ df280881/images/Kong_f1.gif). Bu proteinler çeşitli hücre döngüsü noktalarında aktive olan serin/treonin protein kinaz ailesine mensuptur (Pines 1995). CDK’lar sahip oldukları korunmuş PSTAIRE amino asit dizilerine sahiptir ve hedef aldıkları proteinlerde prolinden sonra gelen serin ve treonin amino asitlerinin fosforilasyonunu sağlarlar (Bernards 1999). Şekil 2.3 Hücre döngüsü ve siklin bağımlı kinazlar 7 Hücre döngüsü sürecinde CDK’ların aktiviteleri pekçok mekanizmaya bağlıdır. Bunlar; ilişkili oldukları siklinlerin hücre içi ifade düzeyleri, siklinleri aktive eden kinazların (CAK) fosforilasyon/defosforilasyonunda görevli fosfatazların aktivasyonu ve CDK inhibitörlerinin aktivasyonudur (Sherr ve Roberts 1999). Kültür ortamında 24 saatte bölünen insan hücreleri farklı evrelerde farklı sinyaller tarafından kontrol edilir. Hücre, kontrol noktalarından geçtikten sonra geri dönmez (Park ve Lee 2003). DNA hasarı ve/veya diğer kritik organel ve hücresel yapılarda meydana gelen bozulmalar hücre devrinin durmasına neden olur. Bu hatalar tamir edilmezse hücre ölümü devreye girer. Chk 2 ve ATM proteinleri tarafından fosforillenen bir transkripsiyon faktörü olan p53 miktarındaki artış sonucu hücre döngüsünü durduracak genlerin ifadesi olup, döngünün durması sağlanır. CDK inhibitörü olan p21, Waf1/Cip1 proteinlerinin programlı hücre ölümünü inhibe ettiği kadar indüklediği de belirlenmiştir (Jin vd. 2000). Apoptozis, hem fizyolojik hem de patolojik olarak istenmeyen, hasar görmüş ya da neoplastik hücrelerin yok edilmesi olarak tanımlanır. Doku homeostazisi, apoptoz ile hücre çoğalması (proliferasyon) dengesinin sağlıklı bir şekilde sürdürülmesine bağlıdır ve bu denge bozulmasının kansere neden olduğu gösterilmiştir (McPhie vd. 2003). Hücre çoğalmasının kontrolsüz bir şekilde artması ve apoptoz işlevinin azalması, karsinogeneze aracılık etmektedir (Pore vd. 2010). Hücre DNA’sında meydana gelen mutasyonlar kanser gelişimine neden olabilecekleri için bu hasarlı hücrelerin apoptoz yolu ile öldürülmesi önemlidir. Apoptoz kontrolünde önemli genler Bcl-2 ailesi ve kaspazlardır. Bcl-2 ailesinin bazı üyeleri apoptozu uyarırken (proapoptotik: Bax, Bad, Bid, Bcl-xs), diğer bazı üyeleri ise engeller (anti-apoptotik: Bcl-2, Bcl-xL). Hücrenin yaşayabilirlik durumu bu ailenin proapoptotik ve antiapoptotik üyelerinin oranına bağlıdır. Bunlar arasından da en fazla apoptotik değere sahip olanı Bcl-2/Bax’dir. Kaspazlar birbirlerini aktifleştirerek proteolitik bir kaskad oluştururlar. Başlatıcı kaspazlar olan kaspaz 2, 8, 9, 10, apoptotik uyarıyla başlayan ölüm sinyallerini alıp efektör kaspazlara iletirken, efektör kaspazlar olan kaspaz 3, 6, 7 de ilgili proteinleri (örneğin, hücre iskeleti proteinleri aktin veya fodrin, nükleer membran proteini lamin A, DNA fragmante edici faktör (DFF), poli-adenozin difosfat riboz-polimeraz (PARP), 8 endonükleaz G) parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine neden olurlar (Arisan vd. 2010.). Efektör kaspazlar tarafından etkisi yok edilen PARP, 89-25 kDa’luk fragmentlere parçalanabilen 116 kDa büyüklüğünde nüklear bir tamir enzimidir (Cha vd. 2004, Huerta vd. 2006). PARP’ın proteolitik parçalanması ilk olarak kemoterapi ile indüklenen apoptozda tanımlanmıştır (Rosenthal vd. 2001). Apoptoz, ekstrinsik ve intrinsik olmak üzere iki ana mekanizma aracılığıyla meydana gelmektedir. (i) Ekstrinsik yolakta apoptozis; Radyasyon, ilaçlar, çeşitli antijenler gibi hücre dışı uyaranlar TNF, Fas, nöron büyüme faktörü (NGF), IGF, IL–2 gibi maddelerin ortamda azalmasına neden olurlar. Bu ligandların hücre zarında bulunan ve hücre ölüm reseptörleri olarak bilinen Fas (diğer isimleriyle APO-1, CD95) ve tümör nekroz faktör reseptörü-1 (TNFR-1) ile etkileşime girmesi ile ekstrinsik apoptotik yolak uyarılır. Bu etkileşim sonucunda, TNFR-1’in sitoplazmik kısmında yer alan TNFR-1 ilişkili ölüm birimleri (TRADD) ve Fas ilişkili ölüm birimleri (FADD) aktifleştirilir. Bu aktivasyon önce kaspaz-8’in daha sonra da kaspaz-3’ü aktifleşmesine neden olur ve sonuçta aktif kaspaz-3, endonükleaz aktivitesine sahip olan DNA fragmante edici faktör (DFF)’ü parçalayarak DNA’da 50-300 kbp’lik parçalar oluşturur. DFF aracılığıyla fragmantasyona uğrayan DNA’yı içeren hücre ise, geri dönüşümsüz olarak apoptoza gider (Zhao vd. 2010, Hengartner 2000). (ii) İntrinsik yolakta apoptozis ise; radyasyon, DNA hasarı nedeniyle bir tümör baskılayıcı gen olan p53 aktifleştirilir. Hücre içinde ise viral-bakteriyel enfeksiyonlar, sitokinler, hücredeki kalsiyum miktarında artış gibi hücre içi uyaranlar tarafından uyarılır. Ayrıca sitotoksik antikanser ilaçları ve hipoksi gibi nekroz oluşturabilen etkenler de intrinsik yolak üzerinden apoptozu uyarabilir. Apoptozdaki bu mekanizma mitokondriye bağımlı olarak gerçekleşir. Apoptotik hücre içi sinyalin alınmasından sonra Bcl-2 ailesinin proapoptotik üyeleri olan Bax ve Bad proteinleri mitokondri membranında oligomerize olarak, mitokondri zarının iyon geçirgenliğini azaltır. Bu sayede mitokondriden; sitokrom c, ikincil mitokondri türevli kaspazlar/doğrudan apoptoz inhibitörünü bağlayıcı protein (Smac/DIABLO) ve apoptozis indükleyici faktör (AIF) gibi moleküller sitoplazmaya salınır. AIF, doğrudan çekirdeğe gider ve buradaki 9 endonükleaz G’yi aktive ederek DNA’da parçalanmaya neden olur. Smac/DIABLO, apoptoz inhibitör proteinine (IAP) bağlanarak kaspaz-9’un aktifliğini kaybetmesini engeller. Sitokrom c’nin ise mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesi ile apoptotik süreç geri dönülemez bir yola girer. Sitokrom c ilk önce bir sitoplazma proteini olan apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 (Apaf-1)’e daha sonra ise prokaspaz-9’a bağlanarak onlarla birlikte apoptozom denilen kompleksi oluştururlar. Oluşan bu kompleks önce kaspaz-9’u daha sonra da sırasıyla efektör kaspazlar olan kaspaz-7, kaspaz-3 ve kaspaz-6’yı aktive ederek, Lamin B, PARP ve endonükleaz G enzimlerini parçalar ve onları aktifleştirir. Sonuçta kromatin kondensasyonu ve DNA’nın parçalanması meydana gelerek hücre apoptoza gider (Şekil 2.4) (Hengartner 2000). Şekil 2.4 Apoptotik yolakların şematik olarak gösterilmesi Apoptotik hücre ölümünde, nekrotik ölüm denilen hücre ölümünden farklı bir süreç izlenmektedir ancak, bu hücre ölümünde, ölüm emri almış hücreler ile normal hücreler arasında morfolojik olarak ayrım zor yapılabilmektedir. Ölmek üzere komut almış hücrede yaklaşık olarak 2 saat sonra kromatin yoğunlaşmaya başlar, belirli bölgelerde sıkıştıkları izlenir ve hücrenin boyutları küçülmeye başlamıştır. İkinci saatin sonuna doğru apoptoz durumunda olan hücre, fragmente olmuş nükleusların ve parçalanan hücreye ait tüm yapıların plazma membranı ile kaplanarak immün sistemi enflamasyon 10 yönünde uyaran “apoptotik cisimcik” denilen daha küçük parçalara bölünür. Apoptotik cisimcikler, yüzeylerinde yeni sinyal yapıları ortaya çıkarır ve bu sinyalin uyarısı ile yanındaki hücre tarafından fagosite edilerek yaklaşık beş saat içinde ortadan kaldırılır. (Lipponen vd. 1994, Wyllie ve Currie 1980). Nekrotik ölümde ise çoğunlukla görülen bir hücre hasarı vardır. Hasar görmüş hücre şişererek, parçalanır. Hücre parçalandığında prostaglandinler, lökotrienler, serotonin, histamin gibi vazoaktif aminler uyarılarak hasara en yakın damar endotelini uyarır. Bu durum selektin yapımını uyarır. Selektin plazma membranının dış yüzeyine yapışırarak, lökositlerin burada yavaşlaması ve yapışmasını sağlar. Daha sonra integrin ligandları aynı hücre parçalanma ürünleri ile uyarılır ve lökositler hücre hasarının olduğu bölgeye doğru çekilmeye başlarlar. Bu süreç sonrasında iltihaplanma denilen kızarıklık, ödem ve ağrı ile tanımlanan enflamatuar reaksiyonlar başlar. Genellikle iskemi, hipertermi, hipoksi, litik viral enfeksiyonlar, toksik maddelerin yüksek konsantrasyonları ve şiddetli oksidatif stress gibi durumlarda nekroz görülürken, büyüme faktörü eksikliği, hücre yaşlanması, HIV, kanser ilaçları, radyasyon, yüksek doz glukokortikoid, Fas ve TNFR-1 reseptörlerinin aktivasyonu, sitotoksik T lenfositler ve çok şiddetli olmayan oksidatif stres gibi durumlarında ise apoptozis görülür (Raff 1992). Apoptozis, nekrozun tam tersine tamamen kontrollü ve programlı bir hücre ölümüdür. Apoptotik mekanizma uyarıldığında kaspazların etkisi ile PARP parçalanır ve DNA hasarı düzeltemez duruma gelir. Efektör kaspazlar tarafından etkisi yok edilen PARP, 89-25 kDa’luk fragmentlere parçalanabilen 116 kDa büyüklüğünde nüklear bir tamir enzimidir (Cha vd. 2004, Huerta vd. 2006). PARP’ın proteolitik parçalanması ilk olarak kemoterapi ile indüklenen apoptozda tanımlanmıştır (Rosenthal vd. 2001). Poly ADPribosylasyonu-(PADPr) DNA tamiri, replikasyon ve transkripsiyon gibi birçok süreçte yer alır. Poly ADP-ribolasyonu PARP-1 ile gerçekleştirilir. Apoptozis sırasında PARP-1 kaspaslar tarafından iki apoptotik fragmana ayrılmasıyla PARP-1 inaktive olur (Hirata vd. 1998, Nicholson ve Thomberry 1997). 11 Apoptozun belirlenmesinde kullanılan yöntemler, genel olarak 5 grupta ncelenebilmektedir; 1. Morfolojik Görüntüleme Yöntemleri: Işık Mikroskobu (Hematoksilen Boyama, Giemsa Boyama), Floresan Mikroskobu/Lazerli Konfokal Mikroskop, Elektron Mikroskobu, Faz Kontrast Mikroskobu 2. İmmunohistokimyasal Yöntemler: Anneksin V Yöntemi, Tunnel Yöntemi, M30 Yöntemi, Kaspaz 3 Yöntemi 3. Biyokimyasal yöntemler: Agoroz Jel Elektroforezi, Western Blot, Flow Sitometri 4. İmmunolojik Yöntemler: Elisa, Flourimetrik Yöntem 5. Moleküler Biyoloji Yöntemleri: DNA Microarrays (Ulukaya 2003). 2.3 Prostat Kanseri Erkek üreme yardımcı bezlerinden en büyüğü olan prostat, Şekil 2.5’de görüldüğü gibi mesane boynu ve üretranın ilk parçasını sarmaktadır (http://www.prostatitis3dcure.com/prostatitis.html, 2012). Buradan asit fosfotaz, fibrinolizin ve sitrik asit sentezlemektedir. Üretranın başlangıç kısmını oluşturan prostat bezi, tubuloalveolar bezden ve bu bezlerin arasını dolduran ara dokudan oluşmuştur. Yaklaşık olarak 3 cm yüksekliğinde, 4 cm genişliğinde ve 2 cm kalınlığında iri bir ceviz veya kestane büyüklüğünde olup, ağırlığı ise yaklaşık 18-20 g’dır (Arıcı 1993). Embriyonik hayatın on ikinci haftasında fetal testislerin ürettiği androjenik hormonların etkisiyle gelişmeye başlar (Balbay 2008). Prostat, bir glandular epitel ve bir de fibromusküler stroma kısımlarından oluşmaktadır. Her iki kısımda proliferasyon ve hücre ölümü dengeli bir seviyede gitmektedir. 1980’lerde yapılan bir çalışma sonucunda prostatın anatomik olarak periferal zon ve santral zondan oluştuğu tespit edilmiştir (Schulz vd. 2003). Prostat bezi doğumda küçük olup, puberteyle birlikte aniden büyür, 40 yaşından sonra da düzenli olarak büyümeye başlamaktadır (Erkoçak 1982, Tekelioğlu 1984). Prostatın içinde 3 tip bez vardır. En içte yer alan ve mukus salgılayan Mukozal Bezler, ortada yer alan Submukozal Bezler 12 ve bezin dış kısmında yer alan Esas Prostatik Bezler olarak isimlendirilir. Prostat salgısının büyük kısmını oluştururlar. Kanser genellikle bu bezlerden gelişmektedir (Tekelioğlu 1984, Drake 2005). Şekil 2.5 Erkek üreme sisteminin anatomisi Prostat kanseri diğer kanserlerde olduğu gibi tümör özelliği kazanan hücrelerin kontrolsüz olarak çoğalmasıyla meydana gelmektedir ve prostat bezinde çoğunlukla adenokarsinoma olarak ortaya çıkan, heterojen ve genellikle çok odaklı olarak seyreden 50 yaş ve üzeri erkeklerin hastalığıdır (Foster vd. 2000, Kosova ve Arı 2011). Son dönemlerde yapılan kabul görmüş deneysel, epidemiyolojik ve klinik çalışmalar sonucunda dünyada erkeklerde kanserden ölüm oranı olarak akciğer kanserinden sonra ikinci sırayı prostat kanseri almaktadır (Jemal vd. 2008). Amerika’da en sık görülen kanser türü 2007 yılından bu yana prostat kanseridir (Şekil 2.6). Amerika Birleşik Devletleri’nde 2011 yılında kanser tanısı konan erkek hastalar içerisinde, prostat kanseri hastalarının % 33’lük kısmı oluşturacağı tahmin edilmektedir (Jemal vd. 2008). Türkiye de Sağlık Bakanlığı Kanserle Mücadele Derneği tarafından yapılan araştırmalara göre erkeklerde kanser görülme sıklığı yüz binde 110’dur. Ülkemizde ise en sık tanı konan altıncı kanserdir (Polat vd. 2009). 13 Şekil 2.6 2007 yılında ABD’ de yaşayan erkeklerde kansere yakalanma verileri Tam olarak bilinmemekle beraber prostat kanserinin oluşumu ve gelişiminde etnik ve çevresel özellikler, hayat tarzı, genetik özellikler, yaş, metabolizma bozuklukları, viral ve bakteriyel enfeksiyonlar gibi çeşitli risk faktörleri belirlenmiştir (William vd. 2003). Yapılan çalışmalar ile prostat kanserinin oluşumu ve ilerlemesinde oksidatif stresin de rolü olduğu kanıtlanmıştır (Khandrika vd. 2009). Prostat kanserlerinin oluşma nedenleri kalıtsal, ailesel ve kendiliğinden olmak üzere üç grupta incelenebilir. En fazla görülen %85 oranı ile kendiliğinden prostat kanserine yakalanma olup, bunu %10-15 oranıyla aile hikayesi olan vakalar takip etmektedir (Carter vd. 1992, Bratt 2002). Prostat kanseri olma ihtimalinin yaş ile doğru orantılı olduğu kaydedilmiştir. 39 yaşın altındaki erkeklerde görülme sıklığı 1/10.000, 40-50 yaş aralığında 1/139 ve 60-79 arasında bu sıklık 1/8 olarak bulunmuştur (Stephenson vd. 1995). Diyetle yüksek oranda yağ alımının prostat kanserine yakalanma sıklığını arttırdığı düşünülmektedir. Bu hipoteze göre; diyetle alınan fazla miktarda yağ, seks hormonlarının sentezini arttırmakta bu da prostat bezinde kanser riskini artırmaktadır. Bu hipotez sadece yağlar için değil aynı zamanda, yağda eriyen vitaminler (A, D, K) ve eser elementler (çinko) için de geçerlidir. Ayrıca yüksek kalsiyum tüketiminin prostat 14 kanseri riskinde artışla ilişkili olduğu bulunmuştur (Huncharek vd. 2008). Likopen, selenyum ve E-vitamininin antioksidan etkileri sebebiyle kanserde potansiyel bir negatif faktör olduklarına dair çeşitli veriler mevcuttur (Thompson vd. 2009). Irklara göre prostat kanseri görülme sıklığında büyük farklar mevcuttur. Klinik prostat kanseri görülme sıklığı Uzakdoğulu erkeklerde en düşük, İskandinav erkeklerinde ise en yüksektir. Ayrıca, siyah ırka mensup erkeklerde prostat kanseri görülme sıklığı ve ölüm oranının beyaz ırka mensup olanlara göre daha yüksek olduğu bilinmektedir. Irklar arasında gözlenen bu değişikliğin nedeninin, androjen metabolizmasındaki farklılıklar ve diyet/yaşam tarzı ile kuvvetlice ilişkili olduğu öne sürülmektedir (Carter vd. 1993, Ferris vd. 2011). Prostat kanseri riskinin ailevi olarak arttığı gösterilmiştir. Babalarında ya da erkek kardeşlerinde prostat kanseri saptanan erkelerin bu kansere yakalanma risklerinin normal popülasyona göre daha fazla olduğu gösterilmiştir. Tüm prostat kanserlerinin % 9'unda ve 55 yaşın altındaki vakaların % 45 'inde yüksek olasılıklı otozomal dominant geçiş varlığı gösterilmiştir (Carter vd. 1993). Prostat kanserinin transformasyonuna neden olabilecek bazı yüksek riskli genler tanımlanmıştır. Bu şüpheli genler arasında; kromozom 1q24-25 üzerindeki HPC1 (Smith vd. 1996), Xq27-28’de yer alan (X’e bağlı geçiş ile) HPCX 17q21 üzerindeki BRCA (12) ve 13q12’de yer alan BRCA2 ve son dönemlerde 17p kromozomu üzerinde yer alan ELAC2/HPC2 bulunmaktadır (Rokman vd. 2001). Prostat bezinin büyümesi ve işlevi androjen hormonunun özellikle de androjen türlerinden biri olan testosteron hormonunun kontrolü altındadır. Bu hormonun % 95’i testisten % 5’i ise, adrenal bezlerden salgılanır. Her iki organ da hipotalamus ile hipofiz bezinin kontrolü altındadır. Dolaşımdaki testosteronun % 97’si, testosteron-östradiol bağlayan globülin (TeBG)’e bağlanır. Yaklaşık % 3’ü ise, bağlanmayıp serbest olarak bulunur. Serbest testosteron pasif olarak prostat hücrelerine girerek 5-α redüktaz enzimi ile dihidrotestosteron (DHT)’a dönüşür. DHT ise, sitoplazmada androjen reseptörlerine (AR) bağlanır, hücre çekirdeği içine girerek mRNA seviyesinin bunun sonucu olarak da 15 protein sentezinin artışı ile hücrenin büyümesine sebep olur (Şekil 2.7) (Lonergan vd 2011). Şekil 2.7 Prostat hücrelerinde androjen sinyaline bağlı olarak androjene cevap genlerinin anlatımında meydana gelen değişimlerin şematik olarak gösterilmesi AR yoğunluğundaki artış, AR geninde bazı mutasyonlara yol açar. Bu mutasyonlar arasında en çok rastlanılan nokta mutasyonlarıdır. Bu sayede AR, sadece androjen tarafından değil çok sayıda steroid tarafından aktive edilebilir hale gelir. Yapılan çalışmalar androjenlerin ortamda bulunmadıkları durumlarda estradiol, vitamin D, insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) gibi androjenik olmayan faktörlerin de androjenik etkiyi başlattıklarını göstermektedir (Schmidt ve Tindall 2011). AR nokta mutasyonları erken evre prostat kanserlerinde sık değildir. Buna karşılık daha çok ileri evre olan metastatik olgularda % 21 oranında saptanmıştır (Wu vd. 2009). 1979’ da ilk kez ortaya konulan Prostat Spesifik Antijen (PSA), 1980’ lerden bugüne artan sıklıkla kullanılmaktadır. PSA; prostat tanı, evreleme ve takibi için en yararlı tümör belirleyicidir. Serum PSA seviyesi, prostat kanserine özgün olmamakla birlikte, 16 patolojik evre ve tümör hacmi hakkında fikir vermektedir (Partin vd.1993, Polascik vd. 1999). PTEN (fosfataz ve tensin homologları) 10q23 kromozomal bölgede yer alan bir tümör baskılayıcı gendir. Prostat kanserinde oldukça sık karşılaşılan PTEN mutasyonu sonucunda aşırı derecede aktive olan Akt, kuvvetli bir antiapoptotik protein olan Bcl-2 ve Bcl-xL’nin etkilerinin artmasına, intrinsik yolun önemli bileşeni olan kaspaz-9’un da inhibe olmasına neden olur. İntrinsik yoldaki etkilerine ilaveten PTEN normal şartlar altında hücrelerin, membranda bulunan ölüm reseptörlerine olan hassasiyetlerini artırarak ektrinsik yolaktan apoptoza gitmesine de aracılık eder. Ayrıca prostat kanserinde sık gözlenen diğer bir durum olan p53 mutasyonu sonucunda da, Bcl-2 protein ailesinin önemli pro-apoptotik proteinleri olan Bax ve Bad mitokondri membranında oligomerize olamazlar ve mitokondriden sitokrom c salınamaz. Yapılan çalışmalar, apoptoz kontrolünde kilit rol oynayan Bcl-2’nin aşırı ifade edilmesi sonucunda androjen bağımlı olan prostat kanser hücrelerinin, agresif tip olan androjen bağımsız forma dönüştüğünü ve bunun da kanserin prognozunu daha da kötüleştirdiğini göstermiştir (Papadopoulou vd. 2008). Bcl-2 aşırı ifadesinin erken evre tümörlerde de görülebilmesine karşın ileri evre prostat kanserlerinde ifade artışı çok daha sık saptanır (Dvorackova vd. 2006). Genel olarak insan tümörlerinde kaspazlarda mutasyon çok sık rastlanılan bir durum değildir, ancak aktivite kaybına oldukça sık rastlanılır. Prostat kanseri hücrelerinde kaspaz-1, 3 ve 9 ile yapılan bir çalışmada, kaspaz-9’un aksine özellikle kaspaz-1 ve 3 aktivitelerinin anlamlı derecede azaldığı gösterilmiştir (Winter vd. 2001). Oliaminlerin ilk olarak insan semeninde gösterilmiştir. Bunun yanında en yüksek PA seviyesi prostat bezindedir (Schipper vd. 2003). Prostat bezinin büyümesi ve fonksiyon kazanmasını erkeklerde 2. eşey karakterlerini de belirleyen ise daha önce de belirtildiği gibi androjendir. Testosteronun bir diğer düzenlemesi ise prostatik hücrelerde poliamin üretimidir. ODC, S-adenilmetiyonin dekarboksilaz ve Spermidin sentaz (SpdS) androjen tarafından indüklenir. ODC genindeki çalışmalar, ODC promotorünün androjen cevap element (ARE) benzeri bir dizi içerdiğini göstermiştir (Crozat vd. 1992). Ayrıca spermin seviyesinin fazla olması, ilk aşamada prostatik kanser hücrelerinin büyümesini 17 engeller. Bu, prostat kanserinin ilk aşamalarda neden yavaş ilerlediğini açıklayabilir. ODC’nin apoptozdaki rolü tam bilinmemekle birlikte yapılan araştırmalarda seviyesinin sabit kalması, artması ya da azalmasının, kullanılan hücre sistemlerine ve uyarılan apoptotik faktörlere bağlı olduğu gösterilmiştir (Schipper vd. 2000). 2.4 Meme Kanseri Ter bezlerinin gelişmiş hali olan meme bezleri embriyolojik hayatta, aksiller bölgeden inguinal bölgeye uzanan süt çizgileri üzerinde gelişir. Bu gelişim safhasından sonra postnatal dönemde erkeklerde de çok az da olsa gelişim görülür ancak sonrasında gelişme gözlenmez. Kadınlarda ise, gelişim hormonlar tarafından düzenlenir (Topuz vd. 2003) Şekil 2.8 Meme ve bölümleri Her meme “lob” adı verilen 15-20 bölümden oluşmuştur. Loblar ise, daha küçük alt bölümleri olan “lobül”lere sahiptir. Her bir lobülde bulunan bezden süt salgılanmaktadır. Loblar, lobüller ve süt salgı bezleri “duktus’’ denilen ince tüplerle birbirine bağlıdır. Şekil 2.8’de görüleceği gibi bu tüpler meme dokusunun ortasında 18 bulunan meme başına ‘’areola’’ ya ulaşır (http://www.nlm.nih.gov/ medlineplus/ ency/ imagepages/17084.htm, 2011). Lobüller ve duktusların çevresini yağ dokusu ile sarar. Meme dokusu içinde kas bulunmaz. Kas dokusu, meme dokusunun hemen altında yer alır ve kaburgaların üzerini sarmaktadır. Tüm dokularda olduğu gibi memelerin de kendilerine ait kan ve lenf damarları bulunmaktadır. Lenf bezleri kümeler halinde koltuk altında ‘’aksilla’’ da kümelenmişlerdir (Apaydın 2003). Meme dokusu 20 yaşında gelişimin doruğundadır ancak tam olgunluk gebelik döneminde gözlenir. 40 yaş civarında memede atrofik değişiklikler başlar. Her menstrual dönemde, over hormonlarının düzeyine bağlı olarak meme dokusunda yapısal değişiklikler olur. Menopoz döneminde ise hormon düzeylerindeki değişimler ile meme dokusunun bez dokusu azalıp involüsyona uğrar ve yerini yağ ve bağ dokusuna bırakır (Topuz vd. 2003). Meme kanseri dünyada kadınlar arasında en fazla görülen kötü huylu tümör olup, kadınlarda görülen tüm kanserlerin %30’unu oluşturmaktadır (Greenlee vd. 2000). Meme kanseri 30 yaşından önce nadir olup, bu yaşı takip eden yıllarda hızlı bir artış gösterir; menopoz dönemindeki hafif bir azalmayı takiben de menopoz sonrası yıllarda yavaş bir eğilimle sürekli artar (Hoover 1996). İnsanlarda meme kanserinin nedenleri bilinmemektedir. Genetik, çevresel, hormonal, sosyobiyolojik ve psikolojik etkenlerin oluşumunda etkili olduğu kabul edilmekle birlikte, meme kanserli kadınların %70-80’ inde bu risk faktörlerine rastlanmamıştır (Tannock ve Hill 1992). Meme kanserinde ailesel yatkınlık ilk olarak 1866 yılında Paul Broca tarafından kendi eşinin ailesinde dört nesil süresince 24 kadının 10’unda meme kanserinin ortaya çıkışı sonrasında ileri sürülmüştür (Lynch vd. 1976). Daha sonrasında meme kanserli bir kişinin annesinde toplumdaki kadınlara göre meme kanseri gelişme ihtimalinin 2 kat fazla, kız kardeşinin ise 2,5 kat fazla olduğu gösterilmiştir. Meme kanseri aile hikâyesi olan kişilerde meme kanserinin ortaya çıkma yaşı daha erken olup, bilateral olma eğilimindedir ve özellikle annesinde meme kanseri bulunanlarda daha da belirgindir (Anderson 1974, Ottman vd. 1983). 19 Memede gerçekleşen endokrin etkenler büyük öneme sahiptir. Östrojene maruz kalma açıkça meme kanseri etyolojisi ile ilişkilendirilmektedir. Progesteron ve östrojen hormonları tümör oluşumunu ve gelişimini uyarmaktadır. Prognostik olarak yol gösterici olarak kullanılmamakla beraber, östrojen reseptörü tayini 25 yılı aşkın bir süredir hormonal tedaviye cevap yeteneğini değerlendirmek amacıyla uygulanmaktadır. (Robinson ve Jordan 1987). BRCA1 (Breast Cancer Susceptibility Gene 1) ve BRCA2 (Breast Cancer Susceptibility Gene 2) kalıtsal meme kanserinin oluşumunda etkili en önemli iki tümör süpresör gendir. BRCA1 geni, kalıtsal meme kanserinde rol oynadığı tespit edilen ilk gendir. 17. kromozomun uzun bacağı (q) üzerinde yer almaktadır. BRCA1’deki mutasyonlar, over ve meme kanserine yatkınlık ile ilişkilidir ve bu yatkınlık otozomal dominant olarak kalıtılmaktadır. BRCA1 geninde, proteininin işlev kaybına neden olan çok fazla sayıda mutasyon tanımlanmıştır. Mutant bir BRCA1 geni taşıyan kadında 70 yıl içerisinde meme kanserine yakalanma riski oldukça yüksektir (Wooster vd. 1994, Gürtunç 2007). BRCA2 ise; 13. kromozomun üzerinde bulunan ve ön değerlendirmelere göre ailevi olgularda hastalığın ortaya çıkışında ve bilateral hastalıklarda kendini gösteren bir gendir. Bu geni BRCA1’den ayıran özelliği, over kanseri ile bir ilişkisinin olmayışıdır. BRCA2’de oluşan bir mutasyon sonucu meme kanseri görülme sıklığı %87 olarak hesaplanmıştır (Wooster vd. 1994) 2.5 Serviks Kanseri Uterusun vajinaya doğru çıkıntı yaptığı bölüm serviks olarak adlandırılmaktadır ve internal os aracılığıyla uterus ile devam eder. İnternal os serviks ile uterus arasındaki anatomik sınır olup, uterusun yapısal özelikleri bu noktada başlar. Serviks ile vajina arasındaki sınırı ise eksternal os sağlar. Tübüler bir organ olan serviks yetişkin bir kadında yaklaşık 3 cm uzunluğunda 2-2.5 cm çapındadır (Şekil 2.9) (www. sagliksitesi.biz/wp-content/ uploads /serviks.jpg). Gebelik ve doğumlar sonrası biçimi biraz değişerek çan benzeri bir görünüm alır. Serviks lümeni mukus salgılayan basit prizmatik epitelyum ile çevrelenmiştir. Bu bölgede epitelyum hücreleri arasında silli 20 prizmatik hücrelerinde bulunmaktadır. Bu hücreler silleri vasıtasıyla mukusu vajene doğru iterler (Berek 2004, Ayhan vd. 2008). Serviks kanseri, dünya genelinde kadın kanserleri arasında meme kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır. Serviks kanserinin oluşmasında pek çok faktör rol oynamaktadır ancak, hastalığın cinsel yaşamın başlamasıyla birlikte ortaya çıkması cinsel geçiş özelliğini ortaya çıkarmakla birlikte, ilk ilişki yaşının küçük olması, çoğul cinsel partner, düşük sosyoekonomik düzey, sigara alışkanlığı, ırk, diyetsel faktörler, kontrasepsiyon kullanımı, bağışıklık baskılanması, ve cinsel partnere ait özellikler olarak sayılabilir (Meland ve Flehinger 1973, Guijon vd. 1985). Şekil 2.9 Serviks ve bölümleri 1970’li yıllarda Zur Hausen, Human Papilloma Virüs (HPV) ile serviks kanseri arasında bağlantı olduğunu bildirmiştir. Günümüz mevcut verilerine göre servikal intraepitelyal neoplazilerin (CIN) oluşumunda, HPV enfeksiyonları önemli bir rol oynamaktadır (Bosch ve Munoz 1989, Wright ve Richart 1990) (Şekil 2.10) (www.servikskanseri. com/serviks_kanseri/ i/img_serviks_enfeksiyon.jpg, 2009). 21 Şekil 2.10 HPV enfeksiyonu ve serviks kanserine geçiş 2.6 Kanser ve Adenozin Deaminaz Enzimi 20. kromozomun uzun kolunun 12 ila 13. segmentleri arasındaki bölgeden kodlanan Adenozin deaminaz (ADA; E.C. 3.5.3.3, Adenozin aminohidrolaz) enzimi, hücrelerde yaşamsal rol oynar (Şekil 2.11) (http://www.rpi.edu/dept/bcbp/ molbiochem/MBWeb /mb2/part1/trna.htm). Karbon-oksijen, karbon-azot, karbon-karbon ve fosforik anhidrit bağını da içeren bazı bağların hidrolitik olarak koparılmasını katalizleyen enzimler sınıfına giren ADA, 1939 yılında Conway ve Cooke tarafından tam kan ve serumda bulunmuştur (Yüreğir 1988, Gözükara 1994, Goldberg 1965). Şekil 2.11 Adenin, adenozin ve adenozin monofosfat’ın kimyasal yapısı 22 Hücrenin sitoplazmasında lokalize olan ADA, pürin yıkım yolunun anahtar enzimi olup adenozin ve 2’ deoksiadenozinin sırasıyla inozin ve 2’deoksiinozine geri dönüşümsüz ve hidrolitik deaminasyonunu katalize eden bir enzimdir. Pürin nükleotitleri, 5’nukleaz enziminin etkisiyle fosfat gruplarını kaybederek adenozin monofosfata (AMP) dönüşmektedirler (Şekil 2.12). AMP, ya 5’nükleotidaz ile adenozine ya da AMP deaminaz ile deamine edilerek inozin monofosfata (IMP) dönüşmektedir. Daha sonra adenozin, ADA ile inozine, IMP ise 5’nükleotidaz tarafından inozine çevrilmektedir. İnozin, fosforilaz ile hipoksantini oluşturmaktadır. Pürin yıkım yolunun son aşamasında ise ksantin oksidaz, hipoksantini önce ksantine ve sonra da ksantini ürik asite oksitlemektedir (Şekil 2.12) (Gökbulut 2000). Reaksiyon için gerekli olan oksijen ile tepkimeler sonucunda süper oksit radikali (O2-) oluşmaktadır. Süper oksit radikalinin toksik etkisi süperoksit dismutaz ve katalaz enzimleri tarafından kaldırılmaktadır (Ottoway ve Apps 1984). Adenozin deaminaz enziminin izoenzimleri ile ilgili bugüne kadar pek çok çalışma yapılmıştır. Sim ve Maguire 1971 yılında yaptıkları çalışma ile ADA’ nın insan dokusunda molekül ağırlıklarına göre küçük ve büyük olmak üzere iki izoformunu bulmuşlardır. Schrader ve Stacy (1977) ise küçük formun büyük forma dönüşmesinin konversiyon faktörü veya dönüşüm faktörü adı verilen ADA bağlayıcı bir proteinle gerçekleştiğini göstermişlerdir. Starkey ve Ma’nın 1989, yılında yaptıkları çalışmalarda ise enzimin insan dokusunda 200 kiloDalton (kDa) ağırlığında A ve 35 kDa ağırlığında C olmak üzere iki formu olduğunu tespit etmişlerdir. C formu, A formuna 200 kDa ağırlığında olan dimerik bir protein varlığında dönüşmektedir. Aktif olan form C formudur ve monomerik bir yapı göstermektedir. Katalitik özellikler bakımından A ve C formları birbirine benzer (Ungerer vd. 1992). 23 Şekil 2.12 Adenozin yıkımı Bir başka çalışmada optimal pH, substrat özgüllüğü ve moleküler ağırlıklarına göre üç izoenzim tanımlanmıştır. Bunlar ADA-1, ADA-1+CP ve ADA-2 olarak adlandırılmıştır. Monomerik bir protein olan ADA-1’i kodlayan genin 20. kromozomda, ADA-2’nın ise ayrı bir protein olup geninin hangi kromozom tarafında yer aldığının bilinmediğini ve ADA-1+CP’nin bağlayıcı bir protein ile birleşen iki ADA-1 molekülünden oluştuğu, genlerinin 2. ve 6. kromozomlarda yer aldığı tespit edilmiştir (Veena 1996, Valdes vd. 1996). Bu izoenzim aktivitelerinin tayini için ortama, sadece ADA-1’i inhibe eden, ADA-2’yi inhibe etmeyen E.H.N.A. [erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine] ayıracı eklenir ve ölçüm yapılarak yalnızca ADA-2 aktivitesi, bu aktivitenin total ADA aktivitesinden çıkarılmasıyla da ADA-1 aktivitesi elde edilir. Vücut dokularındaki total ADA aktivitesi miktarı ile izoenzimlerinin aktivite oranları birbirinden farklıdır (Ungerer vd. 1992). T lenfositler ve monositler en yüksek total ADA aktivitesine sahip olan lenfositlerdir (Sullivan vd. 1997). Aktivite düzeyleri hücrenin mitojenik savunması sırasında arttığı için lenfositlerin ve monositlerin hücrenin proliferasyonu ve diferansiasyondan sorumlu olduğu, dolayısıyla ADA’nın hücre immünitesinde bir belirleyici faktör olabileceğine inanılmıştır. Hücrede immünite oluşturan çeşitli hastalıklarda serumda, romatoid artrit’te sinovyal sıvıda, tüberküloz meninjit’te beyin omirilik sıvısında yüksek ADA düzeyinin saptanması bu teoriyi desteklemektedir (Baganha vd. 1990, Ungerer vd. 1992, Carson ve Seegmiller 1976, Hovi vd. 1976, Hillebrand vd. 1996, Piras vd. 1982, Giusti 1974, Galanti vd. 1981) 24 Pürin yıkım yolunda 5’nükleotidaz enziminin AMP ve dAMP’nin defosforile etmesiyle adenozin ve 2’deoksiadenozin meydana gelmektedir (Seegmiller 1985). Adenozin deaminazın bir substratı olan adenozin, aynı zamanda hücrenin normal fonksiyonunu göstermesi için gerekli olan metilasyonun reaksiyonu sonucunda elde edilmektedir. Bu reaksiyonda, S-adenozil metiyonin (SAM), S adenozil metiyonin metil transferaz enzimi ile S-adenozil homosisteine (SAH) ve SAH hidrolaz ile homosistein ve adenozine dönüşmektedir (Şekil 2.13) (Ciliv vd. 1980, Kelems vd. 1985, Seegmiller 1985). Şekil 2.13 Homosisteinin ADA aracılığıyla inozine indirgenmesi. ADA eksikliği ile ortamda artan adenozin, SAH’ın yığılmasına neden olmakta ve bu yığılma SAH ile SAM’ın metilasyonu için rekabete girmesi ve yeteri kadar adenozinin bulunmamasına bağlı olarak metilasyon reaksiyonlarının durmasına neden olmaktadır. ADA eksikliği sonucunda ortamda artan diğer bir substrat olan 2’ deoksiadenozin, SAH hidrolazı inhibe eder ve metilasyon reaksiyonunu durdurmaktadır (Kellems vd. 1985). Adenozin, hücre içerisinde üç farklı metabolizma ile karşılaşır. Bunlardan birincisi SAH hidrolaz ile S-adenozil homosistein oluşumu, ikincisi adenozin kinaz ile adenozin monofostattan adenozintrifosfata ve üçüncüsü ise ADA ile inozine deaminasyonudur. Bu yollardan enzim substrat ilgisi en fazla olan birinci reaksiyon olup, ardından ikinci ve üçüncü reaksiyonlar gelmektedir. Bunun için adenozin konsantrasyonu düşük olduğunda adenozinin büyük kısmı ATP’ye fosforillenirken, adenozinin yüksek konsantrasyonunda inozine deaminasyonu görülmektedir. Substrat olarak 2’ deoksiadenozin kullanıldığında, iki alternatif metabolizma bulunmaktadır. Bunlardan 25 birincisi ADA ile deoksiinozin oluşturmak üzere deaminasyonu, ikincisi deoksiadenozin kinaz ile deoksiadenilik asite fosforilasyonudur. 2’deoksiadenozinin düşük konsantasyonunda 2’deoksiinozin oluşurken yüksek konsantrasyonunda dAMP meydana gelmektedir (Meyskens ve Williams 1971, Seegmiller 1985). İnsan dokularının hemen hepsinde bulunan ADA’nın majör fizyolojik rolü lenf nodları, dalak ve timus gibi lenfoid sistemin farklılaşması ve olgunlaşması ile ilgilidir. T hücrelerindeki ADA aktiviteleri B lenfositlerine göre daha yüksek olarak bulunduğundan ADA düzeyleri, T hücre aktivasyonunun ve hücresel immünitesinin özgün olmayan bir markırı olarak kabul edilmektedir (Cristalli vd. 2001). Artmış serum ADA aktivitesi hücresel immünitenin uyarıldığı tifo, bruselloz, akut pnömoni, tüberküloz, sarkoidoz, karaciğer hastalıkları, akut lösemi, çeşitli maligniteler ve romatoid artrit, Behçet Hastalığı gibi birçok otoimmün hastalıkların aktivasyon döneminde artış göstermektedir (Eroğlu vd. 2000) Adenozin yıkımının en önemli enzimi olan ADA ile ilgili yapılan çalışmalarda enzim aktivitesinin değişik tümörlerde, hatta peritümöral doku ve normal dokular arasında bile farklılık gösterdiği, bu nedenle ADA’nın erken tanısal test olarak kullanılabileceği düşünülmektedir (Meada vd. 1992, Öztürk vd. 1998). Pek çok araştırma ADA ile kanser arasında bir ilişkinin olduğunu göstermektedir. Biyolojik sıvılarda ve tümörlerde, farklı kanser gruplarında yapılan çalışmalar neticesinde yüksek ADA aktivitesi saptanmış, kemoterapi sonunda ise ADA aktivitesinin düşmüş olduğu bulunmuştur. T hücreli lösemili hastaların serumunda, gastrik kanserli hastaların gastrik sıvılarında ADA aktivitesi, kontrol gruplarına göre daha yüksek bulunmaktadır (Ballis 1985, Koizumi ve Ohkawara 1992, Namiot vd. 1994). ADA enziminin hücrede gerekli işlevini yerine getirebilmesi için en yüksek düzeyde bulunması gerekmektedir. ADA aktivitesi immun fonksiyonun değerlendirilmesinde bir kriter olmaktadır. Enzim aktivitesi immunitenin artığı durumlarda artmakta, immunitenin azaldığı durumlarda ise azalmaktadır (Valentine vd. 1977). Enzimin 26 eksikliği tek baz çifti mutasyonun sonucu olarak meydana gelmektedir (Donma ve Donma 1996). Lenfositlerde özellikle T lenfositlerinde yüksek aktivitede bulunan enzimin kalıtsal eksikliği, T ve B lenfositlerin fonksiyonlarının bozulması ile şiddetli kombine immun yetmezlik durumuna öncülük etmektedir (Chen vd. 1978). ADA, tüm memeli hücrelerde bulunmasına rağmen, enzim aktivitesi açısından dokuya özel fizyolojik farklılıklara sahiptir (Bondy vd. 1985). Adenozin yıkımının en önemli enzimi olan ADA ile ilgili yapılan çalışmalarda, enzim aktivitesinin değişik tümörlerde, hatta peritümöral doku ve normal dokular arasında bile farklılık gösterdiği bildirilmiştir. Bu nedenle ADA’nın erken tanısal test olarak kullanılabileceği düşünülmektedir (Öztürk vd. 1998). 2.7 Serbest Radikaller ve Antioksidanlar 2.8 Serbest Radikaller Bir atom veya molekül dış orbitallerinde bir veya daha fazla ortaklaşmamış (eşleşmemiş) elektron bulunduruyorsa “serbest radikal” olarak tanımlanır. Bu tip moleküller, ortaklaşmamış elektronlarından dolayı oldukça reaktiftirler (Halliwell ve Gutteridge 1985). Bağımsız olarak var olabilen bir tür olarak tanımlanırlar (Halliwell 1992). En basit serbest radikal hidrojen atomudur ve bir elektron ile bir protondan oluşmuştur. Serbest radikallerde eşleşmemiş elektron, atom veya molekülün üst kısmına konulan bir nokta (.) ile gösterilir. Çeşitli fiziksel etkenler ve kimyasal olaylar nedeniyle çevrede ve hücresel koşullarda sürekli bir radikal yapımı vardır. Serbest radikallerin oluşumu üç temel yol ile oluşur (Akkuş 1995, Onat vd. 2002): a) Kovalent Bağların Homolitik Kırılması: Kovalent bağın kopması sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalır. b) Normal Bir Molekülün Elektron Kaybetmesi: Radikal özelliği bulunmayan bir molekülden elektron kaybı sırasında dış orbitalinde eşleşmemiş elektron kalması ile 27 radikal formu oluşur. Örneğin, askorbik asit gibi hücresel antioksidanlar, radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formu oluşur. c) Normal bir moleküle tek bir elektron transferi ile: Radikal özelliği taşımayan bir moleküle tek elektron transferi ile dış orbitalinde eşleşmemiş elektron oluşuyorsa bu tür indirgenme radikal oluşumuna neden olabilir. Örneğin, moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi, radikal formu olan süperoksidi oluşturur. Pozitif yüklü, negatif yüklü veya nötral olabilen serbest radikaller, biyolojik sistemlerde en fazla elektron transferi sonucu oluşurlar. En önemli radikaller, serbest oksijen radikalleri olmakla beraber; C, azot, kükürt türevi olan radikaller ve inorganik moleküller de vardır (Akkuş 1995). 2.8.1 Reaktif oksijen türleri Oksijen bulunan bir ortamda, metabolik reaksiyonlar sonucunda fiziksel ve kimyasal etkenlerle oksijen radikalleri üretilir. Oksijen radikalleri biyolojik sistemlerde bulunan en önemli serbest radikallerdir. Okside edici etkileri olan hem oksijen türlerini hem de bazı radikal olmayan bileşikleri içeren ve Reaktif Oksijen Türleri (ROT) denilen bu oluşumlar, oksijen merkezli radikaller ve oksijen merkezli radikal olmayan türler olarak iki sınıfta toplanabilirler (Halliwell 2006). Oksijen merkezli radikaller; süperoksit anyon (O2˙ˉ), hidroksil radikali (OH˙), akloksil radikali (RO˙) ve peroksil radikali (ROO˙) iken oksijen merkezli radikal olmayanlar ise, hidrojen peroksit (H2O2) ve singlet oksijendir (1O2). Diğer reaktif türler ise, nitrik oksit (NO˙), nitrik dioksit (NO2.) ve peroksinitrit (OONO-) gibi azot türleridir (Çizelge 2.1) (Halliwel vd. 1995, Simon vd. 2000). 28 Çizelge 2.1 Bazı serbest radikal türleri Adı Formülü Tanımı Hidrojen atomu H• En basit serbest radikal. Süperoksit O2 •- Oksijen merkezli radikal, seçimli reaktif. • En fazla reaktif oksijen radikali. İnsan vücudundaki tüm moleküllere saldırır. Kükürt üzerinde eşleşmiş elektron bulunduran türlerin genel adı. Organik peroksitlerin yıkımı sırasında oluşan oksijen merkezli radikaller. Hidroksil OH Tiyil RS • Peroksil, RO2 • , Alkosil RO• Nitrik oksit NO • Azotdioksit NO2 • Hidrojen peroksit Singlet oksijen L- arginin amino asitinden in vivo koşullarda üretilir. NO • nun O2 ile reaksiyonundan oluşur. Kirli hava, sigara dumanında vb. bulunur. H2O2 Reaktivitesi en düşük, moleküler hasar yeteneği en düşük. O2 Oksijenin güçlü oksidatif formu Organizmalar, ekzojen ve endojen etkilere maruz kaldıklarında birçok reaktif oksijen türleri oluştururlar. Bu reaktif oksijen türlerinin homeostatik dengeyi bozduğu pek çok bilimsel çalışma ile ortaya konulmuştur (Halliwell 1999). Örneğin; hücre membranında bulunan çoklu doymamış yağ asitleri, ROT’lara duyarlı bileşenlerdir. ROT’lar, hücre içerisindeki yapısal ve işlevsel düzeni bozarlar ve bu hastalıklara yol açan anomaliler ile birlikte doğrudan sitotoksisiteye ve/veya dolaylı olarak da genotoksisiteye neden olmaktadır (Halliwell 1999). Yapılan klinik çalışmalar sonucunda serbest radikaller, protein, lipid, DNA ve nükleotid koenzimler gibi birçok biyolojik materyale zarar vererek aterosklerosis, vazospazm, kanser, travma, inme, astım, hiperoksi, artrit, kalp krizi, yaş pigmentleri, dermatit, kataraktogenez, retinal hasar, hepatit, karaciğer hasarı ve diş eti hastalıkları gibi birçok yaşla ilgili dejeneratif hastalığa neden olmaktadır (Cohen vd. 2000, Packer vd. 2001). Ancak aynı zamanda yararlı etkilerinin olduğu da bilinmektedir. Örneğin; in vivo olarak 29 bu reaktif oksijen türlerinin bazılarının enerji üretimi, nüklear transkripsiyon faktörlerin aktivasyonu, gen ifadesi ve fagositoz gibi mikrobiyal enfeksiyonlarla hedef tümör hücrelerine karşı koruyucu mekanizmalar olarak verilebilir (Halliwell 1997, Simon vd. 2000, Rathee vd. 2006). Reaktif oksijen türlerinin başlıca formları, oluşum yolları ve hücre üzerindeki etkileri şu şekilde özetlenebilir: 2.8.1.1 SüperOksit (O2–) radikali Hemen hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu süperoksit radikali oluşur. Süperoksit anyon radikal, diğer radikallere göre daha stabil olduğundan eşleşmemiş elektronu yerine, yükü ile tanımlanmaktadır. Süperoksit radikalinin, arterlerde (spazmı başlattığı) ve merkezi sinir sisteminde haberci bir molekül olarak görev yaptığı düşünülmüştür. Başlıca dört yol ile üretilmektedir (Halliwell ve Gutteridge 1985, Halliwell 1994): 1. Katekolaminler, hidrokinonlar, redükte flavinler, tiyoller, tetrahidrofolatlar gibi biyolojik moleküllerin aerobik ortamda otooksidasyonu sonucu süperoksit oluşur. Otooksidasyon, atmosferik oksijenin katalizlediği tipik bir serbest radikal zincir reaksiyonudur (Nawar 1996). Serbest radikallerin oksijenle reaksiyonu oldukça hızlıdır ve bu reaksiyonların başlangıcı için birçok mekanizma tanımlanmıştır. Özellikle çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) ve fosfolipidler otooksidasyona eğilimlidir. Otooksidasyonda ilk oluşan ana ürünlerin hidroperoksit (ROOH) ürünleri olduğu düşünülmektedir. Hidroperoksitlerin bir zincir reaksiyonunu başlatabilmesi için üç temel mekanizma önerilmektedir (Foote 1985). a) Hidroperoksit, zincir reaksiyonuna katılabilecek bir peroksi radikalini (ROO·) oluşturmak üzere bazı kaynaklardan gelen başlatıcı bir radikal (X·) ile reaksiyona girebilir. b) Hidroperoksit, bir metal iyonu veya farklı bir indirgenle alkoksi (RO·) radikalini veya daha az bir ihtimalle hidroksi (·OH) radikalini oluşturmak üzere indirgenebilir. 30 c) Diğer mekanizmalara göre daha az önemli olmakla birlikte, yüksek sıcaklıklardan daha ziyade oda sıcaklıklarında hidroperoksitteki O-O bağı parçalanarak alkoksi ve hidroksi radikallerine dönüşebilmektedir. 2. Aktive olmuş fagositik hücreler (nötrofiller, monositler, makrofajlar, eozinofiller), virüs veya bakteri aktifliğini gidermek için bol miktarda süperoksit üretirler. Fagositik hücrelerde membrana bağlı bir enzim kompleksi olan NADPH (Nikotinamid Adenin Dinükleotit Fosfat)’a bağımlı oksidaz, yüksek düzeyde O2●– üretimine neden olur (Nordberg ve Arner 2001). 3. Mitokondriyal enerji metabolizması sırasında oluşan elektron sızıntısı sonucu kullanılan oksijenin %1-3’ü süperoksit radikali yapımı ile sonlanır. Mitokondri dört elektronlu zincir reaksiyonlarını kullanır, oksijeni suya indirger ve enerji üretir. Mitokondride, zincir reaksiyonlarından kaçan bazı elektronlar, doğrudan oksijenle reaksiyona girer ve süperoksit anyonu oluşturur (Lee vd. 2004) 4. İndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu ile süperoksit meydana gelebilir. Demir (Fe) ve bakır (Cu) gibi geçiş metal iyonları da canlı sistemde serbest radikal oluşturan güçlü birer oksidatif katalist olarak görev yapmaktadırlar. Fe; oksidatif reaksiyonları teşvik etmede daha etkili bir metal iken, Cu katalizli reaksiyonlar henüz tam olarak aydınlatılamamıştır (Halliwell ve Gutteridge 1985). Biyolojik sistemlerde oksijen taşınması, ATP üretimi, DNA ve klorofil sentezi gibi önemli rollere sahip olan bu demirin serbest formları canlı hücrelerde toksik etki yapabilmektedir. Tüm canlı hücreler serbest demirin toksik etkisini yok eden ve demirin fazlasını toksik olmayan formlarda hücre içinde depolayan mekanizmalara sahip olmasına karşın, bu toksisite sonucunda oluşan aktif oksijen türleri lipid oksidasyonunu teşvik edebilmekte veya DNA moleküllerine saldırabilmektedir (Miller 1996). Hücresel koşullarda hem oksitleyici hem de indirgeyici olarak görev yapabilen süperoksit radikalinin önemi H2O2 kaynağı olmasından ve geçiş metal iyonlarının indirgeyicisi olmasından kaynaklanır. Örneğin; ferrisitokrom c ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve oksijene dönüşür. Epinefrin 31 oksidasyonunda ise oksidan olarak davranarak bir elektron alır ve H2O2’ye indirgenir (Akkuş 1995). 2.8.1.2 Hidrojen peroksit (H2O2) Yüksek derecede difüze olarak hücre membranlarından serbestçe geçebilen H2O2, moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması ya da süperoksidin bir elektron alması sonucu oluşur. H2O2, reaktif oksijen türleri arasındaki en az reaktif molekül olup, fizyolojik pH’da ve sıcaklıkta metal iyonlarının yokluğunda dengededir. Oksidasyon ve redüksiyon kapasitesi oldukça zayıftır (Lee vd. 2004). Bir radikal olmadığı halde bu sınıfın içinde yer almasının sebebi; geçiş metal iyonları varlığında, Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve daha çok hasar verici olan hidroksil radikaline dönüşmesidir. Serbest radikal biyokimyasında önemli rol oynar (Halliwell vd. 2000). Daha çok tiyol grupları ile reaksiyona girer. Canlı sistemlerde H2O2, HOCl, kloraminler ve süperoksit anyonu ile reaksiyona girdiğinde singlet oksijen oluştururlar (Lee vd 2004). 1) 2) Net O2▪-+ Fe3+ H2O2 + Fe2+ O2▪-+ H2O2 O2 + Fe2+ OH- + ▪OH + Fe3+ (Fenton reaksiyonu) O2 + OH- + ▪OH (Haber-Weiss reaksiyonu) Haber-Weiss reaksiyonu, süperoksitin doğrudan H2O2 ile reaksiyonudur. Reaksiyon katalizörsüz çok yavaş bir şekilde gerçekleşirken, demirin katalizörlüğünde hızlanır. Bu reaksiyonda önce ferri demir (Fe3+) süperoksit tarafından ferro demire (Fe2+) indirgenir. Sonra Fenton reaksiyonu ile H2O2’den ●OH ve -OH üretilir. Süperoksit radikallerinin lipid çözünürlükleri sınırlıyken, H2O2 lipitte çözünebilir ve oluşma yerlerinden uzakta olan ve Fe2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir (Halliwell vd. 2000). 32 2.8.1.3 Hidroksil radikali (·OH) Yarı ömrü 10-9 saniye olan hidroksil radikali, bilinen en toksik oksidandır. Lipidler, proteinler ve nukleik asitler dâhil tüm biyolojik molekülleri okside edebilir. Diğer reaktif oksijen türlerine kıyasla biyolojik sistemlere çok daha fazla zarar verebilir (Betteridge 2000). Hidroksil radikali, hidrojen peroksitten, proteinler veya diğer moleküllerle kompleks halinde bağlı bulunan metal iyonları (Fe2+ veya Cu+) aracılığıyla katalizlenen bir reaksiyonla oluşmaktadır. Bu reaksiyon, Fenton Reaksiyonu olarak bilinmektedir (Fridovich 1997, Nordberg ve Arner 2001). Hidroksil radikalleri yaşayan organizmalardaki her şeyle reaksiyona girebilirler. Genellikle, aromatik bileşikler veya karbon-karbon çifte bağlı bileşikler hidroksil radikalleri ile katılma reaksiyonuna uğrarlar ve sonuçta, hidroksillenmiş serbest radikaller oluşur (Korycka-Dahl ve Richardson 1978). Oluşan serbest radikaller ile oksijen reaksiyona girer ve diğer serbest radikalleri oluşturur. Hidroksil radikalleri, lipitlerle, polipeptitlerle, proteinlerle ve özellikle tiamin ve guanozin ile reaksiyona girer (Ashok ve Ali 1999). 2.8.1.4 Hipoklorik asit (HOCl) Doku makrofajları gibi fagositik özellikte olan hücreler, nötrofil, eozinofil gibi granülositler mikroorganizmaları öldürmek için klorlanmış oksidanlar üretebilir. HOCl, miyeloperoksidaz enzimi tarafından H2O2 ve Cl iyonunun birleşmesi sonucu oluşur. Dokularda hasar oluşturan güçlü bir oksidandır (Murray vd. 1996, Meram ve Aktaran 2002). H2O2 + Cl- + H+ HOCl + H2O 33 2.8.1.5 Peroksil ve alkoksil radikalleri Peroksil radikalleri (ROO˙)’ nin oluşumu, oksijenin alkil radikalleri (R˙) ile reaksiyonu ile gerçekleşir. Alkil peroksitlerin (ROOH) dekompozisyonu ise peroksil ve alkil radikalleri oluşumu ile sonuçlanır. Güçlü birer oksidasyon ajanı olan peroksil ve alkoksil radikalleri, redüksiyon potansiyelleri ile diğer moleküllerden hidrojen koparabilirler. Bazı peroksil radikalleri süperoksit anyonunun salınmasını durdurabilir ya da kendi aralarında reaksiyona girerek singlet oksijeni oluşturabilirler (Halliwell ve Gutteridge 1985). 2.8.1.6 Singlet oksijen (1O2) Oksijen elektronlarından bir tanesinin, enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesi sonucunda singlet oksijen oluşur. Yapısında eşleşmemiş elektron ihtiva etmeyen singlet oksijen, bu durumundan dolayı serbest radikal sınıfına dâhil edilmez ancak; dönme yönlerinin farklılığından dolayı oksijenin yüksek reaktif formudur ve oksijenden daha hızlı bir biyolojik moleküldür. Aldığı enerjiyi çevreye dalga enerjisi şeklinde verip oksijene geri dönebilir. Başlıca; pigmentlerin oksijenli ortamda ışığı absorblamasıyla, hidroperoksitlerin metaller varlığındaki yıkım tepkimelerinde, kendiliğinden dismutasyon tepkimeleri sırasında, prostoglandin endoperoksit sentaz, bazı sitokrom p450 tepkimeleri ile vücutta oluşabilir (Akkuş 1995). 2.8.2 Reaktif azot türleri 2.8.2.1 Nitrik oksit (NO) Küçük bir molekül olan nitrik oksit, bir tane eşleşmemiş elektron içerir ve bu yüzden bir radikaldir. NO biyolojik dokularda, özgün nitrik oksit sentetazlar (NOS) tarafından üretilir (Ghafourifar ve Cadenas 2005). Nörotransmisyon, kan basıncının düzenlenmesi, çeşitli korunma mekanizmaları, düz kasların gevşemesi ve bağışıklık sisteminin 34 düzenlenmesi gibi fizyolojik süreçlerde, oksidatif biyolojik sinyal molekülü olarak rol oynar. NO ve süperoksit anyon radikalinin damar durumunun belirleyicileri olarak birbirlerine zıt bir biçimde işlev gösterdikleri öne sürülmüştür. (Saran ve Bors 1994) Oldukça reaktif bir radikal olan NO’ nun sulu ortamdaki yarı ömrü birkaç saniyedir (yarı ömrü>15 saniye) (Bergendi vd. 1999). Oksijen derişiminin düşük olduğu ortamdaki dengesi daha iyidir. Yapılan bir çalışma ile yarı ömrü saniyeler boyutunda olan NO’nun bu özelliği ile in vivo hücredışı mesaj dönüştürücü olarak görev yapmak için yeterince dengede olan tek oksijen radikali olduğunu belirtmişlerdir (Saran ve Bors 1994). Sulu ve yağlı ortamlarda çözünürlüğü, sitoplazma ve plazma membranlarından kolaylıkla difüze olmasını sağlar (Chiueh 1999). NO, hücre dışında su ve oksijenle, nitrat ve nitrit anyonlarını oluşturmak üzere reaksiyona girer (Valko vd. 2007). Çeşitli yönlerden O2●– ile benzerlikler gösterse de, nitrik oksit serbest radikal ailesinin farklı bir üyesini temsil eder. Eşlenmemiş elektrona sahip olmasına rağmen çoğu molekülle reaksiyona girmez. Ancak bazı serbest radikallerle de kolayca reaksiyona girmekte ve bir nevi radikal süpürücü gibi işlev görerek az reaktif molekülleri üretirler. NO’nun hücre membranlarında lipid peroksidasyonunu engellediği gösterilmiştir (Rubbo vd. 2000). Reaktif azot türlerinin üretimi, onların nötralize edilmesini ve elimine edilmesini aşıyorsa, O2●– , NO ile paralel olarak yüksek miktarlarda üretilirse nitrozatif stres denilen durum meydana gelir. Nitrozatif stres sonucunda ise, nitrolizasyon reaksiyonlarına neden olur, bu reaksiyonlar da, proteinlerin yapısını değiştirerek fonksiyonlarını engeller (Klatt ve Lamas 2000). Peroksinitrit hızlıca CO2 ile etkileşime girerek oldukça reaktif peroksokarboksilat (ONOOCO2-) oluşturabilir veya proton alarak peroksonitroz asit olarak ya ·OH ve ·NO2 oluşturmak için hemolize uğrar ya da yeniden nitrat (NO3) oluşturur. Peroksinitritin bu reaksiyonlarının hızları, pH’a, sıcaklığa ve çevresel ortamda bulunan bileşenlerin tiplerine bağlıdır (Radi vd. 2001). 35 Bağışıklık sisteminin hücreleri, inflamatuvar süreçlerde, süperoksit anyon ile nitrik oksit oluşur ve nitrik oksit ve süperoksit anyon reaksiyona girer. Çok hızlı bir reaksiyon sonucunda oksidatif açıdan çok daha aktif bir molekül olan peroksinitrit anyonunu (ONOO-) oluşur (NO• + O2•−→ ONOO−). NO’nun toksisitesi süperoksit anyon ile birleşme yeteneği ile ilişkilidir. Peroksinitrit anyonu potansiyel bir oksidasyon ajanı olarak DNA’nın parçalanmasına ve lipit peroksidasyonuna neden olur (Şekil 2.14) (Carr vd. 2000) Şekil 2.14 Serbest radikallerin hücredeki etkileri 2.8.3 Serbest radikallerin etkileri Lipidler, serbest radikal etkilerinden en fazla etkilenen biyomoleküllerdir. Çoklu yağ asitleri birden çok çift bağ içermelerinden dolayı, serbest radikallerle kolayca etkileşime girerler (Halliwell 1993). Birçok serbest radikal, hücre membranındaki yağ asitleri ile kolayca reaksiyona girer ve sonucunda peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Lipid peroksidasyonuna ait reaksiyonlar, organizmada yer alan serbest radikallerin ·OH’ ın, membran yapısında bulunan çoklu doymamış yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir H atomu çıkarmasıyla başlar ve yağ asitleri bir radikal (L·) niteliği kazanır. Molekül içi düzenlemeler sonucunda daha kararlı yapılar olan konjuge dienler oluşur ve oksijen 36 ile birleşerek lipid peroksil radikalleri (LOO·) oluştururlar. LOO·, membran yapısındaki diğer çoklu doymamış yağ asitleri ile reaksiyona girerek yeni lipid radikallerinin (L·) oluşumuna yol açarlar ayrıca ortamda buluınan hidrojen atomları ile de lipid peroksitlere (LOOH) dönüşürler (Halliwell ve Gutteridge 1990). Bu oksidasyon reaksiyonu aterosklerotik plakların oluşumunun da nedeni olarak gösterilmektedir (Halliwell 1993). Lipid peroksidasyonunun sonlanma basamağı, aldehit ve diğer karbonil bileşikleri olarak yıkılmasıdır. Bu bileşikler de hücre düzeyinde metabolize edilir ve bu yolla hücrenin diğer bölümlerine de hasarı yayarlar. Lipid peroksidasyonu, membran yapısına doğrudan ve yıkımı sonrasında oluşturduğu reaktif aldehitlerle diğer hücre bileşenlerine dolaylı olarak zarar veren geri dönüşümsüz bir olaydır (Onat vd. 2002). LH + R· L· + O2 LOO▪ + LH LOOH L· + RH LOO· (lipid peroksit radikali) LOOH + L· LOO· ; LO· ; aldehitler Serbest radilallere karşı çoklu yağ asitlerine göre daha az duyarlıdır. Duyarlılık derecesi içerdikleri aminoasitlere göre farklılık gösterir. Bu farklılık doymamış bağ içermelerinden kaynaklanır. En kolay etkilenen amino asitler; sülfür veya selenyum içeren kalıntılardır (Van Der Vliet vd. 1994). Serbest radikaller, karbonhidratlar üzerine etkilerini özellikle polisakkarit depolimerizasyonu ve monosakkarit otooksidasyonu şeklinde gösterirler. Oksidasyon sonrası oluşan okzalaldehitler; DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstererek kanser ve yaşlanma olaylarında da rol oynarlar (Şekil 2.15) (Hawkins ve Davies 1998). 37 Şekil 2.15 Reaktif türlerin kanser gelişimini kolaylaştırmasına neden olan bazı yollar Organizmada normal yaşam sürecinde serbest radikaller üretilmekte ve yine normal bir süreç olan hücresel savunma mekanizmaları ile antioksidanlarca belirli bir dengede ortadan kaldırılırlar. Metabolize olan toksinler, aşırı oksijen derişimine maruz kalma, fagositik aktivasyondaki düzensizlikler, malnütrisyon sonucu diyetle antioksidan etkili bileşiklerin yetersiz alımı gibi sebeplerle bu dengenin serbest radikal üretimi tarafının artması yönünde bozulmasıyla “oksidatif stres” adı verilen durum ortaya çıkar. (Halliwell 1994). Birçok bilimsel çalışma ile ülseratif kolit (Dağlı vd. 1997), iskemi/reperfüzyon hasarı (Cruthirds vd. 2003, Taşçı vd. 1995), ateroskleroz (Halliwell ve Gutteridge 1985), yaşlanma (Hipkiss 2007), diabetes mellitus (Akkuş 1995), Alzheimer hastalığı; Parkinson hastalığı (Dauer ve Przedborski 2003), sigara kullanımı (Zalata vd. 2007, Kösecik vd. 2005) ve hava kirliliğinin (Tao vd. 2003) neden olduğu rahatsızlıklar ve KOAH (Bowler vd. 2004) gibi akciğer hastalıkları; çeşitli kanser türleri, felç, hipertansiyon, romatoit artrit ve multiple sklerosis gibi otoimmün hastalıklar, alerji, astım, inflamasyon, yaşlanmaya bağlı maküler hastalıklar ve katarakt (Anderson 2007, Halliwell 1994, Halliwell ve Gutteridge 2007) gibi rahatsızların ROT’ların neden olduğu gösterilmiştir. Reaktif oksijen türlerinin kimyasal modifikasyon etkisinden dolayı mutajenik oldukları gösterilmiştir (Marnett 2000). DNA serbest radikallerden kolay etkilenen hedeflerden 38 biridir. Aktive olmuş nötrofillerden salınan H2O2, hücre membranından kolayca geçerek hücre çekirdeğine ulaşır ve burada oluşan hidroksil radikali dört DNA bazıyla kolayca reaksiyona girerek baz modifikasyonlarına yol açar (Şekil 2.16) (Halliwell 1994). Şekil 2.16 Pürin ve pirimidin bazları üzerine ∙OH radikalinin etkisiyle oluşan ürünler DNA hasarı onarılmazsa hücre fonksiyon bozukluğuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. ROT etkisi ile replikasyon sırasında hatalı bir eşleme ve sonucunda da mutasyon olacaktır. Bu mekanizma oksidatif stres neticesinde kanser yatkınlığını kısmen açıklayabilmektedir (Mates vd. 1999). Bazı durumlarda görülen hücre ölümlerinin ROT aracılığıyla gerçekleştiği gerçeği ROT aracılı DNA hasarına bağlı olabilir (Nordberg ve Arner 2001). 2.9 Antioksidanlar Reaktif oksijen türlerinin oluşturduğu veya oluşturacağı hasarı önlemek için vücudun belirli savunma mekanizmaları vardır (Çizelge 2.2). Serbest radikalleri nötralize etmek için karşılıklı etkileşim halinde olan endergonik ve ekzergonik kaynaklı, çok çeşitli bileşiklere “antioksidan” denir (Rice-Evans 2001, Seven ve Candan 1996). Konsantrasyonları okside olabilen substratlara kıyasla düşüktür (Becker ve Nissen 2004). Okside olabilen substratların oksidasyonunu önleyen veya oksidasyon derecesini azaltan antioksidanlar, antikarsinojen olarak etki göstererek, hücreleri oksidatif hasardan 39 korurlar ve karsinojenezisin her safhasında baskılayıcı etki yapabilirler (Allen ve Tresini 2000) Antioksidanların normal hücreleri, serbest radikaller sonucu oluşanı hasarlanmadan koruduğu gibi, tümör hücrelerini de kanser tedavisi sonucu oluşan hasarlanmaya karşı aynı oranda koruduğu ileri sürülmektedir (Borek vd. 1986). Çizelge 2.2 Organizmada bulunan temel antioksidan savunma sistemleri Radikal Tutucular Enzimler Süperoksit dismutaz Katalaz Glutatyon peroksidaz Glutatyon redüktaz Glutatyon S transferaz Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz Metal İyonlarını Bağlayan roteinler Yağda Çözünenler Suda Çözünenler E vitamini C vitamini Ferritin β karoten Glutatyon Transferrin Bilirubin Ürikasit Laktoferrin Ubikinon Sistein Albumin Flavonoidler Mannitol Seruloplazmin Melatonin Miyoglobin Lipoik asit Antioksidanlar, oksidan maddelerin etkilerini dört mekanizma ile ortadan kaldırırlar 1. Temizleme etkisi: Mitokondriyal sitokrom oksidaz gibi bir enzim tarafından oksidan molekülleri zayıf bir moleküle çevirme şeklinde etki gösterirler. 2. Baskılama etkisi: Flavonoidler, α-tokoferol, askorbik asit, metiyonin, ürik asit, βkaroten, indirgenmiş glutatyon, mukus gibi, oksidanlara bir hidrojen aktararak etkisiz hale getirme şeklinde etki gösterirler. 3. Onarma etkisi: Nükleik asitler gibi SOR ile yıkılmış biyomolekülleri onarırlar. DNA onarım enzimleri ve metiyonin sülfoksit redüktaz bu gruba dâhil edilir. 4. Zincir koparma etkisi: Oksidanları bağlayarak fonksiyonlarını engelleme şeklinde olan bu etki hemoglobin, seruloplazmin ve E vitamini tarafından yapılır (Memişoğulları 2005). 40 Antioksidanların sınıflandırılması farklılık göstermektedir. Endojen kaynaklı (doğal) ve eksojen kaynaklı antioksidanlar olarak (Akkuş 1995) veya enzim ve enzim olmayan antioksidanlar (Seven ve Candan 1996) şeklinde sınıflandırmalar mevcuttur. Vücudumuzdaki antioksidan savunma sisteminde yer alan başlıca elemanlar ise; enzimler, metal iyonlarını bağlayan proteinler ve suda ve yağda çözünen radikal tutucularıdır (Percival 1998, Halliwell 1994). Antioksidan maddeleri hücre içi, hücre dışı ve gıda kaynaklı antioksidanlar olarak 3 grupta toplanırlar (Akkuş 1995); I-Endojen Antioksidanlar A-Enzim Yapıda Olanlar 1. Mitokondrial Sitokrom Oksidaz Sistemi 2. Süperoksid Dismutaz 3. Katalaz 4. Glutatyon peroksidaz, Glutatyon-S-Transferaz 5. Hidroperoksidaz B-Enzim Yapıda Olmayanlar 1. Lipid Fazda Bulunanlar: Tokoferol (E vitamini), Karoten 2. Sıvı Fazda (Sitozol veya kan plazmasında) bulunanlar: askorbik asit, ürat, melatonin, sistein, seruloplazmin, transferrin, laktoferrin, metionin, myoglobin, hemoglobin, ferritin, albumin, bilirübin, glutatyon, selenyum II-Ekzojen Antioksidanlar 1. Ksantin-oksidaz İnhibitörleri: allopurinol, oksipurinol, folik asit 2. NADPH Oksidaz inhibitörleri: adenozin, lokal anestetikler 3. Rekombinant Süperoksid Dismutaz 4. Endojen Antioksidan Aktiviteyi Arttıranlar: ebselen, asetilsistein 5. Diğer Enzimatik Olmayan Serbest Radikal Toplayıcıları: mannitol, albumin 6. Demir Redoks Döngüsünün inhibitörleri: desferroksamin, seruloplazmin 7. Sitokinler: Tümör Nekroz Faktör (TNF) ve IL-1 8. Demir ġelatörleri 41 III-Gıda antioksidanları 1. Butil Hidroksitoluen 2. Butil Hidroksianizon 3. Sodyum Benzoat 4. Fe-Süperoksid Dismutaz Reaktif ara ürünleri nötralize etmek için çeşitli lipofilik ve hidrofilik bir çok antioksidan mevcuttur (Çizelge 2.3) (Sorg 2004). Çizelge 2.3 Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar Antioksidan Süperoksit Faz Etki Hidrofilik O▪2’nin H2O2 ve O2’ye dismutasyonu Katalaz Hidrofilik H2O2’nin H2O ve O2’ye dismutasyonu Glutatyon Hidrofilik- peroksidaz lipofilik Glutatyon redüktaz Hidrofilik Okside glutatyonun indirgenmesi Hidrofilik R- OOH’nin GSH ile konjugasyonu Metallotieninler Hidrofilik Geçiş metalleri nötralizasyon Tiyoredoksinler Hidrofilik R-S-S-R’nin R-SH’a indirgenmesi dismutaz Glutatyon S transferaz R- OOH’nin R-OH indirgenmesi R-S-S-R’nin R-SH’a indirgenmesi, Serbest Glutatyon Hidrofilik radikal temizleyicisi, GSH-Px ve GST’nin kofaktörü Serbest radikal temizleyicisi, Tokoferol Ubikinon Lipofilik Askorbik asit Hidrofilik Serbest radikal temizleyicisi Karotenler Lipofilik O▪2 baskılayıcısı Tokoferol Lipofilik Selenyum absorbsiyonunu artırır Selenyum Amfifilik Tiyoredoksin, GSH-Px yapıtaşı kazanımı 42 2.9.1 Enzimler Serbest radikallere karşı hücrelerde savunma yapan bazı enzimler vardır (Şekil 2.17). Şekil 2.17 Oksidatif strese karşı enzimatik savunma mekanizmaları 2.9.1.1 Süperoksit dismutazlar (SOD) Serbest radikallere karşı organizmadaki ilk savunmayı gerçekleştiren süperoksit dismutazlar (SOD) keşfedilen ilk gerçek ROT metabolize edici enzimlerdir (McCord ve Fridovich 1969, Nordberg ve Arner 2001). Enzim; oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikalinin zararlı etkilerine karşı korumaktadır. Süperoksidlerin daha az toksik olan H2O2’ye dönüşümünü katalizlediği için SOD enzimi, H2O2 uzaklaştırıcı enzimlerle işbirliği içinde çalışır. Ökaryotik hücrelerde SOD’un, birincisi mitokondride lokalize olan Mn-SOD, ikicisi sitozolde lokalize olan CuZn-SOD ve üçüncüsü de Cu içeren ve plazmadaki süperoksit radikallerini metabolize eden vasküler endotele bağlı Cu-SOD olmak üç tipi bulunmaktadır (Young ve Woodside 2001). 2.9.1.2 Katalazlar Memeli hücrelerindeki subsellüler yerleşimleri peroksizomlarda olup, yapısında Fe+3 bulunduran her biri prostetik grup olan 4 hem grubundan oluşmuş bir hemoproteindir 43 (Guemori vd. 1991). Hidrojen peroksitin su ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizlemektedir: Elektron vericisi bir bileşiğin bulunduğu durumlarda peroksitatif aktivite gösterir (Murray vd. 1996, Onat vd. 2002). Bir antioksidan olan katalaz, H2O2 oluşum hızının düşük olduğu ya da yüksek konsantrasyonlarda Cu veya Fe iyonlarının katalizörlüğü ile Fenton reaksiyonu ile hidroksil radikalinin oluşumu riskini düşürmektedir (Fridovich 1999, Halliwell 1993). 2.9.1.3 Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Hücrede gerçekleşen H2O2’in detoksifikasyonunun esas sorumlusu GSH-Px’ dir. Görev olarak lipid peroksidasyonunun başlaması ve gelişmesini engellemek olan enzim, sitozolde bulunur. Memeli hücrelerinde, selenosistein içeren en az dört değişik GPx (GPx1–4) vardır. Enzim, eritrositlerde bulunan en güçlü antioksidandır. E vitamini eksikliği sebebiyle hasar gören eritrositleri membran hasarına karşı korur (Young ve Woodside 2001). 2.9.1.4 Glutatyon redüktaz (GSH-Red) Prostetik grubu flavin adenin dinükleotid (FAD) olan GSH-Red, sitozol ve mitokondride bulunan, glutatyonun indirgenme reaksiyonunda rol oynayan bir enzimdir (Halliwell 1994). Dimerik yapıda olan enzimin her bir alt birimi NADPH bağlayan alan, FAD bağlayan alan ve ara yüz alan olmak üzere 3 tane yapısal alan içerir. Reaksiyon sırasında elektronlar genellikle NADPH’ dan FAD’a transfer edilir. Daha sonra alt birimlerinde bulunan iki sistein arasındaki disülfit köprüsüne transfer edilerek okside glutatyona aktarılır (Gutteridge 1993). 44 2.9.1.5 Glutatyon S-transferaz (GST) Her biri iki alt birimden oluşmuş enzim, glutatyon ile toksik metabolitlerin konjugasyonunu katalizleyerek onların detoksifiye olmalarını sağlar (Van Haaften vd. 2001). Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahiptirler. Detoksifikasyon görevlerinin yanısıra hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı görevleri de mevcuttur. Metabolize edilemeyen lipofilik ya da hidrofilik olan birçok bileşiği bağlayarak, depo ve taşıma görevi yaparlar (Onat ve Emerk 1996). 2.9.2 Enzimatik olmayan antioksidanlar 2.9.2.1 E vitamini (α-tokoferol) Biyolojik membranlarda bulunan yağda çözünür bir vitamindir. Hücredeki antioksidan görevi, fenolik hidroksil grubundaki aromatik halkadan kaynaklanır (Akkuş 1995). Eşleşmemiş elektronlarla reaksiyona girebilen bir hidroksil grubu içerir (Chopra ve Thurnham 1999). Zincir kırıcı olarak görev yapan bir antioksidan olan E vitamini, membranlarda oksijen radikallerinin ana temizleyicisidir. Kolay bir şekilde membran fosfolipitlerine diffüze olarak, bu bileşikleri doymamış yağ asitlerine indirger ve serbest radikallerin membranlarda oluşturabileceği lipid peroksidasyonunu önler (Seven ve Candan 1996). 2.9.2.2 Karotenoidler Karotenoidler, α-tokoferol bittikten sonra kullanılan zayıf antioksidanlardır. Fotooksidatif süreçteki hasarlara karşı bitkileri koruyan ve bitkilerde yaygın şekilde bulunan doğal renk pigmentleridir (Stahl ve Sies 1999). En bilinen ve üzerinde en çok çalışılan A vitamininin metabolik ön maddesi olan ve radikal yakalayıcı olarak görev yapan β-karoten’dir. Singlet oksijeni baskılayarak, süperoksit radikallerini temizler ve oksijen oranının düşük olduğu durumlarda peroksit serbest radikallerinin dokulara hapsedilmesi yoluyla antioksidan etki gösterir (Cherubini vd. 2005). 45 2.9.2.3 Glutatyon (GSH) Suda kolayca çözünebilen, organizmanın tüm hücrelerinde bulunan glutamikasit-sisteinglisinden oluşan bir tripeptidtir. H2O2, disülfitler, askorbat ve serbest radikalleri indirgeyerek, hücreleri oksidatif hasara karşı korur. Özellikle eritrosit membranını H2O2’den, lökositleri fagositozda üretilen oksidan maddelerden ve lens proteinlerini oksidatif hasara karşı korur. Glutatyon, eritrositlerde bulunan hemoglobinin ve diğer proteinlerin tiyol gruplarını (-SH) indirgenmiş halde tutarak onları oksidasyona karşı korur. Böylece hemoglobinin methemoglobine dönüşümünü engeller, fonksiyonel protein ve enzimlerin de aktif kalmasını sağlar (Onat vd. 2002). 2.9.2.4 α-Lipoik asit Kükürt içeren, endojen bir antioksidan olan α-lipoik asit OH radikali ve H2O2’’i nötralize eder. Lipid ve sulu fazda serbest radikalleri giderir. Prooksidan metalleri şelatlayarak da antioksidan etkilerini gösterebilir (Percival 1998, Packer vd. 1995, Scott vd. 1994). 2.10 Çalışmada Kullanılan Bitkilerin Sistematiği ve Özellikleri 2.10.1 Lupinus albus L. Alem: Plantae Bölüm: Magnoliophyta (Kapalı Tohumlular) Takım: Fabales Familya: Fabaceae Alt familya: Faboideae Cins: Lupinus Tür: Lupinus albus Lüpen, Papilioneceae (Legumineceae; kelebek çiçekliler) familyasının Lupinus türüne dahil bir bitki olup, acıbakla, delice bakla, gavur baklası, kurt baklası, mısır baklası, 46 yahudi baklası, tirmis, termiye gibi değişik isimlerle bilinmektedir (Yorgancılar 1996). Lüpen genusu 300’den fazla tür içermektedir ancak bunlardan sadece dört tanesi tarımsal öneme sahiptir. Bunlar; Lupinus albus (ak lüpen), Lupinus angustifolius (mavi ya da dar yapraklı lüpen) ve Lupinus luteus (sarı lüpen), ve Lupinus mutabilis’dir. İlk üçü orijinini Akdeniz bölgesinden alırken L. mutabilis Güney Amerika orijinlidir (Hondelmann 1984). L. albus, 1 metreye kadar boylanabilen, otsu bir bitkidir. Yaprakları el şeklinde, 5-15 parçalı yapraklıdır. Bitkinin kelebek biçiminde beyaz çiçekleri vardır (Şekil 2.18) (http://www.fotonatura.org/ galerias/ fotos/333538/). Şekil 2.18 L. albus bitkisi ve tanesi Avrupa, Balkanlar ve Türkiye’de özellikle Marmara ve Ege bölgelerinde yabani olarak yetişir. Acı olan taneleri kullanılır. Bitki, sabit yağ ve lupinin, spartein gibi alkaloidler taşımaktadır. Olgun tohumları acıdır ve zehirli bileşikler taşırlar. Bunların uzaklaştırılması için acı bakla tohumları kaynar suda bir müddet tutulurlar. Sonra kabukları gevşer ve soyulup kullanılabileceği gibi tohumları kavrulup, değirmende çekilerek toz haline de getirilebilir. İdrar söktürücü, idrar arttırıcı ve idrar yollarını temizleme, böbrek iltahabı ve böbrek taşları ve böbrek kumları için faydalı olduğu düşünülmektedir (Anonim) 47 2.10.2 Coriandrum sativum L. Alem: Plantae Bölüm: Magnoliophyta Takım: Apiales Familya: Apiaceae Cins: : Coriandrum Tür: Coriandrum sativum Şekil 2.19 C. sativum bitkisi. Coriandrum sativum, çok amaçlı bitkilerden biri olup, tohumları M.Ö 1500 yıllarında eski Mısır’da gıda ve tıbbi amaçlarla kullanılmıştır (Hornok 1992). Yumuşak, tüysüz bir bitkidir. 50 cm boya ulaşabilir (Şekil 2.19). (www.henriettesherbal.com). Tek yıllık bir bitki olan C. sativum Akdeniz Ülkelerinde doğal olarak yetişmektedir. Ülkemiz de Mardin, Gaziantep, Burdur, Erzurum, Denizli gibi şehirlerde, dünya da ise İtalya, Hindistan, Fas, Rusya, Macaristan, Amerika, Hindistan ve Japonya’da tarımı yapılmaktadır (Ceylan 1987, Hornok 1992). C. sativum kişniş, aşotu, kuzbere gibi isimlerle bilinen ve Umbelliferae familyasına ait bir çeşit baharat bitkisidir (Baytop 1994). Coriandrum L. cinsi Türkiye Florasında 2 tür (Davis 1984) ve 2 varyete (Zeybek 1994) ile temsil edilmektedir. 48 Yeşil herbaları sebze ve baharat olarak kullanılan kişnişin (Baytop 1994, Loaiza vd. 1997) asıl kullanılan kısmı meyveleridir. Meyveleri direk baharat olarak kullanıldığı gibi, meyvelerden çıkarılan uçucu yağ gıda, içki ve parfümeri sanayinde de kullanılmaktadır (Ceylan 1987, Doğan vd. 1987, Doğan ve Akgül 1987). Yenen meyveleri 3-5 mm çapında top şeklindedir. Kişniş bitkisinin baharatı küre biçimli sarımsı yeşilden, açık kahverengine kadar değişen renklerdeki meyvelerinin kurutulması ya da öğütülmesiyle elde edilir. Doğal olarak sadece Umbellifera familyası türlerinin sabit yağında bulunan petroselinik asit, kişnişte % 60-70 arasındadır (Bayrak ve Korkut 1995). Petroselinik asit, antimikrobial etkilerinden dolayı parfümeri ve gıda sanayinde geniş kullanım alanına sahiptir (Novak 1961). Bitki, ağrı kesici, sakinleştirici ve kuvvet verici, meyveleri infüsyon veya toz halinde ateş düşürücü, iştah açıcı, sindirim sistemini düzenleyici ve gaz giderici, laksatif, parazit düşürücü ve idrar sökücü özelliğe sahiptir (Baytop 1984, Doğan vd. 1984, Hornok 1992). 2.10.3 Phlomis L. kurdica RECH. FIL. Alem: Plantae Bölüm: Magnoliophyta Takım: Magnoliopsida Familya: Lamiaceae Cins: : Phlomis Tür: Phlomis kurdica Çok yıllık, salgı tüylü veya salgı tüysüz otsu bir bitki olan P. kurdica’nın gövdesi genellikle dallı, (18-)40-55(-65) cm uzunluklarında, dik veya nadiren yükselici, beyazımsı-sarımsı stellat-tomentos-lanat şeklindedir. Bozkır, mısır ve nadas tarlalarında yetişebilen bitkinin yüksekliği 340-2200 cm arasında değişmektedir (Huber-Morath 1982). Kromozom sayısı: 2n =20’dir. Haziran-Ağustos da çiçeklenen bir step bitkisidir. Bitkinin yayılış alanları Irak, İran, (http://www.senteursduquercy.com). 49 Lübnan ve Suriyedir (Şekil 2.20) Şekil 2.20 Phlomis kurdica bitkisi 2.10.4 Thymbra spicata L. var. spicata İnsanlar arasında yaygın olarak kullanılan, tarımı yapılan ve ticarete sunulan kekikler daha çok Origanum, Thymbra, Thymus ve Satureja cinsleridir. Kekik bitkisinin taksonomik kategorileri aşağıda yer almaktadır (Davis 1982). Bölüm : Spermatophyta Altbölüm : Angiospermae Sınıf : Dicotyledonae Altsınıf : Dialypetalae Takım : Tubiflorae Familya : Labiatae (Lamiaceae) Cins : Thymus, Coridothymus, Tymbra, Satureja, Origanum Tür : Thymbra spicata L. var. spicata Türkiye Lamiaceae familyasının önemli bir gen merkezi olup, familyaya ait 45 cins, 546 tür ve 731 takson bulunmaktadır. Türkiye’nin en zengin üçüncü familyası konumundadır (Başer 1993, Kocabaş ve Karaman 2001). Thymus genusun 60 taksona ait 39 türü bulunduğu ve endemizm oranının ise % 45 olduğu bildirilmektedir (Başer 2002). Tüm kekik türlerin ortak özelliği yüksek miktarda uçucu yağ içermeleri ve uçucu 50 yağın ana bileşenin karvakrol veya thymol olmasıdır. Bunlar kekiğin kendine özgü kokusunu veren maddelerdir (Başer vd. 1993). Dünyada, yıllık kekik ihracatı 10 bin ton dolayındadır. Yılda 7- 8 bin ton kekik ihraç eden Türkiye, dünyada en fazla kekik ihraç eden ülke konumundadır. Ayrıca, kekikten elde edilen 20 bin ton dolayında kekik yağı da ihraç edilmektedir (Başer 1997, Başer 2003, Özgüven vd. 2005). Kekiğin yağ altı suyu ise kekik suyu olarak adlandırılır. Bu suyun mide ve bağırsak rahatsızlıklarında olumlu etki yaptığı ve bağışıklık sistemini güçlendirdiği, safra miktarında artış sağlayarak sindirimi artırdığına yönelik görüşler bulunmaktadır (Aydın 1996). Kekik çay olarak kullanıldığında hazmettirici ve gaz giderici etki yaptığı, bileşimindeki fenolik asitler ve monoterpenik fenollerin antioksidan özellikte olduğu belirtilmektedir (Başer 2000). Kekik herbası %2 ila % 8 oranında uçucu yağ içerir. Karvakrol veya thymol gibi monoterpenik fenollerce zengin olan bu yağlar çok güçlü mikrop ve mantar öldürücü özelliğe sahiptir ve bu tür enfeksiyonlarda etkilidir (Kızıl ve Uyar 2005). Kekik yağının güçlü antimikrobiyal ve antifungal etkisinden dolayı halk arasında kullanılmaktadır. Kekik arılar için iyi bir polen kaynağı ve süt veren hayvanlar için de kaliteli bir ot kaynağı olup, kekikle beslenen arıların balı ve kekikle otlatılan hayvanların süt ürünleri kaliteli olur. Ayrıca karvakrolun güçlü ağrı kesici ve yara iyileştirici etkisinin olduğu bilimsel olarak kanıtlanmıştır (Aydın 1996) 50 cm kadar boylanabilen tüylü, pembe çiçekli, çalı görünümlü Thymbra spicata var. spicata (Karakekik - Zahter) çok yıllık otsu bir bitkidir (Şekil 2.21). Bileşiminde % 1.21.8 oranında uçucu yağ bulunmaktadır. Uçucu yağları içerisinde bilhassa karvakrol bulunmaktadır. İnfusyon halinde antiseptik ve uyarıcı etki yapmaktadır (Baytop 1984). 51 Şekil 2.21 Thymbra spicata var. spicata bitkisi. Doğu Akdeniz’de yetişen T. spicata var. spicata mevsimsel değişikliklere bağlı olarak uçucu yağın kimyasal yapısında meydana gelen değişmelerin incelediği çalışma ile mevsimsel değişikliklerin uçucu yağın kimyasal yapısı üzerinde etkili olduğu, fenolik bileşiklerin maksimum noktaya kademeli olarak çiçeklenmeden hemen sonraki (Haziran-Temmuz) dönemine kadar bir artış sağladığı tespit edilmiştir (Müller-Riebau vd. 1997). Türkiye’de ise hasat zamanları olarak çiçeklenme öncesi, tam çiçeklenme ve çiçeklenme sonrası dönemlerini ele aldıklarını, en yüksek, drog yaprak verimi (3.107 t/ha) ve uçucu yağ verimi (70.7 t/ha) tam çiçeklenme döneminde ve on santim biçim yüksekliğinden elde ettiklerini, uçucu yağ oranının % 1.58 ile 2.33 arasında değiştiğini, sonuç olarak kuru madde ve uçucu yağ verimi için en uygun hasat zamanının tam çiçeklenme dönemi ve biçim yüksekliğinin ise 10 cm’lik uygulamaların olduğu Tonçer ve Kızıl (2005) yaptıkları çalışma ile saptamışlardır. Kızıl ve Uyar (2005)’ ın yaptıkları çalışmada T. spicata var. spicata’dan elde edilen uçucu yağları GC yardımıyla analiz ettiklerini, uçucu yağın antibakteriyel ve antifungal etkisini test etmek için 4 bitki patojenine karşı farklı 3 konsantrasyonda (5, 10 ve 15 µg) ve farklı 3 inkübasyon süresince (24, 48 ve 72 saat) uygulama yaptıklarını, yapılan analiz T. spicata var. spicata (% 81)’da ana bileşenin ise karvakrol olduğunu, bitkinin hekzanlı özütü agar disk difüzyon yöntemi kullanarak antibakteriyel etkilerini test ettiklerini, test sonuçlarına göre tüm uçucu yağların Xanthomonas campestris pv. malvecearum, Avibacter michiganensis subsp hariç diğer Clavibakter michiganensis subsp. michiganensis, Pseuduomonas syringae pv. tomato ve Macrophomina phaseoli’ 52 ye karşı antibakteriyel etkisinin olduğunu, ayrıca gram pozitiflerin gram negatif olanlara göre çok daha hassas olduklarını belirtmişlerdir. 2.10.5 Hypericum calycinum L. Alem: Plantae Alt Alem: Tracheobionta Bölüm: Magnoliophyta Sınıf: Magnoliopsida Alt sınıf: Dilleniidae Takht. ex Reveal & Tahkt. Takım : Theales Familya: Clusiaceae Lindl. Cins: Hypericum calycinum Çalılık ve fundalıklar arasında yetişen çok yıllık bir otsu ve her dem yeşil olan bitkinin, Büyük çiçekli Binbirdelik otu, Kantaron, İri Çanaklı Koyunkıran, İri Çanaklı Kılıçotu, İri Çanaklı Kantaron, Kanotu, Kılıçotu, Koyunkıran, Kuzukıran, Mayasılotu, Sarı Kantaron, Yaraotu gibi yöresel adlandırmaları vardır. 30-80 santimetre kadar boy alabilen bitkinin yaprakları perfoliat (sarıcı) veya değil, nadiren aurikulat (kulaklı) olup sepaller ve petallar 5, 5 serbest, petallar genellikle sarı, stamenler 5 grup halinde ve petallerin önündedir. Ovaryum 3-5 veya tek lokuluslu, 2-çok ovüllü. Meyvesi pestisid kapsula veya nadiren baka durumundadır. Kapsulanın üzerinde boyuna çizgiler veya enine kabartılar bulunur (Baytop 1988). Çiçekleri parlak sarı renktedir (Şekil 2.22) (http://www.bakker.co.uk/product/rose-of-sharon1). Yapraklar ışığa karşı tutulduğunda, yağ bezleri, parlak noktacıklar halinde kolaylıkla görülür. Bitkiye binbirdelik otu denmesi bu özellikten ileri gelmektedir. Bitkinin tam olarak açmış bir çiçeği ezildiğinde, kırmızı bir sıvı salgılar. Avrupa’da 10, Türkiye’de 89 tür olmak üzere dünyada sıcak ve ılıman bölgelerde yayılış gösteren 400’ün üzerinde türü olup, bunlardan 43’ü endemiktir. Hypericum L.’nin Türkiye’de en yaygın temsil edilen türleri, Hypericum perforatum, Hypericum 53 Trigqetrifolium, Hypericum calycinum, Hypericum empetrifolium, Hypericum scabrum, Hypericum tedrapetum’dir (Baytop 1974, Davis 1978). Şekil 2.22 Hypericum calycinum bitkisi Yaraları iyileştirici etkisiyle birçok yerde bilinen bitki, antikanser ve antitümöral etkili olarak kullanılmakta oluşu ile de dikkati çekmektedir. Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından Hypericum ile yapılan çalışmalarda, antikanser etkinliğin çok düşük olduğu bildirilmesine karşın, yapılan birbirinden bağımsız çalışmalar ile de ovaryum kanserinin, mide kanserinin, lenfoit tümörlerin ve çeşitli karsinomların, bu bitkiyle son derece etkili bir şekilde tedavi edildiği bildirilmiştir (Duke 1985). Merkezi sinir sistemi üzerindeki etkisi bilinen bitkinin, ayrıca prosiyanidin yapısındaki kimyasal bileşikleri aracılığı ile kalp ve koroner kan akımı üzerinde etkili olduklarını bildirilmektedir (Melzer vd.1989). Hypericum bitkileri, tanen (tannin), uçucu yağ (carophyllene, pinene, limonene, myrcene), flavon türevleri (pseudohypericin) ve hiperisin (hyperic, pseudohypericin), karoten (carotene), vitamin C ve resin içermektedir. Farklı içeriklerin bitkideki konsantrasyonları ve bulunma oranları hasat zamanı, kurutma yöntemleri ve depolama koşullarıyla ilgilidir (Metini 2004). Hypericum genusunun en önemli metabolitlerinden biri olan ve 36 Hypericum türünün yirmi yedisinde bulunan hiperisin ve pseudohyperisin bitkiyi böcek ve zararlı hayvanlara karşı koruyan allokimyasal 54 fotosensitizer bileşiklerdir. Sadece beyaz tüylü hayvanlar bu bitkiyi yediklerinde, güneş ışığı tesiri ile deri ve mukozalarında yaralar ve genel metabolizma bozuklukları ile beliren özel bir hastalık olan hipericismus meydana gelir. Bitkide, hiperisin ve onun protoformu pseudhiperisin, bitkinin kökü, yaprakları, sepal, petal, stamen ve taze ovüllerinde ışığa tutulunca görülen küçük koyu bezlerde lokalize granüller olarak bulunur. Bitkide pseudohyperisin ve hiperisin oranının yüksek tutulması veya içinde bulundukları veziküllerin geçirgen olmaması sayesinde bitki ışığa bağlı fotoharabiyetten korunmaktadır (Agostinis vd 2002). Hiperisin küçük dozlarda mental depresyona karşı tonik ve stimülan olarak kullanılmaktadır (Tanker ve Tanker 1973, Baytop 1974). Hiperisinin tümor hücreleri ve viruslar üzerine güçlü bir fotodinamik etkiye sahip olduğu tespit edilmiş fakat bu bileşiğin tümör ölüm mekanizmasını nasıl teşvik ettiği henüz açığa kavuşturulamamıştır. Hiperisinin zarflı virüsleri inaktif hale getirdiği fakat zarfsız virüslere bir etkisinin olmadığı ve bu özelliğinin ışığa bağlı olarak arttığı rapor edilmiştir (Tang vd. 1990). Çeşitli kanser hücrelerine karşı in vitro güçlü bir antitümör aktivitesi gösteren hiperisin, yüksek konsantrasyonlarda dahi normal hücreler üzerine hiçbir toksik etki sergilememektedir. Hiperisin, tümör oluşumu üzerinde etkili bir faktör olup, hücre büyümesini düzenleyen epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptörlerini ve protein kinaz (PTK) aktivitesini direkt olarak inhibe etmektedir. Proteinlerin tirozin kalıntıları üzerinden fosforilasyonu, hücre döngüsü ve farklılaşmasının kontrolünü de içeren oldukça çeşitli hücresel sinyallere arabuluculuk eden anahtar bir biyokimyasal reaksiyonudur (Agostinis vd 2002). 55 3. MATERYAL METOT 3.1 Materyaller 3.1.1 Çalışmada kullanılan bitki türleri Bu çalışmada Fabaceae Familyasına ait L. albus, Lamiaceae Familyasına ait P. kurdica, Apiaceae/Umbelliferae Familyasına ait C. sativum, Lamiaceae (Labiatae) familyasına ait T. spicata var. spicata ve Hypericaceae familyasına ait H. calycinum bitkileri kullanılmıştır. Bitkiler araziden toplanmış ve Türkiye Florasındaki teşhis anahtarına göre Prof. Dr. Mecit Vural ve Doç. Dr. Osman Tugay tarafından teşhis edilmiştir. Çalışılan bitkilerden C. sativum ve L. albus bitkisinde tohumlar kullanılmış, C. sativum tohumları aktardan temin edilirken L. albus tohumları araziden toplanmıştır. Bitki örnekleri oda sıcaklığında kurutulduktan sonra buzdolabında muhafaza edilmiştir. 3.1.2 Mikroorganizmalar Çalışmada kullanılan standart mikroorganizmalar Anadolu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ve Yeditepe Üniversitesinden temin edilmiştir. Bitkilerden antimikrobiyal, antioksidant ve sitotoksik aktiviteleri belirlenmek amacıyla etanol ve metanol özütleri elde edilmiştir. Özütlerin antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek için Bacillus subtilis (ATCC 29213), Bacillus cereus (NRLL B-3008), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 35218), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus fecalis (ATCC 29212), Proteus vulgaris (NRRL B-123) ve Pseudomonas aureginosa (ATCC 27853)’ adlı patojen standart bakteri suşları ile Candida albicans (ATCC 10231) ve Candida tropicalis (ATCC 13803) adlı mayalar kullanılmıştır. 3.1.3 Kullanılan kimyasal maddeler ve ekipmanlar Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler özellikle belirtilmemiş ise analitik saflıkta olup, Sigma, Aldrich ve MERC’den temin edilmiştir. Çalışmada rondo (Tefal 400W), 56 çalkalamalı su banyosu (FALC termostatic bath 100-400rpm) vortex (FISONS), evaporatör (Buchi R-210), spektrofotometre (Shimadzu UV-1700), Etüv (Memmert), pH-metre (metler toledo), analitik terazi (sartorious), hassas terazi (sartorious), santrifüj (hettich micro22R), liyofilizatör (Edwars Freze Dryer Modulyo), ısıtıcılı manyetik karıştırıcı (Daihan MSH-20A), mikro pipetler (Gilson), Karbondioksitli etüv (InCu Safe), Inverted Mikroskop (Olimpus), MIC cihazı (Sunostik spr 960), Otoklav (Tomysx 700E), Steril kabin (Holten 1.8), Eliza cihazı (ELx808-IU), Sıvı azot kapları, kar makinası, buzdolabı, derin dondurucu kullanılmıştır. 3.1.4 Antimikrobiyal aktivite için kullanılan kimyasal maddeler ve çözücüler Muller Hilton Agar (Oxoid), Nutrient Broth (NB, Oxoid), Nutrient Agar (NA, Oxoid), % 0.9 Serum fizyolojik, Distile su, DMSO (Dimetil sülfoksit), Etanol, Metanol, MFarland Çözeltisi (Merck), linoleik asit, DPPH, folin-Ciocaltesu reaktifi (FLUKA). Nutrient Agar (NA) Besiyeri (Oxoid): 1g Et Özütü (beef extract), 2g maya özütü (yeast extract) 5g pepton, 5g sodyum klorür (NaCl), 15g agar ve distile su ile ilave edilerek son hacim 1000 ml olacak şekilde hazırlanmıştır. Nutrient Sıvı (NB) Besiyeri (Oxoid): 1g Et Özütü, 2g Maya Özütü, 5g Pepton, 5g NaCle distile su ile ilave edilerek son hacim 1000 ml olacak şekilde pH, 0,01 N HCl ve 0,01 NaOH ile 7,8’e ayarlanarak hazırlanmıştır. Luria Bertani Sıvı (LB) Besiyeri (Oxoid): 5g Maya özütü, 10g pepton ve 10g NaCl ‘e distile su ile ilave edilerek son hacim 1000 ml olacak şekilde hazırlanmıştır. Muller Hinton Broth: 2.0 g Et özütü, 17.5 g Kazein hidrolizatı, 1.5 g Nişastaya distile su ieklenmiş son hacim 1000 ml olacak şekilde hazırlanmıştır. Katı besiyeri için yukarıdaki karışıma 12 g agar ilave edilmiştir. 57 Sabouraud Dextrose Agar: 10 g Bacto pepton, 40 g Bacto Dekstroz, 15 g Bacto Agar karışımı, disitle su ile son hacim 1000 ml olacak şekilde hazırlanmıştır. Katı besiyeri için yukarıdaki karışıma 12 g agar ilave edilmiştir. TTC Tuzu : 250 mg 2,3,5- Triphenytetrazolium klorür üzerine etanol (%96) ilave edilerek son hacim 100 ml ye ayarlanmıştır. Mc Farland No: 0.5 bulanıklık standardı: 0.5 ml BaCl2 ( %1.175) ve 99.5 ml H2SO4 ile hazırlanmıştır. 3.1.5 Antioksidan aktivite için kullanılan kimyasal maddeler ve çözücüler Etanol, Methanol, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil), Folin-ciocalteu Reaktifi, Sodyum karbonat (Na2CO3), Demir III Klorür (FeCl3. 6H2O), Potasyum ferrisiyanür (K3Fe(CN)6), Trikloroasetikasit (TCA), Fosfat tamponu, Distile su, Bütinlenmiş Hidroksi Toluen (BHT), Gallik asit. Folin-Ciocalteu Reaktifi: Ticari olarak satın alınmıştır. 1 mM DPPH çözeltisi: 0.0986 gr DPPH tartılarak etanolde çözülerek 250 mL’ye tamamlanmıştır. 0.1 mM DPPH çözeltisi: 1 mM DPPH çözeltisinden 10 mL alınarak etanolle 100 mL’ye tamamlanmıştır. % 3.5’luk HCl çözeltisi: 9.46 mL’lik HCl çözeltisinden pipetle alınarak, distile su ile 100 mL’ye tamamlanmıştır. % 30’luk NH4SCN çözeltisi: 30 gr NH4SCN tartılarak distile suda 100 mL’ye tamamlanmıştır. 58 20 mM FeCl2 çözeltisi: 0.2535 gr FeCl2 tartılarak % 3.5’luk HCl ile 100 mL’ye tamamlanmıştır. Linoleik asit emülsiyonu: 175 mg Tween 20 ve 155 μL linoleik asit 0.04 M fosfat tamponu (pH 7.0) ile 50 ml ye tamamlanmıştır. 0.04 M fosfat tamponu (pH=7.0): KH2PO4 (5.44 g/L) ve Na2HPO4.2H2O (7.12 g/L) çözeltileri pH 7.0 olacak şekilde karıştırılarak hazırlanmıştır. 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4): KH2PO4 (13.609 g/L) ve Na2HPO4.2H2O (17.799 g/L) çözeltileri karıştırılarak pH 7.4 olacak şekilde hazırlanmıştır. 2 mM FeCl2 çözeltisi: 0.0254 gr FeCl2 distile su ile 100 mL’ ye tamamlanarak hazırlanmıştır. % 1’lik K3Fe(CN)6 çözeltisi: 1 gr K3Fe(CN)6 distile su ile 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. % 10’luk TCA çözeltisi: 10 gr TCA distile su ile 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 3.1.6 Hücre hatları için kullanılan kimyasal maddeler ve besiyerleri Etanol, İzopropanol, Tripan Mavisi, RPMI-1640 besiyeri, dimetilsülfoksit, L-glutamin, penisilin, streptomisin, fetal calf serum, DMSO. 3.1.7 Çalışmada kullanılan hücre hatları MCF-7 (ATCC HTB-22,) meme kanseri hücreleri, Androjene bağımlı LNCaP (ATCC CRL1740), androjene bağımsız DU145 (ATCC HTB81), PC-3 (ATCCCRL1435), HeLa (ATCCCCL-2) serviks kanseri hücre hatları. 59 3.1.8 Çalışmada kullanılan çözeltiler 1X Tris EDTA asetat (TAE) tamponu %1.5 lik agaroz jel hazırlamak için kullanılmıştır. TBS (Tris buffered saline) 10X konsantrasyonda İçeriği: 87.66 g NaCl, 12.11 g Tris HCl (pH:8.8’ e ayarlanmıştır). Hacim distile su ile 1000 mL’e tamamlanmıştır. TBST (Tris buffered saline ve Tween 20) 1X. İçeriği: 100 mL 10 X TBS, 900 mL distile H2O ve 2 mL Tween 20. Transfer tamponu İçeriği: 50 mL 10 x yürütme tamponu, 150 mL methanol Hacim distile su ile 500 mL’e tamamlanmıştır. Yürütme tamponu. İçeriği: 30.3 g Tris-base, 144 g Glisin, 10 g SDS, Distile su ile hacim 1000 mL’ ye tamamlanmıştır. 3.1.9 Hücre kültüründe kullanılan malzemeler 12 kuyucuklu hücre petrileri, TPP (Zellkultur Testplatte), Kat. No: 92012., İsviçre 6 kuyucuklu hücre petrileri, TPP (Zellkultur Testplatte), Kat. No: 92006., İsviçre 75 cm2 hücre büyütme kapları (hücre kültürü için), TPP (Zellkultur Testplatte), Kat. No: 90075., İsviçre 96 kuyucuklu hücre petrileri, TPP (Zellkultur Testplatte) Kat. No: 92096., İsviçre Etüv, Heraus Thermo Electron Company, Model: Hera cell 150. Hemostometri, Hausser. (Bright-Line,Neubauer Model, 0.1 mm derinlikli). Laminar flow HeraSafe, Model: 12469, 2000. 2. dereceden güvenlik kabinidir. LNCaP hücre hattı ATCC ‘den satın alınmıştır (ATTC kodu: CRL-1740). Penisilin/streptomisin çözeltisi, Pan Biotech, Kat. No: P06-07100. Pipetler, Ratiolab (Accupetta). Pipet uçları, CAPP 60 Petri kapları (100 X 20 mm) TPP (Zellkultur Schalen) , Kat. No: 93100, İsviçre. RPMI 1640 medya (İçeriği L-glutamine, 2.0 g/L NaHCO3), Pan Biotech GmbH, Almanya, Kat. No: P04-16500. Serolojik pipetler (5 mL), TPP, Kat. No: 94005. Serolojik pipetler (10 mL) ,TPP, Kat. No: 94010. Şırınga filtreleri (0.22 μm) ,TPP, Cat. No: 99722. 5-10-25 cc Şırıngalar, Set Inject, Kat. No: B25107. Santrifüj Model 5417R, Eppendorf. Trypsin-EDTA, Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek Israel) tarafından üretilmiştir, Kat. No.:03-053-1B. 3.1.10 Hücre kültüründe kullanılan cihazlar Distile su, Ultra saf su cihazı: TKA-GenPure. Dondurucu (-80ºC) New Brunswick Scientific, Model: Ultra Low Temperature Freezer, U725 innova). Elektroforez araçları, BioRad. Mikrofüj tüpleri (0,2 ml, 0.5 mL, 1.5 mL ve 2 mL) Axygen. Etüv (Çözeltileri ısıtmakta kullanılan), Nüve, Model: EN 025. Etüv (Mikrofüj tüpleri için kullanılan), Biosan, Model: CH-100 Konik tüpleri ( 15 mL ve 50 mL), TPP tarafından üretilmiştir. Florasan mikroskop, Olympus, Model: IX71. Ayrıca görüntüleme ve florasan ışımaları yakalamak için kullanılan yazılım programı da Olympus tarafından üretilmiştir. Inverted mikroskop, SOIF, Model: XDS-1B. Mini Labroller, Labnet International Inc. Otoklav, Nüve, Model: OT 4060 Plastik tüpler PVDF membran, Roche ,03 010 040 001 Santrifüj Model MiniSpinPlus,Eppendorf. Santrifüj Model NF200, Nüve. 61 Spektrofotometre Model 680 Microplate Reader S/N 19280. Western blotlamada kullanılan kasetler, Dr. Goos-Suprema GmbH tarafından üretilmiştir, Almanya. X-ray (fotoğraf) film, Kodak tarafından üretilmiştir. 3.1.11 ADA aktivitesi ile ilgili kimyasal maddeler Tampon: 50 mM, pH: 7.2 Fosfat ya da Tris tamponu Adenozin: 4.0 mM Normal ve Kanserli Dokular (Prostat kanseri) Sterilizasyon: Çalışmada kullanılan bütün besiyerleri 121 0C’de, 1.5 atm/Hg basınçta 20 dk. otoklavda steril edilmiştir. Çalışmada ayrıca 0.22 µm filtre sterilizasyonu da kullanılmıştır. 3.2 Yöntem 3.2.1 Bitki özütlerinin hazırlanması Araştırmada kullanılan bitki türleri toplandıktan sonra serin, rutubetsiz bir ortamda kurutulmuştur. Kurutulmuş bitkilerin gövde kısımları ev tipi rondoda öğütülerek toz haline getirilmiştir. L. albus ve C. sativum bitkilerinin tohumları kullanılmıştır. Tohumlar, havanda dövülerek toz haline getirilmiştir. Öğütülmüş bitkilerden 50 g tartıldıktan sonra, 500 ml çözücü eklenerek oda sıcaklığında, karanlıkta 7 gün bekletilmiştir. Daha sonra özütler Wattman 1 filtre kâğıdından süzülmüştür. Süzüntüdeki çözücü evaporatörde 50°C’de, düşük basınçla uzaklaştırılarak kurutulmuştur. Elde edilen kuru özütler kullanılıncaya kadar +4 0C de karanlıkta muhafaza edilmiştir. Çözücü olarak etanol ve metanol kullanılmıştır. 62 3.2.2 Antimikrobiyal aktivite belirleme yöntemi 3.2.2.1 Disk kuyucuk yöntemi 3.2.2.2 Besiyerlerinin hazırlanması Çalışmada Müeller-Hinton Agar ve Nutrient Broth kullanılmıştır. Müeller-Hinton Agar’dan 34 g alınıp 1000 mL saf su içinde karıştıralarak hazırlanmıştır. 8 g Nutrient Broth alınıp 1000 mL saf su içinde karıştıralarak hazırlanırak steril edilir. Sterilizasyon 121⁰C basınçta 20 dakika süreyle yapılmıştır. % 0,9’luk NaCl çözeltisine öze yardımıyla alınarak bakteri bulanıklığı 0.5 Mc Farland’ a ayarlanmıştır. 3.2.2.3 Bitki özütlerinin disk kuyucuk yöntemi ile antimikrobiyal aktivitelerinin tayini Etanol ve metanol de hazırlanan bitki özütleri dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde beş farklı konsantrasyonu olacak şekilde çözülmüştür. Milipor filtreden geçirilerek steril edilmiştir. Steril petri kaplarına bakteriye uygun besiyeri dökülmüştür. Besiyeri katılaştıktan sonra 106- 107 cfu/ml hücre konsantrasyonunu ihtiva eden bakteri süspansiyonu besiyerinin yüzeyine homojen bir şekilde yayılmıştır. Daha sonra besiyerine 3 adet kuyucuk aseptik şartlarda açılıp her bir kuyucuğa hazırlanan özütlerden ilave edilmiştir. Belli bir süre (2 saat) buzdolabında 4 0C de bekletildikten sonra petri kapları 37 0C de 18-24 saat inkubasyona bırakılmıştır. Mayalar ise 30 0C de 48 saat inkubasyona bırakılmıştır. İnkubasyon sonunda oluşan zon çapları milimetrik olarak ölçülmüştür. Çalışma üç kez tekrarlanmış ve aritmetik ortalamaları alınmıştır. Negatif kontrol olarak DMSO, pozitif kontrol olarak klorampenikol ve amphisilin (mayalar için ketokonozole) standard antibiyotik diskleri kullanılmıştır. 63 3.2.2.4 Aktif bulunan bitki özütlerinin minimal inhibitör konsantrasyonlarının belirlenmesi Bakteri suşları uygun sıvı besiyerlerine inöküle edillip 37 0C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. 24 saatlik kültürden hazırlanan süspansiyonlar, 0.5 McFarland standardı kullanılarak uygun konsantrasyona ayarlanmıştır. Bitki özütlerinden seri seyreltmeler de eş zamanlı olarak hazırlanmıştır. Steril 96’lık mikropletlerin kuyucuklarına, besiyeri, bakteri kültürü (1x108 CFU/mL McFarland ile ayarlanan) ve bitki özütleri ilave edilmiştir. Son kuyucukta negatif kontrole mutlaka yer verilmiştir. Kaplar kapatıldıktan sonra 37 0C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra MIC cihazında absorbans değerleri ölçülerek özütlerin mikroorganizmaları öldürdüğü en düşük konsantrasyon belirlenmiştir. 3.2.3 Özütlerin antioksidan özelliklerinin tayini 3.2.3.1 DPPH radikal süpürücü etki tayini Serbest radikal süpürücü aktiviteleri 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) kullanılarak belirlenir (Blois 1958). Yöntemim prensibi, özütlerin bir proton veya elektron verebilme yeteneği ile mor renkli DPPH çözeltisinin renginin açılmasıdır. Sonuçlar spektrofotometrede 517 nanometrede absorbans ölçülmesi ile hesaplanır. Absorbansının düşmesi yüksek serbest radikal giderme aktivitesinin göstergesidir. Bu çalışmada bitki özütlerinden 1 mg/mL stok hazırlanmış ve stoktan farklı konsantrasyonlar ayarlanmıştır. Tüplere önce 1 mL istenilen konsantrasyondaki özütler konmuş ve 4 mL DPPH çözeltisi eklenmiştir. 30 dk karanlıkta oda sıcaklığında bekletil miştir. 30 dk sonra 517 nm de absorbans değerleri ölçülmüştür. Örnek ve standart madde yerine Kör olarak özüt çözücüsü ve diğer şartlar aynı olacak şekilde DPPH çözücüsü kullanılmıştır. Kontrol absorbansı taze ölçülür. Standart olarak aynı konsantrasyonlarda hazırlanan BHT kullanılmıştır. % DPPH Serbest radikali Giderme Aktivitesi değeri: 64 (Absorbans kontrol- Absorbans örnek / Absorbans kontrol)x 100 olarak hesaplanmıştır. %50 inhibisyonu sağlayan özüt ve standart madde konsantrasyon değeri (IC 50), özüt konsantrasyonuna karşılık gelen inhibisyon değeri grafiğinden hesaplanarak bulunmuş ve IC50 = μg/mL olarak verilmiştir. Test en az üç kez farklı zamanlarda tekrarlanmıştır. 3.2.3.2 Toplam fenolik içerik miktar tayini Bitkilerin, etanol ve metanol özütlerindeki toplam çözünebilen fenolik maddeler FolinCiocalteu reaktifi (FCR) ile belirlenmiştir (Singleton ve Rossi 1965). FCR, fosfotungustik (H3PW12O40) ve fosfomolibdik (H3PMo12O40) asitlerden oluşan bir reaktif olup fenol oksidasyonu sırasında oksitlerin mavi renkli bileşiklere dönüşmesi ile karekterizedir. Renk değişiminin nedeni polifenolik bileşik miktarıdır. Bu miktar spektofotometrede 760 nm’de belirlenebilir. Polifenol miktarı genellikle gallik asit eküvalantı olarak ifade edilir. Kullanılan bütün bitkiler için farklı konsantrasyonlarda hazırlanan (beş konsantrasyon antioksidan deneyleri için uygun) özütlerden 100 µl tüplere dağıtılmıştır. Üzerlerine 200 µl %50 FCR eklenen karışım 3 dk bekletilmiştir. Karışımın üstüne 1 ml %2 Na2CO3 çözeltisi konarak iyice çalkalanmıştır. Karışım oda sıcaklığında 1 saat bekletildikten sonra 760 nm’de absorbans değerleri okutulmuştur (Singleton ve Rossi 1965). Örnek yerine distile su içeren kör kullanılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda (μg/mL) hazırlanan gallik asit çözeltilerinin FCR ile toplam fenolik madde tayini yapılmıştır. Ölçülen absorbans değerleri ve konsantrasyonlar kullanılarak gallik asit için standart grafik çizilmiştir. Özütlerin toplam fenolik bileşik miktarları standart gallik asit grafiğinden elde edilen aşağıdaki eşitlik kullanılarak µg gallik asite eşdeğer mg özüt olacak biçimde belirlenmiştir: (R2: 0.9858) A= 0.0085 gallik asit (μg) - 0.0209 65 3.2.4 Kanserli hücre dizilerinde sitotoksisitenin belirlenmesi 3.2.4.1 Bitki özütünün hücre kültürü için hazırlanması Mevcut özütlerin hücre dizileri üzerindeki in vitro sitotoksik etkisinin belirlenmesi amacı ile 10 mg/ml’lik stok özüt çözeltileri hazırlanmıştır. Metanol özütünü çözmek için gerekli miktarda tartılan özüt üzerine dimetil sülfoksit (DMSO) ilave (mevcut en yüksek özüt konsantrasyonundaki oranı %1’i geçmeyecek şekilde) edilmiştir. Çözdürülen özüt üzerine azar azar besiyeri ilave edilerek çözdürme işlemine devam edilmiş ve stok çözelti gerekli hacme tamamlanmıştır. Su özütünde ise stok çözeltiler besiyeri içinde çözülmüştür. Hazırlanan stok çözelti 0,22 μm por çaplı, şırıngalı filtreden geçirilerek, steril edilmiş kapaklı tüplere alınmış ve denemelerde kullanılıncaya kadar +4 oC’ de saklanmıştır. 3.2.4.2 Hücre kültürü ve hücre sayımı MCF-7 meme kanseri hücreleri, DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Androjene bağımlı LNCaP, androjene bağımsız DU145 ve prostat kanseri hücre dizileri ve HeLa serviks kanseri hücre dizileri RPMI1640 besiyerinde olacak şekilde % 10 fetal sığır serumu, 4 Mm L-glutamin, 3,7 g/mL sodyum karbonat ve 100U/mL Penisilin/Streptomisin (Gibco) ile %5 CO2 içeren nemli 37oC’lik etüvde aseptik koşullar göz önünde bulundurularak geliştirilmişlerdir. Her 2-3 günde bir, hücre yoğunluğuna bağlı olarak pasajları gerçekleştirimiştir. 3.2.4.3 Hücre canlılık testi (MTT testi) Kolorimetrik yöntemlerle 3-(4,5-dimetiltiyazol2-yl)-2,5-difenil tetrazolyum bromürün yaşayan hücrelerde formazan tuzu oluşturmasına bakılarak (MTT belirteci), hücre canlılığı seviyesi belirlenmiştir. Kanserli hücreler 1x104 hücre/kuyucuk olacak şekilde 96 kuyucuklu hücre petrilerine ekilmiştir. 96 kuyucuklu hücre kaplarına, her bir kuyuda 1 x 104 kanser hücresi olacak şekilde ekim yapılmıştır ve 24 saat süresince hücrelerin 66 yüzeye yapışmaları için beklenmiştir. Bir gece boyunca yapışması beklenen hücreler ters bakışlı mikroskop ile kontrol edildikten sonra bitkilerin etanol ve metanol özütlerinden 1-1000 g/mL olacak şekilde MCF-7, LNCap, DU145 ve PC3 gibi kanser hücre hatlarına 24 saat boyunca uygulanmıştır. Kontrol olarak uygulama yapılmamış hücreler kullanılmış ve her bir bitki özütü için sadece saf etanol veya saf metanol hücrelere bitki özütleri ile aynı surede uygulanmıştır. 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-yl)-2,5difenil tetrazolyum bromid boyası (Sigma, 50 mg/ml PBS çözeltisinde hazırlandı), 5 L olacak şekilde 4 saat boyunca 37°C de hücreler ile muamele edilmiştir. Hücre canlılığı mitokondriden türevlenen aktiviteye bağlı olarak formazan ürünleri olan mor kristallerin oluşması ile belirlenmiştir. Mor kristallerin çözünür olabilmesi için her bir kuyucuğa 100 L DMSO (Sigma) eklenip, 5 dakika boyunca hücreler karanlıkta bekletilmiştir. Mikroplaka okuyucuda (Biorad) 570 nm’de kolorimetrik olarak okuma gerçekleştirilmiştir. 3.2.4.4 Hücre sağ kalım eğrisinin belirlenmesi Kanser hücre hatları zaman içerisinde % 50 oranında hücre canlılığına ket vuran etanol veya metanol özütlerine verdikleri cevabın belirlenebilmesi amacı ile 5x104 hücre/kuyu 12 kuyucuklu hücre kültür petrilerine ekildmiştir. 0 ila 96 saat arasında özüt uygulamasına tabi tutulan hücreler her 24 saatte bir tripsin ile kaldırılmış ve elde edilen hücreler % 0,4 trypan mavisi ile 1:1 oranında karıştırılarak, haemositometre lamında mikroskopta sayılmıştır. 3.2.4.5 Hücre ölümünün propidyum iyodür (PI) boyama ile belirlenmesi Hücrelere özüt uygulaması sonrasında, ölüm oranları PI boyama yöntemi ile saptanabilmesi amacı ile, 1x105 hücre/kuyu olacak şekilde 12 kuyucuklu hücre petrilerine ekilmiştir. Bitki özütü ile 24 saat boyunca uygulama yapılan hücreler önce PBS ile yıkanmış besiyeri çekilmeden PI boyası (Konsantrasyon:1 μg/ml ) eklenmiştir. 15 dakika PI‘ın hücrelerin hedef bölgelerine difüz etmesi için beklendikten sonra floresan mikroskobu altında görüntüleme gerçekleştirilmiştir. 67 3.2.4.6 Apoptotik hücrelerin DAPI boyaması ile belirlenmesi Hücreler 1x105 hücre/kuyu olacak şekilde 12 kuyucuklu hücre petrilerine ekilmiştir. Bitki özütleri ile 24 saat boyunca uygulama yapılan hücreler önce PBS ile yıkanmış hücrelerde nukleusların görünür olabilmesi için PBS içerisinde hazırlanan 4,6diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Molecular Probes) ile son konsantrasyonu 1 g/mL olacak şekilde 15 dakika boyunca boyama gerçekleştirilmiştir. Hücreler floresan mikroskobunda (Olympus) incelenerek her bir görüş alanında 100 hücre olacak şekilde sayım gerçekleştirilmiştir. 3.2.4.7 Mitokondri membran potansiyelindeki değişimin belirlenmesi (Δψm) Hücreler 1x105 hücre/kuyu olacak şekilde 12 kuyucuklu hücre petrilerine ekilmiştir. Bitki özütü ile 24 saat boyunca uygulama yapılan hücreler önce PBS ile yıkandıktan sonra 4 nM 3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodür (DiOC6) (Calbiochem, 40 nM stok konsantrasyon DMSO’da hazırlandı) floresan prob ile 15 dakika boyunca muamele edilmiştir. Δψm değişimi floresan mikroskopta (Olympus, Japan) (Excitation/emission = 488 nm /525nm) gözlenmiştir. 3.2.5 Protein İzolasyonu Hücrelerden protein izole edebilmek amacıyla 6 kuyucuklu petrilere 5x105 hücre/kuyu olacak şekilde hücre ekimi yapılmıştır. Bitki özütleri için seçilen dozların hücrelere uygulanmasından sonra protein izole edilmiştir. Hücre ekstraksiyon tamponu (%1 nonidet p40, %0,5 deoxycholate, % 0.1 SDS, 1mM Sodyum florid (NaF), 1mM sodyum orthovanadate (Na3VO4), taze eklenmek üzere 1 mM fenilmetilsülfonilflorid (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 40 µl proteaz inhibitör) içerisine alınmış ve 30 dakika buz üzerinde bekletilmiştir. 30 dakika 13200 rpm’de 4C’de santrifüjlenmiştir. Örneklerin sıvı kısmı yeni bir tüpe alınarak -80C’de saklanmıştır. Bradford yöntemi ile BSA standartları üzerinden çizilen standart grafiğe göre miktarları ölçülmüştür (Biorad, Bradford çözeltisi). Total proteinler 595 nm absorbans değerinde ölçülmüştür. 68 3.2.6 Western blotlama Western blotlama yöntemi için protein miktarı 30 μg olacak şekilde örnekler seçilmiştir. Laemmli tamponu 2x (Sigma) ve 30 μg protein örnekleri 1:1 oranında karıştırılmış 95C’de 5 dakika tutulmuştur. %12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) için hazırlanarak, örnekler protein belirteçler ile birlikte 75 Volt’da 2,5 saat SDS içeren yürütme tamponunda yürütülmüştür. Örnekler daha sonra Polivinil diflorür (PVDF) membrana transfer edilmiştir. Süt tozu ile 2 saat oda sıcaklığında 3D orbital rotatorda çevrilmiştir. 5’er dakikalık 3 kez TBST ile yıkama sonrasında 1:1000 oranında seyreltilerek anti-PARP veya anti-kaspaz-9 ile +4oC’de gece boyunca immunoblotlaması yapılmıştır. Örnekler oda sıcaklığında 1 saat süre ile uygun antitavşan ikincil antikor (Santa Cruz, 1:3000) ile muamele edilmiştir. Ardından 15’er dakikalık TBST ile iki yıkama ve 15 dakikalık PBS ile yıkama sonrasında oda sıcaklığına kemiluminisans madde (Lumilight, Roche) ile 1 dakika boyunca etkileştirilmiştir. Sonra streç filme sarılan membranlar, ışık geçirmez kasetlerde karanlık odaya götürülmüştür. Geliştirici ve sabitleyici film (Kodak X-OMAT) ile istenilen görüntü elde edilinceye kadar yıkanmış ve kurumaya bırakılmıştır. 69 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 Bitki Özütlerinin Hazırlanması ve Yüzde Verimlilik Hesaplanması Bu çalışmada L. albus, C. sativum, P. kurdica, T. spicata var. spicata ve H. calycinum bitkileri kullanılmıştır. Bu bitkilerin toplama yılları ve yerleri çizelgede verilmiştir (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1 Çalışmada kullanılan bitki tür adları ve toplandığı yerler Bitki Tür Adı Toplandığı Yer ve Yıl Adı Lupinus albus Konya Coriandrum sativum Aktarlardan temin edildi Phlomis kurdica C8 Batman: Hasankeyf, İncirli köyü - karakol arası, yol kenarı, 592 m, 08.06.2009, S. Aslan 3784 & B. Şahin Tymbra spicata var. C8 Siirt: Siirt - Eruh yolu, kayalık step (kireçtaşı), spicata 630 m, 09.06.2009, S. Aslan 3804 & B. Şahin. Hypericum calycinum A3 Düzce: Düzce Üniversitesi kampüsü kuzeydoğusu, Phillyrea latifolia makiliği, 300 m, 08.07.2011, S. Aslan 4458. (DUOF0000474) Bitkilerin etanol ve metanol özütleri hazırlandıktan sonra buharlaştırıcıdan geçirilmiş ve % verimlilikleri hesaplanmıştır (Çizelge 4.2). Ekstraksiyon sonrası elde edilen özüt Yüzde verimlilik (g/g): x 100 Başlangıçta ölçülen kuru bitki miktarı L. albus tohum ve yaprak etanol özütlerinin verimliliği %4.48, %8,08 iken metanol özütü verimlilikleri %12,72 ve 25,2 olarak hesaplanmıştır. C. sativum tohum etanol özütün verimliliği %8,42, metanol özütün verimliliği %10.28 dir. P. kurdica türünün 70 etanol özütün %4,26, metanol özütün verimliliği ise 10,62 olarak hesaplanmıştır. T. spicata var. spicata verimliliği %2,78, metanol özütünün verimliliği ise %6,06 olarak hesaplanmıştır. Çalışmada kullanılan bitkilerin büyükten küçüğe verimlilik sıralaması L. albus, C. sativum, P. kurdica, T. spicata var. spicata ve H. calycinum şeklinde olmuştur. H. calycinum türü hariç diğer türlerde en çok % verimin metanol özütlerinde H. calycinum türünde ise etanol özütünde olduğu gözlenmiştir. Çizelge 4.2 Çalışmada kullanılan bitki türlerinin % verimlilikleri Etanol Özütün % Verimlilik Değeri Metanol Özütün % Verimlilik Değeri Lupinus albus (tohum) 4,48 12,72 Lupinus albus (yaprak) 8,08 25,2 Coriandrum sativum (tohum) 8,42 10,28 Phlomis kurdica 4,26 10,62 Tymbra spicata var. spicata 2,78 6,06 Hypericum calycinum 38,94 22.22 Bitki Özütü 4.2 Antimikrobiyal Aktivite Sonuçları 4.2.1 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütsinin antimikrobiyal aktivite sonuçları C. sativum bitki türünün 50, 100, 150, 200 ve 250 mg/ml lik etanol ve metanol özütlerinin sekiz patojen bakteri ve iki patojen maya üzerindeki antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmiştir. Kloramfenikol (C), Ampisilin (Amp), (bakteriler) ve Ketokonazol (Keto), (mayalar) antibiyotiği içeren diskler kontrol olarak kullanılmıştır. Antimikrobiyal aktivite sonucunda oluşan zonlar ile ilgili her bitki için iki resim seçilmiştir (Şekil 4.1). Aktiviteyi belirlemek için 50-250 mg/ml arasındaki konsantrasyonlarda bitki özütleri hazırlanıp, bu özütler petrilerde açılan kuyucuklara 71 ilave edilmiş ve inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında oluşan zon çapları ölçülüp, sonuçlar milimetre (mm) cinsinden verilmiştir (Çizelge 4.3, Çizelge 4.4). C. sativum etanol özütü sadece 150 mg/ml-250 mg/ml’ lik konsantrasyonlarda B. cereus, B. subtilis, P. aeroginosa bakterilerine karşı zayıf bir antimikrobiyal aktivite göstermiştir. C. sativum’ un metanol özütü ise 150 mg/ml-250 mg/ml’lik göstermiştir. C. sativum’ un metanol özütü ise 150 mg/ml-250 mg/ml’lik konsantrasyonlarda P. vulgaris ve E. fecalis bakterileri hariç diğer tüm bakterilerde orta derecede antibakteriyal aktivite göstermiştir. Her iki özütte çalışmada kullanılan C. albicans ve C. tropicalis mayalarında hiçbir etki göstermemiştir. C. sativum bitkisinin antimikrobiyal aktivitesinin düşük olması nedeniyle MIC değerleri hesaplanmamıştır. B. cereus türü için zon çapları 12-14 mm arasında değişirken, B. subtilis türü için 12-13 mm arasında değiştiği gözlenmiştir. P. aeroginosa bakterisi içinde zon çapları 12-14 mm arasında ölçülmüştür. Şekil 4.1 C. sativum bitkisinin etanol özütünün kuyucuk yöntemi ile B. subtilis bakterisi üzerinde oluşturduğu zonlar 72 73 74 4.2.2 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivite sonuçları L. albus bitkisinin tohum ve yapraklarının 50-250 mg/ml’lik etanol ve metanol özütlerinin sekiz patojen bakteri üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri disk kuyucuk yöntemi ile incelenmiştir (Şekil 4.2). Bitkinin etanol özütünün denenen konsantrasyonlarda sadece B. cereus ve B. subtilis bakterilerine karşı çok az etkili olduğu diğer bakteri ve mayalara karşı ise etkisinin olmadığı gözlenmiştir (Çizelge 4.5). B. cereus ve B. subtilis bakterileri için zon çaplarının 11-12 mm arasında değiştiği belirlenmiş, aynı bitkinin metanol özütünde ise denenen konsantrasyonlarda ne bakterilere ne de mayalada antimikrobiyal aktivite gözlenmemiştir. Bitki özütünün MIC değerleri hesaplanmıştır. L. albus bitkisinin, B. cereus ve B. subtilis bakterileri için MIC değerleri 3,90 mg/mL ve 7,81 mg/mL olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.6). Şekil 4.2 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütülerinin S. aureus bakterisi üzerinde kuyucuk yöntemi ile oluşturtuğu zonlar 75 76 77 4.2.3 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivitesi P.kurdica bitki türünün 50-250 mg/ml’ lik etanol ve methanol özütleri hazırlanarak sekiz patojen bakteri ve iki patojen maya üzerindeki antimikrobiyal aktiviteleri çalışılmış ve sonuçlar çizelge halinde verilmiştir (Çizelge 4.7, Çizelge 4.8). Ayrıca oluşan zonları gösteren bir petri seçilmiştir (Şekil 4.3). P. kurdica bitkisinin 40, 100, 200, 250 mg/mL etanol özütünün S. aureus bakterisine karşı 12, 14, 21, 18,5 ve 17,5 mm’ lik inhibisyon zonu oluşturdukları gözlenmiştir. P. kurdica bitkisinin 50, 100, 200, 250 mg/ml etanol özütünün E. feacalis bakterisine karşı ise 50 mg’ da aktivite göstermezken, diğer konsantrasyonlarda sırasıyla 10,3, 12, 10,3 ve12 mm şeklinde inhibisyon zonu oluşturduğu belirlenmiştir. Bitkinin etanol özütü B. subtilis bakterisinde 11,6, 14,3, 14,3, 12 ve 13 mm inhibisyon zonu oluşturmuştur. B. cereus bakterisi için aynı konsatrasyonlarda zon çapları 10, 12, 16, 14 ve 15 mm bulunmuştur. P. vulgaris bakterisi için 14,7, 15, 18, 16 ve 16 mm bulunurken P. aeroginosa bakterisinde 10, 10, 15, ve 10 mm’ lik inhibisyon zonları belirlenmiştir. Bitkinin etanol özütünün C. albicans, C. tropicalis mayaları ve E. coli bakterileri dışındaki diğer tüm bakterilere karşı etkili olduğu gözlenmiştir. En etkili olarak bulunan bakteriler ise P. vulgaris ve B. cereus olarak belirlenmiştir. P. kurdica bitkisinin metanol özütü ise S. aureus, B. subtilis, B. cereus, P. vulgaris bakterisine karşı aktivite gösterirken çok az da olsa P. aeroginosa bakterisine karşı da etkili bulunmuştur. P. kurdica bitkisinin metanol özütü çalışmada kullanılan mayalar üzerinde etkili bulunmamıştır. Etkili özütlerin MIC değerleri hesaplanmıştır (Çizelge 4.9) Şekil 4.3 P. kurdica bitki özütünün antimikrobiyal etkisi 78 79 P. kurdica bitkisinin 50 - 250 mg/ml metanol özütünün S. aureus bakterisine karşı 50 mg /ml’ lık konsantrasyonda inhibisyon göstermezken diğer konsantrasyonlardaki etki 14, 16, 18,5 ve 17,5 mm olarak gözlenmiştir. P. kurdica bitkisinin metanol özütü E. fecalis ve E. coli bakterisine karşı denenen konsantrasyonlarda hiçbir aktivite göstermemiştir. B. subtilis bakterisine karşı 10, 8,5, 12, 12 ve 13 mm inhibisyon zonu oluşturmuştur. B. cereus bakterisi için aynı konsantrasyonlarda zon çapları 11,3, 9,5, 12, 14 ve 15 mm bulunmuştur. P. vulgaris bakterisi için 13, 14,5, 11,5, 16 ve 16 mm bulunurken, P. aeroginosa bakterisinde 50 ve 100 mg konsantrasyonlarda aktivite gözlenmemiştir. Diğer konsantrasyonlarda inhibisyon zonları 9, 10,5 ve 10,5 mm olarak belirlenmiştir. 80 81 82 4.2.4 T. spicata var. spicata etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivite sonuçları T. spicata var. spicata bitkisinin 50, 100, 150, 200 ve 250 mg/mL’ lik etanol ve metanol özütleri hazırlanmıştır. Hazırlanan özütlerin sekiz patojen bakteri ve iki patojen maya üzerindeki antimikrobiyal aktiviteleri hesaplanarak sonuçlar çizelgelerde verilmiştir (Çizelge 4.10-4.11). Sadece bir bakteriye karşı oluşturdukları zonları gösteren bir petri resmi seçilerek aşağıda gösterilmiştir (Şekil 4.4). T. spicata var. spicata bitkisinin 50250 mg/ml etanol özütü P. vulgaris bakterisine karşı 50 ve 100 mg’ da inhibisyon göstermezken, diğer konsantrasyonlardaki etki 11, 14 ve 14 mm olarak gözlenmiştir. T. spicata var. spicata bitkisinin etanol özütü P. aeroginosa bakterisine karşı hiçbir etki göstermezken, denenen diğer konsantrasyonlarda 10 ve 10 mm’ lik inhibisyon gösterdiği saptanmıştır. B. subtilis bakterisine karşı 10, 8,5, 12, 12 ve 13 mm’ lik inhibisyon zonu oluşturduğu gözlenmiştir. E. faecalis baktersine ise 50 mg/mL’ de etki oluşturmazken, diğer konsantrasyonlardaki inhibisyon zonları 10, 13, 17 ve 17 mm olarak belirlendi. S. aureus bakterisi için ise inhibisyon zonları 10 13, 23, 23 ve 33 mm olarak olarak belirlenmiştir. E. coli 35218 baktersi için bu değerler 9, 9,10 13 ve 13 olarak ölçülmüştür. B. cereus bakterisi için 50 mg/mL’ de aktivite gözlenmezken diğer konsantrasyonlarda inhibisyon zonları 15, 22, 20 ve 20 mm, B. subtilis baktersi için de 13, 16, 20, 20 ve 20 mm olarak belirlenmiştir. Bitkinin etanol özütünün C. albicans mayasına ve C. tropicalis mayasına karşı 50 ve 100 mg/mL’ de aktivite göstermediği diğer konsantrasyonlarda aktivite gösterdiği ve inhibisyon zonlarının C. albicans mayası için 24, 33 ve 33 mm, C. tropicalis mayası içinse 17, 27 ve 25 mm olduğu gözlenmiştir. Şekil 4.4 T. spicata var. spicata bitki özütünün S. aureus bakterisi üzerine antimikrobiyal etkisini gösteren inhibisyon zonları 83 84 T. spicata var. spicata bitkisinin 50 - 250 mg/mL metanol özütünün P. vulgaris bakterisine karşı oluşturduğu inhibisyon zon çapları 19.3, 20.6, 24.6, 24 ve 24 mm olarak gözlenmiştir. T. spicata var. spicata bitkisinin metanol özütü P. aeroginosa bakterisine karşı ise 15,3, 15,3, 20,6, 21,3 ve 21,3 mm’lik inhibisyon göstermiştir. B. subtilis bakterisine karşı 11,6, 14,3, 14,3, 12 ve 12 mm inhibisyon zonu oluşturmuştur. E. faecalis baktersinde oluşturudukları inhibisyon zonları 12, 14, 14,6, 19,3 ve 19,3 mm olarak belirlenmiştir. S. aureus bakterisi için ise inhibisyon zonları 20, 32,6, 34,6, 35,3 ve 35,3 mm olarak olarak belirlenmiştir. E. coli 35218 baktersi için 50 ve 100 mg/mL’ de inhibisyon gözlenmezken, diğer konsantrasyonlarda inhibisyon 9,3, 11,3 ve 11,3 olarak ölçülmüştür. B. cereus bakterisi için oluşan inhibisyon zonları 10, 12, 16, 16 ve 16 mm, B. subtilis baktersi için 11, 14,3, 14,3, 12, 12 mm olarak belirlenmiştir. Bitkinin metanol özütlerinin etkisi ile C. albicans ve C. tropicalis mayasının büyümesinde hiçbir inhibisyon gözlenmemiştir. 85 86 Sonuç olarak, T. spicata var. spicata bitkisinin etanol özütü incelenen tüm bakteri ve mayalara karşı aktivite göstermiştir. Özellikle S. aureus, E. coli 35218 ve B. subtilis bakterilerine karşı denenen tüm konsantrasyonlarda etkili olurken, E. fecalis bakterisine karşı ise 100 mg/mL’ den itibaren aktif, E. coli 25922 ve B. cereus bakterilerine karşı 100 mg/mL konsantrasyon üzerinde etkili olmuştur. C. albicans ve C. tropicalis mayalarına karşı ise 150 mg/mL konsantrasyon ve sonrası etkili olduğu bulunmuştur. En etkili olduğu bakteri B. subtilis bakterisi olurken denenen iki mayaya karşı da oldukça aktif bulunmuştur. T. spicata var. spicata bitkisinin metanol özütü incelenen E. coli 25922 bakterisi hariç diğer bakterilere karşı aktivite göstermiştir. Bitkinin metanol özütü incelenen mayalara karşı hiçbir aktivite göstermemiştir. Bitki metanol özütü E. coli 35218 bakterilere 150 mg/mL konsantrasyondan itibaren aktivite gösterirken, diğer etkili olduğu bakterile denenen en düşük konsantrasyon olan 50 mg/mL de bile aktif bulunmuştur. Bitkinin en etkili olduğu bakteriler S. aureus, P. vulgaris ve P. aeroginosa bakterisi olarak belirlenmiştir. T. spicata var. spicata bitkisinin etanol ve methanol özütlerinin MIC değerleri materyal ve metotta belirtildiği gibi hesaplanmıştır (Çizelge 4.12). Buna göre bitkinin etanol özütünün B. cereus, B. subtilis, E. coli 35218, E. coli 25922, P. vulgaris, P. aeroginosa, E. fecalis, S. aureus bakterileri için MIC değerleri 12,5 mg/mL, 12,5 mg/mL, 12,5 mg/mL, 12,5 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 12,5 mg/mLl, 25, mg/mL, ve 25 mg/mL’ dir. T. spicata var. spicata bitkisinin methanol özütlerinin MIC değerleri ise B. cereus, B. subtilis, E. coli 35218, E. coli 25922, P. vulgaris, P. aeroginosa, E. fecalis, S. aureus bakterileri için 31,25 mg/mL, 15,62 mg/mL, 31,25 mg/mL, 31,25 mg/L 31,25 mg/L 31,25 mg/L, 31,25 mg/mL ve 31,25 mg/mL olarak hesaplanmıştır. 87 88 4.2.5 H . calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin antimikrobiyal aktivite sonuçları H. calycinum bitkisinin 50-250 mg/mL’ lik etanol ve metanol özütleri hazırlanmıştır. Hazırlanan özütlerin sekiz patojen bakteri ve iki patojen maya üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri çalışılmış ve sonuçlar çizelgelerde verilmiştir (Çizelge 4.13-4.14). Bitkinin etanol özütü antimikrobiyal aktivite sonuçları verilmiştir. H. calycinum bitkisinin etanol özütünün S. aureus bakterisine karşı inhibisyon zonları 24,33, 22, 20, 21, 20 ve 20 mm olarak ölçülmüştür. H. calycinum bitkisi E. fecalis ve E. coli bakterisine karşı denenen konsantrasyonlarda hiçbir aktivite göstermemiştir. Şekil 4.5’de bitkinin S. aureus bakterisine karşı etkisi gösterilmiştir. B. subtilis bakterisine karşı yapılan antimikrobiyal aktivite çalışmaları sonucu oluşan inhibisyon zonları 17, 18, 17,66, 18,5, 18,5 mm şeklinde hesaplanmıştır. B. cereus bakterisi için aynı konsantrasyonlarda zon çapları 22,5, 20,20, 21 ve 19,66 mm olarak bulunmuştur. P. vulgaris bakterisi için 200 ve 200 mg/ml konsantrasyonlarındaki inhibisyon zonu 20 ve 19 mm bulunurken P. aeroginosa bakterisinde hiç bir konsantrasyonda aktivite gözlenmemiştir. Sonuç olarak, bitkinin etanol özütü P. aeroginosa, E. fecalis, E. coli 35218, E. coli 25922 bakterileri üzerine aktivite göstermezken, S. aureus, B. cereus ve B. subtilis bakterilerine karşı oldukça fazla antimikrobiyal aktiviteye sahip oldukları gözlenmiştir. Şekil 4.5 H. calycinum bitkisinin etanol özütünün S. aureus bakterisi üzerine antimikrobiyal etkisi 89 90 H. calycinum bitkisinin metanol özütünün S. aureus bakterisine karşı etkisini gösteren inhibisyon zon çapları 22, 22, 22, 25, 25, 20 ve 20 mm olarak ölçülmüştür. H. calycinum bitkisi, E. fecalis ve E. coli bakterilerine karşı denenen konsantrasyonlarda hiçbir aktivite göstermemiştir. B. subtilis bakterisine karşı yapılan antimikrobiyal aktivite çalışmaları sonucu oluşan inhibisyon zon çapları 20, 20, 20, 20 ve 24 mm şeklinde hesaplanmıştır. B. cereus bakterisi için zon çapları tüm konsantrasyonlarda 25 mm olarak bulunmuştur. P. vulgaris ve P. aeroginosa bakterisinde hiç bir inhibisyon zonu gözlenmemiştir. Çizelge 4.15’de bitkiye ait MIC değerleri gösterilmiştir. 91 92 93 4.3 DPPH Radikal Süpürücü Aktivite 4.3.1 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi L. albus türünün etanol, metanol özütü ve BHT’ nin serbest radikal süpürücü etkileri DPPH kullanılarak ölçülmüştür. Özüt ve DPPH 30 dakika boyunca karanlıkta bekletildikten sonra absorbans değerleri UV-Vis spektrofotometrede 517 nm dalga boyunda ölçülmüş ve % DPPH Radikali Giderme Aktivitesi değerleri hesaplanmıştır. Bitkinin tohumlarında aktivite çok az bulunduğu için deneylere yaprakla devam edilmiş, sonuçlar Çizelge 4.16’da verilmiştir. Bu değerler kullanılarak konsantrasyona karşı % inhibisyon grafiği çizilerek, her iki özüt ve standart karşılaştırılmıştır (Şekil 4.6). L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi standarda yakın bulunmuştur. Bitki oldukça yüksek aktivite göstermiştir. Metanol özütünde etanol özütüne göre biraz daha fazla aktivite gözlenmiştir. Çizelge 4.16 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri Konsantrasyon µg/mL % İnhibisyon Etanol özütü % İnhibisyon Metanol özütü 50 13,46 ± 1,16 23,82 ± 0,23 100 27,42 ± 0,21 35,87 ± 0,96 150 36,06 ± 1,41 46,09 ± 1,46 200 44,27 ± 0,16 54,12 ± 0,07 250 52,26 ± 1,06 58,92 ± 1,40 300 68,20 ± 0,21 78,01 ± 1,06 400 88,10 ± 1,16 95,92 ± 1,40 500 88,27 ± 0,16 95,12 ± 0,07 94 Şekil 4.6 L. albus etanol, metanol özütü ve standartının % inhibisyon değerleri Grafikten DPPH absorbansını %50 oranına indirgeyen konsantrasyon değeri olan IC 50 değeri hesaplanmıştır (Çizelge 4.17). Bitkinin etanol özütü için bu değer 200 µg/mL metanol özütü için de 160 µg/mL olarak hesaplanmıştır. Çizelge 4.17 L. albus bitki özütlerinin IC50 değerleri IC50 (µg/mL) Bitki özütü L. albus etanol özütü 200 L. albus metanol özütü 160 4.3.2 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin serbest radikal süpürücü etkilerine ait % DPPH Radikali Giderme Aktivitesi değerleri Çizelge 4.18’de verilmiştir. Bitki özütlerinin DPPH serbest radikal giderme aktivitelerine ait konsantrasyon-inhibisyon grafiği çizilerek, her iki özüt ve standart karşılaştırılmıştır (Şekil 4.7). C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi standarda yakın oldukça yüksek aktivite göstermiştir. Metanol özütünde etanol özütüne göre biraz daha fazla aktivite gözlenmiştir. 95 C. sativum bitkisinin etanol özütü 1000 µg/µL de dahi sadece %58 inhibisyon gösterdiği için diğer konsantrasyonlarda deneme yapılmamıştır. Bitki özütlerinin grafik üzerinde DPPH absorbansını %50 ye indirgeyen konsantrasyon değeri olan IC50 değeri çok az bulunan etanol özütü için hesaplanmamıştır. Metanol özütünün IC50 değeri ise 110 µg/µl olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.19). Çizelge 4.18 C. sativum bitkisinin etanol özütlerinin % DPPH radikali süpürücü aktivtesi değerleri Konsantrasyon % İnhibisyon % İnhibisyon (µg/ml) Etanol Özütü Metanol Özütü 20 1,6 ± 0,7 9,3 ± 2,6 40 2,2 ± 1,1 12,6 ± 4 60 3,3 ± 0,9 15 ± 4 80 4,8 ± 1,6 22,5 ± 0,8 100 5,2 ± 1,4 26,3 ± 5 150 4,6 ± 0,7 41,3 ± 1,1 200 7,7 ± 1 55,7 ± 0,5 250 10,3 ± 2 59 ± 2 300 13,4 ± 0,8 80 ± 2,6 350 16,6 ± 1,8 73 ± 3 400 16,6 ± 1,8 91,7 ± 1,1 500 24,1 ± 0,7 91 ± 0 600 27,8 ± 2,8 91,7 ± 0,5 700 39,6 ± 8 - 800 44,7 ± 1,1 - 900 53,6 ± 1,1 - 1000 58,6 ± 1,7 - 96 Şekil 4.7 C. sativum etanoli metanol özütü ve starndardın % inhibisyon değerleri Çizelge 4.19 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri Bitki Tür Adı IC50 (µg/µL) C. sativum metanol özütü C. sativum etanol özütü 110 - 4.3.3 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin DPPH serbest radikali süpürücü etkisine ait konsantrasyon-% DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri Çizelge 4.20’de verilmiştir. Bitki özütlerinin DPPH serbest radikal giderme aktivitelerine ait konsantrasyon-inhibisyon grafikleri çizilmiş ve P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi standarda göre daha düşük aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 4.8). Metanol özütünde etanol özütlerine göre daha fazla aktivite gözlenmiştir. Her bir çözücüye ait özütün ayrı ayrı grafikleri çizilerek IC 50 değerleri hesaplanmıştır (Çizelge 4.21). Bitkinin etanol özütü 50 µg/µL metaol özütü ise 38 µg/µl olarak hesaplanmıştır. 97 Çizelge 4.20 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri Konsantrasyon (µg/µL) % İnhibisyon Etanol Özütü % İnhibisyon Metanol Özütü 10 2,6 ± 1,6 16,45 ± 1,48 20 9,8 ± 2,7 16,45 ± 1,48 30 13 ± 3,2 30,05 ± 1,2 40 18,4 ± 0,4 59,90 ± 1,97 50 27,1 ± 1,4 75,85 ± 0,4 100 75,18 ± 1,2 97,06 ± 0,5 125 87,48 ± 2,8 100 ± 0 150 95,50 ± 0,8 - 175 200 98,39 ± 1 98,58 ± 1,9 - Şekil 4.8 P. kurdica bitkisinin etanol, metanol özütleri ve standardın DPPH süpürücü etkisi 98 Çizelge 4.21 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri Bitki Tür Adı IC50 (µg/µL) P. kurdica etanol özütü 50 P. kurdica metanol özütü 38 4.3.4 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi T. spicata var. spicata bitki özütünün DPPH serbest radikali süpürücü etkisini ait konsantrasyon-% DPPH radikali süpürücü aktivitesi değerleri çizelgede verilmiştir (Çizelge 4.22). Bitki özütlerinin DPPH serbest radikal giderme aktivitelerine ait konsantrasyon-inhibisyon grafikleri çizilmiştir (Şekil 4.9). Bu grafiklerden IC50 değerleri hesaplanmıştır. Etanol özütü için 40 µg/mL, metanol özütsi için IC50 değeri 38 µg/mL olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.23). Çizelge 4.22 T. spicata var. spicata etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri Konsantrasyon µg/mL 10 20 30 40 50 60 80 100 150 200 250 300 % İnhibisyon Etanol Özütü 10,06 ± 1,2 20,12 ±1,1 31,19 ±2,6 41,12 ± 0,7 55,10 ±1,2 63,18 ± 0,41 82,95 ± 0,85 87,27 ± 0,56 90,53 ± 0,82 93,61 ± 0,85 93,61 ± 0,85 - 99 % İnhibisyon Metanol Özütü 12,06 ± 1,2 25,79 ± 11 31,19 ± 2,6 55,40 ± 9,6 47,09 ± 9,5 60,12 ± 0,7 75,10 ± 0,41 83,33 ± 2,3 87,01 ± 1,3 88,13 ± 1,5 88,79 ± 1,6 88,53 ± 1 Şekil 4.9 T. spicata var. spicata bitkisinin etanol, metanol özütleri ve standardın DPPH süpürücü etkisi Çizelge 4.23 T. spicata var. spicata bitkisinini etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri Bitki Tür Adı IC50 (µg/µL) T. spicata var. spicata Etanol Özütü 40 T. spicata var. spicata Metanol Özütü 38 4.3.5 H.calycinum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin radikal süpürücü etkisi H. calycinum bitki özütlerinin DPPH serbest radikali süpürücü etkisine ait konsantrasyon % DPPH radikali süpürücü aktivitesi değerleri çizelgede verilmiştir (Çizelge 4.24). Bitki özütlerinin DPPH serbest radikal giderme aktivitelerine ait konsantrasyon-inhibisyon grafikleri çizilmiştir (Şekil 4.10). Bu grafiklerden yararlanılarak IC50 değerleri hesaplanmıştır (Çizelge 4.25). IC50 değerleri etanol ve metanol özütleri için 10 µg/mL den küçük değer gözlenmiştir. 100 Çizelge 4.24 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin % DPPH radikali giderme aktivitesi değerleri Konsantrasyonlar µg/mL % İnhibisyon Etanol Özütü % İnhibisyon Metanol Özütü 10 70,46 ± 3,42 60,23 ± 0,31 20 82,48 ± 1,56 86,43 ± 0,47 30 87,13 ± 0,59 89,53 ± 0,42 40 88,19 ± 1,06 89,81 ± 1,71 50 88,80 ± 0,58 90,57 ± 0,72 60 87,3 ± 0,47 92,3 ± 0,64 80 87,4 ± 0,76 92,9 ± 0,83 100 88,9 ± 0,38 92,9 ± 0,49 Şekil 4.10 H. calycinum bitkisinin etanol, metanol özütleri ve standardın DPPH süpürücü etkisi 101 Çizelge 4.25 H.calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin IC50 değerleri Bitki Tür Adı IC50 (µg/µl) H. calycinum Etanol Özütü < 10 H. calycinum Metanol Özütü < 10 Sonuç olarak, DPPH radikal süpürücü etki denemelerine göre, çalışmada kullanılan bütün bitkilerin IC50 değerlerine bakılarak, en aktif bitkinin H. calycinum türü olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.26). Çizelge 4.26 Çalışmada kullanılan bütün bitkilerin IC50 değerleri IC50 (µg/mL) Etanol Özütü IC50 (µg/mL) Metanol Özütü 200 160 C. sativum - 110 P. kurdica 50 38 T. spicata var. spicata 40 38 < 10 < 10 Bitki özütü L. albus H. calycinum 4.4 Toplam Fenolik İçerik Miktarlarının Belirlenmesi Çalışmada kullanılan bitkilerin etanol ve metanol özütlerinde bulunan toplam çözünebilen fenolik maddeler, Folin-Ciocalteu reaktifi (FCR) ile tayin edilmiştir. Spektrofotmetrede ölçülen absorbans değerleri Çizelge 4.27 de verilmiştir. Gallik asit kullanılarak standart grafik hazırlanmıştır (Şekil 4.11). Standart grafik kullanılarak bitki örneklerinin toplam fenolik madde miktarları mg gallik asit (mg GAE/g özüt) eşdeğeri şeklinde hesaplanmıştır (Çizelge 4.28). 102 Şekil 4.11 Gallik asit standart grafiği Çizelge 4.27 Etanol ve metanol özütlerinin fenolik içerik tayini için UV-Vis spektrofotometrede 760 nm dalga boyunda elde edilen absorbans değerleri Bitki Adı Etanol Özütü Metanol Özütü Lupinus albus (tohum) 0,156 ± 0,01 0,128 ± 0 Coriandum sativum 0,051 ± 0 0,063 ± 0 Lupinus albus (yaprak) 0,191 ± 0 0,193 ± 0 Phlomis kurdica 0,163 ± 0 0,216 ± 0,01 Tymbra spicata var. spicata 0,306 ± 0,02 0,333 ± 0,02 Hypericum calycinum 0.775 ± 0.04 0.609 ± 0.02 En yüksek fenolik madde içerdiği H. calycinum bitkisine ait olarak bulunmuştur. Bu bitkinin etanol ve metanol özütlerinde fenolik madde miktarı 93,63 ± 4,323 ve 74,15 ± 2,428 μg GAE / mg olarak hesaplanmıştır. T. spicata var. spicata bitkisinin etanol ve metanol özütlerininde fenolik madde miktarı 39,75 ve 41,67 μg GAE / mg olarak hesaplanmıştır. P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinde toplam fenolik madde miktarı 21,71 ve 27,86 μg GAE / mg, L. albus yaprak ve tohum örneğinde 25,0 - 103 20,80 ve 25,24-17,52 μg GAE / mg olarak hesaplanmıştır. En düşük fenolik madde miktarı C. sativum bitkisinin etanol özütünde 8,70, metanol özütünde 17,52 μg GAE / mg olarak belirlenmiştir. L.albus ve H. calycinum hariç çalışılan diğer bitkilerin metanol özütlerinde fenolik madde içeriği daha fazla bulunmuştur. Şekil 4.12’de bulunan değerler görsel olarak sunulmuştur. Çizelge 4.28 Bitkilerin gallik asit eşdeğeri olan fenolik madde içerikleri Bitki Özütü Etanol Özütlerinde Toplam Fenolik μg GAE / mg Metanol Özütlerinde Toplam Fenolik μg GAE / mg Lupinus albus (tohum) 20,8 17,52 Coriandum sativum 8,7 9,9 Lupinus albus (yaprak) 25 25,24 Phlomis kurdica 21,71 27,86 T.spicata var. spicata 39,75 41,67 Hypericum calycinum 93,63 74,15 Şekil 4.12 Bitki özütlerinin gallik asit eşdeğeri olan fenolik madde miktarları (Yatay eksen bitki özütlerini gösterirken dikey eksen Gallik asit eşdeğer düzeylerini mg/g düzeyinde gösterir) 104 4.5 L. albus, C. sativum, T. spicata var. spicata, P. kurdica ve H. calycinum Bitki Özütlerinin çeşitli Kanser Hücreleri Üzerindeki Etkisinin MTT Hücre Canlılığı Testi ile Belirlenmesi 4.5.1 Hücre canlılık testi ile sitotoksik etkinin belirlenmesi Çalışma kapsamında L. albus, C. sativum, T. spicata var. spicata, P. kurdica ve H. calycinum bitkilerinin etanol ve metanol özütlerinin hücre canlılığı üzerine etkisini belirlemek amacı ile çeşitli kanser hücrelerine 24 saat boyunca (1-1000 µg/mL) farklı konsantrasyonlarda uygulama yapılmıştır. Uygulama yapılmamış kontrol hücreler ve bitki özütleri ile muamele edilmiş örnekler 4 saat boyunca 37°C’ de 4, 5-dimetil thiazol2-yl)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) ile bekletilmiştir. Hücre canlılığı mitokondrisi aktif olan uygulama yapılmamış hücrelerdeki formazan oluşumuna bağlı olarak mor kristallerin DMSO ile çözünür hale getirilmesinden sonra 540 nm dalga boyunda yapılan kolorimetrik analizine göre % 100 canlı olarak kabul edilmiştir. Uygulama yapılan hücrelerdeki spektrofotometre okuması bu değer ile oranlanarak göreceli hücre canlılığı olarak (%) ifade edilmiştir. 4.5.1.1 L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi L. albus bitkisinin etanol ve metanol özütleri farklı konsantrasyonlarda seyreltilerek HeLa serviks ve MCF-7 meme hücre hatları üzerinde 24 saat boyunca uygulanmıştır. Elde edilen sonuçlar şekillerde verilmiştir (Şekil 4.13-4.14). Denenen özüt konsantrasyonlarında L. albus etanol ve metanol özütleri MCF-7 meme kanseri hücre canlılığına herhangi bir etki göstermemiştir. HeLa hücrelerinde ise hücre canlılığında azalma, ancak etanol özütünün 100 ng/ml’ de sadece % 2 civarında bir hücre canlılığına etki saptanmıştır. Bu nedenle, L. albus için hazırlanan 1ng- 100 mg bitki özütlerinin sitotoksik etki göstermediğine kanaat getirilmiştir. 105 Şekil 4.13 L. albus bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin HeLa serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. Şekil 4.14 L. albus bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. 106 4.5.1.2 C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi C. sativum bitkisinin etanol ve metanol özütleri farklı konsantrasyonlar şeklinde HeLa ve MCF-7 hücreleri üzerinde 24 saat boyunca uygulanmıştır (Şekil 4.15-4.16). En etkili konsantrasyon 1 mg/mL olarak bulunmuştur. Etanol uygulamasının metanol uygulamasına oranla hücre canlılığı üzerine daha etkili olduğu gözlenmiştir. Hücre canlılığının metanol ile özütleme sonucunda 10 mg/ml konsantrasyondan 1 ng/mL C. sativum ekstresi uygulamasına kadar HeLa serviks kanseri hücrelerinde doza bağımlı bir sitotoksik etki gösterdiği saptanmıştır. Ancak bu etki MCF-7 meme kanseri hücrelerinde hücre büyümesinin tetiklenmesi şeklinde görülmüş ve % 25 oranında hücre canlılığında azalma sadece 10 ng/mL C. sativum metanol özütü uygulamasının ardından saptanmıştır. Bu nedenle HeLa hücrelerine oranla MCF-7 hücreleri kişniş uygulamasına karşın dirençli hücre tipi olarak düşünülmektedir. Şekil 4.15 C. sativum metanol ve etanol özütlerinin HeLa serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. 107 Şekil 4.16 C. sativum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme kanseri hücre dizilerinde bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. 4.5.1.3 T. spicata var. spicata bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi T. spicata var. spicata bitkisinin etanol ve metanol özütleri farklı konsantrasyonlar halinde HeLa serviks kanseri ve MCF-7 meme kanseri hücreleri üzerinde 24 saat boyunca uygulanmıştır (Şekil 4.17-4.18). T. spicata var. spicata etanol ve metanol özütleri hem HeLa hücreleri hem de MCF-7 hücrelerinin büyüme potansiyellerini olumlu yönde arttırmıştır. Hücrelerin bölünme hızlarının artması nedeni ile T. spicata var. spicata bitkisinin HeLa ve MCF-7 hücreleri üzerine terapotik etkisinin olmadığına kanaat getirilmiştir. 108 Şekil 4.17 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin HeLa hücreleri üzerine etkisinin MTT hücre canlılığı testi ile gösterilmesi. Kolon grafik beş biyolojik tekrarlı deneyin ortalama sonuçları olarak sunulmaktadır. Şekil 4.18 T. spicata var. spicata bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 hücrelerinde etkisinin MTT hücre canlılığı testi ile gösterilmesi. Kolon grafik beş biyolojik tekrarlı deneyin ortalama sonuçları olarak sunulmaktadır. 109 4.5.1.4 P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin HeLa ve MCF-7 hücreleri canlılığına etkisi P. kurdica bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin farklı konsantrasyonları HeLa ve MCF-7 hücreleri üzerinde 24 saat boyunca uygulanmıştır. Her bir hücre hattı, 1x10 4 hücre olacak şekilde 96 kuyucuklu petrilere ekildikten sonra 24 saat boyunca 1 ng/mL100 g/mL muamele edilmiştir. Hücre canlılığı üzerine bitki özütlerinin etkilerinin gösterilebilmesi amacı ile MTT hücre canlılığı testi uygulanmıştır. En etkili konsantrasyonlar 1 mg ve 5 µg/mL olarak saptanmıştır. 10 ng/mL P. kurdica etanol özütü MCF-7 hücrelerinde % 35 hücre canlılığında azalmaya neden olurken, metanol özütü ise % 40 oranında azalmaya neden olmuştur. Aynı konsantrasyonda HeLa hücrelerine uygulama yapılmasının ardından hücre canlılığında azalma oranları hem metanol hem de etanol özütü için % 42 oranında tespit edilmiştir. P. kurdica için metanol veya etanol uygulaması arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Özütlerin HeLa hücrelerinde (Şekil 4.19) MCF-7 hücrelerine (Şekil 4.20) göre daha etkili olduğu gözlenmiştir. Şekil 4.19 P. kurdica metanol ve etanol özütlerinin HeLa serviks serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi 110 Şekil 4.20 P. kurdica metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme serviks kanseri hücre hatlarında bağıl hücre canlılığına ilişkin beş biyolojik tekrarlı MTT testi sonuçlarının kolon grafik ile gösterimi. Hücre canlılığına ket vuran P. kurdica bitkisinin hücre sağ kalım mekanizması üzerine etkisinin belirlenebilmesi amacı ile zamana bağlı bir şekilde P. kurdica özütü MCF-7 ve HeLa hücrelerine 24 saat boyunca uygulanmış ve uygulama yapılmamış kontrol hücrelere oranla hücrelerin sağ kalım potansiyelleri belirlenmiştir (Şekil 4.21). Bu amaçla 5x104 hücre/mL olacak şekilde iki tekrarlı her bir saat için hücre ekilmiş ve P. kurdica (10 ng/ml) metanol ve etanol özütü uygulanmıştır. Her bir saat diliminde (24-48-72 ve 96 saat) hücreler tripsinlenerek kaldırılmış ve tripan mavisi ile 1:1 oranında karıştırılarak hematositometre yardımı ile ışık mikroskobunda sayılmıştır. Uygulama yapılmamış MCF-7 hücreleri 72. saatten itibaren büyüme grafiği gösterirken, P. kurdica metanol ve etanol uygulamasına tabii tutulan hücrelerin kontrol hücrelere benzer şekilde 72. saatte kadar büyüme eğrisi göstermedikleri ancak kontrol hücrelere göre yaklaşık 3 kat kadar azalma gösterdikleri saptanmıştır. Bu nedenle MTT hücre canlılığı testinden elde edilen veriler hücre sağ kalım testi ile doğrulanmış olup, P. kurdica için metanol veya etanol özütünün hücreler üzerindeki hücre canlılığını baskılayıcı etkisi doğrulanmıştır. Benzer şekilde C. sativum metanol özütü MCF-7 hücreleri üzerindeki sitotoksik etki göstermiş ve hücre sağ kalım potansiyelini indirgemiştir. P. kurdica ve C. sativum 24 saat uygulamasına ardışık olarak hücre sayısında kontrol hücrelere oranla düşüş her iki bitki özütlerinin de sitotoksik etkisine işaret etmektedir. 111 HeLa serviks hücrelerinde ise P. kurdica etanol özütü uygulaması 72 saat boyunca büyüme potansiyelini kontrol hücrelere göre indirgemiş ancak bu etki metanol özütüne göre az olarak saptanmıştır. Hücreler üzerinde sitostatik etki 72. Saat uygulamasını takiben gösterilebilmiştir. Farklı zaman dilimlerinde 96 saat boyunca P. kurdica metanol ve etanol özütü uygulamaları ise HeLa serviks hücreleri üzerinde hücre sayısında azalmaya neden olmamakla birlikte bölünme potansiyeline ket vurarak sitostatik etki göstermiştir (Şekil 4.22). Şekil 4.21 P. kurdica ve C. sativum bitkilerinin metanol ve/veya etanol özütlerinin MCF-7 meme kanseri hücreleri sağ kalım potansiyeli üzerine etkisinin gösterilmesi. 112 Şekil 4.22 P. kurdica ve C. sativum bitkilerinin metanol ve/veya etanol özütlerinin (10 ng/ml, IC50 yaklaşık değer) HeLa serviks kanseri hücreleri sağ kalım potansiyeli üzerine etkisinin gösterilmesi. 4.5.2 H. calycinum bitki özütlerinin PC3, DU145, LNCaP prostat kanseri, MCF-7 meme kanseri, HeLa serviks kanseri hücre dizilerinde hücre canlılık testi ve sağ kalım eğrilerinin belirlenmesi Çalışma kapsamında fenolik içeriği en yüksek ve antioksidan aktivitesi DPPH yöntemine göre en fazla olan tür olarak belirlenen H. calycinum bitkisi PC3 (Androjen reseptörü negatif, p53 içermeyen), DU145 (Androjen reseptörü negatif, p53 mt, LNCaP (Androjen reseptörü pozitif, p53 dogal tip) prostat kanseri, MCF-7 (Östrojen reseptörü pozitif, p53 doğal tip) meme kanseri ve HeLa serviks kanseri hücre dizilerinin canlılığı üzerine etkisi belirlenmiştir. H. calycinum bitkisinin etanol özütlerinin 0-0.5 mg/mL arasında değişen farklı konsantrasyonları PC3, DU145 hücreleri üzerinde 24-48 saat boyunca uygulanmıştır. En etkili konsantrasyonlar 0,2-0,5 mg/mL olarak bulunmuştur. Bitki özütünün PC3 hücrelerine, DU145 hücrelerinden daha etkili olduğu gözlenmiştir. Hücre canlılığını 0,5 mg/mL’lik konsantrasyonun % 50 oranında azalttığı gözlenmiştir. Ayrıca uygulanan bitki özütlerinin zamana bağlı bir şekilde hücre canlılığında azalmaya neden olduğu saptanmıştır (Şekil 4.23). 113 Şekil 4.23 H. calycinum etanol özütünün doza, zamana bağlı olarak hücre canlılığına etkisi H. calycinum bitkisinin metanol özütlerinin LNCap, DU145 ve PC3 prostat kanseri hücre hatlarında etkisi MTT hücre canlılığı testi ile incelendi (Şekil 4.24). Elde edilen sonuçlara göre 1-5 g/mL ve 10-100 ng/mL 24 saat boyunca uygulaması DU145 hücrelerinde etkili olup hücre canlılığında azalmaya neden olmuştur. Şekil 4.24 H. calcinum metanol bitki özütü doza bağlı olarak hücre canlılığına etkisi 114 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin meme kanseri hücreleri üzerindeki etkisini göstermek amacıyla MTT hücre canlılığı testi farklı konsantrasyonlarında bitki özütlerinin (1–1000 µg/mL) 24 saat boyunca uygulama yapılması sonucunda gerçekleştirilmiştir (Şekil 25). En etkili konsantrasyonlar 5, 100 ve 1000 µg/mL olarak bulunmuştur. Metanol veya etanol uygulaması arasında anlamlı bir fark saptanmamıştır. H. calcinum uygulaması özellikle 5 µg/mL konsantrasyon için anlamlı olarak sonraki deneylerde kullanılmak üzere seçilmiştir. Her ne kadar 100 ve 1000 µg/ml konsantrasyon uygulamaları, 5 µg/mL uygulamasında olduğu gibi hücre canlılığını % 50 oranına azaltmış olsa da, hücre kültüründe H. calycinum için kullanılan etanol ve metanol özütlerinin oranının 5 µg/ml dozu için çok az olması nedeni ile apoptotik parametrelerin araştırılması için düşük konsantrasyon uygulaması ile deneylere devam edilmesine karar verilmiştir. Şekil 4.25 H. calycinum etanol ve metanol özütlerinin doza bağlı MCF-7 hücre canlılığına etkisi Ayrıca zamana bağlı olarak MCF-7 meme kanseri hücrelerinde H. calycinum etanol ve metanol özütlerinin hücre sağ kalım sürecine etkileri saptanmıştır. 2x104 hücre ekildikten sonra 72 saat boyunca büyümeye bırakılan hücreler bitki özütlerinin varlığında ve yokluğunda olacak şekilde her 24 saatte bir tripsin ile kaldırılarak tripan mavisi ile boyanmış ve hemositometrede sayılmıştır. Şekil 4.26’da belirtildiği üzere, 115 uygulama yapılmayan MCF-7 meme kanseri hücreleri büyümeye devam ederken, her iki bitki özütleri için ilk 48 saat boyunca sitostatik etki gösterilmiştir. Şekil 4.26 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin uygulamalarının MCF7 hücrelerinin proliferasyonuna etkileri HeLa hücrelerine 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda uygulanan H. calycinum bitki özütlerinin hücre canlılığına etkileri MTT testi ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre etanol, metanol çözücüleri hücrelere % 0,5 sınırını geçmeden uygulanarak hücre canlılığına negatif etkilerinin olmadığı saptanmıştır (Şekil 4.27). Uygulama için 1 mg konsantrasyonun bitki özütü için hücre kültür ortamında yeterince çözünmediği saptanmış olup elde edilen MTT sonuçları değerlendirilmeye alınmamıştır. Bitki özütü için etkin konsantrasyon aralığı 10-100 µg/mL arasında olup daha düşük konsantrasyonlarda kontrole nazaran herhangi bir farklı etki saptanamamıştır. H. calycinum için etanol ve metanol özütleri 10-100 g/mL konsantrasyon aralığında yaklaşık %50 oranında hücre canlılığına ket vurmuştur. H. calycinum için etanol ve metanol özütleri arasında 10-100 g/mL konsantrasyon aralığında anlamlı bir fark saptanamamıştır. 116 Şekil 4.27 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin doza bağlı olarak HeLa serviks kanseri hücre canlılığına etkileri 4.5.3 P. kurdica ve H. calycinum bitkisi etanol ve metanol özütlerinin uygulanan kanser hücre hatlarında morfolojik değişimlerin ters bakışlı ışık ve floresan mikroskobunda gösterimi Çalışma kapsamında P. kurdica ve H. calycinum türlerinde gözlenen hücre canlılığında azalmanın hücrelerde ölümü tetikleyip tetiklemediğini ortaya çıkarmak amacı ile bitki özütlerinin uygulanmasının ardından ölü hücreleri boyayan propidyum iyodür ile muamele yapılmıştır. Propidyum iyodür boyası canlı hücre zarlarından geçmeyen ancak ölü hücrelerin zar yapıları bozulduğu için ölü hücreler tarafından boyanın hücre içerisine alınması ile floresan mikroskobunda ölü hücrelerin ayırt edilmesini sağlayan bir ajandır. Bu amaçla hücre dizileri 10 μg/ml konsantrasyondaki metanol ve etanol özütleri ile 24 saat muamele edilmiştir. Ardından özütlerin sitotoksik ve apoptotik etkilerini belirlemek amacıyla propidium iyodür, 3’,3’-6,4’-diamidino-2-fenilindol ve diheksiloksakarbosiyanin iyodür floresan boyamaları yapılmıştır. Görüntülerin 4x ve 10x büyütmede hem ışık mikroskobunda hem de floresan mikroskobunda fotoğrafları çekilmiştir. 117 4.5.3.1 P. kurdica bitkisinin metanol özütünün uygulanması sonucu kanser hücre hatlarında oluşan morfolojik değişimlerin ters bakışlı ışık ve floresan mikroskobunda gösterimi P. kurdica bitkisinin metanol özütünün 24 saat boyunca HeLa serviks kanseri hücrelerine uygulanmasının ardından 15 dakika boyunca PI boyaması gerçekleştirilmiş ve kontrol hücrelere oranla PI pozitif hücre sayısı artış göstermiştir (Şekil 4.28-4.29). Ayrıca kontrol hücrelerine göre morfolojik değişikliklerin anlaşılabilmesi amacı ile kontrol hücreleri PI boyaması öncesi ışık mikroskobu ile incelenmiş ve az sayıda PI pozitif hücre HeLa serviks kanseri hücre hatlarında saptanmıştır. Şekil 4.28 HeLa hücre hatlarının uygulama öncesi morfolojik görünümleri ve kontrol hücrelerinde hücre ölümünün PI boyaması ile gösterilmesi. 118 Şekil 4.29 HeLa hücre dizilerine doza bağlı P. kurdica metanol özütü uygulamasıyla hücre ölümünün PI boyaması ile gösterilmesi. P. kurdica metanol özütlerinin hücreler üzerinde etkisinin gösterilebilmesi amacı ile gerçekleştirilen bir başka deney setinde DAPI ve DiOC6 gibi apoptotik hücre ölümü markırları kullanılmıştır. Bu amaçla PI boyamaya ek olarak mitokondriyal apoptotik hücre ölümünü görüntülemek için de DiOC6 ve nüklear kondensasyonu görüntülemek için hücreler 30 dakika DAPI ile boyanmışlardır (Şekil 4.30, Şekil 4.31. Şekil 4.32, Şekil 4.33). Şekilde görüldüğü gibi P. kurdica metanol özütü morfolojik bozulmaya sebep olmakta ve apoptozisi tetikleyerek hücre ölümüne neden olduğu gözlenmiştir. 119 Şekil 4.30 HeLa serviks hücrelerinde bitki özütünün uygulanmasından önce DiOC6 boyama gerçekleştirilmesi. 120 Şekil 4.31 HeLa serviks kanseri hücrelerine uygulanan farklı dozlardaki P. kurdica metanol özütünün etkileri. P. kurdica metanol özütünün DNA kondansasyonu üzerine etkisinin gösterilebilmesi için hücreler DAPI ile boyanmış ve sonuçlar floresan mikroskobunda gösterilmiştir. Uygulama yapılmamış kontrol HeLa servikal hücrelerinde DAPI pozitif hücre sayısı az olmasına karşın P. kurdica metanol uygulamasını takiben DAPI pozitif hücre sayısı artış göstermiştir. Bu nedenle 10 ng/ml P. kurdica özütünün apoptotik hücre ölümünü arttırarak hücrelerde hücre canlılığına ket vurduğu sonucuna varılmıştır. 121 Şekil 4.32 Uygulama gerçekleştirilmemiş HeLa kontrol hücrelerinde DAPI boyamasının gösterimi 122 Şekil 4.33 HeLa hücre dizilerine farklı dozlarda uygulanan P. kurdica metanol özütünün etkilerinin DAPI boyaması ile gösterimi 4.5.3.2 H. calycinum bitkisinin metanol özütünün uygulanması sonucu kanser hücre hatlarında oluşan morfolojik değişimlerin ters bakışlı ışık ve floresan mikroskobunda gösterimi Hücre canlılık testinden sonra yapılan hücre boyama testleri sonucu H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MCF-7 meme kanser hücrelerinde mitokondri aracılığı ile oluşturulan apoptozu aktifleştirerek mitokondri membran potansiyelini değiştirdiği gözlendi. Bu amaçla hücreler 24 saat bitki özütüne maruz bırakıldı (konsantrasyon %50 hücre kaybına göre belirlendi). Siyah beyaz görüntüler ışık mikroskobi, renkli görüntüler floresan mikroskobu görüntüleri göstermektedir (Şekil 4.34, Şekil 4.35, Şekil 4.36). 123 Şekil 4.34 H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MCF-7 meme kanser hücrelerinin apoptotik hücre yolağına etkilerinin gösterilmesi Şekil 4.35 MCF-7 meme kanser hücrelerinde H. calycinum metanol ve etanol özütlerinin uygulamasının mitokondri membran potansiyeline etkilerinin görüntüleri 124 Şekil 4.36 H. calycinum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin MCF-7 meme kanser hücrelerinde etkilerinin DAPI ile gösterilmesi (üst sıra 20X, alt sıra 40X) H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütleri MCF-7 meme kanser hücrelerinde mitokondri aracılığı ile oluşturulan apoptozu aktifleştirerek apoptotik hücre yolağındaki etkilerinin gösterilebilmesi amacı ile hücre ölümü (nekroz ve apoptoz) propidyum boyama ile 15 dakika boyunca boyandıktan sonra floresan mikroskobu ile hücreler incelendi (Şekil 4.34). PI boyama sonuçlarına göre metanol ve etanol özütleri MCF-7 meme kanser hücrelerinde ölü hücre sayısında artışa neden olduğu saptandı. Ancak PI boyamanın hücre ölüm tipinin ne olduğu konusunda bilgi vermemesi nedeni ile mitokondri membran potansiyeline ilişkin farklılıkların gözlenebilmesi için DiOC6 ve nüklear kondansasyonu görebilmek için DAPI boyama, hücre özütleri varlığında MCF-7 hücrelerinde gerçekleştirilmiştir (Şekil 4.45 - Şekil 4.46). Elde edilen sonuçlar neticesinde floresan mikroskobunda DAPI ve DiOC6 boyaması sonrasında hücrelerde bitki özütlerinin apoptozu tetikleyen bir ajan olarak değerlendirilmiştir. 4.5.3.3 Apoptotik sürecin moleküler belirteçler ile gösterilmesi Bitki özütleri tarafından tetiklenen apoptotik sürecin moleküler belirteçler ile gösterilebilmesi amacı ile PARP kesimi immunoblotlama yöntemi ile belirlenmiştir (Şekil 4.37). P. kurdica 10 μg/ml konsantrasyondaki metanol özütü 24 saat boyunca 125 HeLa serviks hücrelerine uygulanmasını takiben, PARP kesimi (89 kDa) görülmüş ve bu fragmentin miktarı MCF-7 hücrelerine göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir. MCF-7 ve HeLa hücre hatlarının P. kurdica ile 24 saat muamelesini takiben apoptotik yönden uyarıldığı ancak her iki hücre hattında farklı zaman dilimlerinde apoptozun finale ulaştığı kanaatine varılmıştır. Bu düşünceden hareketle, daha önce apoptotik uyarıyı modellemek için kullanılan hücre sağ-kalım MTT hücre canlılığı ve floresan boyamalara ek olarak kaspaz-9 kesimi her iki hücre hattında da P. kurdica bitkisinin metanol özütünün 24 saat uygulanmasına takiben belirlenmiştir. PARP verilerine benzer şekilde P. kurdica bitkisinin metanol özütü mitokondri yolağını aktive ederek kaspaz-9’ un aktivasyonuna neden olmuştur. Bu nedenle P. kurdica metanol özütü her iki hücre hattı içinde, apoptotik bir ajan olarak önerilebilir. Benzer sonuçlar H. calycinum için MCF-7 ve HeLa hücrelerinde de gösterilmiştir. Bu nedenle bu bitkisel özütlerin mitokondri yolağını ve kaspazlara bağımlı bir hücre ölüm yolağını aktive ettikleri kanaatine varılmıştır. Şekil 4.37 PARP ve Kaspaz-9 parçalanmasının Western Blotlama yöntemi ile gösterimi 4.6 ADA Aktivitesi Ölçümü Dokularda bulunan ADA’nın aktivetisinin ölçülmesi amacıyla, 3 normal kolon dokusu1, 1 Tümörsüz parça-2, rektum 12. cm'den bir doku, 2 tümörlü parça ve 1 de radikal prostat-tümörlü parça kullanılmıştır. Bitki özütlerinden %1 (V/W) çözelti hazırlanıp, 126 örneklere uygulanarak ADA aktivitesi mIU/mg.protein olarak ölçülmüştür (Çizelge 4.29) Çizelge 4.29 Çeşitli dokularda ADA enzimi aktivitesi ADA AKTİVİTESİ (mIU/mg.protein) Homojenat Homojenat + Etanol Homojenat + Metanol 1 2,77 0,82 1 2 2,8 0,64 0,44 3 3,97 1,14 0,9 4 47,96 14,81 8,01 5 12,05 1,83 3,24 6 20,63 10,85 7,44 7 14,78 9,36 8,16 8 4,1 - 2,81 3 Normal Kolon Dokusu-1. 1 Tümörsüz parça-2, Rectum 12. cm'den, 2 Tümörlü parça ve 1 de Radikal Prostat-Tümörlü parçanın ADA aktivitesi sırasıyla 2,77, 2,8, 3,97, 47,96, 12,05, 20,63, 14,78 ve 4,1 olarak bulunmuştur. Etanol özütü ile muamele sonucu 3 Normal Kolon Dokusu-1. 1 Tümörsüz parça-2, Rektum 12. cm'den, 2 Tümörlü parça ve 1 de Radikal Prostat-Tümörlü parçanın ADA aktivitesi sırasıyla 0,82, 0,64, 1,14, 14,81, 1,83, 10,85, 9,36 ve 0 olarak gözlenirken; metanol özütü ile muamele sonucu 1, 0,44, 0,9, 9,01, 3,24, 7,44, 8,16, 2,81 olarak gözlenmiştir. Normal dokularda ADA aktivitesi 2,77 ile 3, 97 arasında değişirken, tümörlü dokularda bu değer 4,1 ila 47,97 arasında değiştiği gözlenmiştir. Bu homojenatlar H. calycinum etanol ve metanol özütleri ile muamele edildiği zaman ADA aktivitesinde oldukça önemli derecede azalma gözlenmiştir. Normal dokular için ADA aktivitesi etanol özütleri ile muamele sonrası 0.64 ila 1,14 arasındaki değerlere gerilerken metanol özütleri ile muamele 127 sonrası 0,44-1 arasına gerilediği gözlenmiştir. Tümörlü dokularda ise etanol özütlerinin ADA aktivitesini 4,1-47,96 arasındaki değerlerden 0-14,81 olacak şekilde inhibe ettiği, metanol özütleri ise 2-81-8,16 gibi çok daha fazla ADA aktivitesini inhibe ettiği gözlenmiştir. 128 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Ülkemizde ölümcül hastalıklar sırasında kardiyovasküler hastalıklardan sonra kanser ikinci sırada yer almaktadır. Kanserler arasında erkelerde akciğer kanseri kadınlarda da meme kanseri birinci sıradadır. Fakat erkeklerde prostat, kadınlarda ise serviks kanseri de oldukça yaygındır. Bütün kanserlerde proronkogenler, virüsler ve tümor baskılaycı genler önemli rol oynamaktadır. Hücre kanserle ilgili genlerdeki mutasyonlar sonucu kontrolsüz olarak çoğalmaya başlamakta ve bazı organ ya da dokularda tumor oluşturmaktadır. Hücrelerin transformasyona uğraması ve bunların çoğalması kanser oluşumunda etkilidir. Günümüzde kanserle mücadelede çok fazla başarıya ulaşılamamıştır. Kemoterapi, radyoterapiye ilave olarak insanlar fitoterapiye de başvurmaktadır. İlaçların ham maddesi olan bitkiler ülkemizde çok sayıda tür ile temsil edilmektedir. 10000’e yakın bitki türünün yayılış gösterdiği ülkemizde yaklaşık 3000 tür endemiktir (Davis 1985). Türkiye’de bu bitkilerden yaklaşık 500 – 900 takson tıbbi ve aromatik bitki olarak kullanılmaktadır. Bitkiler ile ilgili pek çok çalışma yapılmış olmasına rağmen sitotoksik aktivite çalışmaları pek fazla yaygın değildir. Ayrıca bitki türlerinin antimikrobiyal, antioksidan ve sitotoksik aktiviteyi hep birlikte kapsayan çalışmalar da çok fazla değildir. Bu tez ile Türkiye de yayılış gösteren L. albus, C. sativum ve P. kurdica, T. spicata var. spicata ve H. calycinum bitki türlerinin etanol ve metanol özütlerinin biyolojik aktiviteleri araştırılmıştır. L. albus, C. sativum türleri için tohum kullanılmıştır. Diğer türler araziden toplanmıştır. Çalışmamızda ilk olarak, bitkilerin etanol ve metanol özütlerinin yüzde verimlilkleri araştırılmıştır. Bitki özütleri içinde yüzde verimliliğe göre en verimli tür H. calycinum olarak bulunmuştur. Bütün diğer araştırılan türlerde metanol özütü daha verimli iken H. calycinum türünde etanol özütü daha verimli olarak tespit edilmiştir. Daha sonra bitkilerin etanol ve metanol özütlerinin seçilen bazı patojen bakteri ve mayalara karşı antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmeye çalışılmıştır. Denemeler sonucunda P. kurdica, T. spicata var. spicata, H. calycinum bitkisinin seçilen bakterilere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Bu bitkilerin en etkili olduğu mikroorganizma 129 türleri B. subtilis, B. cereus, S. aureus gibi Gram pozitf bakterileri üzerinde etkili olduğu tespit edilmiştir. Mikroorganizmalara kaşı biyolojik aktivite tespit edildikten sonra bitki türlerinin antioksidan aktiviteleri incelenmiştir. Antioksidan aktivite açısından T. spicata var. spicata, P. kurdica ve H. calycinum bitkilerinin oldukça yüksek aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Antioksidan etkisi bilinen fenolik bileşik varlığını belirlemek amacı ile kullanılan bitkilerin etanol ve metanol özütlerinin toplam çözünebilen fenolik maddeleri tayin edilmiş ve fenolik madde miktarları mg gallik asit (mg GAE/g özüt) eşdeğeri şeklinde verilmiştir. Bu sonuçlara göre H.calycinum bitkisinde etanol ve metanol özütünde fenolik madde miktarının en fazla olduğu bulunmuştur. Bu bitkiyi T. spicata var. spicata türü takip etmiştir. Antimikrobiyal, antioksidan ve fenolik madde içeriği tayin edilen bitkilerin etanol ve metanol özütlerinin hücre canlılığı üzerine etkisini belirlemek amacı ile özütler kanser hücre dizileri üzerine uygulanmış ve hücre canlılıkları belirlenmiştir. Çalışılan bitki türlerinden L. albus, T. spicata var. spicata ve C. sativum bitki özütleri serviks kanseri hücre dizisi HeLa ve meme kanseri hücre dizisi olan MCF-7 hücrelerinde uygulanmış ve uygun dozlarda aktiviteye rastlanmamıştır. 1 ng/mL C. sativum metanol özütü ise HeLa hücrelerinde % 39 hücre canlılığında azalmaya neden olurken, etanol özütünün hücre canlılığına etkisi saptanamamıştır. P. kurdica bitkisinin 10 ng/mL etanol özütü MCF-7 hücrelerinde % 35 hücre canlılığında azalmaya neden olurken, metanol özütünün ise %40 oranında azalmaya neden olduğu gözlenmiştir. Aynı konsantrasyonda HeLa hücrelerinde ise hücre canlılığında azalma hem metanol hem de etanol özütü için %42 oranında tespit edilmiştir. En fazla fenolik içeriğe sahip olan H. calycinum özütünün hücre canlılığı üzerine etkisi PC3 (Androjen reseptörü negatif, p53 null), DU145 (Androjen reseptörü negatif, p53 mt, LNCaP (Androjen reseptörü pozitif, p53 doğal tip) prostat kanseri, MCF-7 meme kanseri ve HeLa serviks kanseri hücre dizilerine MTT testi uygulanmıştır. Bitki özütlerinin PC3 hücrelerine, DU145 hücrelerinden daha etkili olduğu gözlenmiştir. Hücre canlılığını 0,5 mg/mL’lik konsantrasyonun % 50 oranında azalttığı gözlenirken 130 uygulanan bitki özütlerinin zamana bağlı bir şekilde hücre canlılığında azalmaya neden olduğu da saptanmıştır. Bu bitki özütünün MCF-7 meme kanseri hücreleri için ilk 48 saat boyunca sitostatik etki gösterdiği bulunmuştur. H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütlerinin MCF-7 meme kanser hücrelerinde mitokondri aracılığı ile oluşturulan apoptozisi aktifleştirerek apoptotik hücre yolağındaki etkileri (nekroz ve apoptoz) incelenmiştir. PI Boyama ile H. calycinum bitkisinin metanol ve etanol özütlerinin apoptotik potansiyele sahip olduğu ve hücre ölümünü tetiklediği gösterilmiştir. Ancak PI boyamanın hücre ölüm tipinin ne olduğu konusunda bilgi vermemesi nedeni ile DAPI boyama hücre özütleri varlığında MCF-7 hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Apoptotik potansiyellerinin anlaşılabilmesi için bitki özütleri ile muamele edilen hücreler DAPI ile boyanarak DNA kondansasyonu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar bitki özütlerinin meme kanseri hücre dizilerinde hücre ölümünü arttırdığını göstermiştir. H. calycinum ve P. kurdica için hazırlanan metanol özütleri MCF-7 meme kanseri ve HeLa serviks kanseri model hücre hatlarında apoptotik etki göstermiş ve mitokondriden türevlenen içsel apoptotik yolağı, mitokondri membranındaki potansiyelin değişimi ve kaspaz-9 un aktivasyonu yolu ile aktive etmiştir. PARP kesimi sonuçları ise PI ve DAPI floresan problar kullanılarak hücre ölümünün modellenmesi şeklinde ortaya çıkan sonuçları desteklemiştir. Bu nedenle bu bitkilerin terapotik etkileri olabileceği sonucuna varılmıştır. Ayrıca ADA aktivitesi ile ilgili yapılan çalışmalarda normal dokularda ADA aktivitesi 2,77 ile 3, 97 arasında değişirken, tümörlü dokularda bu değer 4,1 ila 47,97 arasında değiştiği yani tümörlü dokularda aktivitenin arttığı gözlenmiştir. Bunun üzerine normal ve tümörlü dokular en aktif bitki olarak belirlenen H. calycinum bitkisinin etanol ve metanol özütleri, kontrol ve kanserli dokular ile muamele edilmiş ve ADA aktiviteleri ölçülmüştür. Yapılan ölçümlerde bitki özütleri ile muamele edilen dokularda ADA aktivitesinde oldukça önemli derecede azalma gösterdiği gözlenmiştir. Normal dokular için ADA aktivitesi etanol özütleri ile muamele sonrası 0.64 ila 1,14 arasındaki değerlere gerilerken metanol özütleri ile muamele sonrası 0,44-1 arasına gerilediği 131 gözlenmiştir. Tümörlü dokularda ise etanol özütleri ADA aktivitesini 4,1-47,96 arasındaki değerlerden 0-14,81 olacak şekilde inhibe ettiği, metanol özütlerinin ise 281-8,16 gibi çok daha fazla ADA aktivitesini inhibe ettiği gözlenmiştir. Sonuç olarak, yukarıdaki bütün değerler birlikte ele alındığı zaman bu bitkilerin terapotik etkileri olabileceği sonucuna varılmıştır L. albus bitkisi ülkemizde termiye olarak bilinir. Halk arasında şekeri düşürdüğüne inanılan bitki, hayvan beslemede protein kaynağı olarak kullanılır. Ayrıca kanser gibi oksidatif stres ile ilgili hastalıklarda, kardiyovasküler hastalıklarda, nörodejeneretif hastalıklara iyi geldiği bilinmektedir (Wang ve Clements 2008). El-Shazly vd. (2001)’nın yaptıkları çalışmada tohumlarının antioksidan aktivitelerine bakmışlar ve oldukça yüksek radikal süpürücü aktiviteleri olduğunu rapor etmişlerdir. Ayrıca total fenolik içerik ile radikal süpürücü etki arasında bir ilişkinin olmadığı sonucuna varmışlardır. GLC ve GLC-kütle spektrofotometre analizlerinde L. albus bitkisinde 44 quinolizidine, bipiperidyl ve proto-indole alkaloidleri tanımlamışlardır. Alkaloidal yapının profilinin yaprak, çiçek, kök ve gövde için çıkarmışlar ve bitki özütünün güçlü bir antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu bildirmişlerdir. Bitki özütünü C. albicans, Aspergillus flavus ve B.subtilis bakterisine karşı aktif bulmuşlardır. Bizim yaptığımız çalışmada L. albus tohum özütünün B. subtilis ve B. cereus bakterinse karşı aktiviteleri tespit edilmiş fakat mayalarda aktiviteye rastlanmamıştır. Bitkinin tohumlarının radikal süpürücü aktivitesini de oldukça düşük bulunmuştur. Siger vd. (2012) L. albus ‘un fenolik içeriği ve antioksidant aktivitesi çalışmışlardır. Yapılan çalışmada fenolik asit ve flavonitçe çok zengin olan Lupinus türlerinin toplam fenol içeriği oldukça yüksek bulunurken, fenolik içerik ile radikal süpürücü aktivite arasında bir ilişki bulunmamıştır. Ayrıca türün tohumun antioksidant özelliğe sahip olduğu kaydedilmiştir. Stobiecki vd. (1993) yaptıkları çalışmada alkoloitlerine rağmen in vitro çalışmalarda L. albus özütünün toksik olmadığını gözlemlemişlerdir. Bizim çalışmamızda da bitki meme kanseri ve HeLa hücreleri üzerinde toksik etki göstermemiştir. T. spicata var. spicata bitkisi kekik, zahter olarak bilinir. Yemeklere baharat olarak ilave edilmesinin yanı sıra çay olarak da kullanılmaktadır. Halk tebabatinde astım, bronsit gibi soğuk algınlığı hastalıklarında kullanılmaktadır. İçerisindeki karvakrol ve 132 timol nedeniyle antimikrobiyal aktivitesi oldukça güçlüdür (Baytop 1984). Kilic (2006), T.spicata var. spicata bitkisinin uçucu yağlarının antimikrobial etkisini çalışmış ve bitkinin uçucu yağının C. albicans mayasına ve E. coli, B. subtilis, S. aureus, K. pneumoniae, P aeruginosa, E. faecalis bakterilerine karşı aktif olduğunu kaydetmiştir. Bizim çalışmamızda kullanılan bitkinin özütünün de hem denenen bakterilere hem de C. albicans ve C. tropicalis mayasına karşı oldukça aktif olduğu gözlenmiştir. Bitki uçucu yağlarında Kılıç (2006) karvakrol, p-cymene, beta-myrcene, gamma-terpinene, a-terpinene ve trans-caryophyllene maddelerini belirlemiştir. Bitkinin biyolojik aktivitesinin yüksek olması bu maddeler nedeniyledir. Dirican vd. (2011), T. spicata var. spicata bitkisi ile insan lemfositlerinde yaptıkları calışmada Hg2Cl2 ile indüklenmiş DNA hasarına karşı direnç sağlamada kullanmışlar ve ağır metal ile oluşturlan genotoksiteyi baskılayıcı etkisini rapor etmişlerdir. Avcı vd. (2006) T. spicata var. spicata etanol ve metanol özütlerinin antioksidant aktivitesi çalışmışlar ve bitkinin total kolesterol seviyesini düşürdüğünü kaydetmişlerdir. T. spicata bitkisi terpenoid, iridoid glycosides ve flavonoidlerce zengin olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmamızda da bu bitkinin oldukça yüksek radikal süpürücü aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. Fakat bitkinin meme kanseri ve serviks kanseri hücre dizilerinde sitotoksik aktiviteye rastlanmamıştır. C. sativum Akdeniz, Hindistan, Afrika ve Latin Amerika da yaygın olarak yemeklerde kullanılan bir türdür. Geleneksel tıpta sindirim, solunum ve üriner sistem hastalıklarında kullanılır. Ayrıca antimutajenik, antihipertansif, antioksidan ve antimikrobiyal aktivte varlığı gösterilmiştir (Silva vd. 2011). C. sativum uçucu yağları pek çok bakteriye karşı denenmiştir. Yapılan çalışmalarda, Bacillus cereus ve E. faecalis karşı aktif bulunmazken diğer bakterilere aktiflik gösterdiği gözlenmiştir. Mekanizma olarak bitkinin yağının membrana zarar vererek hücre ölümüne neden olduğu açıklanmıştır. 100 ve 200 mg/kg dozluk C. sativum bitkisinin hemen hemen dizzepama eşdeğer bir şekilde anksiyete önleyici etkisi kaydedilmiştir (Silva vd. 2011). Özbek vd. (2006) bitkinin uçucu yağının başlıca bileşenlerinin % 60-70 linalol, % 6 -terpinen, pinen, kâfur, jeraniol, p-simen, jeranil asetat, limonen, aldehitler, esterler ve alkoller olarak göstermişlerdir. Gıda sanayinde baharat, tentür ve alkollü ve alkolsüz içeceklerde, gıda dışında ise kozmetik ve parfümeride kullanılan bu türün antienflamatuar etkisini 133 çalışmışlar ve etkili olduğunu rapor etmişlerdir. Contore vd. (2004)’de yaptıkları çalışmada, bitkinin uçucu yağının E. coli ve Bacillus megateriuma karşı önemli derecede antimikrobiayal aktiviteye sahip olduğunu bulmuşlardır. Çalışmamızda bitki özütünün P. vulgaris ve mayalar hariç denenen diğer mikroorganizmalara karşı aktif bir etki gösterdiği bulunmuştur. Ayrıca radikal süpürücü etkisinin de oldukça yüksek olduğu gözlenmiştir. Fakat HeLa ve MCF-7 kanser hücre dizilerinde etkin olmadığı belirlenmiştir. Phlomis Türkiye, İran ve Irak da görülen çok güzel çiçekleri olan bir bitkidir. Atinociceptive, anti-inflammatory, antidiabetik, antioksidan, immun baskılayıcı, antimutajenik, serbest radikal süpürücü aktivite ve antimikrobiyal aktivitesi olan bir bitkidir. İçeriğinde sesquiterpenoids, diterpenoids, triterpenoids, triterpene, saponins, flavonoidler vardır. P. kurdica en fazla antitripanozomal aktivitesine sahip türdür. Pekçok Gram negatif ve Gram pozitif bakteriye karşı aktivitesi saptanmıştır. Fakat bu bitki üzerinde pek fazla çalışma yapılmadığını rapor etmişlerdir (Li 2010). Çalışmamızda P. kurdica türünün çalışılan bakterilerin E. coli türü hariç tamamına karşı aktif bulunduğu gözlenmiştir. Fakat mayalara karşı aktivite gözlenmemiştir. Bitkinin radikal süpürücü aktivitesinin oldukça fazla olduğu gözlenmiştir. P. kurdica etanol özütü MCF-7 hücrelerinde % 35 hücre canlılığında azalmaya neden olurken, metanol özütü ise %40 oranında azalmaya neden olmaktadır. Aynı konsantrasyonda HeLa hücrelerinde ise hücre canlılığında azalma hem metanol hem de etanol özütü için %42 oranında tespit edilmiştir. Bitkinin bu çalışmada antikansorejen özelliği gözlenmiştir. Hypericum cinsi 460 türü olan Asya, Amerika ve Avrupa da yayılış gösteren ve halk tıbbında sık kullanılan bir bitkidir. Türkiye de 84 türü bulunmaktadır. Enfeksiyonların tedavisinde solunum ve deri yaralarında kullanılır (Quiney vd. 2006). Bitkinin en aktif içeriği hiperisindir. Antidepresan ve antikanserojen olduğu rapor edilmiştir (Pasqua vd. 2003, Quiney vd. 2006). Tümor oluşumunu apoptoz yoluyla inhibe ettiği ve pregran X reseptöre bağlanma için yarışçıl bir etkiye sahiptir. Bu reseptör çoklu CYP450 genlerini ve P-gpyi kodlayan MDR1 genlerinin transkripsiyonunu düzenler (Quiney vd. 2006). İçerdiği biyoaktif fitokimyasalların antioksidant ve antikanser aktivitelerini düzenlediği düşünülmektedir (Silva vd. 2005). H. calycinum özütünün yüksek konsantrasyonlarının 134 hücre çoğalmasına ket vurucu etkisi bilinmekle birlikte H. calycinum sitotoksik denemeleri sonucunda SW480 hücrelerinde bu etki modellenmiştir (Duggans 2011). Maggi vd. (2010) ana içeriklerinin sesquiterpene hidrakarbon olduğunu kaydetmişler ve bitkinin uçucu yağının B. subtilis’e karşı çok aktif, C. albicans ve S. aureus, karşı orta derecede E. coli ve E. faecalis bakterilerine karşı zayıf aktivitede olduğunu kaydetmişlerdir. Çalışmamızda ise bitki özütünün S. aureus, B. cereus ve B. cereus’a karşı çok aktif olduğu E. coli ve E. faecalis bakterilerine karşı aktivite göstermediği gözlenmiştir. Kirmizibekmez vd. (2009) bitki özütünün yüksek radikal süpürücü aktivetesi olduğunu kaydetmişlerdir. Çalışmamızda da bitki yüksek oranda radikal süpürücü aktivite göstermiştir. Güzey (2007) H. perforatum ile ilgili yaptığı sitotoksik aktivite çalışmalarında, türün sitotoksik ve antiproliferatif olduğunu bildirmiştir. Duggans (2011) yılında yaptığı Çalışmamızda HeLa, MCF-7 kanser hücre hatlarında P. kurdica’nın metanol özütü ile HeLa, MCF-7 ve prostat kanseri hüre hatlarında H. calycinum’un etanol ve metanol özütlerinin hücre çoğalmasını inhibe etiği gözlenmiştir. Bu bitkiyle yapılacak olan daha sonraki çalışmalarda bu özütün içeriğindeki maddeler araştırılarak, etken maddenin tespit edilmesi ve biyolojik etkilerinin araştırılması tavsiye edilmektedir. 135 KAYNAKLAR Agostinis, P., Vantieghem, A., Merlevede, W., Witte, P. 2002. Hypericin in Cancer Treatment: More Light on the Way, Int. J. Biochem. Cell Biol., 34, 221–241. Akkuş, G. 1995. Serbest Oksijen Radikalleri ve Fizyopatolojik Etkileri. Mimoza Basım Yayın ve Dağıtım. pp:1-20, Konya. Allen, R. G., Tresini, M. 2000. Oxidative Stress and Gene Regulation. Free Radic Biol Med. 28:463-499. Anderson, D.E. 1974. Genetic Study of Breast Cancer. Identification of A Hight Risk Group. Cancer 53:1090-1097. Anderson, R.A. 2007. Prescribing Antioxidants. Chapter 103, P.1083-1094, In: Rakel:Integrative Medicine, 2nd Ed., Saunders. Apaydın, I. 2003. Meme Kanseri ile Hipoksi ile İndüklenen Faktör (HIF-1) Alfa Gen Polimorfizmleri Arasındaki İlişkinin Belirlenmesi. Gazi Üniv. Sağlık Bilimleri Ens. Tıbbi Biyoloji ve Genetik ABD. Yüksek Lisans Tezi. Arıcı, K. 1993. Uygulamalı Anatomi. Türkiye Klinikleri Yayınevi, Ankara. Arisan E.D., Kutuk O., Tezil T., Bodur C., Telci, D., Basaga, H. 2010. Small Inhibitor of Bcl-2, HA14-1, Selectively Enhanced The Apoptotic Effect of Cisplatin By Modulating Bcl-2 Family Members in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells. Breast Cancer Research And Treatment, 119 (2):271-281. Ashok, B.T., and Ali, R. 1999. The Aging Paradox: Free Radical Theory of Aging. Exp Gerontol, 34 (3), 293-303. Avcı, G., Kupeli, E., Eryavuz A., Yesilada, E., Kucukkurt, İ. 2006. Antihypercholesterolaemic and Antioxidant Activity Assessment of Some Plants Used As Remedy in Turkish Folk Medicine Journal of Ethnopharmacology 107(418–423). Aydın, S. 1996. Kekik (Origanum onites L.) Yağ Altı Suyunun Farmakolojisi. Anadolu Ü. Eczacılık Fakültesi Doktora Tezi 229 sayfa, Eskişehir. Ayhan, A., Durukan, T., Günalp, S. 2008. Temel Kadın Hastalıkları ve Doğum Bilgisi. Güneş Tıp Kitapevleri, Ankara, 1046-1048. Baganha, M.F., Pego, A., Lima, M.A., Gaspar, E.V., Cordeiro, A.R. 1990. Serum and Pleural Adenosine Deaminase. Correlation With Lymphocytic Populations. Chest. 97(3):605-10. Balbay, D. 2008. Prostat.Güneş Kitap Evi, Ankara 3:39-42. Balis, M. E. 1985. Adenosine Deaminase and Malignant Cells. Ann N Y Acad Sci. 451:142-149. Başer, K. H. C. 1993. Essential Oils of Anatolian Labiateae: A Profile. Acta Horticulturae, 333: 217-237. 1994. Essential oils of Lamiaceae from Turkey: Recent Results Lamiales Newsletter 3, 6-11. Türkiye Başer, K. H. C. 2000. Uçucu Yağların Parlak Geleceği. Tıbbi ve Aromatik Bitkiler Bülteni Sayı: 15, Anadolu Üniversitesi Tıbbi ve Aromatik Bitki ve İlaç Araştırma Merkezi, Eskişehir. 136 Bayrak, A., Korkut H. 1995. Bazı Tohum Baharatların (Umbelliferae) Yağ Asidi Kompozisyonu ve Özellikle Petroselinik Asit Miktarları Üzerinde Araştırmalar II, Standarat Der., 400, 120-126. Baytop T. 1999. Türkiye’de Bitkiler ile Tedavi. İstanbul Üniversitesi Basımevi, No:3255. Baytop, T. 1994. Türkçe Bitki Adları Sözlüğü Atatürk, Dil ve Tarih Kurumu Yayınları: 578, Ankara Becker, E.M., Nıssen, L.R., Skıbsted, L.H. 2004. Antioxidant Evaluation Protocols: Food Quality Or Health Effects. Eur. Food Res. Technol., 219: 561-571. Berek, J. S. 2004. Novak Jinekoloji. Erk, A., Nobel Tıp Kitapevleri, İstanbul, 79-82, 134-135, 1124. Bergendi, L., Benes, L., Durackova, Z.,Ferencik, M. 1999. Chemistry, Physiology and Pathology of Free Radicals. Life Sci, 65 (18-19), 1865-1874. Bergmeyer, H.U. 1974. Enzyme Activities. Methods of Enzymatic Analysis. Verlag Chemia, G.m.b.H. Weinheim, Bergest Bernards, R. 1999. CDK-Independent Activities of D Type Cyclins. Biochimica Et Biophysica Acta 1424 (2-3):M17-22 Betterıdge, D.J. (2000). What Is Oxidative Stress? Metabolism, 49: 3-8 Blois, M.S. 1958. Antioxidant Determinations by Use of A Stable Free Radical. Nature. 181:1199-1200. Bondy, D., Bondy, P., Freinstein, A., Fishman, A. 1985. The Merck Manuel Teşhis ve Tedavi El Kitabı. 4. Baskı Merck Yayıncılık. Borek, C., Ong, A., Mason, H., Donahue, L., Biaglow, J. E. 1986. Selenium and Vitamin E Inhibit Radiogenic and Chemically Induced Transformation In Vitro Via Different Mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA.;83:1490-1494. Bosch, F. and Munoz, N. 1989. Human Papilomavirus and Cervical Neoplasia: A Critical Rewiew of The Epidemiological Evidence”, IARC Sci. Publ., 94:135. Bowler, R.P., Barnes, P.J., Crapo, J.D. 2004. The Role of Oxidative Stres in Chronic Obstructive Pulmonary Disease.” Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 1(2), 255-277. Bowles and Leyser Phillipson, J.D., 1994. Plants As Sourche of Voluable Products From Plant Tissue Culture. P.1-21. Proceedings of The Phytochemical Society of Europe.30, Clarendon Pres,Oxford. Bowles, D. and Leyser, O. 1994.‘TheBig Green Book’ Plant Biotechnology – Centre for exploitation of science and technology (CEST). Bratt, O. 2002. Hereditary Prostate Cancer: Clinical Aspects. J Urol.168: 906-13. Carr, A. C., McCall, M. R., Frei, B. 2000. Oxidation of LDL by Myeloperoxidase and Reactive Nitrogen Species: Reaction Pathways And Antioxidant Protection. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20 (7), 1716-1723. Carson, D.A., Seegmiller, J.E. 1976. Effect of Adenosine Deaminase Inhibition Upon Human 137 Carter, B. S., Bova, G. S., Beaty, T. H., Steinberg, G. D., Childs, B., Isaacs, W. B., Walsh, P. C. 1993. Hereditary Prostate Cancer: Epidemiologic and Clinical Features. The Journal of Urology 150 (3):797-802 Carter, B.S., Beaty, T.H., Steinberg, G.D., Childs, B., Walsh, P.C. 1992. Mendelian Inheritance of Familial Prostate Cancer. Proc Natl Acadsci U.S.A. 89: 336771. Ceylan, A. 1987. Tıbbi Bitkiler II (Uçucu Yağ içerenler). Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları No: 481, 188, İzmir. Cha, Y-Y., Lee, E-O., Lee, H-J., Park, Y-D., Ko, S-G., Kim, D-H., Kim, H-M., Kang, IC., Kim, S-H. 2004. Methylene Chloride Fraction of Scutellaria Barbata Induces Apoptosis in Human U937 Leukemia Cells via The Mitochondrial Signaling Pathway. Clinica Chimica Acta, 348: 41– 48. Chen, S.H., Ochs, H.D., Scott, C.R. 1978. Adenosine Deaminase Deficiency. J Clin Invest. 62:1386-1389. Cherubini, A., Ruggiero, C., Polidori, Mc., Mecocci, C. 2005. Potential Markers of Oxidative Stress In Stroke. Free Radic Biol Med. 39:841–852. Chiueh, C.C. 1999. Neuroprotective Properties of Nitric Oxide. Ann N Y Acad Sci, 890, 301-311. Chopra, M., Thurnham, D. I. 1999. Antioxidants and Lipoprotein Metabolism. Proc. Nutr. Soc., 58: 663-671. Ciliv, G., Emerk, K., Karan, A. 1980. İnsan Biyokimyasına Giriş. 2. Baskı. Hacettepe Uni. Yayınları Ankara. 266-267. Cohen, J.H., Kristal, A.R.,Stanford, J.L. 2000. Fruit and Vegetable Intakes and Prostate Cancer Risk. J Natl Cancer Inst, 92 (1), 61-68. Collin, F., Edwards, S. 1998. Plant Cell Culture-Introduction to Biotechniques s.103120 Scientific Publishers Limited, Oxford. Collins-Pavao M., Chin C.K.,Pedersen H. 1996. Taxol Partitioning in Twophase Plant Cell Cultures of Taxus brevifolia. J. Biotechnol. 49: 95-100. Cristalli, G., Costanzi, S., Lambertucci, C. 2001. Adenozsine Deaminase: Function Implications and Different Classes of Inhibitors. Med Res Rev. 21: 105-28. Crozat, A., Palvimo, J.J., Julkunen, M., Janne, O.A. 1992. Comparison of Androgen Regulation of Ornithine Decarboxylase and S-Adenosylmethionine Decarboxylase Gene Expression In Rodent Kidney And Accessory Sex Organs. Endocrinology 130 (3):1131-1144 Cruthırds, D.l., Novak, L., Akhı, K.M,., Sanders, P.W., Thompson, J.A. 2003 Mitochondrial Targets of Oxidative Stress During Renal Ischemia/Reperfusion. Archives Biochemistry And Biophysics, 412, 27-33. Dağlı Ü., Balk M., Yücel D., Ülker A., Över H. 1997. The Role of Reactive Oxygen Metabolites in Ulcerative Colitis. Inflammatory Bowel Diseases, 3(4),260-264. Dauer, W., Przedborskı, S., 2003. Parkinson’s Disease: Mechanism and Models. Neuron, 39, 889-909. Deaminase in Typhoid Fever. Scand J Infect Dis. 13(1):47-50. 138 Davis, P.H. 1984. Flora of Turkey and The East Aegean Islands, Vol: 4, Edinburgh University Press. Davis, P.H. 1988. Flora of Turkey and the East Aegean Islands, I-X, Edinburgh Press. Demirtas, I., Sahin, A., Ayhan, B., Tekin, S., Telci, I. 2009. Antiproliferative Effects of the Methanolic Extracts of Sideritis libanotica Labill. subsp. linearis. Rec. Nat. Prod., 3: 104-109. Dilsiz, N. 2009. Moleküler Biyoloji 2. Baskı”, Palme yayıncılık, Ankara, 197-198. Dirican., E., Turkez, H., ToğAr, B. 2012. Modulatory Effects of Thymbra Spicata L. Different Extracts Against The Mercury Induced Genotoxicity In Human Lymphocytes In Vitro Cytotechnology 64:181–186 Doğan, A., Bayrak, A., Akgül, A. 1984. Türk Kişnişlerinin Uçucu Yağ Verimi Ve Uçucu Yağların Bileşenleri. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yıllığı 34 (1,2,3,4) 213-220. Doğan, A., Akgül, A. 1987. Kişniş Üretimi, Bileşimi ve Kullanımı. Doğa Türk Tarım ve Ormancılık Dergisi, 11, 2, 326-333. Donma, M. M., Donma, O. 1996. Diagnostic Efficacy of Adenosine Deaminase for Future Therapeutic Approaches in Immuno-Deficiency Disorders. Lab. Med. Intern. 13:16-19. Drake, R.L., Vogl, W., Mitchell, A.W.M. 2005. Gray’s Anatomy For Studensts. Churchill Livingstone Dvorackova, J., Ceganova, L., Sterba, J., Nedbalek, A., Kolar, Z. 2006. Proliferative and Apoptotic Markers İn Prostate Carcinoma in Relation to Androgen Receptor. Ceskoslovenska Patologie 42 (3):125-129 El-Shazlya, A., Abdel-Monem, M., Wink , A., Wink, M. 2001. Quinolizidine Alkaloid Profiles of Lupinus Varius Orientalis, L. Albus Albus, L. Hartwegii, and L. Densiflorus Z. Naturforsch. 56c, 20-30 Erkan Topuz, Adnan Aydıner, Maktav Dinçer. 2003. Meme Kanseri. Nobel Tıp Kitapevleri. Erkoçak, A. 1982. Özel Histoloji. 4. Baskı Ankara. Ankara Tıp Yayını 1982 Eroglu, A., Canpolat, O., Demirci, S. 2000. Activities of Adenosine Deaminase and 5’Nucleotidase In Cancerous and Noncancerous Human Colorectal Tissues. Med Oncol. 17:319-24 Ferris, I.T.J., Garcia, I.C.J., Berbel-Tornero, O., Ortega-Garcia J.A. 2011. Constitutional Risk Factors In Prostate Cancer. Actas Urologicas Espanolas 35 (5):282-288 Foote, C.S. 1985. Chemistry Of Reactive Oxygen Species. In Chemical Changes İn Food During Processing, T. Richardson And J.W. Finley (Eds), Pp:17-32. Van Nostrand Rainhold Company, New York. Foster, C.S., Bostwick, D.G., Bonkhoff, H., Damber, J.-E, Kwast, T.V.D., Montironi, R., Sakr, W.,. 2000. A Cellular and molecular pathology of prostate cancer precursors. Scand J Urol Nephrol Suppl., 205:19-43. Fridovich, I. 1997. Superoxide Anion Radical (O2– •), Superoxide Dismutases, and Related 139 Fridovich, I. 1999. Fundamental Aspects of Reactive Oxygen Species, or What’s The Matter Galanti, B., Nardiello, S, Russo, M., Fiorentino, F. 1981. Increased Lymphocyte Adenosine Ghafourifar, P., Cadenas, E. 2005. Mitochondrial Nitric Oxide Synthase. Trends Pharmacol Sci, 26 (4), 190-195. Giusti, G. 1974. In: Methods of Enzyme Analysis. Bergmayer ed. New York Academic Press Inc. Goldberg, D. M. 1965. Serum Adenosine Deaminase in The Differential Diagnosis of Jaundice. Brit Med J. 1: 353-355 Gökbulut, İ. 2000. Çeşitli Göğüs Hastalıklarında Bronşial Lavaj Sıvısı ve Plazmada Ksantin Oksidaz ve Adenozin DEaminaz Aktiviteleri ile Nitrik Oksit ve Malondialdehit Seviyeleri Yüksek Lisans Tezi. Malatya, 47 s. Gözükara, E 1994. Biyokimya 2. 2. Baskı, Evin Matbaası, Malatya 665-666. Greenlee, R. T., Murray, T., Bolden, S. 2000. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 50: 733 Guemori, L., Artur, Y., Herbeth, B., Jeandel, C., Cunny, G., Siest, G. 1991. Biological Variability of Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase In Blood. Clin. Chem. 37:1932-1937. Guijon, F. B., Paraskaves, M., Brunham, M. 1985. The Association of Sexually Transmitted Diseases With Cervical Intraepithelial Neoplasia: A Case Control Study. Am. J. Obsteret. Gynecol., 151: 185. Gutteridge, J. M. 1993. Free Radicals In Disease Processes: A Compilation of Cause And Consequence. Free Radic Res Commun. 19:141-158. Gürtunç, E. 2007. Meme Kanserli Hastalarda CYP19 Geni Kodon 39 Trp/Arg Polimorfizminin ve Genotip Dağılımının Araştırılması. Çukurova Üniv. Sağlık Bilimleri Ens. Tıbbi Biyoloji ABD. Yüksek Lisans Tezi. Güzey G. 2007. A549, HeLa ve NIH3T3 Hücre Kültürlerinde Hypericum Perforatum, Hypericum Montbrettii ve Hypericum Origanifolium Türlerinin Sitotoksik ve Antiproliferatif Etkileri. Anadolu Üni, Sağlık Bilim Enst. Doktora tezi. Halliwell, B. 1992. Reactive Oxygen Species and The Central Nervous System. J Neurochem, 59 (5), 1609-1623. Halliwell, B. 1993. The Role of Oxygen Radicals in Human Disease, With Particular Reference To The Vascular System. Haemostasis, 23 (Suppl. 1): 118-126. Halliwell, B. 1994. Free Radicals and Antioxidants: A Personal View.” Nutrition Reviews, 52(8), 253-265. Halliwell, B. 1997. Antioxidants and :Human Diseases: A General İntroduction. Nutr. Rev., 55: S44-S52. Halliwell, B. 1999. Antioxidant Defence Mechanisms: From The Beginning To The End (of The Beginning). Free Radic. Res., 31: 261-272. Halliwell, B. 2006. Reactive Species and Antioxidants Redox Biology is A Fundamental Theme of Aerobic Life. Plant. Physiol., 141: 312-322. 140 Halliwell, B. and Gutteridge J. M. C. 1985. The Importance of Free Radicals and Catalytic Metal Ions In Human Diseases. Mol Aspects Med, 8 (2), 89-193. Halliwell, B. and Gutteridge J. M. C. 2007. Free Radicals in Biology and Medicine. Newyork: Oxford Uni. Press Inc. 55-79. Halliwell, B., Murcia, M.A., Chirico, S.,Aruoma, O.I. 1995. Free Radicals and Antioxidants In Food and In Vivo: What They Do and How They Work. Crit Rev Food Sci Nutr, 35 (1-2), 7-20. Hanahan, D., Weinberg, R. A. 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell 100 (1):57-70. Hawkins, C.l., Davies M.J. 1998. Degradation of Hyaluronic Acid, Poly- And MonoSaccharides, and Model Compounds by Hypochlorite: Evidence For Radical İntermediates and Fragmentation. Free Radical Biology And Medicine, 24(9), 1396-1410. Hengartner, M.O. 2000. The Biochemistry of Apoptosis. Nature 407 (6805):770-77. Hıpkiss, A.R. 2007. Biological Aspects Of Ageing. Psychiatry, 6(12), 476-479. Hillebrand, D. J., Runyon, B. A., Yasmineh, W. G., Rynders, G. P. 1996. Ascitic Fluid Adenosine Deaminase Insensitivity In Detecting Tuberculous Peritonitis In The United States. Hepatology. 24(6):1408-12. Hirata, H., Takahashi, A., Kobayashi, S., Yonehara, S., Sawai, H., Okasaki, T., Yamamoto, K. and Sasada, M. 1998. Caspases Are Activated in a Branched Protease Cascade and Control Distinct Downstream Processes in Fas-Induced Apoptosis. J. Exp. Med. 187: 587-600. Hondelmann, W. 1984. The lupin-ancient and modern crop. Theor App Genet. 68: 1–8. Hornok, L. 1992. The Cultivation of Medicinal Plants. Cultivation and Processing of Medicinal Plants (Ed. L. Hornok), Budapest, pp. 131-136. Hoover, R. 1996. Breast Cancer: Geographic, Migrant and Time-Trend Patterns In: Fortner JSP, Ed Accomplishments In Cancer Research. New York: Lippincott Raven. Hovi, T., Smyth, J. F., Allison, A. C., Williams, S. C. 1976. Role of Adenosine Deaminase in Lymphocyte Proliferation. Clin Exp Immunol. 23(3):395-403. http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info/ cancerstats /world/the-global-picture/ http://www2.tbmm.gov.tr/d24/7/7-3626sgc.pdf 2012 http://journals.prous.com/journals/dof/ 20032809/html/ df280881/images/Kong_f1.gif http://www.prostatitis3d-cure.com/prostatitis.html http://www.nlm.nih.gov/ medlineplus/ ency/ imagepages/17084.htm http://www.servikskanseri. com/serviks_kanseri/ i/img_serviks_enfeksiyon.jpg http://www.fotonatura.org/ galerias/ fotos/333538 http://www.henriettesherbal.com http://www.senteursduquercy.com 141 Huber-Morath, A., 1982, Phlomis L. in Davis, P.H., ‘Flora of Turkey and East Aegean Islands’, Edinburg Univ. Prass., vol. 7, pp. 102-126, Edinburgh Huerta, S., Goulet, E.J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E.H. 2006. Screening and Detection Of Apoptosis. Journal of Surgical Research, 139: 143–156. Huncharek, M., Muscat, J., Kupelnick, B. 2008. Dairy Products, Dietary Calcium and Vitamin D Intake As Risk Factors For Prostate Cancer: A Meta-Analysis of 26,769 Cases From 45 Observational Studies. Nutrition And Cancer 60 (4):421-441. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T., Thun, M.J. 2008. Cancer Statistics, Ca Cancer J Clin. 58: 71-96. Jin, Y.H., Yoo, K.J., Lee, Y.H., Lee, S.K. 2000 Caspase 3-Mediated Cleavage Of P21waf1/CIP1 Associated With The Cyclin A-Cyclin-Dependent Kinase 2 Complex İs A Prerequisite For Apoptosis İn SK-HEP-1 Cells. The Journal Of Biological Chemistry 275 (39):30256-30263 Johansson, M., Persson, J.L. 2008. Cancer Therapy: Targeting Cell Cycle Regulators. Anti-Cancer Agents In Medicinal Chemistry 8 (7):723-731 Kellems, R. E., Yeung, C. Y., Ingolia, D. E. 1985. Adenosine Deaminase Deficiency and Severe Combined Immunodeficiencies. Trends Genetic, 1:278-283. Khandrika, L., Kumar, B., Koul, S. 2009. Role of Oxidative Stress In Prostate Cancer. Cancer Lett. 282(2):125-136. Kerley,S.,J, Huyghe, C. 2001. Comparison of Acid and Alkaline Soil and Liquid Culture Growth Systems For Studies of Shoot and Root Characteristics of White Lupin (Lupinus albus L.) genotypes. Plant and Soil. 236 (2): 275–286. Kılıç. T. 2006. Analysis of Essential Oil Composition of Thymbra Spicata Var. Spicata: Antifungal, Antibacterial and Antimycobacterial Activities. Z Naturforsch C. 61(5-6):324-8. Kirmizibekmez, H., Bassarello, C., Piacente, S., Celep, E., Atay, I., Mercanoğlu, G., Yeşilada, E. 2009. Phenolic Compounds From Hypericum Calycinum and Their Antioxidant Activity. Nat Prod Commun. 4(4):531-4 Klatt, P.,Lamas, S. 2000. Regulation of Protein Function By S-Glutathiolation in Response To Oxidative And Nitrosative Stress. Eur J Biochem, 267 (16), 4928-4944. Koizumi, H., Ohkawara, A. 1992. Adenosine Deaminase Activity in Sera of Patients with Psoriasis, Mycosis Fungoides and Adult T Cell Leukemia. Acta Derm Venereol 72:410-412. Korycka-Dahl, M. B., Richardson, T. 1978. Activated Oxygen Species and Oxidation of Food Constituents. CRC Crit Rev Food Sci Nutr, 10 (3), 209-241. Kosova, F., Arı, Z.,. 2011. Prostat kanseri ve apoptozis ilişkisi. Klinik ve Deneysel Araştırma Dergisi, 2: 124-131. Kösecik, M., Erel, Ö., Sevinç, E., Selek, S. 2005. Increased Oxidative Stress In Children Exposed To Passive Smoking. International Journal Of Cardiology, 100(1), 6164. 142 Kulkarni, A.A. 2000. Mikropropagation and Secondery Metbolite Study in Taxus spp. and Withannia Somnifera (L) Dunal, DSc Thesis, National Chemical Laboratory, Pune. Lee, J., Koo, N., Min, D. B. 2004. Reactive Oxygen Species, Aging, and Antioxidative Nutraceuticals. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 3 (1), 21-33. Li, M.X., Shanga, X. F., Jia Z.P., Zhanga, R. X. 2010. Phytochemical and Biological Studies of Plants From The Genus Phlomis Chemistry & Biodiversity. 7 (283301) Lipponen, P., Aaltomaa, S., Koşma, V.M., Syrjanen, K. 1194. Apoptosis in Breast Cancer as Related to Histopathological Characteristics and Prognosis. Eur J Cancer. 14:2068-73. Loaiza, J., Cantwell, M. Postharvest. 1997. Physiology and Quality of Cilantro (Coriandrum sativum L.) Hort Science, 32 (1), 104-407. Lonergan P. E., Donald, J. T. 2011. Androgen Receptor Signaling in Prostate Cancer Development and Progression. J Carcinog. 10:20.Lymphocyte Blastogenesis. J Clin Invest. 57(2):274-82. Lynch, H. T., Mulcaht, G. M., Lynch, P. 1976. Genetic Factors in Breast Cancer. A survey. Pathol Ann. 11:77-101. Maggi, F., Cecchini, C., Cresci, A., Coman, M.M., Tirillini, B., Sagratini, G., Papa, F., Vittori, S. 2010. Chemical Composition and Antimicrobial Activity of The Essential Oils From Several Hypericum Taxa (Guttiferae) Growing in Central Italy (Appennino Umbro-Marchigiano). Chem Biodivers. 7(2):447-66. Marnett, L.J. 2000. Oxyradicals and DNA Damage. Carcinogenesis, 21: 361-370. Mates, J.M., Perez-Gomez, C., Nunez De Castro, I. 1999. Antioxidant Enzymes and Human Diseases. Clin. Biochem., 32: 595-603. Mesquita, M.L., Paula, J.E., Pessoa, C., Moraes, M.O., Costa-Lotufo, L.V., Grougnet, R., Michel, S., Tillequin, F., Espindola, L.S. 2009. Cytotoxic activity of Brazilian Cerrado plants used in traditional medicine against cancer cell lines. J Ethnopharmacol., 123 (3): 439–445. Mccord, J. M., Frıdovıch, I. 1969. Superoxide Dismutases: An Enzymatic Function For Erythrocuprein (Hemocuprein). J. Biol. Chem. 244: 6049-6055. McPhie, D.L., Coopersmith, R., Hines-Peralta, A., Chen, Y., Ivins ,K.J., Manly, S.P., Kozlowski, M.R., Neve, K.A., Neve, R.L. 2003. DNA Synthesis and Neuronal Apoptosis Caused By Familial Alzheimer Disease Mutants of The Amyloid Precursor Protein Are Mediated By The P21 Activated Kinase PAK3. J Neurosci 23 (17):6914-6927 Meada, K., Morita, K., Shibata, T., Naito, Y., Mızuno, A. 1992. Simultaneous Assay of Adenosine Deaminase and Purine Nucleoside Phosphorylase Activity As Possible Biochemical Means To Detect Non Hodgkin Lymphomas of Oral Cavity Cancer 70:20. Meland, M. R., Flehinger, B. J. 1973. Early Incidence Rates of Precancerous Cervical Lesions In Women Using Contraceptives. Gynecol. Oncol., 1:290–294. 143 Memişoğulları, R. 2005. Diyabette Serbest Radikallerin Rolü Ve Antioksidanların Etkisi. Düzce Tıp Fakültesi Dergisi.;3:30-39. Meram I., Aktaran Ş. 2002. Serbest Radikallerin Biyomoleküller Üzerine Etkileri. Arşiv, 11, 299-304. Mi, Q., Lantvit, D., Reyes-Lim, E., Chai, H., Phifer, S.S., Wani, M.C., Wall, M.E., Tan, G.T., Cordell, G.A., Farnsworth, N.R., Kinghorn, A.D., Pezzuto, J.M. 2005. “Apoptotic Anticancer Effect of Alvaradoin E Isolated from Alvaradoa haitiensis”, Anticancer Research, 25: 779-788. Miller, D.D. 1996. Minerals. In “Food Chemistry”, O.R. Fennema (Ed), Pp: 617-649. Marcel Dekker, New York. Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. 1996. Harper’ın Biyokimyası 24. Baskı, (Çev: Dikmen N., Özgünen T.), Barış Kitabevi, İstanbul. Namiot, Z., Kemona A., Stasiewicz, J., Marcinkiewicz, M., Namiot, A., Gorski, J. 1994. Adenosine Deaminase Activity in Gastric Cancer. Cancer Lett. 82:95-98. Nawar, W.W. 1996. Lipids. In Food Chemistry, O.R. Fennema (Ed), Pp: 225-319. Marcel Dekker, New York. Nicholson, D.W., Thomberry, NA. 1997. Caspases: Killer Proteases. Trends Biochem Sci. 22:299-306. Nordberg, J., Arnér, E. S. J. 2001. Reactive Oxygen Species, Antioxidants, and The Mammalian Thioredoxin System. Free Radical Biol. Med., 31: 1287– 1312. Novak, A. 1961. Antimicrobial Activity of Some Risinoleic and Oleic Acid Derivates, Journal of the American Oil Chemists Society. 38, 321-324, 1961. Onat, T., Emerk, K. 1996. Karbohidratlar: Temel Biyokimya. Birinci Baskı. pp:289409, İzmir. Onat, T., Emerk, K., Sözmen, E. Y. 2002. İnsan Biyokimyası, Palme Yayıncılık, Ankara. Ottaway, J. H., Apps D. K. 1984. Biochemistry. 4th Ed. Cambridge Bailliere Tindal. 5759 Ottman, R., King, M., Pike, Mc. 1983. Practical Guide For Estimating Risk For Familial Breast Cancer. Lancet İi:556-559. Ozturk, H. S., Karaayvaz, M., Kavutçu, M., Akgül, H., Durak, İ. 1998. Activities of Enzymes Participating in Purine and Free Radical Metabolism in Cancerous Human Colorectal Tissues. Cancer Biochem Biophys 16: 157. Özbek, H., Him, A,, Türközü, D. 2006. Uçucu Yağ Özütsinin Letal Doz Düzeyleri ve Antienflamatuvar Aktivetesinin Araştırılması. Ege Tıp Dergisi, 163-167. Packer, L., Weber, S.U.,Rimbach, G. 2001. Molecular Aspects of Alpha-Tocotrienol Antioxidant Action and Cell Signalling. J Nutr, 131 (2), 369S-373S Packer, L., Witt, E. H., Tristchler, H. J. 1995. Alpha-Lipoic Acid As A Biological Antioxidant. Free Radical Biology And Medicine, 19(2), 227-250. Papadopoulou, N., Charalampopoulos, I., Anagnostopoulou, V., Konstantinidis, G., Foller, M., Gravanis, A., Alevizopoulos, K., Lang, F., Stournaras, C. 2008 144 Membrane Androgen Receptor Activation Triggers Down-Regulation Of PI3K/Akt/NF-Kappab Activity and Induces Apoptotic Responses Via Bad, Fasl And Caspase-3 İn DU145 Prostate Cancer Cells. Molecular Cancer 7:88 Park, M.T., Lee, S.J. 2003. Cell cycle and cancer. Journal of biochemistry and Molecular Biology 36 (1):60-65 Pauls K. P. 1995. Plant Biotechnology for Crop Improvement. Biotechnol. Adv. 13:673- 693. Partin, A.W., Yoo, J., Carter H.B. 1993. The Use of Prostate Specific Antigen, Clinical Stage and Gleason Score To Predict Pathological Stage in Men With Localized Prostate Cancer. J Urol. 150(1):110-4. Pasqua, G., Avato, P., Monacelli, B., Santamaria, A.R., Argentieri, M.P. 2003. Metabolites in Cell Suspension Cultures, Calli, and in Vitro Regenerated Organs of Hypericum Perforatum Cv. Topas. Plant Sci. 165:977-982. Doi:10.1016/S0168-9452(03)00275-9 Pauls, K. P. 1995. Plant Biotechnology for Crop Improvement. Biotechnol. Adv. 13:673- 693. Percival, M. 1998. Antioxidants. Clinical Nutrition Insights, 10, 1-4. Phillipson, J.D. 1990. Plants As Sourche of Voluable Products From Plant Tissue Culture. P.1-21. Proceedings of The Phytochemical Society of Europe.30, Clarendon Pres, Oxford. Pines, J. 1995. Cyclins and Cyclin-Dependent Kinases: A Biochemical View. The Biochemical Journal 308 ( Pt 3):697-711 Piras, M. A., Gakis, C., Budroni, M., Andreoni, G. 1982. Immunological Studies in Mediterranean Spotted Fever. Lancet. 29;1(8283):1249. Polascik, T.J., Oesterling I.J. Partin, A.W. 1999. Prostate Specific Antigen: A Decade of Discovery- What We Have Learned and Where We Are Going. J Urol. 162(2)293-306. Polat, K., Tüzel, E., Aktepe, F., Akdoğan, B., Güler, C., Uzun, İ.,. 2009. Türkiye’de otopsi serisinde latent prostat kanseri ve yüksek dereceli prostatik intraepitelyal neoplazi sıklığının araştırılması”, Türk Üroloji Dergisi, 35 (2): 96-100 Pore, M.M., Hiltermann, T.J., Kruyt, F.A. 2010. Targeting apoptosis pathways in lung cancer. Cancer letters Porter, N.A. 1985. Mechanism Of Fatty Acid And Phosp­holipid Autoxidation. In “Chemical Changes İn Food During Processing”, T. Richardson And J.W. Finley (Eds), Pp:73-105. Van Nostrand Rainhold Company, New York. Quiney, C., Billard, C., Salanoubat, C., Fourneron, J.D., Kolb, J.P. 2006. Hyperforin, a New Lead Compound Against The Progression of Cancer and Leukemia 20:1519-1525. Doi:10.1038/Sj.Leu.2404301 Radı, R., Peluffo, G., Alvarez, M.N., Navılıat, M., Cayota, A. 2001. Unraveling Peroxynitrite Formation in Biological Systems. Free Radic. Biol. Med., 30: 463-488. Rathee, J. S., Hassarajanı, S. A., Chattopadhyay, S. 2006. Antioxidant Activity of Mammea longifolia Bud Extracts. Food Chem., 99: 436-443. Raff, M.C. 1992. Social Controls on Celi Survival and Celi Death. Nature. 356:397-400. 145 Rice-Evans, C. 2001. Flavonoid Antioxidants. Curr. Med. Chem., 8: 797-807. Robinson, S.P., Jordan, V.C. 1987. Reversal of Antitumor Effects of Tamoxifen By Progesterone In The DMBA-Induced Rat Mammary Carcinoma Model. Cancer Res. 47:5386-5390. Rohrbeck, A., Borlak, J. 2009. Cancer Genomics Identifies Regulatory Gene Networks Associated With The Transition From Dysplasia To Advanced Lung Adenocarcinomas Induced By C-Raf-1. Plos One 4 (10):E7315 Rokman, A., Ikonen, T., Mononen, N., Autio, V., Matikainen, M. P., Koivisto, P. A., Tammela, T. L., Kallioniemi, O. P., Schleutker, J. 2001. ELAC2/HPC2 Involvement in Hereditary and Sporadic Prostate Cancer. Cancer research 61 (16):6038-6041 Rosenthal, D.S., Simbulan-Rosenthal, C.M., Smith,W., Ray,R., Smulson, M.E. 2001. PARP Determines the Mode of Cell Death in Skin Fibroblasts, but not Keratinocytes, Exposed to Sulfur Mustard. Journal of Investigative Dermatology, 117 (6): 1566-1573. Rubbo, H., Radı, R., Anselmı, D., Kırk, M., Barnes, S., Butler, J., Eıserıch, J.P., Freeman, B.A. 2000. Nitric Oxide Reaction With Lipid Peroxyl Radicals Spares Alpha-Tocopherol During Lipid Peroxidation. Greater Oxidant Protection From The Pair Nitric Oxide/Alpha-Tocopherol Than AlphaTocopherol/Ascorbate. J. Biol. Chem., 275: 10812-10818. Sanovic, R., Krammer, B., Grumboeck, S., Verwanger, T. 2009. Time-Resolved Gene Expression Profiling of Human Squamous Cell Carcinoma Cells During The Apoptosis Process Induced By Photodynamic Treatment With Hypericin. International Journal Of Oncology 35 (4):921-939 Saran, M. and Bors, W. 1994. Signalling by O2 and NO: How Far Can Either Radical, or Any Specific Reaction Product, Transmit A Message Under In Vivo Conditions? Chem. Biol. Interact., 90: 35-45. Schipper, R.G., Deli, G., Deloyer, P., Lange, W.P., Schalken, J.A., Verhofstad, A.A. 2000. Antitumor Activity of The Polyamine Analog N(1), N(11)Diethylnorspermine Against Human Prostate Carcinoma Cells. The Prostate 44 (4):313-321 Schmidt, L. J., Tindall, D. J. 2011. Steroid 5 Alpha-Reductase Inhibitors Targeting BPH and Prostate Cancer. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 125 (1-2):32-38. Schulz, W.A., Burchardt, M., Cronauer, M.V. 2003. Molecular Biology of Prostate Cancer. Mol Hum Reprod, 9(8), 437-48. Scott B.C., Auroma O.I., Evans P.J., O’Neill C., Van Der Vliet, A. 1994. Lipoic Acid And Dihydrolipoic Acid As Antioxidants. A Critical. Free Radical Biology And Medicine, 20 (2), 119-133. Seegmiller, J. E. 1985. Overview of Possible Relation of Defects in Purine Metabolism to Immune Deficiency. Ann N Y Acad Sci. 451:10-19 Seven, A., Candan, G. 1996. Antioksidan Savunma Sistemleri. Cerrahpaşa Tıp Dergisi, 27(1), 41-50. 146 Sherr, C.J., Roberts, J.M. 1999. CDK Inhibitors: Positive And Negative Regulators Of G1-Phase Progression. Genes & Development 13 (12):1501-1512 Siger, A., Czubinski, J., Kachlicki, P., Dwiecki K., Lampart-Szczapa, E., NogalaKalucka, M. 2012. Antioxidant Activity and Phenolic Content In Three Lupin Species, Journal Of Food Composition and Analysis. 25(2)190–197 Silva, B.A, Ferreres, F., Malva, J.O., Dias, A.C.P. 2005. Phytochemical and Antioxidant Characteristics of Hypericum Perforatum Alcoholic Extracts. Food Chem. 90:157-167. Doi:10.1016/J.Foofchem.2004.03.049 Silva, F., Ferreira, S., Queiroz, J.A., Fernanda, C. 2011. Dominguescoriander (Coriandrum Sativum L.) Essential Oil: Its Antibacterial Activity and Mode of Action Evaluated by Flow Cytometry. J Of Medical Microbiology 23. Simon, H.U., Haj-Yehia, A.,Levi-Schaffer, F. 2000. Role of Reactive Oxygen Species (ROS) In Apoptosis Induction. Apoptosis, 5 (5), 415-418. Singleton, V.L., Rossi, J.A. 1965. “Colorimetry of Total Phenolics With Phosphomolbdicphosphotungstic Acid Reagents” American Journal of Enology and Viticulture, 16:144-158. Smith, J. R., Freije, D., Carpten, J. D., Gronberg, H., Xu, J., Isaacs, S. D., Brownstein, M. J., Bova, G. S., Guo, H., Bujnovszky, P., Nusskern, D. R., Damber, J. E., Bergh, A., Emanuelsson, M., Kallioniemi, O. P., Walker-Daniels, J., BaileyWilson, J. E., Beaty, T. H., Meyers, D. A., Walsh, P. C., Collins, F. S., Trent, J. M., Isaacs, W. B. 1996. Major Susceptibility Locus For Prostate Cancer on Chromosome 1 Suggested By A Genome-Wide Search. Science New York, NY 274 (5291):1371-1374 Sorg, O. 2004. Oxidative Stres: A Theoretical Model or Biological Reality. C.R.Biologies 327:649-62 Sökmen, A., Gürel, E., 2001. Sekonder Metabolit Üretimi.Bitki Biyoteknolojisi, 1: Bitki Doku Kültürleri 211-267 (Ed.M.Babaoğlu, E. Gürel,S. Özcan). Selçuk Üniversitesi Vakfı Yayınları, Konya. Stahl, W., Sıes, H. 1999. Carotenoids: Occurance, Biochemical Activities, and Bioavability. Chapter 13, P.183-202 Starkey, J.T, Ma F.P. 1989. A Study of Adenosine Deaminase and Its Convertion Factor in Human Serum. Adv Exp Med Biol. 253:65- 69 Stephenson Ra, Smart Cr, Mineau G.P. 1995. The Fall In Incidence of Prostate Carcinoma. Cancer 77: 1342-8. Stobiecki, B., Blaszczyk, S., Kowalczyk-Bronisz, H., Gulewicz, K. 1993. The Toxicity of Seed Extracts and Their Fractions From Lupinus Angustifolius L. and Lupinus Albus L. M. Journal of Applied Toxicology 13(5)347–352. Sullivan, J.L., Osborne, W.R., Wedgewood, R.J.. 1977. Adenosine Deaminase Activity in Lymphocytes.Br J Haematol. 37(1):157-8. Tannock, I. F., Hill, R. P. 1992. The Basics Science of Oncology.2 nd Ed. New York, Mc Graw-Hill. Tao, F., Gonzales-Flecha, B., Kobzik, L., 2003. Reactive Oxygen Species in Pulmonary Inflammation By Ambient Particulates. Free Radical Biology and Medicine, 35(4), 327-340. 147 Taşçı, I., Yavuz, N., Caner, M., Göksel, S., Yılmaz, O. 1995. Karaciğer Sıcak İskemi ve Reperfüzyon Hasarında Dimetilsülfoksil (DMSO), Allopurinol ve Deferoksamin’in Etkileri Çağdaş Cerrahi Dergisi, 9, 198-202. Tekelioğlu., M. 1984. Tıp Embiryolojisi. Er. Er Ajans. Ankara. Thompson, I. M., Tangen, C. M., Goodman, P. J., Lucia, M. S., Klein, E. A. 2009. Chemoprevention of Prostate Cancer. The Journal of Urology 182 (2):499-507. Tonçer, Ö., Kızıl, S., Arslan, N. 2004. Diyarbakır Koşullarında Kekik'in (Thymbra Spicata L. Var. Spicata) Seleksiyonu ve Kültüre Alınması Olanakları. Tübitak Togtag Proje No. 2654, 2004: 1–21. Topuz, E., Aydıner, A., Dinçer, M.. 2003. Meme Kanseri. Nobel Tıp Kitapevleri. Ungerer,. J.P., Oosthuizen, H. M., Bissbort, S. H., Vermaak, W. J. 1992. Serum Adenosine Deaminase: Isoenzymes and Diagnostic Application. Clin Chem. 38(7):1322-6. Ulukaya E. 2003. Apoptozis Ders Notları. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı 15-26. Valdes, L., San Jose E., Alvarez D., Valle J. M. 1996. Adenosine Deaminase (ADA) Isoenzyme Analysis In Pleural Effusions: Diagnostic Role, And Relevance To The Origin of Increased ADA In Tuberculous Pleurisy. Eur Respir J. 9(4):74751. Valentine, W. N., Paglia, D. E., Gilsanz, F. 1977. Hereditary Hemolytic Anemia with Increased Red Cell Adenoise Deaminase (45 to 70 fold) and Decreased Adenoisine Triphosphate. Science 195:783-784 Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M.,Telser, J. 2007) Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol, 39 (1), 44-84. Van Der Vliet, A., O’neill, C.A., Halliwell, B., Cross, C., Kaur, H. 1994. Aromatic Hydroxylation and Nitration of Phenylalanine and Tyrosine by Peroxynitrite. FEBS Letters, 339, 89-92 Van Haaften, R.I., Evelo, C.T., Penders, J., Eijnwachter, M.P., Haenen, G.R., Bast, A. 2001. Inhibition of Human Glutathione S-Transferase P1-1 By Tocopherols and Alphatocopherol Derivatives. Biochim Biophys Acta. 1548(1):23-28. Veena, B. 1996. Adenosine Deaminase isoenzymes and Pleural Tuberculosis. J Lab Clin Med.127:326-7. Wang, S., Clements, J. 2008. Antıoxıdant Actıvıtıes of Lupin Seeds, Proceedings. 12th Internatıonal Lupın Conference. 14-18 Sept. New Zealand. William, G.N., Angelo, M.D.D, William, B.I. 2003. Mechanisms of Disease: Prostate Cancer. N Engl J Med. 349(4):366-381. Winter, R.N., Kramer, A., Borkowski, A., Kyprianou, N. 2001. Loss of Caspase-1 and Caspase-3 Protein Expression In Human Prostate Cancer. Cancer Research 61 (3):1227-1232 Wooster, R., Neuhausen, S. L., Mangion, J. 1994. Localization of A Breast Cancer Susceptibility Gene BCRA 2, To Chrosome 13q. Science 265:2088-2090. 148 Wright, T. C., Richart, R. M. 1990. Role of Human Papillomavirus In The Pathogenesis of Genital Tract Warts and Cancer. Gynecol. Oncol., 37: 151-164. Wu, K., Katiyar, S., Witkiewicz, A., Li, A., McCue, P., Song, L. N., Tian, L., Jin, M., Pestell, R. G. 2009. The Cell Fate Determination Factor Dachshund Inhibits Androgen Receptor Signaling and Prostate Cancer Cellular Growth. Cancer Research 69 (8):3347-3355 Wyllie, A.H. K.J., Currie, A.R. 1980. Cell death: The Signifıcance of Apoptosis. Int Rev Cytol. 68:251-304. Yorgancılar, M. 1996. Doğanhisar’da Lüpen Ziraati, Selçuk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Lisans semineri. Yorgancılar, M., Babaoğlu, M., Hakkı, E.,E., Atalay, E. 2007. Farklı Orijinli Lüpen (Lupinus sp.) Genotiplerinde Kirece Dayanıklılığın ve Genetik Akrabalık İlişkilerinin Araştırılması. TÜBİTAK Proje No: TOVAG-105O034. Young, I. S, Woodside, J. V. 2001. Antioxidants in Health and Disease. J Clin Pathol. 54:176-186. Yüreğir, G. 1988. Temel Biyokimya 1. 3. Baskı, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayınları, Adana 152-153. Zalata, A., Yahıa, S., El-Bakary, A., Elsheıkha, H.M. 2007. Increased DNA Damage In Children Caused By Passive Smoking As Assessed By Comet Assay and Oxidative Stress. Mutation Research/ Genetic Toxicology And Environmental Mutagenesis, 629(2), 140-147. Zeybek, N., Zeybek, U. 1994. Farmasötik Botanik, Ege Ü., EczacılıkFak. Yayın No: 2, İzmir, 436. Zhao, Y., Li, R., Xia, W., Neuzil, J., Lu, Y., Zhang, H., Zhao, X., Zhang, X., Sun, C., Wu, K. 2010. Bid İntegrates Intrinsic and Extrinsic Signaling In Apoptosis Induced By Alpha-Tocopheryl Succinate In Human Gastric Carcinoma Cells. Cancer letters 288 (1):42-49. 149 150 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Lütfiye Yasemin Koç Doğum Yeri : Ankara Doğum Tarihi : 03/01/1983 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu Lise : Anıttıpe Lisesi Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Çalıştığı Kurum :T.C Şeker Kurumu Yayınları (SCI ve diğer) 1. Akbaş H, Okumuş A, Kılıç Z, Hökelek T, Süzen Y, Koç L.Y, Açık L, Çelik Z.B, Phosphorus-nitrogen compounds part 26. Syntheses, structural characterizations, antimicrobial and cytotoxic activities, and DNA interactions of new phosphazenes bearing secondary amino and pendant (4-fluorobenzyl) spiro groups. European J of medicinal chemistry (in press) 2. Kılıç Z, Asmafiliz N, Hökelek T, Açık L, Süzen Y, Koç L.Y, Öner Y. Phosphorus-Nitrogen Compounds: Part 25. Syntheses, Spectroscopic and Structural Investigations, Biological and Cytotoxic Activities, and DNA Interactions of Mono and Bisferrocenylspirocyclotriphosphazenes, Organometallics (in press) 3. Elmas G, Okumuş A, Kilic Z, Hökelek T, Açık L, Dal Hakan, Ramazanoğlu N, Koç L.Y. Phosphorus-Nitrogen Compounds. Part 24. Syntheses, Crystal Structures, Spectroscopic and Stereogenic Properties, Biological Activities and DNA Interactions of Novel Spiro-Ansa-Spiro- and Ansa-Spiro-Ansacyclotetraphosphazenes, Inorganic Chemistry, Inorg. Chem. 2012, 51, 12841−12856. 151 4. Okumuş A, Kılıç Z, Hökelek T, Dal H, Açık L, Öner Y, Koç L.Y. Phosphorus– nitrogen compounds part 22. Syntheses, structural investigations, biological activities and DNA interactions of new mono and bis (4-fluorobenzyl) spirocyclophosphazenes, Polyhedron, 30 (17) 2896–2907, 2011. 5. Işıklan M, Asmafiliz N, Özalp E, İlter E, Kılıç Z, Çoşut Z, Yeşilot S, Kılıç A, Öztürk A, Hökeek T, Koç L.Y, Açık L, Akyüz E. Phosphorus–Nitrogen Compounds: Part 21. Syntheses, Structural Investigations, Biological Activities, and DNA Interactions of New N/O Spirocyclic Phosphazene Derivatives. The NMR Behaviors of Chiral Phosphazenes with Stereogenic Centers on Addition of Chiral Solvating Agent. Inorganic Chemistry, 40(15): 7057-7071, 2010. 6. Bayramci N.S, Koç L.Y, Açik L, Uçmak Vural G, Kiliç M, Tez M, Koç M, Erçakmak N, Screening of Three Exons of the RET Proto-oncogene in Turkish Patients with Papillary Thyroid Carcinoma, Türkiye Klinikleri, Journal of Endocrinology 2010;5(2):54-61 7. Asmafiliz N, Kilic Z, Ozturk A, Hokelek T, Koc L.Y, Acik L, Kısa Ö, Üstündağ Z, Solak AO, Phosphorus-Nitrogen Compounds 18. Syntheses, Stereogenic Properties, Structural and Electrochemical Investigations, Biological Activities and DNA Interactions of New Mono- and Bis-Ferrocenyl Spirocyclic Phosphazene Derivatives. Inorganic Chemistry, 48(21): 10102-10116, 2009 8. Demir H, Açık L, Bali E.B, Koç L.Y and Kaynak G. Antioxidant and Antimicrobial Activities of Solidago Virgaurea Extracts, African Journal of Biotechnology Vol. 8 (2), pp. 274-279. 2009. 9. Koc L.Y, Akar N, Single Nucleotide Polymorphisms That Affect Homocysteine Levels in Turkish Population. Clinical and Applied Thrombosis-Hemostasis. 15(6): 701-704, 2009. 10. Fitoz S, Sennaroglu L, Incesulu A, Cengiz F.B, Koc Y, Tekin M. SLC26A4 mutations are associated with a specific inner ear malformation. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 71(3): 479-8.2007 Poster 1. Antimicrobial and Cytotoxic Activities, and DNA interactions of new fully substituted mono (4-fluorobenzyl) spirocyclotriphosphazenes, 13th International Congress of the Society for Ethnopharmacology. Graz, Austria, 2012 2. Syntheses, Biological Activities, and DNA Interactions of New N/O Spirocyclotriphosphazenes" 13th International Congress of the Society for Ethnopharmacology. Graz, Austria, 2012 3. Leyla Açık, Gamze Egemen, Aytuğ Okumuş, Zeynel Kılıç, Nagehan Ramazanoğlu and L. Yasemin Koç. Antimicrobial Activities And Dna Interactions Of SpiroAnsa-Spiro- and Ansa-Spiro-Ansa-Cyclotetraphosphazene, 152 Internatıonal Conference “Medıcınal And Aromatıc Plants In Generatıng of New Values In 21st Century”, November 9-12. 2011. Sarajevo, Bosnia And Herzegovina, 2011 4. Naciye Selcen Bayramci, Leyla Açik, Lütfiye Yasemin Koç, Mehmet Kiliç, Gülin Vural, 2009, Papiller Tiroit Kanserli Türk Hastalarda Ret (Rearranged During Transfection) Proto-Onkogeninin 11. Ve 13. Ekzon Bölgelerinin İncelenmesi, 21. Ulusal Biyokimya Kongresi, İstanbul, 2009 5. Nuran Asmafiliz, Zeynel Kılıç, Aslı Öztürk, Tuncer Hökelek, Ali Osman Solak, Lütfiye Yasemin Koç, Leyla Açık, The Investigation of Syntheses, Crystal Structures, Electrochemical and Spectroscopic Properties, and Biological Activities of mono and bis(Ferrocenyl)-Phosphazene Derivatives, Sixth International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, 10-14 Eylül 2008, Sofya, Bulgaristan 6. Nuran Asmafiliz, Zeynel Kılıç, Ayça Avseven Çiftçi, Ali Osman Solak, Aslı Öztürk, Tuncer Hökelek, L. Yasemin Koç, Leyla Açık, Özgül Kısa, Ali Albay, Ferrosenil-Fosfazen Bileşiklerinin Sentezi, Kristal Yapıları, Spektroskopik, Elektrokimyasal Ve Stereojenik Özelliklerinin İncelenmesi, DNA ve Tüberküloz Suşuna (H37Rv) Etkilerinin Araştırılması, II. Ulusal Anorganik Kimya Kongresi, 16-19 Mayıs 2009, Fırat Üniversitesi, Elazığ, 7. Naciye Selcen Bayramci, Lütfiye Yasemin Koç, Leyla Açik, Gülin Uçmak Vural, Mehmet Kiliç, Mesut Tez, Mahmut Koç, Nur Erçakmak, Screening of Three Exons of the RET Proto-oncogene in Turkish Patients with Papillary Thyroid Carcinoma, J of Endocrinology, 2010, 5(2):54-61 8. Lütfiye Yasemin Koç, Nejat Akar The Effect of 19 bp Deletion of DHFR and CT Replacement in the 677th nucleotide in MTHFR enzyme on Homocyteine Levels in Turkish Population. “32th National Hematology Congress ”812.11.2006 Antalya, Turkey 9. Lütfiye Yasemin Koç, Nejat Akar The effect of 19 bp deletion of DHFR on homocysteine levels. “World Congress on Hyperhomocysteinemia, 6th Conference on Homosysteine Metablolism” Saarbruecken Germany 5-9 June 2007 Sunum DHFR 19 bç’lik Delesyonu ve MTHFR 677C-T Gen Değişimlerinin Homosistein Düzeylerine Olan Etkisinin Türk Popülasyonunda İncelenmesi , “32. Ulusal Hematoloji Kongresi” 8-12 Kasım 2006 Antalya 153
