p14 metilasyonunun nöroblastom minimal rezidüel hastalıktaki rolü

T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
P14ARF MET LASYONUNUN
NÖROBLASTOM M N MAL REZ DÜEL
HASTALIKTAK ROLÜ
Uzm.Dr. ZÜBEYDE ERBAYRAKTAR
TEMEL ONKOLOJ PROGRAMI
DOKTORA TEZ
ZM R-2009
T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
P14ARF MET LASYONUNUN
NÖROBLASTOM M N MAL REZ DÜEL
HASTALIKTAK ROLÜ
TEMEL ONKOLOJ PROGRAMI
DOKTORA TEZ
Uzm.Dr. ZÜBEYDE ERBAYRAKTAR
Dan man Ö!retim Üyesi: Prof. Dr. H. NUR OLGUN
Bu ara t rma Türk Pediatrik Onkoloji Grubu taraf ndan “TPOG 2008 Ara t rma
Projelerini Destekleme Program ” kapsam nda 08/535 say ile desteklenmi tir.
Dokuz Eylül Üniversitesi Sa!l k Bilimleri Enstitüsü, Temel Onkoloji Doktora Program
ö!rencisi Uzm.Dr. Zübeyde Erbayraktar’ n “P14ARF Metilasyonunun Nöroblastom Minimal
Rezidüel Hastal2ktaki Rolü” isimli doktora tezi ………………. tarihinde taraf m zdan
de!erlendirilerek Ba5ar2l2 bulunmu tur.
JÜR BA7KANI
Prof. Dr. H. NUR OLGUN
Çocuk Sa!l ! ve Hastal klar Anabilim Dal
Pediatrik Onkoloji Bilim Dal
JÜR ÜYELER
Prof. Dr. MÜN R KINAY
Prof. Dr. GÜLDAL KIRKALI
Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dal
T bbi Biyokimya Anabilim Dal
Prof. Dr. NAZAN ÇET NGÜL
Prof. Dr. SAVAF KANSOY
Ege Üniversitesi T p Fakültesi
Ege Üniversitesi T p Fakültesi
Çocuk Sa!l ! ve Hastal klar Anabilim Dal
Çocuk Sa!l ! ve Hastal klar Anabilim Dal
Pediatrik Onkoloji Bilim Dal
Pediatrik Onkoloji Bilim Dal
Ç NDEK LER
Sayfa No
çindekiler ………………………………………………………………………………. i
Tablo listesi ……………………………………………………………………………... iii
Fekil listesi …………………………………………………………………………........ iv
K saltmalar …………………………………………………………………………........ v
Te ekkür ………………………………………………………………………………… vi
ÖZET …………………………………………………………………………………… 1
ABSTRACT ……………………………………………………………………………. 3
1. G R 7 VE AMAÇ …………………………………………………………………… 5
2. GENEL B LG LER ………………………………………………………………… 7
2.1 Nöroblastom: Tan m ve Özellikleri .………………………………………... 7
2.1.1 Nöroblastom Tedavi Protokolünde zlenen Stratejiler Nelerdir? ……….. 12
2.1.2 TPOG-NB-2003 Riske Dayal Tedavi Yakla m ………..…………….... 14
2.2 Metilasyon ve Kanser …….………………………………………………….. 15
2.2.1 p14ARF Metilasyonunun Kanser Olu um Sürecindeki Önemi ...…...……... 17
3. GEREÇ ve YÖNTEMLER ….……………………………………………………… 19
3.1 Hücre Kültürü …………………………………..……………………………. 20
3.1.1 Hücrelerin Ço!alt lmas …………………………………………………. 20
3.1.2 n Vitro Minimal Rezidüel Hastal k Modelinin Olu turulmas …………. 20
3.1.3 Tripan Mavisi ile Hücre Canl l ! Testi …………………………………. 22
3.2 MYCN ve p14ARF Gen fadelerinin Analizi ...………………………………... 23
3.2.1 Total RNA zolasyonu …………………………………………………... 23
3.2.2 DNA zolasyonu ………………………………….................................... 23
i
3.2.3 Komplementer DNA (cDNA) Sentezi ……....………………………….... 24
3.2.4 Real time-PCR ile Gen Ekpresyon Analizleri ………………………........ 24
3.2.5 DNA Metilasyon qPCR Analizleri ............................................................. 25
3.3 Protein Düzeylerinin Ölçümü ……………………………………………….…. 28
3.3.1 Nüklear Ekstraksiyon ……………………………………………….……. 28
3.3.2 EL SA Deneyi ……………………………………………………….…… 28
3.4 statistiksel Analiz ……………………………………………………………... .29
4. BULGULAR ………………………………………………………………………….. 30
5. TARTI7MA …………………………………………………………………………...43
6. SONUÇ VE ÖNER LER ……………………………………………………………. 49
7. KAYNAKLAR ……………………………………………………………………..… 51
8. EK.1 …...……………………………………………………………………………… 56
ii
TABLO L STES
Tablo 1. Uluslararas Nöroblastom Patoloji S n flamas (INPC)
Tablo 2. Uluslararas Nöroblastom Evreleme Sistemi (INSS)
Tablo 3. Çocuk Onkoloji Grubunun (COG) kabul etti!i ve TPOG NB 2003 Protokolünde
kullan lan Nöroblastom Risk S n flamas
Tablo 4. MYCN Onkogen Analizi Yap lmam Olgular n TPOG NB 2003 Protokolündeki
Nöroblastom Risk S n flamas
Tablo 5. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
Tablo 6. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
Tablo 7. MYCN (+) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
Tablo 8. MYCN (-) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
iii
7EK L L STES
7ekil 1. S n fland rma (International Neuroblastoma Pathology Comittee-1999)
7ekil 2. Nöroblastomun hücresel ve moleküler belirleyicilere göre s n flamas
7ekil 3. Kanser tan s , risk belirleme ve tedavisinde epigenetik hedefler
7ekil 4. p14ARF geninin, p53 tümör bask lay c gen yola! n aktivasyon mekanizmas
7ekil 5. Çal mada kullan lan yöntemlerin genel ak
emas .
7ekil 6. TPOG-NB-2009 protokolü yüksek risk grubu tedavi emas
7ekil 7. MYCN (+) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 8. MYCN (+) hücre gruplar nda p14ARF geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 9. MYCN (-) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 10. MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 11. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda protein düzeylerinin kar la t r lmas
7ekil 12. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni promotor bölgesinin
demetilasyon yüzdelerinin kar la t r lmas
7ekil 13. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 14. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR s cakl k e!rileri
7ekil 15. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas
7ekil 16. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas
7ekil 17. MYCN (+) kontrol grubu
7ekil 18. MYCN (-) kontrol grubu
7ekil 19. MYCN (+) 5-aza-CdR grubu
7ekil 20. MYCN (-) 5-aza-CdR grubu
iv
KISALTMALAR
NBL
: Nöroblastom
MRD
: Minimal Rezidüel Hastal k
TPOG : Türk Pediatrik Onkoloji Grubu
FBS
: Fetal Bovine Serum
RT
: Real Time
RT-PCR : Real Time – Polimeraz Zincir Reaksiyonu
GADPH : Gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenaz
CDKN2A: Siklin ba! ml kinaz 2A
v
TE7EKKÜR
Projenin mali kayna! n sa!layan Türk Pediatrik Onkoloji Grubu Yönetim Kurulu’na,
Bu çal man n planlanmas , yürütülmesi ve sonuçlar n yorumlanmas a amalar nda bilimsel
görü lerini ve deste!ini hiçbir zaman esirgemeyen dan man m Prof.Dr. H. Nur OLGUN’a,
Laboratuar çal malar n n planlanmas ve deneylerin gerçekle tirilmesi a amalar nda bilimsel
deneyim ve birikimini her zaman payla an Prof.Dr. Güldal KIRKALI’ya,
Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji Laboratuvar olanaklar n n kullan lmas n
sa!layan
Onkoloji Enstitüsü Müdürü Prof.Dr. Münir KINAY’a
Moleküler çal malar n planlanmas
ve gerçekle tirilmesinde bilgi ve deneyimlerini
payla arak destek olan Zeynep ZADEO LULARI’na, Ö!r.Gör. Uzm.Dr. Serpil T.
AKH SARO LU’na ve Doç.Dr. Ataç SÖNMEZ’e,
statistiksel analizlerin yap lmas ve de!erlendirilmesindeki katk lar için Doç.Dr. Hülya
ELL DOKUZ’a,
Bütün çal malar m boyunca deste!ini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili e im Doç.Dr. R.
Serhat ERBAYRAKTAR’a ve çal malar mdan dolay
benimle geçirmek istedikleri
zamanlar ndan çald ! m can m k z m Duygu ERBAYRAKTAR ile can m o!lum Fad l Alp
ERBAYRAKTAR’a sonsuz te ekkürlerimi bir borç biliyorum.
Zübeyde ERBAYRAKTAR
vi
ÖZET
P14ARF MET LASYONUNUN NÖROBLASTOM M N MAL REZ DÜEL
HASTALIKTAK ROLÜ
Zübeyde ERBAYRAKTAR
Dokuz Eylül Üniversitesi, Onkoloji Enstitüsü, Temel Onkoloji AD, zmir.
Nöroblastom, primordial nöral krest hücrelerinden köken alan ve tüm çocukluk ça!
kanserlerinin %8-10’unu olu turan bir tümördür. Bir ya alt ndaki çocuklar n en s k görülen
tümörüdür. Tümörün biyolojik davran ndaki de!i kenlik nedeniyle, nöroblastom spontan
regresyonlar, benign transformasyon ya da agresif seyir gösterebilmekte, bu durum hastal ! n
prognozunu belirlemede ve tedavisinde sorunlara yol açmaktad r.
Epigenetik de!i iklikler, tümörün olu umunda ve progresyonunda önemli rol
oynamaktad r. Bu de!i ikliklerin sonucunda görülen malign hücre genomu, spesifik histon
modifikasyonlar n n azalmas
ve baz
genlerin metilasyonu veya demetilasyonu ile
karakterizedir. p14ARF metilasyonunun olu turdu!u tümöral etki, N-Myc gibi onkogenler
taraf ndan aktive olduktan sonra p53 tümör bask lay c gen ekspresyonunu bloke ederek hücre
ço!almas n negatif yönde düzenleyen faktörleri inhibe etmek eklindedir.
Bu çal mada, Kelly (Nöroblastik, N-Myc +) ve SH-SY5Y (Nöroblastik, N-Myc -)
insan nöroblastom hücre hatlar nda p14ARF geni demetile edici bir ajan ile bloke edilerek
Türk Pediatrik Onkoloji Grubu (TPOG) kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlar n tümör
hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri de!erlendirilmi tir. Ayr ca, p14ARF geninin N-Myc
amplifikasyonu olan ve olmayan hücre hatlar ndaki etkisi de!erlendirilerek tümörün
prognozunu ne yönde etkiledi!i ve sitotoksik etki de!i ikli!i ile prognoz aras nda bir ili ki
bulunup bulunmad ! ara t r lm t r. laçlar n hücre canl l ! ve hücre hasar na etkisi tripan
mavisi boyamas ile de!erlendirilmi tir. Nöroblastom hücre hatlar nda sitotoksik etki farkl l !
saptanm , bu etkinin mekanizmalar n incelemek için p14ARF geninin metilasyon ve
ekspresyon düzeyleri ile birlikte N-Myc expresyon düzeyleri hedef olarak seçilmi tir. p14ARF
ve N-Myc mRNA ekspresyonu real-time PCR ile, protein ekspresyonu ELISA yöntemi ile
de!erlendirilmi tir.
1
Projemizde, nöroblastomdaki minimal rezidüel hastal k modelinde p14ARF geninin
N-Myc amplifikasyonu ile olan ili kisi ve bu ili kinin rutin kemoterapi protokolünde
kullan lan ilaçlarla olan etkile iminde demetilasyonun rolü, bugüne kadar henüz
incelenmeyen epigenetik tedavi yakla m s n rlar nda geni kapsaml olarak ara t r lm ,
metilasyon ili kili tedavi ile tümörün prognozu aras nda bir ili ki olup olmad ! na dair önemli
ipuçlar elde edilmi ve bu ili kinin yönü ortaya konmu tur.
Sonuç olarak, bu öncü çal mada nöroblastomda minimal rezidüel hastal ! n
önlenmesinde; gerek tedavinin kesilmesinden sonra kar m za ç kan erken ya da geç
dönemdeki relapslar n tedavisine yönelik yeni bir yakla m önerisi elde edilmi , gerekse de
rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlar n p14ARF gen düzeyleri üzerindeki etkileri
geni bir perspektifte incelenmi tir. leriye yönelik olarak, p14ARF gen düzeyleri ile ili kili
transkripsiyon faktörlerinin prognostik öneminin ara t r lmas uygun bir yakla m olacakt r.
Yine ekspresyon düzeyinin yüksek oldu!u hücre serilerinde bu faktörlere kar
geli tirilmi
inhibitörlerin etkinli!i de tedavide bu ekspresyonlar n önemini ortaya koyacakt r.
ARF
Anahtar Sözcükler: Nöroblastom, p14
geni, DNA metilasyonu, Minimal rezidüel hastal k
2
ABSTRACT
THE ROLE OF P14ARF METHYLATION IN NEUROBLASTOMA MINIMAL
RESIDUAL DISEASE
Zübeyde ERBAYRAKTAR
Dokuz Eylül University, Institute of Oncology, Department of Basic Oncology, Izmir.
Neuroblastoma originating from primordial neural crest cells constitutes 8-10 % of
whole childhood cancers. It is the most frequently diagnosed tumor of infancy. Because of the
variations in its biological behavior, neuroblastoma may show spontaneous regression, benign
transformation or agressive progression and this uncertainity leads to difficulties in predicting
prognosis and treatment.
Epigenetic changes has a significant role in the occurence and progression of the
tumor and the resultant malignant cell genome is characterized by the reduction of specific
histone modifications and methylation or demethylation of genes. Tumorigenesis effect of
p14ARF methylation depends upon inhibiting factors that impairs cell proliferation via
blocking p53 gene expression due to its N-Myc mediated activation.
In the present study, cytotoxic effects of blocked p14ARF by demethylating agent on
Kelly (Neuroblastic, N-Myc +) and SH-SY5Y (Neuroblastic, N-Myc -) human neuroblastoma
cell lines assigned according to whether Turk Pediatric Oncology Group (TPOG)
chemotherapy protocol drugs are added. Moreover, with the evaluation of the effects of
p14ARF gene on cell lines with or without N-Myc amplification a probable change in prognosis
and any relation between cytotoxic effects and prognosis were investigated. Drug induced
effects on cell viability, cell damage and apoptotic cell death ratio were assessed with trypan
blue dying. The difference of cytotoxic effects were observed in neuoroblastoma cell lines.
For to investigate the mechanisms of this effect, p14ARF gen methylation and expression
levels, and N-Myc expression levels were targeted. Expressions of mRNA and protein will be
determined with real-time PCR and ELISA, respectively.
3
So that, in this project relationship between p14ARF gene and N-Myc amplification, as
well as the role of gene methylation on chemoterapeutic agents in epigenetic treatment
approach which has not been studied yet in minimal residual disease model of neuroblastoma,
were investigated in detail and a possible relation between this treatment model and the
prognosis and its direction were demonstrated.
In conclusion, in this pioneering study we have demonstrated that not only new
therapeutic approach for early or late relapses following the ending of treatment were found
but also effects of chemoterapeutic agents on p14ARF gene on this model were investigated in
detail. Regarding our results, investigation of transcription factors with related p14ARF gene
levels may help to determine prognosis in neuroblastoma. Moreover, development of targeted
therapies against these transcriptional factors may be a therapeutic approach in the near
future.
Keywords: Neuroblastoma, p14ARF gene, DNA methylation, Minimal residual disease
4
1. G R 7 VE AMAÇ
Nöroblastom, çocukluk ça! n n en yayg n olarak görülen solid tümörlerinden birisidir.
Günümüzde özellikle ileri evre nöroblastom hastalar n n tedavisinde uygulanan yo!un
kemoterapi protokolleri ile hastan n ya am süresi uzayabilmektedir. Ancak ya am süresinin
uzamas ile birlikte, tüm dünyada önemli bir problem olan geç relapslar n görülme s kl ! da
artmaktad r. Tedavinin kesilmesinden özellikle birinci y ldan sonra ortaya ç kan relapslar n
(geç relaps) sorumlusu olarak minimal rezidüel hastal k varl ! dü ünülmektedir. Dolay s yla
minimal rezidüel hastal ! ortadan kald rmaya yönelik idame tedavileri giderek önem
kazanmaktad r (1, 2, 3).
Son y llarda üzerinde oldukça aktif bir ekilde çal lan epigenetik de!i ikliklerin,
onkogenlerin aktivasyonu, genomik instabilite ve tümör supresör genlerin transkripsiyonunun
azalt lmas yoluyla karsinogenez sürecini ba latt klar bilinmektedir (4). Kanser olu umunda
ve progresyonunda rol oynayan epigenetik de!i ikliklerin önemi anla ld kça yeni terapötik
hedefler ortaya ç kmaktad r.
Onkolojik tedavide amaç, etkin ancak daha az yan etkili tedavi protokolleri ile
hastan n ya am süresini uzatmak ve kaliteli bir ya am sa!layarak en iyi sonuçlar elde
etmektir. Özellikle geli mekte olan ülkelerde, hasta ailesinin ve devletin sosyoekonomik
dengesini koruyacak, hastan n hayat kalitesini yüksek tutacak, uygulaman n kolay oldu!u
ve hasta takibini kolayla t ran tedavi yöntemlerini seçmek gerekmektedir. Nöroblastomda
özellikle ileri evre hastalarda katedilen mesafe, uygulanan multimodal tedavi protokolleri ve
alternatif tedavilere ra!men çok azd r. Dolay s yla, acilen yeni tedavi yakla mlar n n
geli tirilmesi gerekmektedir (5, 6, 7).
Ara t rmam z n amac , nöroblastom hücre kültürlerinde in vitro minimal rezidüel
hastal k modelini olu turmak, bu modelde epigenetik tedavi yakla m n irdelemek, bunun
için de, p14ARF genini demetile edici bir ajan olan 5’-Aza-2-deoxycytidine (5-aza-CdR)
uygulayarak N-Myc ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkilerini incelemek, e!er varsa bu
ili kinin rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlarla olan etkile iminde p14ARF geni
5
demetilasyonunun rolünü incelemektir. Kanser hücrelerinde proliferasyonu durdurucu,
diferansiyasyonu artt r c ve apoptozisi uyar c etkileri olan tedavi protokollerine, antitümöral
etkinlikte
de
sinerjizm
gösterecek
yeni
mekanizmalar n
ayd nlat lmas na
ihtiyaç
bulunmaktad r.
Bu hipotezi s namak amac yla çal mam zda, Kelly (Nöroblastik, MYCN+) ve
SHSY5Y (Nöroblastik, MYCN-) insan nöroblastom hücre hatlar nda ve minimal rezidüel
hastal k modelinde, p14ARF gen metilasyonunun ve demetile edici ajan (5’-aza-CdR) ile
demetilasyonunun rutin kemoterapi protokolünde kullan lan ilaçlarla (Vinkristin, Dakarbazin,
fosfamid, Doksorubisin, Siklofosfamid, Etoposid, Sisplatin) olan etkile imi ve tümör
hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerinin de!erlendirilmesi ile p14ARF gen metilasyonunun,
tümörün prognozunu ne yönde etkiledi!i ve sitotoksik etki ile prognoz aras nda bir ili ki
bulunup bulunmad ! n n ara t r lmas planlanm t r.
Ara t rmam z, nöroblastom minimal rezidüel hastal k modelinde bugüne kadar henüz
incelenmemi olan, tümörün regresyon ya da progresyon yapma karar nda kritik bir rol
oynayabilece!ini
dü ündü!ümüz
p14ARF
gen
ekspresyon
düzeylerini,
p14ARF
gen
metilasyonunun N-Myc ekspresyonu üzerindeki etkisini ilk kez inceleyecek olmas , olas
etkilerinin hücresel ve moleküler mekanizmalar ile birlikte irdelenmesi, yeni tedavi
yakla mlar n n ve prognostik belirteçlerin öngörülmesini sa!layacak olmas aç s ndan
literatürde öncü çal ma olacakt r.
6
2. GENEL B LG LER
2.1 NÖROBLASTOM: Tan2m ve Özellikleri
Nöroblastom, çocukluk ça! n n en s k görülen ekstrakraniyal solid tümörüdür.
Primordial nöral krest hücrelerinden köken al r. Tüm çocukluk ça! kanserlerinin %8-10’unu
olu turur. Bir ya alt ndaki çocuklar n en s k görülen tümörü olan nöroblastom, çocukluk ya
grubunda santral sinir sistemi tümörlerinden sonra ikinci s kl kta kar m za ç kmaktad r (8).
Periferal Nöroblastik Tümörler (PNT), nöroblastom (NB), ganglionöroblastom (GNB)
ve ganglionörom (GN)’dan olu an bir tümör grubudur (Fekil 1). Bu tümörler ba ta adrenal
bezi olmak üzere, sempatik sinir sistemine ait dokulardan köken al rlar. PNT histolojik olarak
nöroblastomatöz ve ganglionöromatöz komponentlerden meydana gelir (9):
• Nöroblastomtöz komponent, andifferansiye ya da differansiye nöroblastlar ve
stromas nda nöropili içerir.
• Ganglionöromatöz komponent, ganglion hücrelerinden, fasiküler nörotik uzant lar
olan Schwann hücrelerinden (Schwannian stroma) ve matür fibröz dokudan olu ur.
7ekil 1. S n fland rma (International Neuroblastoma Pathology Comittee-1999)
7
Nöroblastom gerek klinik davran , gerekse tümör hücrelerinde gözlenen genetik
de!i iklikler bak m ndan heterojen özellik gösteren bir tümördür. Tümörün biyolojik
davran ndaki
de!i kenlik
nedeniyle,
nöroblastom
spontan
regresyonlar,
benign
transformasyon ya da agresif seyir gösterebilmekte, bu durum hastal ! n prognozunu
belirlemede ve tedavisinde sorunlara yol açmaktad r (10). Hastal k olgular n % 40’ ndan
fazlas nda letal olup çocukluk ça! tümörlerine ba!l ölümlerin yakla k % 15’ini olu turur.
Nöroblastom olgular nda çe itli edinsel genetik de!i iklikler gözlenmektedir. Bu de!i iklikler
aras nda MYCN onkogeninin amplifikasyonu, 1p36 ve 11q23 kromozom bölgelerinin
delesyonu, 17 no’lu kromozomun uzun kolunda gözlenen dengesiz kopya say s art lar
yeterince tan mlanm
olup, bu de!i ikliklerin tümör davran
ve tedaviye yan tla birliktelik
gösterdi!i bilinmektedir (Fekil 2) (11).
T P1 :
< 1ya ;
TRKA
3N
Hiperdiploid veya near triploid karyotip;
TRKA ,
Lokalize hastal!k;
3N
Çok iyi prognostik grup
Mitotik disfxn.
T P2: near diploid
2N
Kromozomal
bozukluklar
TRKB
2N
17q +
T P2A :
3p – , 11q –
2N/4N 17q +
3p ve 11q delesyonu
17q kazan!m!
TRKB ekspresyonu
Ya daha büyük
Daha ileri evreli hastal!k
T P2B:
2N/4N
1p – , 17q +
2N/4N
1p – , 17q +
MYCN
amplifikasyonu
MYCN amplifikasyonu
1p delesyonu
17q kazan!m!
TRKB + BDNF ekspresyonu
1 – 5 ya
leri evreli , h!zla progrese olan,
S!kl!kla fatal hastal!k
7ekil 2. Nöroblastomun hücresel ve moleküler belirleyicilere göre s n flamas
Tümör davran n ve tedaviye yan t etkileyen bir di!er kriter, tümörün histopatolojik
özelli!idir. Tümör hücre tipine göre nöroblastik (N-tip), stromal (S-tip) ve intermedier (I-tip)
diye ba l ca üç s n fa ayr l r. N-tip nöroblastom hücreleri, nöronal, dar stoplazmal ,
nöroflamanlar ve psödoganglion olu turmaya e!ilimli, granin ve nörotransmiter enzim
8
ekspresyonu yapabilen, malign hücrelerdir. S-tip nöroblastom hücreleri (substrate-adherent
cells), nöronal olmayan, geni stoplazmal , vimentin ve CD44 ekspresyonu yapabilen, malign
olmayan hücrelerdir. I-tip nöroblastom hücreleri (stem cells) ise hem N-tip hem de S-tip
hücrelerin özelliklerine sahiptir, bu hücre tiplerinden daha malign karakterlidir. Tümörün
ba lamas , proliferasyonu ya da differansiyasyonu ve spontan regresyonu ile yak ndan
ili kilidir. I-tip hücrelerin potansiyeli ne yönde ise tümörün davran
o yönde olmaktad r.
leri evre nöroblastom hastalar nda ve rekürren nöroblastom hastalar nda I-tip hücrelerin
varl ! gösterilmi tir. Ayr ca N-tip nöroblastom hücreleri, yüksek miktarda MYCN proteini
eksprese ederler ve bunlar ço!unlukla yüksek risk ta yan tümör hücreleridir. Çünkü MYCN
onkogeni transkripsiyonu aktive ederek proliferasyonu ve tümörün büyümesini artt r rken,
differansiyasyonu azalt r (12).
Bu bilgilerin
! nda, uluslar aras
arenada, prognostik s n f, ya , histolojik
incelemede diferansiasyon ve mitoz karyoreksis indeksi (MKI) özelliklerini kapsayan
Shimada’n n
patoloji
s n flama
sistemi
(International
Neuroblastoma
Pathology
Classification, “INPC”) kullan lmaktad r (Tablo 1) (13).
Tablo 1. Uluslararas Nöroblastom Patoloji S n flamas (INPC)
Shimada
Ya5
Diferansiasyon
Mitoz Karyoreksis ndeksi (MKI)
< 18 ay
Andiferansiye
Herhangi
< 18 ay
Az diferansiye veya
Dü ük (<%2) veya Orta (%2-4)
Prognostik s2n2f2
KÖTÜ
Y
Diferansiye
KÖTÜ
< 18 ay
Herhangi
Yüksek (>%4)
KÖTÜ
18 ay – 5 y l
Andiferansiye veya
Herhangi
Az diferansiye
Y
18 ay – 5 y l
Diferansiye
Dü ük (<%2)
KÖTÜ
18 ay – 5 y l
Diferansiye
Orta (%2-4) veya Yüksek (>%4)
KÖTÜ
>5yl
Herhangi
Herhangi
Nöroblastom’un klinik evrelemesinde ise genel kabul gören, cerrahiye dayal uluslar
aras nöroblastom evreleme sistemidir (International Neuroblastoma Staging System, “INSS”)
(Tablo 2); tedavi protokollerinin olu turulmas nda yap lmas gereken nöroblastom risk
9
s n flamas nda Amerika Birle ik Devletleri’ndeki Çocuk Onkoloji Grubu (Children Oncology
Group “COG”) nun sistemi (Tablo 3) kullan lmaktad r.
Tablo 2. Uluslararas Nöroblastom Evreleme Sistemi (INSS)
INSS Evre
Tan2m
Evre 1
Tümör köken ald ! organda s n rl , makroskopik tam rezeksiyon. Mikroskopik tümör art !
olabilir veya olmayabilir. psilateral veya kontlateral lenf nodu tutulumu yok.
Evre 2a
Unilateral tümör, tam olmayan makroskopik rezeksiyon. psilateral veya kontlateral lenf
nodu tutulumu yok.
Evre 2b
Unilateral tümör, tam veya tam olmayan makroskopik rezeksiyon. psilateral bölgesel lenf
nodu tutulumu var, kontlateral lenf nodu tutulumu yok.
Orta hatt a an tümör ± bölgesel lenf nodu tutulumu
Evre 3
Unilateral tümör + kontlateral lenf nodu tutulumu
Orta hat tümörü +bilateral lenf nodu tutulumu
Yayg n hastal k, uzak metastazlar (kemik ili!i, kemik, uzak lenf nodu, karaci!er ve/veya
Evre 4
di!er organlar )
Evre 4S
Hastan nya
<365 gün; Evre 1 ve 2 gibi lokalize primer tümör var; sadece karaci!er, cilt
ve/veya kemik ili!i tutulumu (kemik ili!inde tümör hücrelerinin oran <%10 olmal ).
Avrupa Nöroblastom Grubu (International Society of Pediatric Oncology European
Neuroblastoma Group, SIOPEN) ise, gerek cerrahi risk faktörlerine, gerekse sitogenetik,
moleküler genetik, patolojik faktörlere dayal bir risk klasifikasyon sistemi olu turmaya
çal maktad rlar. Bu klasifikasyon çal malar n n da tamamlanmak üzere oldu!u bildirilmi tir
(14).
Nöroblastom
olgular n n
klinikte
sitogenetik,
moleküler
genetik,
patolojik
de!erlendirme ve evreleme çal malar tamamland ktan sonra, uygun tedavi protokollerinin
seçilmesi için risk s n flamas yap lmakta ve riske dayal tedavi protokolleri uygulanmaktad r.
Türkiye’de nöroblastom tan l
çocuk hasta say s n , karakteristik özelliklerini
belirlemek amac yla ilk kez, 1992’de Ege Bölgesi’nde zmir Pediatrik Onkoloji Grubu
( POG-1992) kurulmu tur. POG-1992 nöroblastom tedavi protokolüyle ba layan çal malar,
daha sonra TPOG-NB-2003 (Türk Pediatrik Onkoloji Grubu - Nöroblastom - 2003) protokol
çal mas yla devam etmi tir. TPOG-NB–2003 protokolü, Türkiye’deki 30 çocuk onkoloji
merkezinde 01.10.2002 tarihinde uygulanmaya ba lanm ; 2009 y l nda ise, 2003 protokolü
tamamlanm
ve yeni protokole geçilmi tir. Bu protokollerin amac , Türkiye’deki
nöroblastom tedavisinin standardize edilmesi ve yo!un tedavi protokollerinin ülkemiz
10
ko ullar nda uygulanabilirli!inin de!erlendirilmesidir. TPOG-NB-2009 tedavi protokolünde
de yukar da sözü edilen risk klasifikasyonu (Tablo 3) kullan lmaktad r.
Tablo 3. Çocuk Onkoloji Grubunun (COG) kabul etti!i ve TPOG NB 2003 Protokolünde
kullan lan Nöroblastom Risk S n flamas
R SK Grubu
INSS Evre
Ya5 (y2l)
MYCN
Shimada
Amplifikasyonu
Histolojisi
DNA ploidi
1
0-21
herhangi
herhangi
herhangi
2A-2B
<1
herhangi
herhangi
herhangi
2A-2B
]1
(-)
herhangi
herhangi
2A-2B
]1
(+)
iyi
herhangi
4S
<1
(-)
iyi
>1
3
<1
(-)
iyi
>1
3
]1
(-)
iyi
herhangi
4
<1
(-)
iyi
>1
Orta
3-4
<1
(-)
iyi
1
Kötü Histoloji
3-4
<1
(-)
kötü
>1
4S
<1
(-)
kötü
herhangi
4S
<1
(-)
iyi
1
2A-2B
]1
(+)
kötü
3
0-21
(+)
herhangi
herhangi
3
]1
(-)
kötü
herhangi
4
>1
herhangi
herhangi
herhangi
4
<1
(+)
herhangi
herhangi
4S
<1
(+)
herhangi
herhangi
Dü5ük
Orta
yi Histoloji
Yüksek
Dokuz Eylül Üniversitesi T bbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dal ’nda tümör dokusu
veya tutulu kemik ili!i örneklerinde MYCN onkogen amplifikasyonu çal lmakta ve MYCN
için 10 kopyan n üzeri amplifikasyon olarak kabul edilmektedir. Hastalarda MYCN onkogen
amplifikasyonu çal lmam
ise, bu grup için ya , INSS evre ve INPC histolojik inceleme
sonucu dikkate al narak risk s n flamas yap lmaktad r (Tablo 4).
11
Tablo 4. MYCN Onkogen Analizi Yap lmam Olgular n TPOG NB 2003 Protokolündeki
Nöroblastom Risk S n flamas
R SK Grubu
INSS Evre
Ya5 (y2l)
Shimada Histolojisi
Dü5ük
1
0 – 21
herhangi
2a – 2b
0 – 21
herhangi
4S
<1
yi
3
0 – 21
yi
3
]1
yi
4
<1
yi
Orta
3–4
<1
Kötü
Kötü Histoloji
4S
<1
Kötü
Yüksek
3
]1
Kötü
4
>1
herhangi
Orta
yi Histoloji
2.1.1 Nöroblastom Tedavi Protokolünde zlenen Stratejiler Nelerdir?
Bugün dünyada uygulanan multimodal tedavi protokolleri, sitogenetik ve moleküler
genetik özellikler, MYCN amplifikasyonu, klinik evre, ya , DNA ploidisine göre haz rlanm
olan risk s n flama sistemine dayanmaktad r. TPOG-NB-2009 protokolünde de bu sistem
kullan lmaktad r (15).
Son y llarda tümör biyolojisi hakk nda bilgilerin artmas na, lokalize hastal kta
kombine tedavi protokolleri ile ba ar sa!lanmas na ra!men, özellikle 1 ya üzeri ileri evre
hastalar n (E3+E4) prognozunda belirgin bir iyile me sa!lanamam t r. As l problem evre 3
(E3) ve özellikle de evre 4 (E4)’dedir. Olgular n yar s ndan fazlas n n E3 ve E4’de tan ald !
göz önüne al n rsa, nöroblastomlu hastalar n büyük bir k sm nda bugünkü yo!un protokoller,
kök hücre deste!i ve immünoterapi yakla mlar na ra!men halen istenen ba ar elde
edilememektedir. ki y ll k hastal ks z ya am süresi (Progression-free survival, PFS) %30–35
düzeylerinde kalmaktad r. Özellikle ileri evre hastalarda (minimal rezidüel hastal k görülme
s kl ! yüksek olan grup) ba ar s zl k nedenlerini aç !a ç karacak ve bunlar tedavi edebilecek
yöntemlerin geli mesine olanak tan yan çal malara ihtiyaç bulunmaktad r (15, 16).
12
Nöroblastomda, Sisplatin’e dayal kemoterapi protokolleriyle ba layan çal malar
bugün, Sisplatin, Siklofosfamid, Doksorubisin, Vinkristin, Dakarbazin,
fosfamid ve
Etoposid’den olu an çoklu kemoterapötik ajanlar n olu turdu!u tedavi protokolleriyle devam
etmektedir. Ayr ca bu protokollere ek olarak primer tümör bölgesine ve metastazlara
radyoterapi uygulanmakta ve cerrahinin de katk s yla birlikte yani, multimodal tedavi
protokolleriyle hastal kta ba ar elde edilmeye çal lmaktad r. Bu tedavi yakla mlar na ek
olarak, özellikle ileri evre yüksek risk hastalarda yüksek doz kemoterapi protokolleri,
immünoterapi protokolleri, antianjiyogenik tedaviler, apoptotik tedavi yakla mlar , I123metaiyodobenzilguanidin (I123-MIBG) tedavi protokolleri gündemdedir (17).
Bu protokollerle olgular n ya am süreleri uzarken, beraberinde geç relapslar n da görülme
s kl ! artmaktad r. Tedavi kesimini takiben 1 y ldan sonra ortaya ç kan relapslar, “geç relaps”
olarak isimlendirilmektedir. Nöroblastomda geç relapslardan sorumlu olan en önemli faktör,
minimal rezidüel hastal k (Minimal Residual Disease, MRD) t r. Bu nedenle MRD’yi kontrol
etmeye yönelik idame tedavileri, son 15 y lda giderek önem kazanmaktad r (18).
dame tedavilerinde; dü ük doz kemoterapi (metronomik tedavi), sitotoksik ajanlar,
diferansiye edici ajanlar (13-sisretinoik asit) ve immünoterapi yöntemleri (nöroblastom GD2
antijenine kar geli tirilmi monoklonal antikor tedavisi) denenmektedir (19).
Alman Pediatrik Onkoloji - Hematoloji Grubu (GPOH), tedavinin geç dönemlerinde
tümör hücrelerinin sensitif faza geç girmeleri nedeniyle geç relapslar n olabilece!i ve bu
nedenle hücre ölümünün gerçekle tirilebilmesi gerekti!i dü üncesinden yola ç karak ilk kez,
1982 nöroblastom tedavi protokolünde ileri evre olgularda idame tedavisi protokolünü
olu turmu lard r (19).
Bugün Amerika Çocuk Onkoloji Grubu, yüksek doz kemoterapi protokollerinin
ard ndan 13-sisretinoik asit ya da monoklonal antikor gibi ajanlar idame tedavisi olarak
kullanmaktad r. Avrupa Nöroblastom Grubu (SIOPEN) da nöroblastomda idame tedavisi
kullanmaya ba lam t r (19).
TPOG taraf ndan 1992 y l nda haz rlanm
olan nöroblastom tedavi protokolüne göre
tedavi edilen hastalarda da, geç relapslar (61. ayda) görülmektedir (20). TPOG-1992
13
nöroblastom tedavi protokolünden elde edilen deneyimlerle haz rlanan 2003 protokolünde,
özellikle yüksek riskli hasta grubuna idame tedavisi eklenmi tir.
2.1.2 TPOG-NB-2003 Riske Dayal2 Tedavi Yakla52m2
Dü ük risk grubunda (DRG); evre 1’de sadece cerrahi, evre 2’de cerrahiye ek 3 kür
kemoterapi (sisplatin, vinkristin, ifosfamid), evre 4S’de cerrahiye ek 4 kür kemoterapi
(vinkristin, siklofosfamid) verilmektedir.
Orta risk grubunda (ORG); cerrahiye ek 2 – 4 kür kemoterapi (vinkristin, ifosfamid,
dakarbazin, adriamisin / sisplatin, siklofosfamid, etoposid) verilmektedir. dame tedavi ve 13
cis-retinoik asit 10 hafta verilmektedir. Rezidüel hastal !a radyoterapi uygulanmaktad r.
Yüksek risk grubunda (YRG); hastalar tan sonras sorumlu hekimin karar na göre
konvansiyonel kemoterapi (KKT) veya yüksek doz kemoterapi(YDKT)+otolog kök hücre
nakli(OKHN) ile tedavi edilmektedirler.
YRG-KKT kolunda 4 kür kemoterapi (vinkristin, ifosfamid, dakarbazin, adriamisin /
sisplatin, siklofosfamid, etoposid), ard ndan geciktirilmi cerrahi, 6 ay idame kemoterapi
verilmektedir.
YRG-OKHN kolunda 3 kür kemoterapi (vinkristin, ifosfamid, dakarbazin, adriamisin /
sisplatin, siklofosfamid, etoposid), geciktirilmi cerrahi ve haz rlama rejiminden (karboplatin,
etoposid, melfalan) olu ur. Primer tümör bölgesine radyoterapi uygulan r.
Her iki gruba da 6 ay süreyle 13-cis retinoik asit verilmektedir (18).
14
2.2 MET LASYON VE KANSER
Metilasyon, memeli DNA’s nda gerçekle ti!i bilinen tek kovalan olayd r ve sadece
CG (CpG) dinükleotidlerinde bulunan sitozinlerde meydana gelir. 1950 y l ndan beri varl !
bilinen 5-metilsitozin (5 mC), modifiye bir bazd r ve genomdaki bazlar n yakla k %4’ünü
olu turur. Metile CpG dinükleotidlerinin ço!u; sentromerik tekrarlar, satellit dizileri ve
tekrarlayan genler gibi dizilerde yer al r. Tüm genomun yakla k %2’sini ve CpG’lerin
yakla k %15’ini olu turan CpG adac klar ise; 0,2-1 kb uzunluktad r ve insan genomundaki
genlerin yakla k %50’sinin promotor bölgelerinde bulunur (21).
DNA metilasyonu memeli genomunda transkripsiyonel bask lama, kromatin yap n n
de!i tirilmesi, X kromozomu inaktivasyonu, genomik imprinting, tekrarlayan ve parazitik
DNA dizinlerinin bask lanmas gibi önemli etkilere sahiptir. Normal hücreler de ekstragenik
DNA (CpG dinükleotidleri) metileyken, gen promotorlar nda bulunan CpG adac klar
demetiledir, bunun istisnas X inaktivasyonuna ve genomik imprintinge u!rayan genlerdir;
bunlar, normal hücrelerde de tek alelden ekspresyonun sa!lanmas için sadece bir alelde
metiledir. Normal dokularda imprintinge ve X inaktivasyonuna u!rayan genler d nda da
ender olarak CpG adac k metilasyonu gözlenir ve s kl kla genin susturulmas na yol açar.
Promotor bölgeden çok gen içindeki CpG adac klar nda saptan r, promotorda olmas
durumunda ise; CpG içeri!i az olan promotor bölgelerde CpG yo!un olanlara göre daha fazla
gözlenir. Promotor, bir genin 5’ ucunda bulunan ve transkripsiyon faktörleri ile RNA
polimeraza ba!lanma bölgesi olu turan DNA dizisidir ve gen ekspresyonunun kontrolünde
önemli role sahiptir. Normal hücrelerde gözlenen promotor bölge metilasyonunun hücre
farkl la mas nda, dokuya özgü genlerin ekspresyonunu düzenleyerek etkili oldu!u
dü ünülmektedir (22).
Epigenetik, en basit ekliyle çevre ve genetik aras ndaki etkile imdir; ayn genotipin
nas l olup da farkl fenotiplere yol açt ! n n en iyi aç klamas n sunar. Gen nükleotid dizisinde
de!i iklik olmaks z n, gen ifadesinde kal t labilir de!i imler gözlenmesi olarak tan mlanabilir.
Epigenetik mutasyon olarak adland r labilen CpG adac klar ndaki metilasyon kal b
de!i ikli!i; her hücre bölünmesinde pasif olarak kal t lan mutasyonlar n aksine, aktif olarak
kal t l r ve gen ifadesini de!i tirebilir (22, 23). Epigeneti!in gen ifadesi kontrolündeki en
15
temel etkisi transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya ula mas n
engelleyecek mekanik
de!i iklikler yaratmas d r. Bu mekanik etki, geri dönü lü olmas aç s ndan DNA dizisinde
gözlenen mutasyonlardan farkl l k gösterir (23).
Kanser olu umu; bir hücrenin, genetik yap s nda ard ard na olu an kal t labilir
de!i ikliklerin birikmesi sonucu, büyüme avantaj kazanmas ile aç klanabilir. Bu süreçte
etkili iki s n f gen vard r, bunlar onkogenler ve tümör bask lay c genlerdir. Bu genlerin
nükleotid dizisini de!i tirerek hatal protein yap m na neden olan, genin kopya say s n
de!i tiren ya da transkripsiyonunu artt ran/azaltan de!i iklikler kansere yol açabilir.
Onkogenlerde gözlenen de!i iklikler onlar n normalden fazla ifade bulmas na neden olurken,
tümör bask lay c genlerde gözlenenler s kl kla ekspresyon azalmas na yol açar. Kanser
olu umunda bir di!er hipotez de Knudson’un iki vuru hipotezidir. Bu hipoteze göre, malign
dönü ümün olu abilmesi için organizmada tümör baskl lay c genlerin iki alelinin de i lev
kaybetmesi gereklidir. Bugün, bu iki vuru un birinin genetik (nokta mutasyonu, delesyon,
çerçeve kayma mutasyonu …), di!erinin epigenetik (promotor metilasyonu) ya da her ikisinin
de genetik veya epigenetik olabilece!i bilinmektedir (24).
Antikanser tedaviler, sitotoksik etkilerini ba l ca tümör hücrelerinde proliferasyonu
durdurarak, diferansiyasyonu artt rarak ve apoptozisi uyararak gerçekle tirirler. Kanser
tedavisinde son y llardaki geli meler; kanser tan s risk belirleme ve tedavisinde epigenetik
yakla mlar n önemini vurgulamaktad r (Fekil 3).
7ekil 3. Kanser tan s , risk belirleme ve tedavisinde epigenetik hedefler
16
2.2.1 p14ARF Metilasyonunun Kanser Olu5um Sürecindeki Önemi
Ba lang çta yüksek risk nöroblastomlar n ço!unda, sitotoksik tedavilere ve lokal
radyoterapiye iyi yan t al n yor iken son zamanlarda, relaps s kl ! n n giderek art gösterdi!i
izlenmektedir. Bunun da nedenleri aras nda, tedavinin yo!unlu!u ile korele bir ekilde geli en
ilaç direncinin önemli rol oynad ! bildirilmi tir (25). Tümör hücrelerindeki intrensek
kemorezistans n en önemli mekanizmas , p53/MDM2/p14ARF yola! ndaki anormalliklerdir.
p53 geni, 17. kromozomun k sa kolunda (17p13) lokalize olup tümör bask lay c olarak
fonksiyon görür. Kanserlerin büyük bir ço!unlu!unda p53 geninde mutasyon oldu!u
bilinmektedir. Onkojenik bir uyaran nedeniyle p53 geninin aktivasyonu sonucunda, hücre
döngüsü duraklat l p apoptoz ili kili çok say da genin transkripsiyonu tetiklenir ve hasara
u!ram olan hücre apoptoz yoluyla ortadan kald r l r (Fekil 4).
7ekil 4. p14ARF geninin, p53 tümör bask lay c gen yola! n aktivasyon mekanizmas
INK4a/ARF loküsü, 9 nolu kromozomun k sa kolunda (9p21-22) lokalize olup, siklinba! ml kinaz inhibitörü p16INK4a ve p14ARF olmak üzere, yap sal olarak iki farkl gen ürününü
kodlar. p16INK4a geni retinoblastomda, p14ARF geni p53 yola! nda önemli ve aktif rol oynarlar.
Bu nedenle, heriki genin hücre ço!almas n n kontrolünde etkin görevleri bulunmaktad r.
Dolay s yla, bu genlerin inaktivasyonuna neden olabilecek herhangi bir durumda, hücre
ço!almas ndaki kontrol ortadan kaybolarak kanser geli imi ba layabilmektedir. p14ARF ve
p16INK4a ekson 2 ve 3 için ortak kodlay c diziler içerirler, ancak promoter ve ekson 1
17
bölgeleri farkl d r. p14ARF geni, p53 geninin proteozom arac l degradasyonu yoluyla genin
inaktivasyonuna neden olan MDM2’nin ubikitin ligaz aktivitesini inhibe ederek, p53 tümör
bask lay c yola! aktive eder ve hücre döngüsünü durdurur. Delesyon veya metilasyon
nedeniyle p14ARF geninin inaktivasyonu sonucunda, MDM2 düzeylerinin artmas yla p53 geni
inaktive olur (26). Tüm bu mekanizmalardan da anla ld ! üzere, p53/MDM2/p14ARF
yola! n n, normal hücre döngüsünün kontrolünde kanser olu umunda kritik bir öneme sahip
oldu!u belirgindir.
Nöroblastomda, p53 mutasyon oran olgular n %2’sinden az nda gözlenmektedir.
Relaps ile gelen olgular n yap lan analizlerinde ise, sitotoksik tedavi sonras nda bu tedaviyle
do!rudan ili kili bir ekilde, p53 mutasyon oranlar n n artt ! n bildiren çal malar vard r (27).
Di!er yandan, baz nöroblastom hücre hatlar nda yap lan çal malarda, tedavi sonras nda,
p14ARF gen delesyonu veya MDM2 amplifikasyonu gibi çe itli mekanizmalar ile p53 geninin
fonksiyonel inaktivasyonunun meydana geldi!i gösterilmi tir (28).
Nöroblastomda, minimal rezidüel hastal ! n ortaya ç kmas ndaki ba l ca nedenlerden
biri olan kemoterapi direncinin geli iminde rol oynayan en önemli mekanizmalardan biri
p-glikoproteini
kodlayan
MDR-1
(multidrug
resistance
gene)
geni,
di!eri
de
p53/MDM2/p14ARF yola! ndaki fonksiyon bozukluklar d r (29).
Sonuç olarak; p14ARF geninin metilasyon ile inaktivasyonunun, hem nöroblastom
olu um sürecinde hem de tedavi verildikten sonra kar m za ç kan minimal rezidüel hastal kta
oldu!u gibi relaps geli iminde çok önemli bir rol oynad ! bildirilmektedir (30). n vitro ve in
vivo yap lan çal malar sonucunda, özellikle kemoterapi sonras nda ortaya ç kan relaps
olgular nda, taksol, temozolamid ve arsenik trioksit gibi p53 yola! ndan ba! ms z etki
gösterebilecek tedavi yakla mlar n n denenmesi gerekti!i vurgulanmaktad r (31).
Bütün bu bilgilerin
! nda, kanser olu umunda ve progresyonunda rol oynayan
epigenetik de!i ikliklerin önemi anla ld kça yeni terapötik hedefler ortaya ç kmaktad r.
18
3. GEREÇ VE YÖNTEMLER
nsan nöroblastom MYCN (+) hücre dizisi KELLY (ACC 355) ve MYCN (-) hücre
dizisi SH-SY5Y (ACC 209), Almanya DSMZ hücre kültürü koleksiyonundan al nd .
Ara t rma için yap lan çal malar n ak
emas Fekil 5’te verilmektedir.
Kelly ve SH-SY5Y Hücre Dizileri
HÜCRE KÜLTÜRÜ
Hücrelerin s v
azotta saklanmas
S v azotta saklanan
hücrelerin çözünmesi
Kemoterapötik ilaçlarla 12
Minimal Rezidüel
Hastal2k Modelinin
Olu5turulmas2
Hücre Say m
saatlik inkübasyon
Demetile edici ilaçla
72 saatlik inkübasyon
Total RNA ve DNA
izolasyonu
cDNA sentezi
Sonuçlar2n statistiksel Analizi
Gen fadesinin Analizi
(
: ayn gün çal lan örnekler),
(
7ekil 5. Çal mada kullan lan yöntemlerin genel ak
: s v azotta ar ivlenen örnekler)
emas .
19
3.1 HÜCRE KÜLTÜRÜ
3.1.1 Hücrelerin ÇoNalt2lmas2
S v azotta dondurulan hücrelerin çözündürülmesi için; s v azot ar ivinden ç kar lan
hücreler, h zla 37ºC su banyosunda hafifçe sallayarak çözüldü. Hücre süspansiyonunda küçük
buz kristalleri olu tu!u anda su banyosundan ç kar ld . Fi enin d
alkolle silindikten sonra
hücreler 10 ml’lik steril dibi konik tüpe aktar ld . ki dakika içinde hafifçe tüpü sallayarak
damla damla so!uk (+4ºC) RPMI-1640 (Gibco) ilave edildi. Hücre süspansiyonu 200 x g’de
10 dakika so!utmal santrifüjde döndürüldü. Süpernatant dikkatli bir ekilde uzakla t r ld .
Hücreler, uygun besi ortamlar ile süspanse edildi.
KELLY hücreleri, %10 FBS (Sigma-Aldrich), %1 L-Glutamin (Sigma-Aldrich), %1
Penisilin-Streptomisin (Sigma-Aldrich) ilavesiyle haz rlanan RPMI ortam nda 75 cm2’lik
kültür flask na ekildi, 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre kald r ld . Her 3 günde bir ortam
de!i tirilerek yakla k %90 yo!unlu!a gelmesi sa!land . Daha sonra 1:3 oran nda pasaj
yap ld (P2).
SH-SY5Y hücreleri ise, %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin ilavesiyle haz rlanan
DMEM (Gibco) ortam nda 75 cm2’lik kültür flask na ekildi, 37 C0’de %5’lik CO2’li
inkübatöre kald r ld . Her 4 günde bir ortam de!i tirilerek yakla k %90 yo!unlu!a gelmesi
sa!land . Yo!unluk sa!land ktan sonra 1:3 oran nda pasaj yap ld (P2).
Hücre kültürü ortamlar n n de!i tirilmesi ve hücrelerin pasajlanmas
eklindeki
a amalar, kemoterapötik ilaç eklenebilmesi için yeterli hücre say s na ula ncaya kadar
tekrarland . laç eklendi!inde 1x106 canl hücre kalabilmesi için öngörülen hücre say lar n n
eldesi yakla k 2 ayl k bir süreçte gerçekle ti.
3.1.2 n Vitro Minimal Rezidüel Hastal2k Modelinin Olu5turulmas2
Nöroblastomda minimal rezidüel hastal k modelini olu turabilmek için, ba lang çta
flaska ekilen hücre say s , kemoterapötik ilaç eklenmesiyle %90 hücre ölümünden sonra
1x106 canl hücre kalacak ekilde hesapland . Bunun için, 32 ayr 75 cm2’lik kültür flask na
1x108 hücre ekildi, 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre kald r ld . Sonuç olarak; 16 tane
MYCN (+) grup, 16 tane MYCN (-) grup olu turuldu.
Toplam 32 hücre grubu için kemoterapötiklerin dozlar , TPOG-NB-2009 nöroblastom
tedavi protokolünde, 1 ya ve üzerindeki yüksek risk grubu hastalar için düzenlenmi olan A9
20
ve A11 bloklar ndaki ilaç dozlar na göre, 75 cm2’lik kültür flasklar na uygun olarak
hesapland (Fekil 6).
Yüksek Risk Grubu
Konvansiyonel Kemoterapi
De+erlendirme
Pri tm
•MIBG (+) veya
•Oktreotid (+)
RT Primer tm
CR
dame tedavi
13 cis RA
De+erlendirme
De+erlendirme
OP
A9
A11
OP
x3
VGPR, PR
A9
A11
Rezidü
Hastal&k
(+)
OP
VGPR, PR
Metastaz RT*
NR, PD
Pri tm
•Canl& tümör varsa
veya
•MIBG (+) veya
•Oktreotid (+)
•RT Primer tm
Protokol d&,&
* E+er gerekiyorsa kemik metastazlar&na palyatif RT
De+erlendirme
Hastan&n ya,& < 6 ay ise A7 kürü kemoterapi uygulanacak.
dame tedavi
13 cis RA
7ekil 6. TPOG-NB-2009 Protokolü Yüksek Risk Grubu Tedavi Femas
A9 KÜRÜ
Vinkristin
1,5 mg/m2/doz/gün, V pu e, 1. ve 5. günler
DTIC (Dakarbazin) 200 mg/m2/doz/gün, 30 dakikal k V infuzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Ifosfamid
1500 mg/m2/doz/gün, 20 saatlik V infuzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
+ %100 MESNA
1500 mg/m2/doz/gün, 20 saatlik V infuzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Adriamisin (Doksorubisin) 30 mg/m2/doz/gün, 4 saatlik V infuzyon, 4 ve 5. günler
21
A11 KÜRÜ
Siklofosfamid
300 mg/m2/doz/gün, 1 saatlik V infüzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
MESNA
3 x 60 mg/m2/doz, 10 dakikal k V infüzyon,
MESNA siklofosfamidin 0., 4. ve 8. saatlerinde, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Etoposid
80 mg/m2/doz/gün, 5 saatlik V infüzyon, 1, 2, 3, ve 4. günler
Sisplatin
30 mg/m2/doz/gün, 18 saatlik V infüzyon, 1, 2, 3, 4 ve 5. günler
Yakla k %90 hücre yo!unlu!una ula m
flasklara, %90 hücre ölümünü sa!layacak
dozlarda Vinkristin (1 mg/mL, Orna: 0,01125 mg), Dakarbazin (10 mg/mL, Aventis: 1,5 mg),
fosfamid (40 mg/mL, Eczac ba : 11,25 mg), Doksorubisin (2 mg/mL, Farmar: 0,225 mg),
Siklofosfamid (100 mg/mL, Eczac ba : 2,25 mg), Etoposid (20 mg/mL, Atafarm: 0,6 mg) ve
Sisplatin (0,5 mg/mL, Koçak Farma: 0,225 mg) eklendi ve 12 saatlik inkübasyon için 37
C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre kald r ld . 12 saat sonra, tripan mavisi hücre canl l k testi ile
toma lam nda say m yap ld . Kemoterapötik ilaçlarla inkübasyon sonras canl kalabilen %10
oran ndaki hücreler ya at l p ço!alabilmeleri için 37 C0’de %5’lik CO2’li inkübatöre
kald r ld . Minimal rezidüel hastal k modelini temsil eden hücre grubu %90 yo!unlu!a
ula t ! nda, kontrol gruplar d ndaki tüm flasklara 5’-aza-CdR (5µmol/L; Sigma, St. Louis,
MO: 0,18 mg) eklendi. 72 saatlik inkübasyon sonras nda hücreler flasklardan kald r ld ve
total RNA izolasyonlar yap ld .
3.1.3 Tripan Mavisi ile Hücre Canl2l2N2 Testi
Hücre süspansiyonunda bulunan hücrelerin % 0,4’lük tripan mavisi ile canl l klar
kontrol edildi (32). Test, canl hücrelerin boyay membranlar ndan içeri geçirmeme prensibine
dayanmaktad r. K saca, bire bir oran nda hücre süspansiyonu örne!i ile tripan mavisi lam
üzerinde hafifçe kar t r ld . Yakla k 2-3 dakika bekletildikten sonra
k mikroskobunda
canl ve ölü hücrelerin tümü say ld . Tripan mavisi ile boyanmayan hücrelerin yüzdesi
hesapland . Canl l k testi % 10’un üzerinde ç kan hücre süspansiyonlar seçildi.
Tripan-Blue Solüsyonu:
0,04 g Trypan-blue stain 10 ml distile suda çözüldü.
3 ml Trypan blue solüsyonuna 19 ml PBS ilave edildi.
0,2 µm’lik filtreden geçirilerek kullan ma haz r hale getirildi.
22
3.2 MYCN ve p14ARF GEN FADELER N N ANAL Z
3.2.1. Total RNA zolasyonu
Total RNA ekstraksiyonu, MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar ndan “High Pure
RNA Isolation Kit“ (Roche Diagnostic GmBH, Mannheim, Cat # 11 828 665 001)
kullan larak yap lm t r. Yöntem üretici firman n önerdi!i ekilde gerçekle tirilmi tir.
Tripsin/EDTA ile kald r lan hücreler 400 x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Hücreler 200
bl fosfat tampon solusyonunda (PBS) resüspanse edildi. 400 bl lizis/ ba!lay c (lysis/binding
buffer) tamponu eklendi ve 15 saniye vortekslendi. Örnekler filtreli tüpe aktar ld ve 8000 x
g’de 15 saniye santrifüj edildi. Toplama tüpüne geçen alt k s m at ld ve her bir örnek için 90
bl Dnase inkübasyon tamponu (Dnase incubation buffer) ve 10bl Dnase I eklendi. 15 dakika
oda s s nda inkübe edildi. nkübasyon sonras nda 500 bl y kama tamponu I (wash buffer I)
eklendi 8000 x g’de 15 saniye santrifüj edildi. Toplama tüpüne geçen alt k s m at ld . 500 bl
y kama tamponu II (wash buffer II) eklendi 8000 x g’de 15 saniye santrifüj edildi. Toplama
tüpüne geçen alt k s m at ld .Tekrar 200 bl y kama tamponu II (wash buffer II) eklendi,
13000 x g’de 2 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpleri at ld ve filtreler 1,5 ml’lik
ependorflara aktar ld , 100 bl elüsyon tamponu (elution buffer) eklenip 8000 x g’de 1 dakika
santrifüj edildi. Ependorfa geçen k s mda RNA elde edilmi oldu. Filtreli tüpler at ld ve total
RNA örne!inin bulundu!u tüplerdeki RNA kalitesi spektrofotometrik yöntem (PG Instrument
T 80 + UV/VIS) ile de!erlendirildi ve daha sonra kullan lmak üzere -80ºC’de sakland .
3.2.2 DNA zolasyonu
DNA izolasyonlar , MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar ndan “High Pure PCR
Template Preparation Kit” (Roche Diagnostic GmBH, Mannheim, Cat # 11 796 828 001)
kullan larak yap lm t r. Yöntem üretici firman n önerdi!i ekilde gerçekle tirilmi tir.
Tripsin/EDTA ile kald r lan hücreler 400 x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Hücreler 200
bl fosfat tampon solusyonunda (PBS) resüspanse edildi. Her bir örne!e 200 bl ba!lay c
tampon (binding buffer) ve 40 bl proteinaz K eklendi. 70 C0’de 10 dakika inkübe edildi.
nkübasyon sonras nda 100 bl izopropanol eklendi ve iyice kar t r ld . Filtreler toplama
tüplerine geçirildi ve örnekler filtrelere aktar ld . 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi.
Toplama tüpü yenisi ile de!i tirildi. 500 bl inhibitör ayr m tamponu (inhibitor removal buffer)
eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü yenisi ile de!i tirildi. 500 bl
23
y kama tamponu (wash buffer) eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü
yenisi ile de!i tirildi. Yeniden 500 bl y kama tamponu (wash buffer) eklendi. 8000 x g’de 1
dakika santrifüj edildi. Toplama tüpü içindeki s v at ld , 13000 x g’de 10 saniye santrifüj
edildi. Filtreler ependorfa aktar ld . Her bir örne!e 200 bl elüsyon tamponu (elution buffer)
eklendi. 8000 x g’de 1 dakika santrifüj edildi. Ependorfa geçen k s mda DNA elde edilmi
oldu. DNA kalitesi spektrofotometrik yöntem (PG Instrument T 80 + UV/VIS) ile
de!erlendirildi.
3.2.3 Komplementer DNA (cDNA) Sentezi
Elde edilen RNA’lardan 12’ er bl total RNA örne!i kal p olarak kullan larak cDNA
sentezi, “SABiosciences’s RT2 First Strand Kit” (Cat # C-03) ile gerçekle tirildi. 8 bl’sinde
20 ng RNA olan örneklere genomik DNA eliminasyonu yapmak için 2 bl 5X gDNA
eliminasyon tamponu eklendi, iyice kar t r ld , Thermal Cycler (Eppendorf AG, Hamburg,
Germany)’da 42 C0’de 5 dakika inkübe edildi. nkübasyon sonras nda buz üzerine al nd . Her
bir örnek için a a! da gösterilmi miktarlarda RT kokteyl haz rland :
RT kokteyl
Miktar
5X RT tampon 3
4 bl
Primer ve eksternal
1 bl
kontrol miks
Haz rlanm
RT enzim miks 3
2 bl
Rnaz içermeyen H2O
3 bl
Toplam hacim
10 ,l
RT kokteyl, genomik DNA eliminasyonu yap lm
ve buz üstüne al nm
0
örneklere eklendi, iyice kar t r ld . Termal Cycler’da 42 C ’de 15, 95 C0’da 5 dakika inkübe
edildi. Daha sonra örnekler -20 C0’ye kald r ld .
3.2.4 Real time-PCR ile Gen Ekpresyon Analizleri
RT-PCR gen ekspresyon analizleri SABiosciences’s RT2 qPCR Master Miksleri ile
gerçekle tirildi. MYC-N (NM-005378), P14ARF (CDKN2A) (NM-000077) genleri için uygun
primerler kullan ld . “House keeping” gen olarak ise GADPH (NM-002046) seçilmi tir.
24
Her üç gen için PCR miksleri ayr ayr u oranlarda haz rland :
RT2 qPCR master miks
12,5 bl
ddH2O
10,5 bl
Dilue edilmi cDNA
1,0 bl
RT2 qPCR primerler
1,0 bl
Toplam hacim
25 ,l
PCR miksi 96 kuyucuklu örnek küvetine yüklendi ve Roche Light Cycler® 480 cihaz nda u
protokolde reaksiyon gerçekle tirildi:
Roche Light Cycler® 480
Siklus
Süre
S2cakl2k
1
10 dakika
95 C0
45
15 saniye
97 C0
1 dakika*
72 C0
* Her 45 siklusun sonundaki uzama evresinde SYBR Green floresan ölçüldü.
Erime e!risi analizi yap ld :
Süre
S2cakl2k
65 C0’den 95 C0’ye
s2cakl2k art252/dakika
Roche Light Cycler® 480
1 dakika
95 C0
2 dakika
65 C0
2 C0 / dakika
Veri analizleri 5u 5ekilde yap2ld2: Herbir gen Cp (Crossing point) de!erlerinin ortalamas
al narak GADPH referans geni ortalama Cp de!erine göre fark hesapland . Daha sonra herbir
genin kontrol GADPH genine göre R (ratio) ekspresyon katlar hesapland .
3.2.5 DNA Metilasyon qPCR Analizleri
p14ARF geninin metilasyon durumu ”Methyl-Profiler DNA Methylation qPCR Assays”
(SABiosciences’s DNA methylation enzyme kit, Cat # MeA-03; RT2 SYBR Green qPCR
Master Mix, Cat # PA-010) ile incelendi.
Testte demetile ya da metile DNA’y kesmek için DNA metilasyonuna duyarl ve
ba! ml enzimler kullan ld . DNA kesiminden sonra p14ARF geninin primerleri (NM-058195)
kullan larak qPCR analizleri Roche Light Cycler® 480 cihaz nda gerçekle tirildi.
25
Hipermetile, orta dereceli metile ve demetile DNA relatif konsantrasyonlar “mock digest
(sahte kesim)” yap lm DNA miktarlar ile kar la t r larak hesapland .
DNA kesimi için herbir örnek ba na dört ayr tüp u ekilde haz rland :
a) Mock Digest (Mo): RT-PCR deneyi için gerekli olan tüm genomik DNA’y içeren tüp.
b) Metilasyon duyarl2 kesim (Ms): Demetile ya da k smen metile DNA’n n metilasyona
duyarl enzim ile kesilip, hipermetile DNA’n n RT-PCR deneyi için bulundu!u tüp.
c) Metilasyon baN2ml2 kesim (Md): Metile DNA’n n metilasyona ba! ml enzim ile kesilip,
demetile DNA’n n RT-PCR deneyi için bulundu!u tüp.
d) Çift kesim (Msd): Metilasyona duyarl ve metilasyona ba! ml enzimlerin bulundu!u
enzimatik kesim ba ar s n n ölçüldü!ü tüp.
Herbir örnek için kokteyl u ekilde haz rland :
Bile5enler
Miktar
Çift distile su
89 bl
5X kesim tamponu ( 5X RM buffer)
26 bl
0,5 bg örnek DNA
5 bl
Toplam hacim
120 ,l
Haz rlanan kokteyl vortekslendi ve u ekilde dört ayr tüpe bölündü:
Farkl2 i5lemlenmi5 PCR tüpleri
Bile5enler
Mo
Ms
Md
Msd
Çift distile su
2 bl
1 bl
1 bl
- bl
Kesim kokteyli
28 bl
28 bl
28 bl
28 bl
- bl
1 bl
- bl
1 bl
- bl
- bl
1 bl
1 bl
30 ,l
30 ,l
30 ,l
30 ,l
Enzim A
(Metilasyona
duyarl2 enzim)
Enzim B
(Metilasyona
baN2ml2 enzim)
Toplam
26
Tüpler vortekslendi ve iyice kar t r ld . Termal Cycler’da 37 C0’de bir gece inkübasyona
b rak ld . nkübasyon sonras nda enzimlerin inaktive olmas için, 65 C0’de 20 dakika inkübe
edildi. Daha sonra örnekler qPCR analizleri için -20 C0’ye kald r ld .
Herbir örnek için u ekilde PCR reaksiyon kokteylleri haz rland :
PCR reaksiyon kokteylleri
Mo
Ms
Md
Msd
Çift distile su
9.5 bl
9.5 bl
9.5 bl
9.5 bl
PCR master
12.5 bl
12.5 bl
12.5 bl
12.5 bl
1 bl
1 bl
1 bl
1 bl
miks
PCR primer
miks
Mo kesim
2 bl
2 bl
Ms kesim
2 bl
Md kesim
2 bl
Msd kesim
Toplam
25 ,l
25 ,l
25 ,l
25 ,l
PCR miksi, 96 kuyucuklu örnek küvetine yüklendi ve Roche Light Cycler® 480 cihaz nda u
protokolde reaksiyon gerçekle tirildi:
Roche Light Cycler® 480
Siklus
Süre
S2cakl2k
1
10 dakika
95 C0
40
15 saniye
97 C0
1 dakika*
72 C0
* Her 40 siklüsün sonundaki uzama evresinde SYBR Green floresan ölçüldü.
Veri analizleri 5u 5ekilde yap2ld2:
www.sabiosciences.com/dna_methylation_data_analysis.php adresinden tek gen metilasyon
analizi için uygun program seçildi, veri giri i yap larak analiz gerçekle tirildi.
27
3.3 PROTE N DÜZEYLER N N ÖLÇÜMÜ
3.3.1 Nüklear Ekstraksiyon
Nüklear ekstraksiyon “Aktive Motif Nuclear Extract Kit” (Active Motif, Cat # 40010)
ile gerçekle tirildi. Hücre kaz ma aleti ile kald r lan hücreler 400 x g’de 5 dakika santrifüj
edildi. Santrifüj sonras üst faz at ld , hücreler 500 bl 1X Hipotonik tampon ile resüspanse
edildi. 15 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Her bir örne!e 25 bl deterjan eklendi, 10 saniye
vortekslendi, 14000 x g’de +4 C0’de 30 saniye santrifüj edildi. Üstte kalan k s m, yani
sitoplazmik fraksiyon at ld . 50 bl lizis tampon ile nüklear pellet resüspanse edildi, 10 dakika
vortekslendi. Sal n ml çalkalay c da 150 rpm’de buz üzerinde 30 dakika inkübe edildi. Daha
sonra 30 saniye vortekslendi. 14000 x g’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatandaki nüklear
ekstrakt yeni bir ependorfa al nd ve -80 C0’ye kald r ld .
3.3.2 EL SA Deneyi
Elisa testi “Active Motif p53 Transcription Factor Assay Kits” (Active Motif
TransAM p53, Cat # 41196), standart e!ri çizimi için gerekli olan rekombinant p53 proteini
5000 ünite (Active Motif TransAM, Cat # 31103) olarak kullan ld . Herbir kuyucu!a 40 bl
ba!lay c tampon eklendi. Örnek kuyucuklar na örnekler, 10 bl’de 10 bg nüklear ekstrakt
olacak ekilde eklendi. Pozitif kontrol kuyucuklar na, lizis tampon ile dilüe edilmi MCF-7
nüklear ekstraktlar ndan 10 bl eklendi. Negatif kontrol kuyucuklar na, 10 bl lizis tampon
eklendi ve lizis tampon kullan larak dilüe edilmi standart proteinlerden 10’ar bl eklendi.
Sal n ml çalkalay c da 100 rpm’de oda s s nda, 1 saat inkübe edildi. nkübasyon sonras nda
3 kere 200 bl 1X y kama tamponu ile y kand . Herbir kuyucu!a 1X antikor ba!lay c tampon
ile 1:1000 oran nda dilüe edilmi p53 antikoru 100 bl eklendi. 1 saat oda s s nda inkübe
edildi. nkübasyon sonras nda 3 kere 200 bl 1X y kama tamponu ile y kand . Herbir kuyucu!a
1X antikor ba!lay c tampon ile 1:1000 oran nda dilüe edilmi HRP antikorundan 100 bl
eklendi. 1 saat oda s s nda inkübe edildi. nkübasyon sonras nda 4 kere 200 bl 1X y kama
tamponu ile y kand . Herbir kuyucu!a önceden oda s s na getirilmi
solüsyonundan 100 bl eklendi. Direkt
olan reaksiyon
ktan korunarak oda s s nda 10 dakika inkübe edildi.
nkübasyon sonras nda 100 bl durdurma solüsyonu eklendi. Spektroforometrik olarak 450/
655 nm’de absorbans ölçümü yap ld .
28
3.4 STAT ST KSEL ANAL Z
statistiksel analizler SPSS software versiyon 15.0 kullan larak gerçekle tirildi.
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar aras nda, MYCN ve p14ARF gen ekspreyon
düzeyleri Mann-Whitney U testi kullan larak kar la t r ld .
P <0.05 de!eri, istatistiksel
olarak anlaml kabul edildi.
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar aras nda, p14ARF gen metilasyon düzeyleri
Mann-Whitney U testi kullan larak kar la t r ld . P <0.05 de!eri, istatistiksel olarak anlaml
kabul edildi.
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar aras nda, 5-aza-CdR’nin MYCN ve p14ARF
gen ekspreyon düzeylerine etkisi T testi kullan larak kar la t r ld .
P <0.05 de!eri,
istatistiksel olarak anlaml kabul edildi.
29
4. BULGULAR
Çal mam zda, MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda, MYCN ve p14ARF gen
(CDKN2A) ekspresyon düzeyleri ve p14ARF metilasyon yüzdeleri ölçülmü tür (Tablo 5 ve 6).
Ayr ca, MYCN ve p14ARF gen protein miktarlar n n de!erlendirilmesi için, p53 protein
düzeyleri ölçülmü tür (Tablo 7 ve 8).
Tablo 5. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
p14ARF Metilasyon Oranlar2 (%)
MYCN
p14ARF
gen ekspresyon
gen ekspresyon
düzeyi
düzeyi
Kontrol
0,810
1,060
5-aza-CdR
0,847
1,053
Vinkristin
0,807
1,070
Vinkr.+5-aza
0,907
1,063
Dakarbazin
0,827
1,090
Dakar.+5-aza
0,850
1,027
fosfamid
1,00
1,093
fosfa.+5-aza
0,923
1,017
Doksorubisin
0,753
1,007
Dokso.+5-aza
0,817
1,030
Siklofosfamid
0,740
1,030
Siklof.+5-aza
0,853
1,033
Etoposid
0,847
1,143
Etopo.+5-aza
0,787
1,063
Sisplatin
0,833
1,097
Sisp.+5-aza
0,903
1,063
KELLY
ntermedier
Hipermetile
Demetile
Metile
72,08
27,92
0
0,07
99,93
0
0,14
99,86
0
0,02
99,98
0
0,15
99,85
0
0,07
99,93
0
0,08
8,6
91,31
0,2
99,8
0
0,22
30,63
69,14
0,05
99,95
0
0,09
33,25
66,66
0,14
99,86
0
0,1
3,54
96,36
0,05
54,37
45,58
0,08
99,92
0
0,05
99,95
0
30
7ekil 7. MYCN (+) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 8. MYCN (+) hücre gruplar nda p14ARF geni PCR amplifikasyon e!rileri
31
Tablo 6. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon ve p14ARF metilasyon oranlar
p14ARF Metilasyon Oranlar2 (%)
MYCN
p14ARF
gen ekspresyon
gen ekspresyon
düzeyi
düzeyi
Kontrol
1,073
1,190
5-aza-CdR
1,113
1,170
Vinkristin
1,163
1,227
Vinkr.+5-aza
1,130
1,153
Dakarbazin
1,137
1,210
Dakar.+5-aza
1,083
1,093
fosfamid
1,130
1,177
fosfa.+5-aza
1,077
1,173
Doksorubisin
1,033
1,100
Dokso.+5-aza
1,100
1,133
Siklofosfamid
1,037
1,140
Siklof.+5-aza
1,107
1,123
Etoposid
1,040
1,193
Etopo.+5-aza
1,097
1,187
Sisplatin
1,050
1,127
Sisp.+5-aza
1,037
1,070
SH-SY5Y
ntermedier
Hipermetile
Demetile
Metile
2,05
62,38
35,57
0,42
99,58
0
1,78
98,22
0
0,46
99,54
0
0,49
99,51
0
0,87
99,13
0
0,7
99,3
0
0,6
99,4
0
0,15
99,85
0
0,27
99,73
0
1,26
98,74
0
0,44
99,56
0
0,07
48,67
51,26
1,15
98,85
0
0,18
99,82
0
0,33
99,67
0
MYCN (+) hücre gruplar nda, MYCN gen ekspresyonlar n n 15. siklustan itibaren
ba lad ! , p14ARF gen ekspresyonlar n n ise 20. siklustan itibaren ba lad ! gözlenmi tir.
Burada, ilgili genin ekspresyon düzeyi ne kadar yüksek ise o kadar erken siklusa girmektedir
(Fekil 7 ve 8).
MYCN (-) hücre gruplar nda, MYCN ve p14ARF genlerinin ekspresyonlar , 30. siklusa
kadar gözlenmemi tir. Bu çal mada, 30. siklustan sonra gözlenen ekspresyon de!erleri
dikkate al nmam t r (Fekil 9 ve 10).
32
7ekil 9. MYCN (-) hücre gruplar nda MYCN geni PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 10. MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni PCR amplifikasyon e!rileri
33
Tablo 7. MYCN (+) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
PROTE N (ng)
KELLY
PROTE N (ng)
Kontrol
2,612
Doksorubisin
2,555
5-aza-CdR
0,532
Dokso.+5-aza
1,016
Vinkristin
1,502
Siklofosfamid
2,138
Vinkr.+5-aza
0,450
Siklof.+5-aza
0,426
Dakarbazin
0,788
Etoposid
1,389
Dakar.+5-aza
0,728
Etopo.+5-aza
0,450
fosfamid
1,512
Sisplatin
0,768
fosfa.+5-aza
0,511
Sisp.+5-aza
0,453
Tablo 8. MYCN (-) hücre gruplar nda p53 protein düzeyleri
PROTE N (ng)
SH-SY5Y
PROTE N (ng)
Kontrol
0,383
Doksorubisin
0,387
5-aza-CdR
0,360
Dokso.+5-aza
0,301
Vinkristin
0,254
Siklofosfamid
0,362
Vinkr.+5-aza
0,324
Siklof.+5-aza
0,298
Dakarbazin
0,322
Etoposid
0,458
Dakar.+5-aza
0,232
Etopo.+5-aza
0,368
fosfamid
0,251
Sisplatin
0,486
fosfa.+5-aza
0,299
Sisp.+5-aza
0,556
Protein (ng)
PROTE N DÜZEYLER
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
KELLY
SHSY5Y
Gruplar
7ekil 11. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda protein düzeylerinin kar la t r lmas
34
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda, MYCN ve p14ARF genlerinin etki
yola! ndaki ölçülebilen tek protein p53 genine ait oldu!u için p53 protein düzeyleri
ölçülmü tür. Sonuçta, MYCN ve ve p14ARF gen ekspresyon düzeyleriyle uyumlu protein
düzeyleri (ng) elde edilmi tir.
MYCN (+) hücre gruplar n n protein düzeyleri, MYCN (-) hücre gruplar n n protein
düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0.001) (Fekil 11).
MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda, p14ARF geni promotor bölgesinin demetile
edici ajan ile gerçekle tirilen demetilasyon yüzdeleri, MYCN (-) hücre grubunda anlaml bir
ekilde yüksek bulunmu tur (p=0.034) (Fekil 12).
MYCN (+) kontrol hücre grubunda, p14ARF geni promotor bölgesinin %72,08
hipermetile, %27,92 demetile oldu!u; 5-aza-CdR eklenmesiyle demetilasyon oran n n
%99,93’e yükseldi!i bulunmu tur.
MYCN (-) kontrol hücre grubunda, p14ARF geni promotor bölgesinin %2,05
hipermetile, %62,38 demetile oldu!u, 5-aza-CdR eklenmesiyle demetilasyon oran n n
%99,58’e yükseldi!i bulunmu tur.
Demetilasyon Yüzdesi (%)
DEMET LE p14ARF GEN DÜZEYLER
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
KELLY
SHSY5Y
Gruplar
7ekil 12. MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geni promotor bölgesinin
demetilasyon yüzdelerinin kar la t r lmas
35
7ekil 13. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR amplifikasyon e!rileri
7ekil 14. p14ARFpromotor bölgesi metilasyon spesifik PCR s cakl k e!rileri
36
MYCN (+) hücre gruplar ndaki MYCN ve p14ARFgen ekspresyon düzeyleri, RT-PCR
sonuçlar a a! daki grafikte verilmi tir (Fekil 15).
KELLY GEN EKSPRESYON DÜZEYLER N N KARCILACTIRILMASI
Gen Amplifikasyonu
1,40
1,20
1,00
0,80
MYCN
0,60
p14ARF
0,40
0,20
0,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Gruplar
7ekil 15. MYCN (+) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas
MYCN gen ekspresyon düzeylerinin kar52la5t2r2lmas2:
• KELLY kontrol grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y kontrol grubunun
MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur (p=0,003).
• KELLY 5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y 5-aza-CdR
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,004).
• KELLY Vinkristin grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Vinkristin
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,003).
• KELLY Vinkristin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Vinkristin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,003).
37
• KELLY Dakarbazin grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Dakarbazin
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,004).
• KELLY Dakarbazin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Dakarbazin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,004).
• KELLY fosfamid grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y fosfamid
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir
(p=0,325).
• KELLY fosfamid+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
fosfamid+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,004).
• KELLY Doksorubisin grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Doksorubisin
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,004).
• KELLY Doksorubisin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Doksorubisin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,004).
• KELLY Siklofosfamid grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Siklofosfamid grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek
bulunmu tur (p=0,004).
• KELLY Siklofosfamid+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Siklofosfamid+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir
ekilde yüksek bulunmu tur (p=0,003).
38
• KELLY Etoposid grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Etoposid
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,003).
• KELLY Etoposid+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Etoposid+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,004).
• KELLY Sisplatin grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Sisplatin
grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,003).
• KELLY Sisplatin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Sisplatin+5-aza-CdR grubunun MYCN gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,004).
MYCN (-) hücre gruplar ndaki MYCN ve p14ARFgen ekspresyon düzeyleri, RT-PCR
sonuçlar a a! daki grafikte verilmi tir (Fekil 16).
SHSY5Y GEN EKSPRESYON DÜZEYLER N N KARCILACTIRILMASI
Gen Amplifikasyonu
1,40
1,20
1,00
0,80
MYCN
0,60
p14ARF
0,40
0,20
0,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Gruplar
7ekil 16. MYCN (-) hücre gruplar nda gen ekspresyon düzeylerinin kar la t r lmas
39
p14ARFgen ekspresyon düzeylerinin kar52la5t2r2lmas2:
• KELLY kontrol grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y kontrol grubunun
p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir (p=0,106).
• KELLY 5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y 5-aza-CdR
grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,009).
• KELLY Vinkristin grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Vinkristin
grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,004).
• KELLY Vinkristin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Vinkristin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,023).
• KELLY Dakarbazin grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Dakarbazin
grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde yüksek bulunmu tur
(p=0,023).
• KELLY Dakarbazin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Dakarbazin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur,
ancak anlaml de!ildir (p=0,332).
• KELLY fosfamid grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y fosfamid
grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir
(p=0,106).
• KELLY fosfamid+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
fosfamid+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,004).
40
• KELLY Doksorubisin grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Doksorubisin
grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir
(p=0,106).
• KELLY Doksorubisin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Doksorubisin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,023).
• KELLY Siklofosfamid grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Siklofosfamid
grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir
(p=0,101).
• KELLY Siklofosfamid+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Siklofosfamid+5-aza-CdR
grubunun
p14ARF
gen
ekspresyon
düzeylerinden
yüksek
bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir (p=0,106).
• KELLY Etoposid grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Etoposid grubunun
p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir (p=0,743).
• KELLY Etoposid+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Etoposid+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden anlaml bir ekilde
yüksek bulunmu tur (p=0,009).
• KELLY Sisplatin grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y Sisplatin grubunun
p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur, ancak anlaml de!ildir (p=0,189).
• KELLY Sisplatin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeyleri, SH-SY5Y
Sisplatin+5-aza-CdR grubunun p14ARF gen ekspresyon düzeylerinden yüksek bulunmu tur,
ancak anlaml de!ildir (p=0,317).
41
Çal mam zda, MYCN (+) ve MYCN (-) hücrelerde, kontrol gruplar na 5-aza-CdR
eklenmesiyle hücre morfolojisinde gözlenen belirgin de!i iklikler a a! da sunulmu tur (Fekil
15-18).
7ekil 17. MYCN (+) kontrol grubu
7ekil 18. MYCN (-) kontrol grubu
7ekil 19. MYCN (+) 5-aza-CdR grubu
7ekil 20. MYCN (-) 5-aza-CdR grubu
42
5. TARTI7MA
Yüksek risk grubundaki ileri evre nöroblastom olgular ndan yüksek doz kemoterapi
protokolleri ve periferik kök hücre nakli ile remisyon sa!lanan hastalarda, erken ve özellikle
geç relapslar n görülmesinden sorumlu olabilece!i dü ünülen faktörlerden birisi minimal
rezidüel hastal kt r. Günümüzde MRD’nin kontrolünde sitostatik ve sitotoksik ilaçlar,
apoptotik ajanlar, immünoterapötik yakla mlar, anti-anjiyojenik ilaçlar, diferansiye edici
ajanlar kullan lmaktad r. Ancak tüm bu tedavi yakla mlar na ra!men bu grupta 2 y ll k
hastal ks z ya am oran %30-40’t r (33). Bu nedenle, daha az toksik ve daha etkin alternatif
tedavi stratejilerine gereksinim bulunmaktad r.
MYCN (+) olan Kelly hücrelerinde olmas beklenen MYCN geni ekspresyon düzeyleri,
MYCN (-) olan SY-SY5Y hücrelerine göre anlaml bir ekilde yüksek olarak bulunmu tur.
Ayn hücre dizilerindeki p14ARF gen ekspresyon düzeyleri incelendi!inde, MYCN (+) hücre
grubunda p14ARF gen düzeylerinin anlaml bir
ekilde yüksek olmas , nöroblastomda
prognozu belirleyen bir belirteç olabilece!ini dü ündürmü tür. p14ARF geni tümör bask lay c
etkisini, di!er bir tümör bask lay c gen olan p53 geninin nükleoplazmada y k lmas n
engelleyip hücre döngüsünü durdurarak gerçekle tirmektedir (34). Amente S. ve ark.’n n (35)
çal malar nda, MYCN ve p14ARF aras nda bir etkile im bulundu!u, p14ARF gen ekspresyon
düzeylerinin
MYCN’in
bildirilmi tir. Bu bilgilerin
bask lay c
transkripsiyonel
! nda, p14
ARF
aktivitesini
düzenlemede
önemli
oldu!u
geninin p53’den ba! ms z olarak da tümör
etki gösterebilece!i anla lmaktad r. Nitekim Datta A. ve ark.’n n (36)
çal malar nda, p14ARF geninin c-Myc gibi çe itli transkripsiyon faktörleri ile ili kili oldu!u
ve MYCN geninin transkripsiyonel aktivitesini inhibe etti!i gösterilmi tir. Bizim
çal mam zda da, p14ARF gen ekspresyon düzeylerinin, ba l ca olumsuz prognostik faktör
olarak bilinen onkojenik MYCN düzeylerine paralel olarak yüksek bulunmas ile, p14ARF
geninin mitojenik bir sinyal kar s nda hücrenin savunma mekanizmas nda çok önemli bir
görev yapt ! n dü ündürmektedir.
Hem MYCN (+) hem de MYCN (-) hücre gruplar nda, 5-aza-CdR eklenmesiyle MYCN
gen ekspresyon düzeylerinin belirgin bir ekilde azald ! bulunmu tur. Bu azalman n MYCN
43
(+) hücre grubunda, MYCN (-) hücrelere göre anlaml bir ekilde gözlenmesi, demetile edici
ajan kullan m n n prognozu daha kötü olan hücrelerde daha etkili oldu!unu göstermi tir. Bu
bulgu, MYCN (+) hücrelerdeki yüksek p14ARF gen düzeyleriyle de uyumludur; demetilasyon
sonucunda p14ARF transkripsiyon aktivitesinin artarak MYCN geninin transkripsiyonunu
inhibe etti!i dü ünülmektedir. Yang Q. ve ark. da (37), agresif nöroblastom primer tümör
örneklerinde çe itli genlerdeki metilasyon oranlar n n yüksek oldu!unu göstermi ler ve
tedavide demetile edici ajanlar n kullan lmas gereklili!ini vurgulam lard r.
Hem MYCN (+) hem de MYCN (-) hücre gruplar nda, 5-aza-CdR eklenmesiyle p14ARF
gen ekspresyon düzeylerinin belirgin bir ekilde artt ! bulunmu tur. Bu art n MYCN (+)
hücre grubunda, MYCN (-) hücrelere göre anlaml bir ekilde olmas , demetile edici ajan ile
bir tümör supresör geni olan p14ARF ekspresyon düzeyinin art n n tetiklendi!ini göstermekte
ve prognozun iyile tirilmesinde olumlu yönde katk sa!layabilece!ini dü ündürmektedir.
Badal V. ve ark. (38), yapt klar in vitro çal mada 5-aza-CdR eklenmesiyle süreye ba! ml
olarak p14ARF geninin transkripsiyonel aktivitesinin artt ! n , bu durumun tümör hücrelerinin
programlanm hücre ölümüne gitmesinde önemli rol oynad ! n belirtmi lerdir. Khan SH. ve
ark. da (39), tümör hücrelerinde p14ARF gen ekspresyon art yla p53 arac l apoptoz yola! n n
aktifle ti!ini ve yeni tedavi protokollerinde bu yola! tetikleyen p14ARF geninin hedef al nmas
gerekti!ini bildirmi lerdir.
MYCN (+) kontrol grubu hücrelerinde p14ARF geninin promotor bölgesi, %72,08
oran nda hipermetile, %27,92 oran nda demetile bulunmu tur. 5-aza-CdR eklenmesiyle
demetilasyon oran %99,93 düzeyine yükselmi tir.
Vinkristin eklenen MYCN (+) hücrelerde, %99,86 oran nda demetilasyon oldu!u
gözlenmi , Vinkristin ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n artt ! ve
Vinkristin’in demetile edici bir ajan gibi etki olu turdu!u bulunmu tur. Mikrotübül sistem
inhibitörü olan Vinkristin’in, metafazda duraklamaya neden olarak mitozu engelledi!i
bilinmektedir. Ayn
zamanda, Vinkristin’in hücre siklusunun S faz na etki ederek
replikasyonu durdurdu!unu bildiren çal malar (40) da mevcuttur. Bizim
çal mam zda,
Vinkristin’in hücre döngüsünde rol alan p14ARF tümör bask lay c genin antitümöral etki
yola! ndaki moleküllerle etkile ti!ini dü ündüren bulgular elde edilmi tir.
44
Dakarbazin ve Sisplatin eklenen MYCN (+) hücre gruplar nda da Vinkristin’e benzeyen
bir etki izlenmi , bu ilaçlar n da demetile edici bir ajan gibi davran p p14ARF geninin promotor
bölgesindeki demetilasyon oran n artt rd klar bulunmu tur.
Dakarbazin eklenen hücrelerde, %99,85 oran nda demetilasyon oldu!u gözlenmi ,
Dakarbazin ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n artt ! bulunmu tur.
Alkilleyici bir ajan olan Dakarbazin, hücre döngüsü fazlar na özgül olmayan, imidazotetrazin
s n f kemoterapötik ilaçlar grubundand r. Di!er bir imidazotetrazin olan Temozolomid’in
DNA metile edici etkisi oldu!u ve bunu DNA metil transferaz (DNMT) enzimi ile yar mal
bir ekilde gerçekle tirdi!i bilinmektedir (41). DNA metilasyonu sonucunda, hücre ya am n ,
proliferasyon ve diferansiyasyonunu s k kontrol alt nda tutan birçok genin önünde (promotor
bölge) yer alan CpG adac klar n n metilasyonu ile gen susturulmu olur. Bu çal mada, ayn
gruptan olmas na ra!men Dakarbazin demetile edici bir etki sergilemi tir. Bu durum, ilaçlar n
farmakodinami!indeki farkl l ktan kaynaklan yor olabilir. Bilindi!i üzere Temozolomid,
karaci!erde enzimatik demetilasyon gerektirmeden fizyolojik pH’da aktif ilaç formuna
dönü ebilmekte iken Dakarbazin, karaci!erde metabolik aktivasyona u!ramaktad r. Bu
nedenle, Dakarbazin’in metabolik aktivasyon sürecinde metile edici etkisinin ortadan kalkt !
ve hatta demetile edici özellik kazand ! dü ünülebilir (42).
Sisplatin eklenen hücrelerde, %99,92 oran nda demetilasyon oldu!u gözlenmi ,
Sisplatin ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n %99,95’e yükseldi!i
bulunmu tur. Campbell KJ. ve ark. (43) osteosarkom hücre dizisinde, sisplatinin ARF tümör
bask lay c fonksiyon ile benzer bir etki olu turdu!u bildirilmi tir. DNA çift zincirinde çapraz
ba!lanma yaparak etki gösteren sisplatin, ayn
zamanda NF- B gibi antiapoptotik
moleküllerin nötralizasyonu yoluyla da antineoplastik etkisini güçlendirmektedir. Shang D. ve
ark. (44) mesanenin transizyonel hücreli karsinomunda, Sisplatin ile 5-aza-CdR’in birlikte
verildiklerinde tümör büyümesi üzerinde sinerjistik supresyon gösterdi!ini ve Siplatin ile 5aza-CdR’in proliferasyon inhibisyonunu hücre döngüsünü G2/M noktas nda durdurarak
sa!lad ! n ve bu etkinin tümör supresör gen olan p53’den ba! ms z oldu!unu bildirmi lerdir.
MYCN (+) hücre gruplar na fosfamid, Doksorubisin, Siklofosfamid ve Etoposid, tek
ba lar na eklendiklerinde metile edici ajan gibi davranarak, p14ARF geninin promotor
bölgesindeki metilasyon oranlar n artt rm lard r. fosfamid, Doksorubisin, Siklofosfamid’in
bu etki mekanizmalar n aç klayacak herhangi bir yay na ula lamam t r, ancak relaps
45
nöroblastom hücre dizilerinde p53 mutasyonlar ile ilgili bir çal mada Melfalan, Karboplatin
ve Etoposid gibi ajanlara ba!l rezistans ile p14ARF ili kisi gösterilmi tir (45). Elde etti!imiz
verilerde gözlenen, bu ajanlar n p14ARF geninde olu turdu!u metilasyon, ilaç rezistans
geli im mekanizmalar na m , yoksa Temozolomid örne!inde oldu!u gibi enzimatik bir
mekanizmaya m
ba!l d r? Bu sorulara cevap bulabilmek ve bu mekanizmalar n
ayd nlat lmas n sa!layabilmek için ileri çal malara ihtiyaç bulunmaktad r.
fosfamid eklenen hücrelerde, %91,31 oran nda metilasyon oldu!u gözlenmi ,
fosfamid ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n %0 düzeylerine indi!i ve
demetilasyon oran n n %99,8’e yükseldi!i bulunmu tur. Bu bulgu, fosfamid’in tek ba na
verildi!inde metile edici etkisinin oldu!unu ancak, demetile edici bir ajan ile birlikte
verildi!inde bu etkisinin ortadan kalkt ! n göstermi tir.
Doksorubisin eklenen hücrelerde, %66,14 oran nda metilasyon oldu!u gözlenmi ,
Doksorubisin ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n %0 düzeylerine indi!i
ve demetilasyon oran n n %99,95’e yükseldi!i gözlenmi tir. Bu bulgu, Doksorubisin’in tek
ba na verildi!inde metile edici etkisinin oldu!unu ancak, demetile edici bir ajan ile birlikte
verildi!inde bu etkisinin ortadan kalkt ! n göstermi tir.
Siklofosfamid eklenen hücrelerde, %66,66 oran nda metilasyon oldu!u, Siklofosfamid
ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n %0 düzeylerine indi!i ve demetilasyon
oran n n %99,86’ya yükseldi!i bulunmu tur. Bu bulgu, Siklofosfamid’in tek ba na
verildi!inde metile edici etkisinin oldu!unu ancak, demetile edici bir ajan ile birlikte
verildi!inde bu etkisinin ortadan kalkt ! n göstermi tir.
Etoposid eklenen hücrelerde ise, %96,36 oran nda metilasyon oldu!u gözlenmi ,
Etoposid ile 5-aza-CdR kombine edilerek verildi!inde bu oran n di!er ilaçlar n aksine
%45,58’e kadar inebildi!i ve demetilasyon oran n n %54,37’ye yükseldi!i bulunmu tur. Bu
bulgu, Etoposid’in tek ba na verildi!inde metile edici etkisinin oldu!unu ancak, demetile
edici bir ajan ile birlikte verildi!inde bu etkisinin tamamen ortadan kaybolmad ! n
göstermi tir. DNA sentez inhibisyonu yaparak antitümöral etki gösteren Etoposid’in, ayn
zamanda NF- B stimülasyonu yoluyla antiapoptotik proteinleri indükleyici etkilerinin
bulundu!u bildirilmi tir (46).
Bu ara t rmada, MYCN (+) hücre gruplar nda Vinkristin, Dakarbazin ve Sisplatin’in
ARF
p14
geninin promotor bölgesini demetile edici etkilerinin, demetile edici bir ajanla
artt r ld ! ; fosfamid, Doksorubisin, Siklofosfamid ve Etoposid’in p14ARF geninin promotor
46
bölgesini metile edici etkilerinin, demetile edici bir ajanla azalt ld !
bulunmu tur.
Dolay s yla, güncel tedavi protokollerinde kullan lan bu ilaçlarla birlikte demetile edici bir
ajan n kombinasyonunun faydal olabilece!i dü ünülmektedir.
MYCN (-) kontrol grubu hücrelerinde p14ARF geninin promotor bölgesi, %62,38
oran nda demetile bulunmu tur. 5-aza-CdR eklenmesiyle demetilasyon oran
%99,58
düzeyine yükselmi tir. Vinkristin, Dakarbazin, fosfamid, Doksorubisin, Siklofosfamid ve
Sisplatin eklenen hücrelerde, kontrol grubundaki hücrelere göre demetilasyon oranlar nda
belirgin bir art
oldu!u gözlenmi , 5-aza-CdR ile kombine edilerek verildiklerinde bu
oranlar n daha da artt ! ve sonuç olarak, bu ilaçlar n demetile edici bir ajan gibi etki
olu turduklar bulunmu tur.
Antimitotik bir ajan olan Doksorubisin’in kaspaz-8 mRNA ekspresyonlar n artt rarak
gerçekle tirdi!i apoptotik etkisinin, demetile edici bir ajan ile kombine verildi!inde daha da
artt ! gözlenmi tir. Liu JQ. ve ark. (47) MYCN (-) hücre grubu olan SH-SY5Y nöroblastom
hücre dizisinde yapt klar bir çal mada, 5-aza-CdR ile birlikte verilen Doksorubisin’in
antitümöral etkinli!inde belirgin bir art
izlendi!i ve bunun kaspaz-8 mRNA ekspresyon
düzeylerindeki art a paralel oldu!u bildirilmi tir.
Ba ta nöroblastom olmak üzere, medülloblastom ve küçük hücreli akci!er kanseri gibi
çe itli solid tümörlerde, kaspaz-8 ekspresyonlar n n metilasyon ile inaktive oldu!u
bilinmektedir. Bugün nöroblastom minimal rezidüel hastal ! n kontrolünde diferansiye edici
ajan olarak kullan lmakta olan retinoik asit ile yap lan çal malarda, retinoik asitin de kaspaz8 düzeylerini artt rarak apoptozu h zland rd ! gösterilmi tir (48).
Öte yandan, Etoposid verilen MYCN (-) hücre grubunda, p14ARF geninin promotor
bölgesinin metilasyon oranlar n metile edici ajan gibi davranarak artt rd ! , 5-aza-CdR ile
kombine edilerek verildi!inde ise tek ba na sergiledi!i metilasyon profilinin ortadan kalkarak
demetilasyon oranlar n n artt ! gözlenmi tir.
Bu ara t rmada, Etoposid’in hem MYCN (+) ve hem de MYCN (-) hücre gruplar nda,
p14ARF geninin promotor bölgesini metile edici etki olu turdu!u ve bu etkisinin demetile edici
bir ajan eklendi!inde azalt ld ! bulunmu tur. Bu bulgu, ara t rmada uygulanan di!er
ilaçlardan farkl olarak sadece Etoposid’e özgüdür. Özellikle Etoposid’de görülen ve
antineoplastik tedavi amac na ters dü en istenmeyen etkilerin, çe itli tümör hücre dizilerinde
47
olmak üzere in vivo deneylerle de ara t r lmas
ve mekanizmalar n n ayd nlat lmas
gerekmektedir.
Ula labilen literatür de!erlendirmesinde; hem MYCN (+) ve hem de MYCN (-)
nöroblastomda, gerek minimal rezidüel hastal k modelinde gerekse p14ARF ile ilgili demetile
edici ajanlarla yap lm herhangi bir ara t rma bulunamam t r. Ancak, nöroblastom d ndaki
di!er pediyatrik ve eri kin solid tümörlerinde yap lan çal malarda, kemoterapi protokollerine
eklenen demetile edici ajanlar n antitümör etkinli!i artt rd klar ve epigenetik tedavi
yakla mlar nda toksik olmayan yeni demetile edici ajanlar n geli tirilmesine ihtiyaç
bulundu!u aç klanmaktad r. Nitekim, Majid S. ve ark. (49), renal hücreli karsinom hücre
dizilerinde BTG3 tümör supresör geninin demetilasyonu için 5-aza-CdR ve genistein
kullanarak, bu iki demetile edici bile i!in etki düzeylerini kar la t rm lar ve diyetteki
izoflavonlar n yap s nda do!al olarak bulunan, toksik olmayan genistein maddesinin, yüksek
toksisiteye sahip instabil bir yap da olan 5-aza-CdR’e benzer düzeyde bir etki olu turdu!unu
bildirmi lerdir. Yine, myeloid malignansilerde demetile edici ajanlar n etkilerini inceleyen bir
çal mada da, demetile edici ajanlar n özellikle dü ük doz uygulamalar nda daha etkili
olduklar ve demetile edici ajanlarla yap lan kombinasyon tedavilerinin çok daha etkin
olabilece!i gösterilmi tir (50).
Günümüzde kullan lan baz
sitotoksik ilaçlar n standart kemoterapide kullan lan
dozlar n n onda biri gibi dü ük dozlarda, daha az yan etki ile MRD’nin kontrolü için
uygulanan idame tedavilerinde kullan labilece!ine ve ba ar elde edilebilece!ine dair veriler
bulunmaktad r. Nöroblastom’da uygulanan metronomik tedavinin amac , ilaçlar n toksik yan
etkilerini en aza indirmek, kemoterapötiklere kar
direnç geli imini azaltmak ve
antianjiogenik etkisinden faydalanarak relapslar engellemektir.
Bu çal madan elde edilen veriler do!rultusunda, MRD’yi kontrol edebilmek amac yla
uygun, dü ük doz sitotoksik ve sitostatikler gibi demetile edici ajanlar n da uygulanabilece!i
dü ünülmektedir. Ancak, Azasitidin ve Desitabin gibi toksisitesi yüksek ajanlar n yerine
kullan labilecek, toksik olmayan yeni demetile edici bile iklerin geli tirilmesine ve bu
ilaçlarla birlikte düzenlenecek olan kombinasyon tedavi protokollerinin haz rlanmas nda
farmakokinetik çal malar n yap lmas na ihtiyaç bulunmaktad r.
48
6. SONUÇ VE ÖNER LER
1) MYCN (+) hücre grubunda, MYCN ve p14ARF gen ekspresyon düzeyleri anlaml bir
ekilde yüksek bulunmu tur.
2) MYCN (-) hücre grubunda, MYCN ve p14ARF gen ekspresyon düzeyleri anlaml bir ekilde
dü ük bulunmu tur.
3) MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar n n herikisinde de, demetile edici ajan
eklenmesiyle MYCN gen ekspresyon düzeyinin azald ! , p14ARF gen ekspresyon düzeyinin
ise artt ! bulunmu tur.
4) Vinkristin, Dakarbazin ve Sisplatin, MYCN (+) ve MYCN (-) hücre gruplar n n herikisinde
de p14ARF geninin promotor bölgesini demetile edici etki olu turmu lard r ve demetile edici
bir ajan eklendi!inde bu etkilerinin artt ! bulunmu tur.
5) fosfamid, Doksorubisin ve Siklofosfamid, MYCN (-) hücre gruplar nda p14ARF geninin
promotor bölgesini demetile edici etki olu tururken; MYCN (+) hücre gruplar nda metile
edici etki olu turmu lar ve demetile edici bir ajan eklendi!inde ise metile edici etkilerinin
ortadan kayboldu!u gözlenmi tir.
6) Etoposid’in hem MYCN (+) ve hem de MYCN (-) hücre gruplar nda, p14ARF geninin
promotor bölgesini metile edici etki olu turdu!u ve bu etkisinin demetile edici bir ajan
eklendi!inde azalt ld ! bulunmu tur.
Sonuç olarak; nöroblastom MRD’de, p14ARFgen metilasyonunun çok önemli bir rol
oynad ! ve MRD kontrolünde kullan lan ilaçlar n etkinli!ini artt rmak ve daha etkin yeni
tedavi kombinasyonlar n planlamak için, p14ARFgeninin tümör bask lay c yola! içerisinde
bulunan, p14ARF geni ile ili kili farkl etki ve direnç mekanizmalar n n hem in vitro ve hem de
in vivo ayd nlat lmas gerekti!i anla lm t r. Bu konuda yap lm
olan çal ma say s çok
azd r, dolay s yla yan tlanmay bekleyen oldukça fazla say da soru bulunmaktad r. Bu
49
sorular n cevaplanabilmesi için, gerek nöroblastom ve gerekse di!er malign tümör
modellerinde, ileri ara t rmalar n yap lmas na gereksinim bulunmaktad r.
kinci sonuç; nöroblastom MRD kontrolünde metronomik tedavilere ek olarak, kötü
prognoz belirteci olan MYCN (+) hücre grubunda daha etkili oldu!u gösterilen demetile edici
ajanlar n, bu tedavi modaliteleri ile kombine edilerek uygulanabilece!i dü ünülmü tür. Bunun
için, daha az toksik ve daha etkin yeni alternatif tedavi yakla mlar n n geli tirilmesine
gereksinim vard r. Bu konuda da yap lacak olan ileri farmakokinetik çal malarla, doz
optimizasyonlar n n düzenlenmesinin ve ki iye özel tedavi protokollerinin olu turulmas n n
gereklili!i, bu çal mam z ile bir kez daha vurgulanmaktad r.
50
7. KAYNAKLAR
1. Maris JM, Matthay KK. Molecular biology of neuroblastoma. J Clin Oncol,
1999;17:2264-79.
2. Olgun N, Kansoy S, Aksoylar S, Uysal K. Türk Pediatrik Onkoloji Grubu (TPOGNBL) nöroblastom 2003 tedavi protokolü.
3. Berthold F. Neuroblastoma-90 (NB-90) protocol. German Pediatric Oncology Group
(GPOG-NBL) 1990.
4. Matthey KK, Perez C, Seeger RC, et al. Successful treatment of stage III
neuroblastoma based on prospective biologic staging: A Children’s Cancer Group
study. J Clin Oncol, 1998;16:1256.
5. SIOPEN Annual General Meeting, Stockholm, 30th October-3rd November, 2006.
6. Nöroblastom tedavi protokolü. Türk Pediatrik Onkoloji Grubu (TPOG-NBL) 1992.
7. Walton JD, Kattan DR, Thomas SK, Spengler BA, Guo H, Biedler JL, Cheung NV,
Ross RA. Characteristics of stem cells from human neuroblastoma cell lines and in
tumors. Neoplasia, 2004;6:838-845.
8. Kang J, Rychahou PG, Ishola TA, Qiao J, Evers BM, Chung DH. N-MYC silencing
induces differentiation and apoptosis in human neuroblastoma cells. Biochem Biophys
Res Comm, 2006;351:192-197.
9. Goto S, Umehara S, Gerbing RB, Stram DO, Brodeur GM, Seeger RC, Lukens JN,
Matthay KK, Shimada H. Histopathology (International Neuroblastoma Pathology
Classification) and MYCN status in patients with peripheral neuroblastic tumors: a
report from the Children's Cancer Group. Cancer, 2001;92(10):2699-708.
10. Mühlethaler-Mottet A, Flahaut M, Bourloud KB, Auderset K, Meier R, Joseph J,
Gross N. Histone deacetylase inhibitors strongly sensitise neuroblastoma cells to
TRAIL-induced apoptosis by a caspases-dependent increase of the pro- to antiapoptotic proteins ratio. BMC Cancer, 2006;6,214:1-13.
11. Haraguchi S, Nakagawara A. A simple PCR method for rapid genotype analysis of the
TH-MYCN transgenic mouse. PLoS One, 2009 Sep 4;4(9):e6902.
51
12. Jacobs JF, van Bokhoven H, van Leeuwen FN, Hulsbergen-van de Kaa CA, de Vries
IJ, Adema GJ, Hoogerbrugge PM, de Brouwer AP. Regulation of MYCN expression
in human neuroblastoma cells. BMC Cancer, 2009;9:239.
13. Altungoz O, Aygun N, Tumer S, Ozer E, Olgun N, Sakizli M. Correlation of modified
Shimada classification with MYCN and 1p36 status detected by fluorescence in situ
hybridization in neuroblastoma. Cancer Genet Cytogenet, 2007;172(2):113-9.
14. Nur Olgun, SIOPEN üyesi, ki isel görü me ile sözlü ileti im bilgisi, 2009.
15. Kim E, Shohet J. Targeted Molecular Therapy for Neuroblastoma: The
ARF/MDM2/p53 Axis. J Natl Cancer Inst, 2009;101(22):1527-29.
16. Van Maerken T, Vandesompele J, Rihani A, De Paepe A, Speleman F. Escape from
p53-mediated tumor surveillance in neuroblastoma: switching off the p14(ARF)MDM2-p53 axis. Cell Death Differ, 2009;16(12):1563-72.
17. Matthay KK, Reynolds CP, Seeger RC, Shimada H, Adkins ES, Haas-Kogan D,
Gerbing RB, London WB, Villablanca JG. Long-term results for children with highrisk neuroblastoma treated on a randomized trial of myeloablative therapy followed by
13-cis-retinoic
acid:
a
children's
oncology
group
study.
J
Clin
Oncol,
2009;27(7):1007-13.
18. Park JR, Villablanca JG, London WB, Gerbing RB, Haas-Kogan D, Adkins ES,
Attiyeh EF, Maris JM, Seeger RC, Reynolds CP, Matthay KK; Children's Oncology
Group. Outcome of high-risk stage 3 neuroblastoma with myeloablative therapy and
13-cis-retinoic acid: a report from the Children's Oncology Group. Pediatr Blood
Cancer, 2009;52(1):44-50.
19. Vermeulen J, De Preter K, Naranjo A, Vercruysse L, Van Roy N, Hellemans J, Swerts
K, Bravo S, Scaruffi P, Tonini GP, De Bernardi B, Noguera R, Piqueras M, Cañete A,
Castel V, Janoueix-Lerosey I, Delattre O, Schleiermacher G, Michon J, Combaret V,
Fischer M, Oberthuer A, Ambros PF, Beiske K, Bénard J, Marques B, Rubie H,
Kohler J, Pötschger U, Ladenstein R, Hogarty MD, McGrady P, London WB, Laureys
G, Speleman F, Vandesompele J. Predicting outcomes for children with
neuroblastoma
using
a
multigene-expression
signature:
a
retrospective
SIOPEN/COG/GPOH study. Lancet Oncol, 2009;10(7):663-71.
52
20. Nur Olgun, Dilek Gunes, Serap Aksoylar, Ali Varan, Ayse Erbay, Volkan Hazar,
Ayhan Dagdemir, Rejin Kebudi, Emel Unal, Cengiz Canbulat, Inci Yildiz, Haldun
Oniz, Sema Anak, Aynur Oguz, Nurdan Tacyildiz, Nilgun Yaris, Funda Corapcioglu,
Inci Ilhan, Faik Saialioglu, Kamer Mutafoglu Uysal, Oguz Altungoz, Vedat Koseoglu,
Gulnur Tokuc, Betul Biner, Savas Kansoy. The Turkish Pediatric Oncology Group
Neuroblastoma 2003 (TPOG-NB-2003): Treatment Results Of The High Risk Group.
40th Congress of the International Society of Paediatric Oncology Berlin, Germany.
October 2-6, 2008. SIOP Abstract Book, D110:140.
21. Hellebrekers DMEI, Griffioen AW, Engeland M. Dual targeting of epigenetic therapy
in cancer. Biochim Biophys Acta, 2007;1775:76-91.
22. Tonini GP, Romani M. Genetic and epigenetic alterations in neuroblastoma. Cancer
Letters, 2003;197:69-73.
23. Gilbert SF. Ageing and cancer as diseases of epigenesis. J Biosci. 2009;34(4):601604.
24. Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome
integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet, 2003;33:245-54.
25. Carr J, Bell E, Pearson ADJ, Kees UR, Beris H. Increased frequency of aberrations in
the p53/MDM2/p14AFR pathway in neuroblastoma cell lines established at relapse.
Cancer Res 2006;66:4.
26. Agrawal A, Yang J, Murphy RF, Agrawal DK. Regulation of the p14ARF-Mdm2-p53
pathway: an overview in breast cancer. Exp Mol Pathol. 2006;81(2):115-22.
27. Lim KP, Sharifah H, Lau SH, Teo SH, Cheong SC. Alterations of the p14ARF-p53MDM2 pathway in oral squamous cell carcinoma: MDM2 overexpression is a
common event. Oncol Rep. 2005;14(4):963-8.
28. Tweddle DA, Pearson AD, Haber M, Norris MD, Xue C, Flemming C, Lunec J. The
p53 pathway and its inactivation in neuroblastoma. Cancer Lett. 2003 Jul 18;197(12):93-8.
29. Keshelava N, Zuo JJ, Chen P, Waidyaratne SN, Luna MC, Gomer CJ, Triche TJ,
Reynolds CP. Loss of p53 function confers high-level multidrug resistance in
neuroblastoma cell lines. Cancer Res, 2001;61(16):6185-93.
53
30. Michalowski MB, de Fraipont F, Plantaz D, Michelland S, Combaret V, Favrot MC.
Methylation of tumor-suppressor genes in neuroblastoma: The RASSF1A gene is
almost always methylated in primary tumors. Pediatr Blood Cancer. 2008
Jan;50(1):29-32.
31. Pizzo PA, Poplack DG. Principles and Practice of Pediatric Oncology. Fifth Edition.
Philedelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2006; 933-71.
32. Heppner GH, Miller FR. The cellular basis of tumor progression. Int. Rev. Cytol.
1998;177:1-56.
33. Olgun N. Türk Pediatrik Onkoloji Grubu, Nöroblastom - 2009 Tedavi Protokolü
(TPOG-NB-2009).
34. Gallagher SJ, Kefford RF, Rizos H. The ARF tumour suppressor. Int J Biochem &
Cell Biol, 2006;38:1637-41.
35. Amente S, Gargano B, Diolaiti D, Vale GD, Lania L, Majello B. p14ARF interacts with
N-Myc and inhibits its transcriptional activity. FEBS Lett, 2007;581:821-5.
36. Datta A, Nag A, Pan W, Hay N, Gartel AL, Colamonici O, Mori Y, Raychaudhuri P.
Myc-ARF (alternate reading frame) interaction inhibits the functions of Myc. J Biol
Chem, 2004;279(35):36698-707.
37. Yang Q, Kiernan CM, Tian Y, Salwen HR, Chlenski A, Brumback BA, London WB,
Cohn SL. Methylation of CASP8, DCR2, and HIN-1 in neuroblastoma is associated
with poor outcome. Clin Cancer Res, 2007;13(11):3191-7.
38. Badal V, Menendez S, Coomber D, Lane DP. Regulation of the p14ARF promoter by
DNA methylation. Cell Cycle 2008;7:1,112-119.
39. Khan SH, Moritsugu J, Wahl GM. Differential requirement for p19ARF in the p53dependent arrest induced by DNA damage, microtubule disruption, and ribonucleotide
depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Mar 28;97(7):3266-71.
40. Abou El Hassan MA, van der Meulen-Muileman I, Abbas S, Kruyt FA. Conditionally
replicating adenoviruses kill tumor cells via a basic apoptotic machinery-independent
mechanism that resembles necrosis-like programmed cell death. J Virol. 2004
Nov;78(22):12243-51.
41. Everhard S, Kaloshi G, Criniere E, Benouaich-Amiel A, Lejeune J, Marie Y, Sanson
M, Kujas M, Mokhtari K, Hoang-Xuan K, Delattre JY, Thillet J. MGMT Methylation:
54
AMarker of Response to Temozolomide in Low-Grade Gliomas. Ann Neurol,
2006;60:740-743.
42. Barone G, Maurizi P, Tamburrini G, Riccardi R. Role of temozolomide in pediatric
brain tumors. Childs Nerv Syst, 2006;22(7):652-61.
43. Campbell KJ, Witty JM, Rocha S, Perkins ND. Cisplatin mimics ARF tumor
suppressor regulation of ReIA (p65) nuclear factor-mB transactivation. Cancer Res,
2006;66(2):929-35.
44. Shang D, Liu Y, Matsui Y, Ito N, Nishiyama H, Kamoto T, Ogawa O. Demethylating
agent 5-aza-2'-deoxycytidine enhances susceptibility of bladder transitional cell
carcinoma to Cisplatin. Urology, 2008;71(6):1220-5.
45. Carr J, Bell E, Pearson ADJ, Kees UR, Beris H. Increased frequency of aberrations in
the p53/MDM2/p14AFR pathway in neuroblastoma cell lines established at relapse.
Cancer Res 2006;66:4.
46. Singh S, Khar A. Biological effects of curcumin and its role in cancer
chemoprevention and therapy. Anticancer Agents Med Chem. 2006;6(3):259-70.
47. Liu JQ, Li AM, Zhang JH. 5-azacytidine enhances anti-tumor efficacy of doxorubicin
to neuroblastoma cell lines.Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, 2007;9(6):577-9.
48. Jiang M, Zhu K, Grenet J, Lahti JM. Retinoic acid induces caspase-8 transcription via
phospho-CREB and increases apoptotic responses to death stimuli in neuroblastoma
cells. Biochim Biophys Acta,2008;1783(6):1055-67.
49. Majid S, Dar AA, Ahmad AE, Hirata H, Kawakami K, Shahryari V, Saini S, Tanaka
Y, Dahiya AV, Khatri G, Dahiya R. BTG3 tumor suppressor gene promoter
demethylation, histone modification and cell cycle arrest by genistein in renal cancer.
Carcinogenesis, 2009;30(4):662-70.
50. Garcia-Manero G. Demethylating agents in myeloid malignancies. Curr Opin Oncol,
2008;20(6):705-10.
55
EK.1: ET K KURUL ONAYI
56