Gıdalarda Tağşişinin Belirlenmesinde Kullanılan Moleküler Yöntemler

ADANA BİLİM ve TEKNOLOJİ ÜNİVERSİTESİ
Gıdalarda Tağşişin Belirlenmesinde
Kullanılan Moleküler Yöntemler
• Ar. Gör. Sevgin DIBLAN
• Yrd. Doç. Dr. Pınar KADİROĞLU
1
İçerik
Tağşiş nedir ve etkileri
Gıda tağşişinin belirlenmesinde
kullanılan yöntemler
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Gerçek zamanlı PCR ve çeşitleri
Gerçek zamanlı PCR ile ilgili çalışmalar
Sonuçlar
Gıda Tağşişi
• Gıdalara özgü özellikleri belirleyici olan öğelerin
tamamının veya bir kısmının veya miktarının
değiştirilmesi ile izin verilen özelliklerine aykırı şekilde
üretilmesi olarak tanımlanmaktadır.
• Gıda tağşişinin sonuçları:
– Sağlık açısından; gıda alerjisi olan bireyler
– Ekonomik açıdan;
• Tüketicinin kalitesiz ürün alması,
• Ülkenin ihracat itibarının zedelenmesi, rekabet gücünde
azalma görülmesi,
• Firmaların marka değerlerinin zedelenmesi.
Gıda Tağşişi
Gıda Tarım ve
Hayvancılık
Bakanlığı verilerine
göre
Gıda Tarım ve
Hayvancılık
Bakanlığı verilerine
göre
• 2012-2015 yılları arasında 418 firmanın 818 farklı
ürünü teşhir edilmiştir.
• Sadece 2015 yılında 735 bin denetim yapılmıştır.
• Verilen cezaların her biri ortalama 15 bin TL,
• Toplamda 58 milyon TL ceza verilmiştir.
Gıda Tağşişinin Belirlenmesinde
Kullanılan Yöntemler
• Spektrofotometrik,
elektroforetik,
elektronik,
immünolojik ve moleküler yöntemler gıdalarda
tağşişin belirlenmesinde kullanılabilmektedir.
• Gıda tağşişinin belirlenmesinde kullanılan
yöntemlerin seçiminde :



Saptama limiti
Örnek hazırlama kolaylığı
Maliyet ve yüksek işlem hacmi
Üzüm pekmezine; kuru incir, kuru kayısı ektraktı, mısır şurubu, inulin ilavesi
Isotope ratio mass spectroscopy ile C13 analizi
Kırmızı et ürünlerinde, domuz, eşek, at ve kanatlı et ilavesi
Polymerase chain reaction (PCR) metodu
Sahte bal üretimi
Isotope ratio mass spectroscopy ile C13 ve C4 analizi
Süt ürünlerine, jelatin veya bitkisel yağ ilavesi, farklı tür süt ilavesi
Gaz kromatagrafisi, PCR yöntemi
Zeytinyağına, ikinci kalite zeytinyağı veya başka tohum yağları eklenmesi
Gaz veya sıvı kromatografisi, spektrofotometrik yöntemler
Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR)
Metodu ve Çeşitleri
PCR tekniği 1985 yılında, ABD’de, Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K.
Saiki tarafından geliştirilmiştir ve nükleik asitin uygun bir ortamda
çoğaltılmasına dayanmaktaydı.
PCR analizi, denatürasyon olarak adlandırılan DNA zincirlerinin yüksek
sıcaklık uygulaması ile birbirlerinden ayrılması aşaması, sentetik
oliganükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanması olarak bilinen hibridizasyon
aşaması ve polimerizasyon olarak adlandırılan DNA zincirinin uzaması
aşamalarından oluşmaktadır.
3 aşama için 30-40 döngü
1. aşama : Denaturasyon
2. aşama: Bağlanma fazı
3. aşama: Uzama fazı
Real-time PCR
Uzama
(55°C)
Aşamaların hepsi tek bir tüpte yapılır.
DNA çoğalımı ile birlikte artan sinyal değerleri
toplanır.
PCR siklus sayısı 25-40 arasında olabilir.
Bağlanma
(72°C)
Denaturasyon
(94°C)
Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR)
Metodu ile Tağşiş Belirlenmesi
Analiz
metodu
Örnekleme
ve DNA
ekstraksiyonu
Kantitatif
tayin
P
C
R
(Prepare)
(Cycle)
(Report)
İstatistik
analizler
Raporlama
Referans
gen seçimi
ve
validasyonu
DNA Ekstraksiyonu
Ekstraksiyon işlemi boyunca gıda örneğine fiziksel, kimyasal ve enzimatik
olarak çeşitli uygulamalar yapılmaktadır. Seçilen metot sonucunda, DNA
parçacığının miktarı veya uzunluğu azalabilmektedir
Spektrofotometrik
Fluorimetrik
Kemilüminesans
Uygun bir DNA ekstraksiyonu sonucunda
Yüksek miktar
Yüksek saflık
Primer Seçimi
PCR analizinin hassasiyetinde primer seçimi de diğer önemli bir aşamadır.
Primer ; Mitokondriyal veya çekirdek (nükleus) kaynaklı olabilir.
Cytochrome B, Dloop, 12S rRNA ve
16S rRNA
Mitokondrial DNA fazla miktarlarda bulunması en önemli avantajıdır. Ancak,
mitokondri DNA’larının çeşitliliği PCR analizinin hassasiyetini negatif yönde
etkilemektedir. Bu nedenle çekirdek kaynaklı DNA hedef DNA olarak
seçilebilir, bunlar çok az miktarda bulunsa da miktar tayini daha hassas
şekilde sonlandırılmaktadır.
Real-time PCR Belirleme Sistemleri
Özgül
olmayan
Özgül
SYBR Green I floresan boya kullanılır.
SYBR yeşil boya
DNA
“TaqMan” prob, “Molecular beacon”,
“Light-up” prob, hibridizasyon prob
Taqman Probe
Forward primer
5’
3’
Denatürasyon
Floresan işaret
serbat kalır
Bağlanmamış
boya, ışıma
yok
Taq polimeraz
5’
Bağlanma ve
ışıma
3’
Real-time PCR Belirleme Sistemleri
“FRET” prob
İki farklı
prob
İki probun
birbirine
yaklaşması ile bir
enerji yayılımı
FRET (Fluoresance resoanace energy transfer) olarak bilinen bu enerji transferi
sonucunda oluşan floresan miktarı PCR siklusu içinde oluşan amplikonların
miktarına paralel olarak artış göstermektedir.
Kantitatif Değerlendirme
Druml vd. 2015
• Hedef veya tağşiş şüphesi
bulunan genin çoğalma
sayısı ölçülür ve bu değer
bir pozitif standart ile
karşılaştırılarak, oranlanır.
Bu oran, karışım içinde
bulunması gereken veya
gerekmeyen bileşenlerin
miktarı ile orantılıdır.
Kantitatif belirleme için
yaygın olarak kullanılan iki
yöntem bulunmaktadır:
1. Floresan sinyalinin
alındığı döngü sayısı
olarak adlandırılan “eşik
çizgisine ulaşılan döngü
sayısı” karşılaştırması
2. Kalibrasyon kurvesi ile
belirleme
Al-Kahtani et al. 2017
Sığır
Tavuk
En düşük belirleme limiti
%1
Standart kurve ve Ct değeri
ile hesaplama
Deve
Tavşan
Keçi
Koyun
Araştırmada ayrıca 75
adet farklı markalarda
ürünler analiz
edilmiştir. RT-PCR, ticari
PCR cihazının tespit
edemediği 9 üründe
domuz DNA’sı tespit
etmiştir (0.0001 ng/µL).
Bu derece düşük bir
oranın ise çapraz
kontaminasyon ile
oluşabileceği
vurgulanmıştır.
Amaral et al. 2017
Sığır eti
En düşük
belirlenme
limiti
%0.0001
%10; %1; %0.1; %0.01; %0.001; %0.0005 ve
%0.0001 domuz eti
Araştırma
piyasadaki helal
gıdalarda domuz
eti tespit etmiştir.
Helal etiketi altında piyasaya sürülen ürünlerin kontrolünün ve bu konudaki araştırmaların
artırılması gerektiği üzerinde durulmuştur.
 Real-time PCR tekniği ile gıdalarda
tağşişin belirlenmesi araştırmalarının
çoğunluğu et ve süt ürünlerinde
yapılmıştır.
 Et ürünlerinden özellikle salam, sosis
veya hazır köfte olarak satılan gıdaların
içine etiket bilgisinde belirtilmeyen
farklı türlere ait et çeşitlerinin olması,
tüketici güvenilirliği açısından en büyük
sorunlardan birisidir.
 Yapılan araştırmalarda, araştırmacıların
en çok üzerinde çalıştığı konu, tağşişin
belirlenme
limitidir.
Örneğin,
belirlenme limiti bazı araştırmalarda
%0.5 gibi düşük değerlere kadar
düşerken, bazı araştırmalar, en düşük
belirlenme
limiti
%2
olarak
belirlemişlerdir.
 Belirlenme limiti, metot optimizasyonu
ile
maksimum
seviyeye
çıkarılabilmektedir.
Gıdalarda PCR analizinin sırasında karşılaşılan diğer bir sorun ise gıdaların doğası
gereği kompleks yapılar olmasıdır. Gıdaların içerdiği polisakkaritler, polifenoller,
yağlar ve proteinler PCR siklusu boyunca inhibitör etkisi yapabilir hatta analizin
sonlanmasına sebep olabilir.
Primrose et al. (2011) yaptıkları araştırmada, PCR analizini etkileyen tüm faktörleri
göz önünde bulundurarak metot geliştirmeye ve çözüm yöntemlerini ortaya
koymaya çalışmışlardır. Araştırma sonunda, kompoze gıdalar için bunun mümkün
olmadığını ancak tek bileşenli yani sosis, peynir değil de et, süt veya baklagiller
gibi gıdalar için validasyon ile genel metotlar oluşturulabileceği aktarılmıştır.
Real time PCR Analizi
Avantaj
1. Küçük örnek miktarlarınd başarılı
sonuçlar alınabilmekte,
2. Kantitatif tayin için, diğer PCR
analizlerinde zorunlu olarak yapılması
gereken elektroforez veya jel boyanması
aşamalarının olmaması, analizin tek
tüpten yapılması sonucunda,
kontaminasyon riskinin düşük olması,
3. Isıl işlem görmüş ve DNA yapısı
denatüre olmuş gıdalarda da
uygulanabilmesi,
4. Hassasiyetinin ve tekrar edilebilirliğinin
yüksek olması
Dezavantaj
1. Analizin gerekliliklerinin ve sarf
malzemelerinin maliyetli olması,
2. Metot validasyonu için uzun
zaman harcanması
3. Metot validasyonu için eğitimli ve
nitelikli eleman ihtiyacı
SONUÇ
Real-time PCR analizi et ürünlerinde farklı çeşit hayvan
etlerinin ayrımı, makarnada durum veya ekmeklik
buğday ayrımı, pirinç çeşitlerinin belirlenmesi ve farklı
tür hayvan sütlerinin belirlenmesi gibi analizlerde hızlı
ve güvenilir sonuçlar vermektedir. Bu nedenle,
gıdalarda tağşişin belirlenmesinde kullanımının
yaygınlaşma olasılığı yüksektir.
ADANA BİLİM ve TEKNOLOJİ ÜNİVERSİTESİ
TEŞEKKÜR EDERİM…
22