gıda biyoteknolojisi-5

6.4.2016
• Rekombinant DNA teknolojisi (Moleküler
Klonlama
Moleküler biyolojide kullanılan
yöntemler-6
1
2
Rekombinant DNA
Farklı organizmalardan elde edilen DNA parçalarının birleştirilmesi ile
oluşturulan DNA moleküllerine rekombinant DNA denir.
Bedensel hücre çekirdeği aktarımı (nüklear
transfer): Moleküler klonlamadan farklıdır.
Burada bedensel hücre çekirdeği, yumurta
çekirdeğine transfer edilir.
Rekombinant DNA teknolojisi
• Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan genellikle farklı
biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin genetik
mühendisliği teknikleriyle kesilmesi ve birleştirilmesi işlemlerini
kapsayan bir teknolojidir. Moleküler klonlama (gen klonlaması) da
denir.
• Bu işlemler sonucu Rekombinant DNA elde edilir.
Transgenik organizma=genetiği değiştirilmiş organizma (GDO):
yabancı gen bulunduran organizma
3
4
Gen klonlamanın aşamaları
• Moleküler klonlamada herhangi bir kaynaktan
alınan çift zincirli bir DNA parçası bir vektöre
yerleştirilir ve uygun bir konak içerisine
sokulur. Burada çoğaltıldıktan sonra hedef
organizmaya transfer edilir
1) Kaynak DNA’nın parçalanması ve izolasyonu
• Restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, PCR in vitro
rekombinasyonda kullanılan önemli öğelerdir.
Eğer DNA genomik kaynaklı ise, ilk olarak uygun büyüklükte
parçalar karışımı elde etmek için restriksiyon enzimleri ile
kesilir.
Kullanılacak DNA,
 bir organizmanın toplam genomik DNA’sı
 Bir RNA kalıbından ters transkriptaz ile sentezlenen DNA
 PCR ile çoğaltılmış gen veya genler olabilir.
5
6
1
6.4.2016
2) DNA parçalarının DNA ligaz ile bir klonlama
vektörüne bağlanması (Ligasyon)
ligasyon
• DNA kaynağı ve vektör aynı restriksiyon enzimi ile kesilerek iki molekül
oluşan yapışkan uçlarla birleşir. Yapışkan uçların tutunmuş çiftindeki
kırık olan fosfodiester bağlarını birleştirmek için DNA ligaz kullanılır.
• (DNA ligaz 5’fosfat grubunu 3’OH grubuna bağlanmasını sağlar.)
• Klonlama vektörleri, genellikle plazmit veya virüslerden elde edilmiş,
bağımsız replikasyon yapabilen ve gen replikasyonu için kullanılan küçük
genetik elementlerdir.
• Klonlama vektörleri tipik olarak in vitro koşullarda yabancı DNA’nın
vektörün kesme bölgesine eklenmesine olanak verecek şekilde tasarlanır ve
kesme işlemi vektörün replikasyonuna etki etmeyecek şekilde yapılır.
7
Klonlama vektörleri
8
Plazmitler
Hücre içinde kromozomal DNA’dan ayrı olan halkasal yapıdaki DNA’lardır.
Vektörler, klonlamada yabancı genleri taşımada ve konak organizmaya
yerleştirmede kullanılan özel DNA’lardır.
Bakterilerde doğal olarak bulunur. Ökaryotlarda ise nadiren bulunur (S. Cerevisiae).
Replike olma yeteneğinde olmalıdırlar.
•
Plazmitler konak kromozomundan bağımsız replikasyon yaparlar.
•
Kendi replikasyonları için gerekli genlerin dışında konaklarına bazı özellikler kazandıran
çeşitli genleri de taşırlar (genellikle antibiyotik ve çeşitli metallere direnç genleri)
Konak genomundan bağımsız olarak izole edilebilmelidirler.
Klonlama işleminin takip edilebilmesi için seçicilik sağlayan bir marker
gen de bulundurmalıdırlar (Antibiyotik direnç geni gibi)
•
plazmitlerin çoğu doğal vektörlerdir (türler arasında Yatay gen transferi sağlar).
•
Küçük genleri klonlamakta kullanılır (1-20 kb)
Konak: Gen klonlamasının yapıldığı mikroorganizma. Genellikle E. Coli
kullanılır. Büyük fragmentli DNA parçalarını çalışmak için S.
Cerevisiae’de kullanılıabilir. Ayrıca Bacilllus subtilis de
kullanılabilmektedir.
9
10
Diğer vektörler
Plazmitlerin klonlama vektörü olarak
kullanılmalarının nedenleri:
Faj λ
• Plazmit vektörlerden daha büyük fragmentleri
klonlamak için kullanılır.
1) Küçük olmaları DNA’nın izolasyonunu ve
manipülasyonunu kolaylaştırır.
Kosmidler:
• Büyük genleri klonlamakta kullanılır (37-52
kb).
• Plazmit ve bakteriyofajların özellikleri
kullanılarak oluşturulmuş plazmit-bakteriyofaj
λ
2) Bağımsız replikasyon orijinlerinin olması
3) Çoklu kopya halinde bulunmaları, hücrede birkaç
kopya halinde bulunabilirler.
Yapay maya kromozomlar (YAC)
• 200-3000kb’lık DNA’ları klonlamakta kullanılır
Bakteriyel yapay kromozomlarıı (BAC)
• Genom projelerinde kullanılır
Ti Plazmiti (Agrobacterium tumefaciens’e ait
plazmit) bitkilere gen transferinde kullanılır.
4) antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir işaretlerinin
bulunması, plazmit içeren klonların
saptanmasını ve seçilmesini kolaylaştırır
11
12
2
6.4.2016
Bakteriyel transformasyon
3) Klonlanmış DNA’nın bir konak organizmaya transferi (transformasyon)
bakterilerdeki transformasyon yöntemleri
•
• Konak hücre Ca2+ iyonları ile muamele edilerek yabacı DNA’yı (vektör)
hücre içeni alma yeteneği kazanır.
Test tüpü içinde içinde hazırlanmış rekombinant DNA bir konak organizmaya aktarılır ve orada
replike olur.
Klonlama vektörleri için konakl mikroorganizmaların sahip olması gereken özellikler
• Elektroporasyon: Hücrede düşük akımda elektrik şoku uygulanır. Hücre
zarında delikler oluşur ve yabancı DNA’yı içine alır.
•
Yüksek miktarlarda klonlanmış DNA elde etmek için ideal bir konak pahalı olmayan bir kültür
ortamında hızlı bir şekilde büyüyebilmelidir.
•
Patojenik olmamalıdır.
•
DNA’yı içine alabilmeli
•
Vektörün replikasyonunu yürütebilecek uygun enzimlere sahip olmalı
•
Klonlama için en uygun konaklar, kolay çoğalabilen ve yapıları iyi bilinen mikroorganizmalardır.
Bakteriler: E.coli Bacillus subtilis
Maya: Saccharomyces cerevisiae’dir.
13
• vektör konak mikroorganizmaya
yerleştirildikten sonra rekombinant
hücreler çoğalma ortamında inkübe
edilir.
Seleksiyon:
Gen transferinin yapılan hücrelerin belirlenmesinde vektörlerde bulunan işaret genlerinden
yararlanılır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan yöntemler:
•
•
14
Antibiyotik direnci: Bütün plazmitlerde bulunan ampisiline, tetrasikline veya kanamisine direnç sağlayan
genlerden biri bulunur. Transformasyon yapıldıktan sonra rekombinant hücreler antibiyotik içeren
besiyerinde geliştirilir. Transformasyon gerçekleşen hücreler antibiyotikli besiyerinde gelişir.
Yapılamayanlar ise gelişmez. Gelişme varsa transformasyon yapılmıştır.
• Ampisilin ve kimyasal bir boya içeren
nutrient agarlı petrilere ekim yapılarak
rekombinant hücreler inkübe edilir.
Lac Z geni: E. coli’de β-galaktozidazı kodlayan gendir. Besiyerinde bu enzimin substratı olan x-gal.
Besiyerinde gelişen mavi koloniler lac Z geni içerir. Beyaz koloniler ise klonlanmış olan kolonilerdir.
15
16
Bitkilerdeki transformasyon yöntemleri
•
• Gen tabancası (Partikül tabancası) kullanılarak istenilen genin hedef
hücre veya dokuya süratle fırlatılması. 1-2 um çapında metal partiküller
aracılığıyla , bir ateşleme mekanizmasından yararlanılarak DNA hedef
dokuya aktarılır.
Yabancı DNA hücre içine girdikten sonra DNA bitki genomu ile birleşir.
• Elektroporasyon uygulanabilir.
• Mikroenjeksiyon: kapiler mikropipetler ile mikroskop altında
gerçekleştirilir.
•
17
Agrobacterium tumefaciens’e ait Ti-plazmiti olarak adlandırılan büyük bir
plazmit kullanılır. En basit yöntemdir. Genellikle bu yöntem kullanılır.
Bitki yapraklarrı küçük parçalara ayrılır (1x1 cm) ve Agrobacterium tumefaciens
içeren çözeltiye daldırılarak 10 dak bekletilir. Daha sonra antibiyotik içeren
selektif besiyerinde geliştirilir.
18
3
6.4.2016
Rekombinant DNA teknolojisinin kullanım
alanları
TIP
• Rek DNA teknolojisinin en güçlü alanı insan
proteinlerinin üretimidir.
• Gen aktarılmış bir ürünün laboratuvardan
ticarete sunuluncaya kadar değişik analizleri
için ve testleri 10-16 yıllık bir süreyi
kapsamaktadır.
• Memeli hücrelerinde bulunan birçok proteinin yüksek
farmasötik değeri bulunmaktadır. Ancak bu proteinler
normal dokularda oldukça düşük miktarlarda
bulunurlar. Bu yüzden bunları saflaştırmak oldukça
masraflıdır.
• Rekombinant mikroorganizmalarla bu proteinler
üretilebilmektedir
19
20
• İnsülinden başka diğer memeli proteinleri de genetik
mühendisliği yöntemleriyle üretilmektedir. Bunlar
arasında özellikle kan pıhtılaşma mekanizması ve diğer kan
işlemlerinde kullanılan çeşitli hormonlar ve proteinler
bulunmaktadır.
• Biyoteknolojinin ilk başarısı insülin hormonunun
üretilmesidir.
• Geçmişte ticari olarak sığır veya domuz pankreasından
izole edilen insülinin kullanılmasıyla insan diyabeti
tedavi ediliyordu.
• Ancak, insana ait olmaya bu insülin yeteri kadar etkili
olmamakta ve izolasyon yöntemi de karışık ve pahalıdır.
• Günümüzde insan insülin geninin bakterilere
klonlanmasıyla bu sorun çözülmüştür.
Örneğin,
• TPA (doku plazminojen aktivatörü) kan pıhtılarını çözen
protein ve kan pıhtılaşmasını sağlayan proteinler (kan
pıhtılaşma faktörleri), geçmişte toplanan kanlardan izole
ediliyordu. Artık rek DNA teknolojisi ile üretilmektedir.
21
• İnterferonlar: hayvan hücrelerinin viral enfeksiyonu
veya bağışıklık aktivasyonu sonucunda üretilen
proteinlerdir. Bunlar rek. DNA teknolojisi ile üretilerek
kanser tedavisinde ve bağışıklık sistemi
güçlendirilmesinde kullanılır.
• Bunların dışında pekçok protein ve enzim
üretilmektedir
23
22
GIDA ENDÜSTRİSİNDE REKOMBİNANT DNA
TEKNOLOJİSİ UYGULAMALARI
Bitkilerde genetik modifikasyon uygulamaları
Genetik modikifasyon uygulamaları bitkilerde
• verim artışı,
• Gıda ve ilaç üretimi için maliyet düşürme
• Herbisitlere dirençli bitki üretimi
• Böceklere ve diğer zararlılara dirençli bitki üretimi ve kullanılan
kimyasalların azaltılması
• Makro ve mikromolekül yapılarında değişiklik
• Hasat sonrası kayıpların azaltılması
• Olumsuz çevre koşullarına dayanıklı bitki üretimi
• Gıdaların besin değerinin ve kalitesinin arttırılması
24
4
6.4.2016
• İlk transgenik bitki domatestir (Flavr Savr)
• Ticari olarak, daha çok çiftçiyi doğrudan
ilgilendiren herbisitlere, böceklere, virüslere
dayanıklılık gibi özelliklerin aktarılmış olduğu
ürünlerin ekimi yaygındır.
• Ekim alanları 1996 yılında 1.7 milyon hektar
• 2008 yılında 125 milyon hektara çıkmıştır.
• Günümüzde en çok ekimi yapılan transgenik bitkiler soya,
mısır, pamuk ve kolzadır.
• En çok üretimi yapan ülkeler ABD, Arjantin, Brezilya, Kanada,
Hindistan, ve Çin Halk Cumhuriyetidir.
25
Herbisitlere ve bitki zararlılarına dirençli bitki
üretimi
• Herbisit direnci bitkiye genetik olarak aktarılır ve böylece artık
zehirli kimyasallar tarafından öldürülemez.
• Bitkinin kendine zarar vermeksizin, ürünü tehdit eden birçok
yabancı otun tek işlemde ortadan kaldırılmasına olanak sağlar.
26
• Viral enfeksiyonlara karşı direnç: bir virüsün kılıf proteinini
kodlayan gen bitkilere aktarılır. Kılıf proteini içeren bitki, kılıfsız
viral partikülleriyle çatışmakta ve bu da virüsün replikasyonunu
bozmaktadır.
• Böcek direnci: Bacilllus thruringensis’in toksik proteinlerini
kodlayan genler aktarılır. Bu toksin güve ve tırtıllara etkilidir.
• Çok sayıda ilaçlama yapılması zorunluluğu ortadan kalkar.
27
28
Besin değerinin Artırılması
İşleme kalitesinin arttırılması
• Hasat sonrası kaliteyi geliştirmeye yönelik gen aktarımları.
Hastalıklara direnç ve hücre duvarı stabilitesini arttırarak raf ömrünü
uzatmak gibi
• Flavr Savr domatesi FDA tarafından onaylanan ilk GDO’dür. Raf
ömrünü uzatmak amacıyla üretmiştir.
• Etilen üretim geni kontrol edilerek veya poligalakturonaz enzimi
baskılanarak pektin yıkımı önlenerek raf ömrü uzatılmaktadır.
• Olgunlaşmanın yavaşlatılması veya geciktirilmesi, çilek, ahududu,
şeftali gibi ürünlere de yapılmaktadır.
Patateste nişasta biyosentezinin arttırılması, nişasta
içeriğinin değiştirilmesi
Patates ve tahıllarda Lisin, tirozin metiyonin, sistein gibi
zorunlu aminoasitlerin miktarlarının arttırılması
Yağ metabolizmasının genetik modifikasyonu ile yağ
asitlerinin doymuşluk derecelerinin değiştirilmesi
Kanolada laurik asit içeriği arttırılarak bu ürün kısmi
hidrojene olmuş bitkisel yağ olarak şekerlemelerde
kullanılmaktadır.
29
30
5
6.4.2016
• Pirincin β-karoten miktarı arttırılarak A vitaminince zenginleştirilmesi
sağlanmıştır (Altın pirinç-golden rice)
• Çeşitli uygulamalarda (kızartma gibi) istenen özelliklerden biri
oleik asit miktarının linoleik ve linolenik asitten fazla olmasıdır.
Soya fasulyesinin doymuş yağ asit içeriği azaltılıp, oleikasit
içeriği arttırılmış ve böylece soya yağına başka işlemlere gerek
kalmadan daha iyi kızartma stabilitesi kazandırılmıştır .
• Fotosentez için gerekli bir pigment olan β-karoten bitkinin sadece yeşil
dokusunda bulunur, bitkinin fotosentez yapmayan tohumlarında
bulunmaz
• Tohum hücrelerinin β-karoten üretebilmesi için pirinç bitkisinin
genomuna B- karoten sentezinde görev alan 3 gen aktarılmış ve pirinçte
β- karoten üretimi gerçekleştirilmiş.
31
İlaç aşı ve hormon üretimi
32
Genetik modifiye mikroorganizmalar
• Tarımsal biyoteknolojinin bir diğer uygulama alanı da bitkiler
yardımı ile ilaç aşı ve hormon üretimidir.
• M.o’lardan işlem yardımcıları, gıda katkı maddeleri vb eldesinde
uzun yıllardır endüstriyel boyutta yararlanılmaktadır.
• Bu alandaki çalışmalar deneysel aşamadadır.
• M.o’ların endüstride tercih edilmelerinin başlıca nedenleri hızlı
çoğalmaları, üretimlerinde yüksek sıcaklık, basınç veya güçlü
kimyasallara gereksinim duyulmaması ve atık/yan ürünler üzerinde
gelişebilmeleridir.
• Patates, kanola, tütün ve mısır bitkilerinde kuduz, veba ve
hepatit hastalıklarına karşı aşıların üretilmesi üzerinde
denemeler yapılmaktadır.
• Ayrıca atıklar üzerinden değerlendirildiğinde atıkların biyobozunur
olması nedeniyle m.o’lar ekolojik açıdan da kimyasal yöntemlere
• Böylece bu hastalıkların az gelişmiş ülkelerde yayılmasının
önlenmesi mümkün olabilecek hem de yüksek maliyetli geniş
ölçekli aşı kampanyalarına gerek duyulmayacaktır.
göre avantaj sağlamaktadır.
33
34
• Rek DNA tek’nin kullanımı özel gıda işleme koşullarına uygun
yeni enzimlerin üretilmesini de mümkün kılmıştır.
• Genetik mühendisliği uygulamalarının bakteri küf ve
mayaların özelliklerinin değiştirilerek m.o’lar
yardımıyla daha önce üretilmeyen maddelerin
üretimi ve üretimlerin daha verimli ve ekonomik
olması yönünden katkıları olmuştur.
• Bu enzimler, çeşitli kaynaklardan izole edilen m.o’ların
taranması veya bilinen enzimlerin modern protein mühendisliği
teknikleriyle modifikasyonu ile üretilebilmektedir.
• Amilazlar ve lipazlar gibi gıda sanayi açısından önem taşıyan
enzimler özel gıda uygulamalarına uygun olacak şekilde
değiştirilebilmektedir.
35
36
6
6.4.2016
• Rek DNA teknolojisi ile üretilen ilk enzim 1988’de onay alan kimozin
enzimidir.
• Buzağı şirdeninden elde edilen bu enzimin bulunabilirliğinin zor ve
maliyetinin yüksek olması nedeniyle günümüzde Rek DNA
teknolojisiyle bovin prokimozin geni aktarılmış m.o’lar tarafından
üretilmektedir.
• Bu genin E.coli, Kluyveromyces marxianus gibi m.o’lara klonlanması
ve biyoreaktörde üretilmelerinin ardından salgıladıkları enzimin
ekstraksiyonu ve saflaştırılması sonucu kimozin elde edilmektedir.
• Bunun dışında gıda sanayinde fırıncılık ürünleri, alkollü
içecekler, glikoz şurubu, ve diğer nişastalı ürünlerin üretiminde
kullanılan a-amilaz, katalaz, lipaz, proteaz, ksilanaz gibi çok
çeşitli enzimler rekombinant mikroorganizmlardan saf bir
şekilde elde üretilebilmektedir.
• ABD’de peynir üretiminin yaklaşık %60’ında bu enzim
kullanılmaktadır
• Kimozin GRAS statüsünde bir enzimdir
37
38
Starter kültürlerin özelliklerinin geliştirilmesi
• Laktik asit bakterilerinin genetik modifikasyonu ile farklı süt
ürünleri elde edilebilmekte, ürünlerin organoleptik
özelliklerinin yanında besin değerleri de arttırılabilmektedir.
• Ekmek üretiminde kullanılan S. Cerevisiae’ da
yapılan modifikasyonlarla maltaz ve maltoz
permeaz enzimleri üretimi gerçekleştirilerek
nişasta kullanımı arttırılmış
• Substratlardan yüksek oranda dönüşüm sağlanması, doğal
inhibitör maddelerin (bakteriyosin) ve proteolitik enzimlerin
üretimi laktik asit bakterilerinin modifikasyonu ile
sağlanabilmektedir.
• Bakteriyofajlara dirençli kültür üretimi de
gerçekleştirilebilmektedir.
39
40
Hayvanlarda genetik modifikasyon uygulamaları
• İnsan sağlığına yönelik olarak antikorlar ve bazı proteinler de
hayvanlar vasıtasıyla üretilebilmektedir.
• Hayvanların üreme performanslarının arttırılması
• Büyüme hızının arttırılması
• Trangenik olarak yetiştirilen sığır, koyun ve keçilere önemli
proteinlerin genleri aktarılarak bunları sütlerinde fazla
miktarda üretmeleri sağlanır
• Hayvansal ürünlerin miktar ve kalitesinin arttırılması
(sütün kazein, yağ, laktoz miktarlarının
modifikasyonu)
• Balıklarda da büyüme hormonu geni aktarılarak hızlı büyüme
gösteren balıklar elde edilmiştir.
41
42
7