Rekombinant DNA

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-5
1
• Rekombinant DNA teknolojisi (Moleküler
Klonlama
2
Rekombinant DNA
Farklı organizmalardan elde edilen DNA parçalarının birleştirilmesi ile
oluşturulan DNA moleküllerine rekombinant DNA denir.
Rekombinant DNA teknolojisi
• Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan genellikle farklı
biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin genetik
mühendisliği teknikleriyle kesilmesi ve birleştirilmesi işlemlerini
kapsayan bir teknolojidir. Moleküler klonlama (gen klonlaması) da
denir.
• Bu işlemler sonucu Rekombinant DNA elde edilir.
Transgenik organizma=genetiği değiştirilmiş organizma (GDO):
yabancı gen bulunduran organizma
3
Bedensel hücre çekirdeği aktarımı (nüklear
transfer): Moleküler klonlamadan farklıdır.
Burada bedensel hücre çekirdeği, yumurta
çekirdeğine transfer edilir.
4
• Moleküler klonlamada herhangi bir kaynaktan
alınan çift zincirli bir DNA parçası bir vektöre
yerleştirilir ve uygun bir konak içerisine
sokulur. Burada çoğaltıldıktan sonra hedef
organizmaya transfer edilir
• Restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, PCR in vitro
rekombinasyonda kullanılan önemli öğelerdir.
5
Gen klonlamanın aşamaları
1) Kaynak DNA’nın parçalanması ve izolasyonu
Kullanılacak DNA,
 bir organizmanın toplam genomik DNA’sı
 Bir RNA kalıbından ters transkriptaz ile sentezlenen DNA
 PCR ile çoğaltılmış gen veya genler olabilir.
Eğer DNA genomik kaynaklı ise, ilk olarak uygun büyüklükte
parçalar karışımı elde etmek için restriksiyon enzimleri ile
kesilir.
6
2) DNA parçalarının DNA ligaz ile bir klonlama
vektörüne bağlanması
• Klonlama vektörleri, genellikle plazmit veya virüslerden elde edilmiş,
bağımsız replikasyon yapabilen ve gen replikasyonu için kullanılan küçük
genetik elementlerdir.
7
• Klonlama vektörleri tipik olarak in vitro koşullarda yabancı
DNA’nın vektörün kesme bölgesine eklenmesine olanak
verecek şekilde tasarlanır ve kesme işlemi vektörün
replikasyonuna etki etmeyecek şekilde yapılır.
• DNA kaynağı ve vektör aynı restriksiyon enzimi ile kesilerek
iki molekül oluşan yapışkan uçlarla birleşir. Yapışkan uçların
tutunmuş çiftindeki kırık olan fosfodiester bağlarını
birleştirmek için DNA ligaz kullanılır.
8
Klonlama vektörleri
Vektörler, klonlamada yabancı genleri
taşımada ve konak organizmaya
yerleştirmede kullanılan özel
DNA’lardır.
Replike olma yeteneğinde olmalıdırlar.
Konak genomundan bağımsız olarak
izole edilebilmelidirler.
Klonlama işleminin takip edilebilmesi
için seçicilik sağlayan bir marker gen
de bulundurmalıdırlar (Antibiyotik
direnç geni gibi)
9
10
Konak: Gen klonlamasının yapıldığı
mikroorganizma. Genellikle E. Coli kullanılır.
Büyük fragmentli DNA parçalarını çalışmak için S.
Cerevisiae’de kullanılıabilir. Ayrıca Bacilllus
subtilis de kullanılabilmektedir.
11
Plazmitler
Hücre içinde kromozomal DNA’dan ayrı olan halkasal yapıdaki DNA’lardır.
Bakterilerde doğal olarak bulunur. Ökaryotlarda ise nadiren bulunur (S. Cerevisiae).
•
Plazmitler konak kromozomundan bağımsız replikasyon yaparlar.
•
Kendi replikasyonları için gerekli genlerin dışında konaklarına bazı özellikler kazandıran
çeşitli genleri de taşırlar (genellikle antibiyotik ve çeşitli metallere direnç genleri)
•
plazmitlerin çoğu doğal vektörlerdir (türler arasında Yatay gen transferi sağlar).
•
Küçük genleri klonlamakta kullanılır (1-20 kb)
12
Plazmitlerin klonlama vektörü olarak
kullanılmalarının nedenleri:
1) Küçük olmaları DNA’nın izolasyonunu ve
manipülasyonunu kolaylaştırır.
2) Bağımsız replikasyon orijinlerinin olması
3) Çoklu kopya halinde bulunmaları, hücrede
birkaç kopya halinde bulunabilirler.
4) antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir
işaretlerinin bulunması, plazmit içeren
klonların saptanmasını ve seçilmesini
kolaylaştırır
13
Diğer vektörler
Faj λ
• Plazmit vektörlerden daha büyük fragmentleri
klonlamak için kullanılır.
Kosmidler:
• Büyük genleri klonlamakta kullanılır (37-52
kb).
• Plazmit ve bakteriyofajların özellikleri
kullanılarak oluşturulmuş plazmit-bakteriyofaj
λ
Yapay maya kromozomlar (YAC)
• 200-3000kb’lık DNA’ları klonlamakta kullanılır
Bakteriyel yapay kromozomlarıı (BAC)
• Genom projelerinde kullanılır
Ti Plazmiti (Agrobacterium tumefaciens’e ait
plazmit) bitkilere gen transferinde kullanılır.
14
3) Klonlanmış DNA’nın bir konak organizmaya transferi
•
Test tüpü içinde içinde hazırlanmış rekombinant DNA bir konak organizmaya aktarılır
ve orada replike olur.
Klonlama vektörleri için konaklar
•
Yüksek miktarlarda klonlanmış DNA elde etmek için ideal bir konak pahalı olmayan
bir kültür ortamında hızlı bir şekilde büyüyebilmelidir.
•
Patojenik olmamalıdır.
•
DNA’yı içine alabilmeli
•
Vektörün replikasyonunu yürütebilecek uygun enzimlere sahip olmalı
•
Klonlama için en uygun konaklar, kolay çoğalabilen ve yapıları iyi bilinen
mikroorganizmalardır.
Bakteriler: E.coli Bacillus subtilis
Maya: Saccharomyces cerevisiae’dir.
15
Bakteriyel transformasyon
bakterilerdeki transformasyon yöntemleri
• Konak hücre Ca2+ iyonları ile muamele edilerek yabacı DNA’yı (vektör)
hücre içeni alma yeteneği kazanır.
• Elektroporasyon: Hücrede düşük akımda elektrik şoku uygulanır. Hücre
zarında delikler oluşur ve yabancı DNA’yı içine alır.
16
Seleksiyon: Gen transferinin yapılan hücrelerin belirlenmesinde vektörlerde bulunan
işaret genlerinden yararlanılır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan yöntemler:
•
Antibiyotik direnci: Bütün plazmitlerde bulunan ampisiline, tetrasikline veya kanamisine
direnç sağlayan genlerden biri bulunur. Transformasyon yapıldıktan sonra rekombinant
hücreler antibiyotik içeren besiyerinde geliştirilir. Transformasyon gerçekleşen hücreler
antibiyotikli besiyerinde gelişir. Yapılamayanlar ise gelişmez. Gelişme varsa transformasyon
yapılmıştır.
•
Lac Z geni: E. coli’de β-galaktozidazı kodlayan gendir. Besiyerinde bu enzimin substratı olan
x-gal. Besiyerinde gelişen mavi koloniler lac Z geni içerir..
17
• vektör konak mikroorganizmaya
yerleştirildikten sonra rekombinant
hücreler çoğalma ortamında inkübe
edilir.
• Ampisilin ve kimyasal bir boya içeren
nutrient agarlı petrilere ekim yapılarak
rekombinant hücreler inkübe edilir.
18
19
Bitkilerdeki transformasyon yöntemleri
• Gen tabancası (Partikül tabancası) kullanılarak istenilen genin hedef
hücre veya dokuya süratle fırlatılması. 1-2 um çapında metal partiküller
aracılığıyla , bir ateşleme mekanizmasından yararlanılarak DNA hedef
dokuya aktarılır.
Yabancı DNA hücre içine girdikten sonra DNA bitki genomu ile birleşir.
• Elektroporasyon uygulanabilir.
• Mikroenjeksiyon: kapiler mikropipetler ile mikroskop altında
gerçekleştirilir.
20
•
•
Agrobacterium tumefaciens’e ait Ti-plazmiti olarak adlandırılan büyük bir plazmit
kullanılır. En basit yöntemdir. Genellikle bu yöntem kullanılır.
Ti plazmiti, Agrobacterium tumefaciens te bulunan bu plazmit bitkileri infekte
ederek, bitkilerde tümör oluşumuna sebep olmaktadır.
21
• Bitki yaprakları küçük parçalara ayrılır (1x1 cm) ve
Agrobacterium tumefaciens içeren çözeltiye
daldırılarak 10 dak bekletilir. Daha sonra antibiyotik
içeren selektif besiyerinde geliştirilir.
22
• Gen aktarılmış bir ürünün laboratuvardan
ticarete sunuluncaya kadar değişik analizleri
için ve testleri 10-16 yıllık bir süreyi
kapsamaktadır.
23
Rekombinant DNA teknolojisinin kullanım
alanları
TIP
• Rek DNA teknolojisinin en güçlü alanı insan
proteinlerinin üretimidir.
• Memeli hücrelerinde bulunan birçok proteinin yüksek
farmasötik değeri bulunmaktadır. Ancak bu proteinler
normal dokularda oldukça düşük miktarlarda
bulunurlar. Bu yüzden bunları saflaştırmak oldukça
masraflıdır.
• Rekombinant mikroorganizmalarla bu proteinler
üretilebilmektedir
24
• Biyoteknolojinin ilk başarısı insülin hormonunun
üretilmesidir.
• Geçmişte ticari olarak sığır veya domuz pankreasından
izole edilen insülinin kullanılmasıyla insan diyabeti
tedavi ediliyordu.
• Ancak, insana ait olmaya bu insülin yeteri kadar etkili
olmamakta ve izolasyon yöntemi de karışık ve pahalıdır.
• Günümüzde insan insülin geninin bakterilere
klonlanmasıyla bu sorun çözülmüştür.
25
• İnsülinden başka diğer memeli proteinleri de genetik
mühendisliği yöntemleriyle üretilmektedir. Bunlar
arasında özellikle kan pıhtılaşma mekanizması ve diğer kan
işlemlerinde kullanılan çeşitli hormonlar ve proteinler
bulunmaktadır.
Örneğin,
• TPA (doku plazminojen aktivatörü) kan pıhtılarını çözen
protein ve kan pıhtılaşmasını sağlayan proteinler (kan
pıhtılaşma faktörleri), geçmişte toplanan kanlardan izole
ediliyordu. Artık rek DNA teknolojisi ile üretilmektedir.
26
• İnterferonlar: hayvan hücrelerinin viral enfeksiyonu
veya bağışıklık aktivasyonu sonucunda üretilen
proteinlerdir. Bunlar rek. DNA teknolojisi ile üretilerek
kanser tedavisinde ve bağışıklık sistemi
güçlendirilmesinde kullanılır.
• Bunların dışında pekçok protein ve enzim
üretilmektedir
27
GIDA ENDÜSTRİSİNDE REKOMBİNANT DNA
TEKNOLOJİSİ UYGULAMALARI
Bitkilerde genetik modifikasyon uygulamaları
Genetik modikifasyon uygulamaları bitkilerde
• verim artışı,
• Gıda ve ilaç üretimi için maliyet düşürme
• Herbisitlere dirençli bitki üretimi
• Böceklere ve diğer zararlılara dirençli bitki üretimi ve kullanılan
kimyasalların azaltılması
• Makro ve mikromolekül yapılarında değişiklik
• Hasat sonrası kayıpların azaltılması
• Olumsuz çevre koşullarına dayanıklı bitki üretimi
• Gıdaların besin değerinin ve kalitesinin arttırılması
28
• İlk transgenik bitki domatestir (Flavr Savr)
• Ekim alanları 1996 yılında 1.7 milyon hektar
• 2008 yılında 125 milyon hektara çıkmıştır.
• Günümüzde en çok ekimi yapılan transgenik bitkiler soya,
mısır, pamuk ve kolzadır.
• En çok üretimi yapan ülkeler ABD, Arjantin, Brezilya, Kanada,
Hindistan, ve Çin Halk Cumhuriyetidir.
29
• Ticari olarak, daha çok çiftçiyi doğrudan
ilgilendiren herbisitlere, böceklere, virüslere
dayanıklılık gibi özelliklerin aktarılmış olduğu
ürünlerin ekimi yaygındır.
30
Herbisitlere ve bitki zararlılarına dirençli bitki
üretimi
• Herbisit direnci bitkiye genetik olarak aktarılır ve böylece artık
zehirli kimyasallar tarafından öldürülemez.
• Bitkinin kendine zarar vermeksizin, ürünü tehdit eden birçok
yabancı otun tek işlemde ortadan kaldırılmasına olanak sağlar.
• Çok sayıda ilaçlama yapılması zorunluluğu ortadan kalkar.
31
• Viral enfeksiyonlara karşı direnç: bir virüsün kılıf proteinini
kodlayan gen bitkilere aktarılır. Kılıf proteini içeren bitki, kılıfsız
viral partikülleriyle çatışmakta ve bu da virüsün replikasyonunu
bozmaktadır.
• Böcek direnci: Bacilllus thruringensis’in toksik proteinlerini
kodlayan genler aktarılır. Bu toksin güve ve tırtıllara etkilidir.
32
İşleme kalitesinin arttırılması
• Hasat sonrası kaliteyi geliştirmeye yönelik gen aktarımları.
Hastalıklara direnç ve hücre duvarı stabilitesini arttırarak raf ömrünü
uzatmak gibi
• Flavr Savr domatesi FDA tarafından onaylanan ilk GDO’dür. Raf
ömrünü uzatmak amacıyla üretmiştir.
• Etilen üretim geni kontrol edilerek veya poligalakturonaz enzimi
baskılanarak pektin yıkımı önlenerek raf ömrü uzatılmaktadır.
• Olgunlaşmanın yavaşlatılması veya geciktirilmesi, çilek, ahududu,
şeftali gibi ürünlere de yapılmaktadır.
33
Besin değerinin Artırılması
Patateste nişasta biyosentezinin arttırılması, nişasta
içeriğinin değiştirilmesi
Patates ve tahıllarda Lisin, tirozin metiyonin, sistein gibi
zorunlu aminoasitlerin miktarlarının arttırılması
Yağ metabolizmasının genetik modifikasyonu ile yağ
asitlerinin doymuşluk derecelerinin değiştirilmesi
Kanolada laurik asit içeriği arttırılarak bu ürün kısmi
hidrojene olmuş bitkisel yağ olarak şekerlemelerde
kullanılmaktadır.
34
• Çeşitli uygulamalarda (kızartma gibi) istenen özelliklerden biri
oleik asit miktarının linoleik ve linolenik asitten fazla olmasıdır.
Soya fasulyesinin doymuş yağ asit içeriği azaltılıp, oleikasit
içeriği arttırılmış ve böylece soya yağına başka işlemlere gerek
kalmadan daha iyi kızartma stabilitesi kazandırılmıştır.
35
• Pirincin β-karoten miktarı arttırılarak A vitaminince zenginleştirilmesi
sağlanmıştır (Altın pirinç-golden rice)
• Fotosentez için gerekli bir pigment olan β-karoten bitkinin sadece yeşil
dokusunda bulunur, bitkinin fotosentez yapmayan tohumlarında
bulunmaz
• Tohum hücrelerinin β-karoten üretebilmesi için pirinç bitkisinin
genomuna B- karoten sentezinde görev alan 3 gen aktarılmış ve pirinçte
β- karoten üretimi gerçekleştirilmiş.
36
İlaç aşı ve hormon üretimi
• Tarımsal biyoteknolojinin bir diğer uygulama alanı da bitkiler
yardımı ile ilaç aşı ve hormon üretimidir.
• Bu alandaki çalışmalar deneysel aşamadadır.
• Patates, kanola, tütün ve mısır bitkilerinde kuduz, veba ve
hepatit hastalıklarına karşı aşıların üretilmesi üzerinde
denemeler yapılmaktadır.
• Böylece bu hastalıkların az gelişmiş ülkelerde yayılmasının
önlenmesi mümkün olabilecek hem de yüksek maliyetli geniş
ölçekli aşı kampanyalarına gerek duyulmayacaktır.
37
Genetik modifiye mikroorganizmalar
• M.o’lardan işlem yardımcıları, gıda katkı maddeleri vb eldesinde
uzun yıllardır endüstriyel boyutta yararlanılmaktadır.
• M.o’ların endüstride tercih edilmelerinin başlıca nedenleri hızlı
çoğalmaları, üretimlerinde yüksek sıcaklık, basınç veya güçlü
kimyasallara gereksinim duyulmaması ve atık/yan ürünler üzerinde
gelişebilmeleridir.
• Ayrıca atıklar üzerinden değerlendirildiğinde atıkların biyobozunur
olması nedeniyle m.o’lar ekolojik açıdan da kimyasal yöntemlere
göre avantaj sağlamaktadır.
38
• Genetik mühendisliği uygulamalarının bakteri küf ve
mayaların özelliklerinin değiştirilerek m.o’lar
yardımıyla daha önce üretilmeyen maddelerin
üretimi ve üretimlerin daha verimli ve ekonomik
olması yönünden katkıları olmuştur.
39
• Rek DNA tek’nin kullanımı özel gıda işleme koşullarına uygun
yeni enzimlerin üretilmesini de mümkün kılmıştır.
• Bu enzimler, çeşitli kaynaklardan izole edilen m.o’ların
taranması veya bilinen enzimlerin modern protein mühendisliği
teknikleriyle modifikasyonu ile üretilebilmektedir.
• Amilazlar ve lipazlar gibi gıda sanayi açısından önem taşıyan
enzimler özel gıda uygulamalarına uygun olacak şekilde
değiştirilebilmektedir.
40
• Rek DNA teknolojisi ile üretilen ilk enzim 1988’de onay alan kimozin
enzimidir.
• Buzağı şirdeninden elde edilen bu enzimin bulunabilirliğinin zor ve
maliyetinin yüksek olması nedeniyle günümüzde Rek DNA
teknolojisiyle bovin prokimozin geni aktarılmış m.o’lar tarafından
üretilmektedir.
• Bu genin E.coli, Kluyveromyces marxianus gibi m.o’lara klonlanması
ve biyoreaktörde üretilmelerinin ardından salgıladıkları enzimin
ekstraksiyonu ve saflaştırılması sonucu kimozin elde edilmektedir.
• ABD’de peynir üretiminin yaklaşık %60’ında bu enzim
kullanılmaktadır
• Kimozin GRAS statüsünde bir enzimdir
41
• Bunun dışında gıda sanayinde fırıncılık ürünleri, alkollü
içecekler, glikoz şurubu, ve diğer nişastalı ürünlerin üretiminde
kullanılan a-amilaz, katalaz, lipaz, proteaz, ksilanaz gibi çok
çeşitli enzimler rekombinant mikroorganizmlardan saf bir
şekilde elde üretilebilmektedir.
42
Starter kültürlerin özelliklerinin geliştirilmesi
• Laktik asit bakterilerinin genetik modifikasyonu ile farklı süt
ürünleri elde edilebilmekte, ürünlerin organoleptik
özelliklerinin yanında besin değerleri de arttırılabilmektedir.
• Substratlardan yüksek oranda dönüşüm sağlanması, doğal
inhibitör maddelerin (bakteriyosin) ve proteolitik enzimlerin
üretimi laktik asit bakterilerinin modifikasyonu ile
sağlanabilmektedir.
• Bakteriyofajlara dirençli kültür üretimi de
gerçekleştirilebilmektedir.
43
“
• Ekmek üretiminde kullanılan S. Cerevisiae’ da
yapılan modifikasyonlarla maltaz ve maltoz
permeaz enzimleri üretimi gerçekleştirilerek
nişasta kullanımı arttırılmış
44
Hayvanlarda genetik modifikasyon uygulamaları
• Hayvanların üreme performanslarının arttırılması
• Büyüme hızının arttırılması
• Hayvansal ürünlerin miktar ve kalitesinin arttırılması
(sütün kazein, yağ, laktoz miktarlarının
modifikasyonu)
45
• İnsan sağlığına yönelik olarak antikorlar ve bazı proteinler de
hayvanlar vasıtasıyla üretilebilmektedir.
• Trangenik olarak yetiştirilen sığır, koyun ve keçilere önemli
proteinlerin genleri aktarılarak bunları sütlerinde fazla
miktarda üretmeleri sağlanır
• Balıklarda da büyüme hormonu geni aktarılarak hızlı büyüme
gösteren balıklar elde edilmiştir.
46