çukurova bölgesnde hemofl a ve b` l hastaların mutasyon analz

T.C.
ÇUKUROVA ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
B YOK MYA ANAB L M DALI
ÇUKUROVA BÖLGES NDE
HEMOF L A VE B’ L HASTALARIN
MUTASYON ANAL Z
Duygu DÜZGÜNCE
YÜKSEK L SANS TEZ
DANI MANI
Doç. Dr. Abdullah TUL
ADANA 2006
T.C.
ÇUKUROVA ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
B YOK MYA ANAB L M DALI
ÇUKUROVA BÖLGES NDE
HEMOF L A VE B’ L HASTALARIN
MUTASYON ANAL Z
Duygu DÜZGÜNCE
YÜKSEK L SANS TEZ
DANI MANI
Doç. Dr. Abdullah TUL
Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Ara3t4rma Projeleri Birimi taraf4ndan
TF2003YL4 nolu Proje Olarak Desteklenmi3tir.
Tez No:……..
ADANA 2006
KABUL VE ONAY FORMU
Çukurova Üniversitesi Sa&l(k Bilimleri Enstitüsü
Biyokimya Anabilim Dal4 Yüksek Lisans Program4 Çerçevesinde yürütülmü3
olan “Çukurova Bölgesinde Hemofili A ve B’li Hastalar4n Mutasyon Analizi” adl4
çal43ma, a3aC4daki jüri taraf4ndan Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmi3tir.
Tez Savunma Tarihi : 30 / 01 / 2006
mza
Doç. Dr. Abdullah TUL
Çukurova Üniversitesi
Jüri Ba3kan4
mza
Prof. Dr. K4ymet AKSOY
Çukurova Üniversitesi
Jüri Üyesi
mza
Prof. Dr. Sait POLAT
Çukurova Üniversitesi
Jüri Üyesi
Yukar4daki tez, Yönetim kurulunun …………………..tarih ve ……………….say4l4
karar4 ile kabul edilmi3tir.
Prof. Dr. Sait POLAT
Enstitü Müdürü
ii
TE-EKKÜR
Yüksek Lisans eCitimim süresince tez konumun belirlenmesi, 3ekillenmesi,
yürütülmesi ve tez sürecinin organizasyonunda bilimsel çal43maya yönlendiren ve
destekleyen dan43man hocam say4n Doç. Dr. Abdullah TUL ’ ye ve diCer bölüm
hocalar4ma te3ekkür ederim.
Tez örneklerinin temininde yard4mlar4n4 esirgemeyen Pediyatrik Hematoloji
Bilim dal4 öCretim üyeleri say4n Prof. Dr. Yurdanur KILINÇ ve Prof. Dr. Bülent
ANTMEN’e ve tüm bilim dal4 çal43anlar4na te3ekkür ederim.
Tez çal43mam4n deney a3amas4nda benden yard4mlar4n4 esirgemeyen Biyokimya
Bölümü teknik elemanlar4ndan Halil GÜLSEV, Mikail KALAYCI, Erdal ÖZDOLAP
ve diCer çal43ma arkada3lar4ma te3ekkür ederim.
Tezimin bas4m4 ve yürütülmesi a3amas4nda beni destekleyen Çukurova
Üniversitesi Bilimsel Ara3t4rma Projeleri Birimi’ne te3ekkür ederim.
Çal43malar4m boyunca beni her konuda destekleyen ve benim bu günlere
gelmemi saClayan aileme sonsuz te3ekkürlerimi sunar4m.
Duygu DÜZGÜNCE
Adana-2006
iii
Ç NDEK LER
KABUL VE ONAY
TE-EKKÜR
Ç NDEK LER
-EK LLER D Z N
Ç ZELGELER D Z N
S MGELER VE KISALTMALAR
ÖZET
ABSTRACT
ii
iii
iv
vi
vii
viii
ix
x
1.G R - VE AMAÇ
2.GENEL B LG LER
2.1. Kan P4ht4la3ma Mekanizmas4
2.2. Hemofili
2.2.1. Hemofili A
2.2.1.1. FVIII Proteininin Yap4 ve 3levi
2.2.1.2. FVIII’in Sekresyon ve Aktivasyonu
2.2.1.3. FVIII Geninin Yap4 ve 3levi
2.2.1.4. Hemolili A’n4n Moleküler GenetiCi
2.2.1.5. Hemofili A’dan Sorumlu Mutasyonlar
2.2.1.5.1. CpG Dinükleotid Mutasyonlar4
2.2.1.5.2. Missense Mutasyonlar
2.2.1.5.3. Nonsense Mutasyonlar
2.2.1.5.4. Geni3 Delesyonlar ve nsersiyonlar
2.2.1.5.5. Küçük Delesyonlar ve nsersiyonlar(Frameshift Mutasyonlar)
2.2.1.5.6. Splicing Hatalar4
2.2.1.5.7. Gen nversiyonlar4
2.2.1.5.7.1. ntron 22 nversiyonu
2.2.1.5.7.2. ntron 1 nversiyonu
2.2.1.5.8. Gen Polimorfizmleri
2.3.1. Hemofili B
2.3.1.1. Faktör IX Proteini
2.3.1.2. Faktör IX Aktivasyonu
2.3.1.3. FIX Geni Yap4 ve 3levi
2.3.1.4. FIX EksikliCiyle Sonuçlanan Mutasyonlar
2.3.1.5. Gen Polimorfizmleri
3. GEREÇ VE YÖNTEMLER
3.1. Gereçler ve Kimyasal Maddeler
3.1.1. Gereçler
3.1.2. Kimyasal Maddeler
3.2. Örnek Seçimi ve Eldesi
3.3. Moleküler Analiz Yöntemleri
3.3.1. DNA zolasyon Yöntemi
iv
1
3
3
7
9
10
13
15
16
17
17
17
18
18
19
19
20
20
20
21
22
22
23
24
25
26
28
28
28
28
29
29
29
3.3.2. FVIII Polimorfizmlerinin RFLP ile Belirlenmesi
3.3.3. FIX Polimorfizmlerinin RFLP ile Belirlenmesi
4. BULGULAR
5. TARTI-MA
6. SONUÇLAR
7. KAYNAKLAR
ÖZGEÇM -
v
31
33
35
44
49
50
60
-EK LLER D Z N
ekil 1. P4ht4la3ma sistemi
4
ekil 2. FVIII proteini
11
ekil 3. FVIII domain yap4s4 ve FV, Serüloplazmin, Diskoidin I ile yap4sal benzerliCi
11
ekil 4. FVIII’in sekresyonu, aktivasyonu ve inaktivasyonu
15
ekil.5. FVIII geni
16
ekil 6. FVIII geninde ntron 22 inversiyonu
21
ekil 7. FVIII gen polimorfizmleri
22
ekil 8. FIX proteini
23
ekil 9. Olgun FIX proteini
24
ekil 10. FIX geni ve FIX mRNA’s4
25
ekil 11. FIX gen polimorfizmleri
27
ekil 12. ntron 19’da yerle3mi3 HindIII kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak
amplifiye edilen 738 bç’lik bölgenin %2’lik agaroz jel görüntüsü
36
ekil 13. ntron 7’de yerle3mi3 AlwNI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak
amplifiye edilen 260 bç’lik bölgenin %12’lik PAGE görüntüsü
37
ekil 14. FVIII geninin intron 19 amplifiye bölgesinin HindIII enzimi ile kesilerek
genotiplendirilmesi
37
ekil 15. FVIII geninin intron 7 amplifiye bölgesinin AlwNI enzimi ile kesilerek
genotiplendirilmesi
38
ekil 16. ntron 4’da yerle3mi3 TaqI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak
amplifiye edilen 163 bç’lik bölgenin %2’lik agaroz jel görüntüsü
40
ekil 17. ntron 3’de yerle3mi3 XmnI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak
amplifiye edilen 222 bç’lik bölgenin %2’lik agaroz jel görüntüsü
41
ekil 18. FIX geninin intron 4 amplifiye bölgesinin TaqI enzimi ile kesilerek
genotiplendirilmesi
41
ekil 19. FIX geninin intron 3 amplifiye bölgesinin XmnI enzimi ile kesilerek
genotiplendirilmesi
42
ekil 20. FIX geni intron 1’de yerle3mi3 50 bç’lik DdeI polimorfizminin
genotiplendirilmesi
42
vi
Ç ZELGELER D Z N
Çizelge 1. P4ht4la3ma faktörleri
6
Çizelge 2. Hemofilinin S4n4fland4r4lmas4
7
Çizelge 3. FVIII restriksiyon bölgelerinin PCR ile amplifiye edilmi3 ve
restriksiyon enzimi ile kesilmi3 parçalar4
35
Çizelge 4. Polimorfizm saptanan hastalar4n % FVIII aktivitesi
39
Çizelge 5. FIX restriksiyon bölgelerinin PCR ile amplifiye edilmi3 ve
restriksiyon enzimi ile kesilmi3 parçalar4
39
Çizelge 6. Polimorfizm saptanan hastalar4n % FIX aktivitesi
43
vii
S MGELER ve KISALTMALAR D Z N
bç
DF
DNA
dNTP
dk
EDTA
ER
FVIII
FIX
HMWK
Kb
mg
MgCl2
Sg
ng
PAGE
PCR
pH
pmol
RFLP
SDS
sn
TBE
TFPI
U
UV
Baz çifti
Doku Faktörü
Deoksiribo Nükleik Asit
Deoksinükleotid Trifosfat
Dakika
Etilen Diamin Tetra Asetik Asit
Endoplazmik Retikulum
Faktör VIII
Faktör IX
Yüksek Molekül AC4rl4kl4 Kininojen
(High Molecular Weight Kininogen)
Kilobaz
Miligram
Magnezyum Klorür
Mikrogram
Nanogram
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
(Polyacrilamide Gel Electrophoresis)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(Polymerase Chain Reaction)
Hidrojen iyon konsantrasyonunun eksi
logaritmas4
Pikomol
Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Sodyum Dodesil Sülfat
Saniye
Tris Borik Asit-EDTA
Doku Faktörü Yolu nhibitörü
(Tissue Factor Pathway Inhibitor)
Unit (ünite)
Ultra Viole (mor ötesi)
viii
ÖZET
Çukurova Bölgesinde Hemofili A ve B’li Hastalar(n Mutasyon Analizi
Hemofili, p(ht( oluCum yolundaki bir bozukluk nedeniyle genellikle uzam(C
kanama zaman( ile karakterize olan s(k görülen bir kal(tsal kanama hastal(&(d(r.
ki tipi vard(r. Bunlar; her 5.000 erkek do&umda bir görülen Hemofili A (Klasik
Hemofili) ve 30.000’de bir s(kl(&a sahip Hemofili B ( Christmas Hastal(&()’d(r. Her
iki tip de X’ e ba&(ml( resesif olarak kal(t(l(r. Hemofili A ve B’deki genetik
bozukluk, faktör VIII ve IX’un eksikli&i ya da anormalli&iyle sonuçlan(r. Hemofili
A’da en s(k görülen genetik bozukluk intron 22 inversiyonudur. Di&er
mutasyonlar, nokta mutasyonlar( ve çeCitli delesyonlard(r. Hemofili B’de en s(k
görülen genetik bozukluk, nokta mutasyonlar(d(r.
Bu çal(Cmada, Çukurova bölgesinde moleküler tan(s( konmam(C hemofili
hastalar(n(n mutasyonlar(n(n saptanarak bölgenin mutasyon haritas(n(n
ç(kar(lmas( ve prenatal tan(ya bir ön haz(rl(k yap(lmas( amaçlanm(Ct(r.
Çal(Cmada, Çukurova bölgesinde Türk hastalardaki faktör VIII ve IX gen
mutasyonlar(n(n tan(mlanmas(nda RFLP yöntemi kullan(lm(Ct(r. Örnekler 30
hemofili A ve 7 hemofili B hastas(ndan sa&lanm(Ct(r. Hemofili A hastalar(, HindIII
ve AlwNI polimorfizmleri yönünden, hemofili B hastalar( ise TaqI, XmnI ve DdeI
polimorfizmleri yönünden araCt(r(lm(Ct(r. Çal(Cma sonunda, 13 hemofili A
hastas(nda HindIII polimorfizmi saptan(rken, AlwNI polimorfizmi hiçbir hastada
saptanamam(Ct(r. Hemofili B hastalar( ile yap(lan çal(Cma sonucunda ise, 1
hastada TaqI ve XmnI polimorfizmi ve 2 hastada DdeI polimorfizmi saptanm(Ct(r.
Sonuç olarak, HindIII polimorfizmi görülme s(kl(&( %43; TaqI, XmnI ve DdeI
polimorfizmlerinin görülme s(kl(klar( ise s(ras(yla %14, %14 ve %28 olarak
saptanm(Ct(r.
Sonuç olarak, Çukurova Bölgesinde hemofili mutasyon belirleme baCar(s(
daha fazla say(da ekstrajenik ve intrajenik belirteçler ve DNA dizi analizi
yönteminin kullan(m(yla artt(r(labilecek, böylelikle FVIII ve FIX genlerindeki
di&er mutasyonlar(n da belirlenebilecektir. Ayr(ca planlanan prenatal tan(
yaklaC(m(na da kolayl(k sa&layacakt(r.
Anahtar Sözcükler: Hemofili A, hemofili B, faktör VIII, faktör IX, moleküler
tan(.
ix
ABSTRACT
Mutation Analysis of Hemophilia A and B Patients in Çukurova Region
Hemophilias are common hereditary bleeding disorders usually
characterized by prolonged bleeding time due to a defect in the clot formation. It
has two types. They are known as Hemophilia A (Classic Hemophilia) that affects
approximately one in every 5.000 males and Hemophilia B (Christmas Disease)
which has a frequency of one in 30.000. Both types are inherited in an X-linked
recessive manner. The genetic defect in hemophilia A and B result from the
deficiency or abnormality of factor VIII and IX. The most common genetic defect
in hemophilia A is intron 22 inversion. Other mutations are point mutations and
various deletions. The most common genetic defect in hemophilia B is point
mutation.
In this study, we aimed to form the Çukurova region’s mutation map and
make a front preperation to its prenatal diagnosis with determinating hemophilia
patients’ mutations of which not have molecular diagnosis.
In the study, we used RFLP at identification of factor VIII and IX gene
mutations in Turkish patients from Çukurova region. Our samples were obtained
from 30 hemophilia A and 7 hemophilia B patients. Hemophilia A patients were
detected for HindIII and AlwNI polymorphisms and hemophilia B patients were
detected for TaqI, XmnI and DdeI polymorphisms. End of the study, we
determined HindIII polymorphism in 13 hemophilia patients but couldn’t
determined AlwNI poymorphisms in any patients. In the study that have been
done with hemophilia B patients, we determined TaqI and XmnI polymorphisms
in 1 patients and DdeI polymorphisms in 2 patients. As a result of, we determined
HindIII polymorphism incidence as %43; TaqI, XmnI and DdeI polymorphisms
incidences as %14, %14 and %28.
In conclusion, hemophilia mutation determination achievement in the
Çukurova region can be increased with using more extragenic and intragenic
markers and DNA sequencing analysis, in this way other mutations in the FVIII
and FIX genes can be determinated. Furthermore, it provide simplicity to planned
prenatal diagnosis approach.
Key Words: Hemophilia A, hemophilia B, factor VIII, factor IX, molecular
diagnosis.
x
1. G R - ve AMAÇ
Kan4n p4ht4la3mas4 ve trombosit (kan plaketi) arac4l4 hemostazis kanamaya kar34
önemli koruma mekanizmalar4d4r. Kan4n p4ht4la3mas4 hücresel yan4t ve moleküler yan4t
olarak iki a3amada gerçekle3ir. lk a3ama olan hücresel yan4tta yani birincil hemostaziste,
endotel hasar4 sonucunda trombositler damar içinde olu3turduklar4 bir t4kaçla kanamay4 bir
süre durdurabilirler. Ancak, daha sonraki a3ama olan moleküler yan4tta yani ikincil
hemostaziste, kan plazmas4ndaki p4ht4la3ma faktörlerinin devreye girmesi ve fibrin denilen
p4ht4y4 olu3turmas4 gerekir. Olu3an bu p4ht4, kanama bölgesini kapatarak kanamay4
tamamen durdurur1.
Zedelenen bir damar duvar4nda fibrin p4ht4s4n4n olu3umu vasküler bütünlüCün
devam4nda oldukça önemlidir. Hemostaz4n kontrolünde damar endoteli, p4ht4la3ma
faktörleri ve trombositler görev al4rlar. Çözünebilen fibrinojeni çözünmeyen fibrine
dönü3türen mekanizma bir dizi kompleks ve oldukça s4k4 bir 3ekilde kontrol edilen
plazma serin proteazlar4 ve onlar4n kofaktörleri aras4ndaki etkile3imi içermektedir2.
Olay4n damar4n zedelenme olan bölgesinde lokalize edilebilmesi için güçlü
prokoagülan maddelerin aktivasyonuna gerek vard4r. Koagülasyonun bu kontrolü
prokoagülan tepkimelerin özgün hücre yüzeylerine lokalize edilmesi ile gerçekle3irken,
p4ht4n4n tüm vasküler sisteme yay4lmas4 da önlenmi3 olur. Koagülasyonda farkl4
hücreler farkl4 roller üstlenebilirler. Trombositler prokoagülan tepkimelerde esas rolü
oynarken, vasküler endotel hücreleri antikoagülan i3levlerin sürdürülmesinde anahtar
rol oynamaktad4r3.
ntrinsik ve ekstrinsik sistem aktivasyonu sonucu olu3an protrombinin
trombine dönü3ümü bir dizi hidroliz tepkimesidir. Olu3an trombin fibrinojenden fibrin
olu3umunu saClar. Aktif faktör XIII (FXIIIa) de olu3an fibrini stabilize eder4.
ntrinsik yolda görevli olan faktör VIII (FVIII) ve faktör IX (FIX), kan
p4ht4la3ma sürecinin merkezinde yer almaktad4rlar. Ayr4ca trombinin yeterli miktarda
üretimini de saClamaktad4rlar. Herhangi bir darbeden sonra doku faktörü (DF) ve FVIII
kompleksinin aktivasyonu aktif faktör X (FXa)’un üretimini saClar. Bu üretim,
koagülasyon sürecinin tamamlanmas4 için, FVIII ve FIX taraf4ndan desteklenmelidir.
Kan plazmas4ndaki bu p4ht4la3ma faktörlerinin eksikliCi, çe3itli kanama hastal4klar4yla
1
sonuçlanmaktad4r. Bu hastal4klardan biri olan Hemofili, X’ e baCl4 kal4t4m gösteren ve
özgün p4ht4la3ma faktörlerinin dü3ük deri3imlerinin neden olduCu kal4tsal bir kanama
hastal4C4d4r. Hemofilide kanama ikincil hemostazisteki sorundan dolay4 meydana gelir.
En iyi bilinen iki tipi Hemofili A (FVIII eksikliCi) ve Hemofili B (FIX eksikliCi)’dir5.
FVIII ve FIX genlerinin tan4mlanmas4, hemofiliye neden olan eksikliklerin
moleküler karakterizasyonunda önemli avantajlar saClam43t4r. Faktör VIII genindeki
mutasyonlar Hemofili A denilen kanama eCilimiyle sonuçlan4r. Hemofili A, 5000 erkekten
birinde görülür5. Hemofili A’da en s4k görülen genetik bozukluk; intron 22
inversiyonudur.
nversiyon mutasyonlar4n4n bulunmas4 hemofili A’n4n moleküler
incelemelerinde son derece önemli olup, tüm hastalar4n %25’i , aC4r hastalar4n %40-50’
sindeki bozukluktur6. FVIII geninin intron 1’ini içeren benzer bir inversiyon, aC4r hemofili
A hastalar4n4n yakla34k %5’inde tan4mlanm43t4r7. ntron 22 inversiyonlar4ndan ba3ka
hemofili A’ya neden olan diCer mutasyonlar; nokta mutasyonlar4 (yakla34k %85 missense,
%15 nonsense) ve geni3 ya da küçük delesyonlar ve insersiyonlard4r (yakla34k %5).
Hemofili B 30.000 erkekte bir görülür. Faktör IX geninde 2100’den fazla
mutasyon
tan4mlanm43t4r.
Mutasyonlar4n
büyük
çoCunluCu,
1/3’ini
missense
mutasyonlar4n olu3turduCu, nokta mutasyonlar4d4r. Orta dereceli hemofili B olgular4n4n
%20-30’u, belirli say4daki kurucu mutasyonlardan dolay4 meydana gelir. Bunlar4n
yakla34k %7’si k4sa insersiyonlar ya da delesyonlar ve yakla34k %3’ü büyük gen
delesyonlar4 ve kompleks yeniden düzenlenmelerdir. FIX geninin promotor bölgesindeki
yer deCi3tirmeler, FIX Leiden fenotipi ile sonuçlan4r5.
Hemofilide tedavi protokolü, eksikliCi saptanan faktörün eksiklik yüzdesine baCl4
olarak deCi3mektedir. Hemofili hastas4 ya3am4 boyunca bu tedaviye devam etmek
zorundad4r. Tedavi süreci hastalara aC4r ekonomik yükümlülükler getirdiCinden,
hemofilinin moleküler düzeyde incelenmesi ta34y4c4lar4n belirlenerek onlara doCum öncesi
tan4 olanaC4 verilebilmesi aç4s4ndan önemlidir. Bu nedenle bu çal43mada Çukurova
Bölgesi’nde moleküler tan4s4 konmam43 hemofili hastalar4n4n mutasyonlar4n4n saptanarak
bölgenin olas4 mutasyon haritalar4n4n ç4kar4lmas4 ve prenatal tan4ya bir ön haz4rl4k
yap4lmas4 amaçlanm43t4r.
2
2. GENEL B LG
2.1. Kan P(ht(laCma Mekanizmas(
Hemostazis; kan ak434n4 muhafaza eden ve kan damarlar4n4n bütünlüCünü saClayan
temel bir memeli sistemidir. nsanlarda, diCer memelilerde olduCu gibi, prokoagülasyon
faktörleri, inhibitör faktörleri, fibrinolizis bile3enleri, trombositler ve vasküler
endotelyumu kapsayan 100’den fazla proteinin düzenli aC4ndan ibarettir. Bu bile3enler
damar yaralanma bölgesinde, ikinci bir fibrin p4ht4s4yla stabilize olan birincil trombosit
t4kac4n4n olu3umuyla sonuçlanan, h4zl4 ve elveri3li kan p4ht4la3ma sürecini ba3lat4rlar.
Bu süreç, yaralanma bölgesinde p4ht4y4 s4n4rlayan ve p4ht4 formasyonunu engelleyen
geri dönü3üm mekanizmas4 ve hemostazis bile3enlerinin aC4 ile düzenlenir8.
Plazma proteinlerinin çoCu bulunu3 s4ralar4na göre Roma rakam4 ile faktör (F)
olarak adland4r4l4rlar. FXII, FXI, FIX, FVII, FX ve protrombin (FII)’i kapsayan bu
plazma glikoproteinleri, sindirim proteazlar4 olan tripsin ve kimotripsinle belirgin
i3levsel ve yap4sal benzerlik gösterirler. Her biri, bir yada iki peptit baC4n4n
proteolizisinin s4n4rlanmas4yla inaktif formdan aktif forma çevrilirler. Bu durum izleyen
Roma rakam4ndan sonra “a” ile gösterilirler (FXa gibi)9.
P4ht4la3ma sistemindeki mekanizmalar ilk kez 1964’ te Macfarlane ve Davie ile
Ratnoff taraf4ndan ortaya at4lan kaskad ya da 3elale hipotezi ile anla34lmaya
ba3lam43t4r2. Bu 3emada baz4 serin proteaz zimojenlerinin birbiri ard4s4ra aktivasyonlar4
sonucunda trombin olu3ur ve fibrinojeni fibrine dönü3türür. P4ht4la3ma faktörlerinin
hepsi normalde inaktif iken, aktifle3tikleri zaman FXII, FXI, FIX, FX ve protrombin
proteolitik enzim özelliCi kazan4rken (serin proteazlar), FVIII ve FV proteaz deCillerdir;
ancak bu reaksiyonlarda kofaktör olarak görev yaparlar. Koagülasyon proteinlerine ek
olarak membran yüzeyleri ve metal iyonlar4 da sistem içinde önemli rol oynarlar3.
Kan4n p4ht4la3mas4; iki temel mekanizma ile gerçekle3ir. Bunlardan birincisi, tüm
protein komponentlerinin kanda bulunduCu intrinsik yol, diCeri ise hücre membran
proteini doku faktörünün kritik rol oynad4C4 ekstrinsik yoldur10 ( ekil 1).
3
ekil. 1. P4ht4la3ma Sistemi3.
ntrinsik ve ekstrinsik sistem aktivasyonu sonucu olu3an protrombinin trombine
dönü3ümü bir dizi hidroliz reaksiyonudur. Olu3an trombin, fibrinojenden fibrin
olu3umunu saClar. FXIIIa’ de olu3an fibrini kararl4 hale getirir4. ntrinsik yolun
bile3enleri DF arac4l4C4yla olan koagülasyon sisteminin içinde yer almaktad4r. Eskiden
bilinenin aksine bu iki yol birbirinden baC4ms4z olarak fonksiyon görmemektedir11.
FVIIa-DF, FX’un güçlü bir aktivatörüdür ve fibrin p4ht4s4 olu3turmak için intrinsik yolu
tamamen atlama kapasitesine sahiptir3.
4
Son y4llarda, koagülasyonun FVIIa-DF kompleksi ile ba3lad4C4; ancak FIX ve
FVIII’ in hemostaz4n saClanmas4 için kesin olarak gerektiCi yeni bir koagülasyon
3emas4 ortaya ç4kar4lm43t4r12. Bu 3emada, doku faktör yolu inhibitörü (TFPI) geri
besleme mekanizmayla in vivo ortamda FVIIa-DF kompleksini inhibe etmektedir13.
FXa’un ilk üretiminden sonra TFPI’ nün inhibitör etkisi belirginle3ir ve FVIIa-DF
inhibe edilerek daha fazla FIX ve FX’ un aktive olmas4 engellenir. Bu a3amadan sonra
FX aktivasyonu hemen hemen tamamen FIX üzerinden kofaktörü olan FVIII
arac4l4C4yla (intrinsik yol) olur13. Yenilenmi3 koagülasyon modeli TFPI taraf4ndan
FVIIa-DF’ün FXa’ a baC4ml4 inhibisyonu p4ht4 olu3umu için intrinsik (FIX, FXI) ve
ekstrinsik (FVII) yolun gerekliliCini aç4klamaktad4r14.
Moleküler biyoloji teknikleri, çe3itli rekombinant p4ht4la3ma faktör deri3imlerinin
geli3imi için temel saClayarak, uygun genlerin klonlanmas4n4 ve tan4m4n4 saClam43t4r15.
Bu genlerin yeni analizleri, ilgili proteinlerin yap4 ve i3lev benzerliklerinin analizine,
hemorajik ve tromboembolik bozukluk bulunan hastalarda fenotip ve genotip
korelasyonlar4n4n tan4mlanmas4na izin vermi3tir. Böylece geçen 15 y4l süresince
hemostaziste rol alan birçok gen ve proteinin yap4s4 meydana ç4kar4lm43t4r8 (Çizelge 1).
Kal4tsal ya da kazan4lm43 bozukluklar taraf4ndan bu aC4n zay4flat4lmas4, çok çe3itli
hemorajik ya da tromboembolik fenotipin olu3mas4na neden olur. Bunlardan Hemofili
A (FVIII), Hemofili B (FIX) ve von Willebrand Hastal4C4 (von Willebrand Faktör)
önemli kanama hastal4klar4d4r. DiCer p4ht4la3ma faktörlerindeki eksiklikler (Fibrinojen,
FII, FV, FVII, FX, FXI, FXII ve FXIII) nadiren görülür16.
5
8
Çizelge 1. P4ht4la3ma faktörleri
Protein
Kromozom
Ekson
cDNA
mRNA
Olgun/Öncü
MW
Plazma
Yar( Ömrü
(bp)
(kb)
Protein (aa)
(kD)
Kons.
(h)
(Sg/mL)
340
Fibrinojen
2000
72
X-zinciri
4q23-32
5
1932
2.2
610/644
68
Z-zinciri
4q23-32
8
1449
1.9
461/483
52
[-zinciri
4q23-32
10
1311
1.6
411/437
49
FII
11
14
1866
2.0
579/622
72
10
48-60
FV
1q21-25
25
6672
7.0
2196/2224
330
7
12
FVII
13
8
1332
2.5
406/444
50
0.5
4-6
FVIII
Xq28
26
7053
9.0
2332/2351
265
0.1
8-12
FIX
Xq27
8
1381
2.8
415/461
57
5
20-24
FX
13q32
8
1446
1.5
442-482
59
10
26-30
FXI
4q35
15
1875
2.1
607/625
140-160
2-7
60-80
FXII
5q33
14
1845
2.6
596/615
76
30
48-72
320
30
>240
FXIII
A-altbirimi
6p24-25
15
2193
3.8
731
75
15
B-altbirimi
1q31-32
12
1923
2.3
641
80
16
12p
52
8439
8.7
2050/2813
220-
10-15
12
vWF
20.000
AT
1q22-25
7
1296
1.4
432
58
125
60-96
Protein C
2q13-14
9
1383
1.7
405/461
62
4
6
Protein S
3
15
2028
3.5
635/676
69
25
40
6
2.2. Hemofili
Hemofili kan p4ht4la3mas4nda rol alan proteinlerden FVIII ve FIX’dan birinin
eksikliCi veya bozukluCu ile ortaya ç4kan X kromozomuna baCl4 resesif geçi3 gösteren
tek gene baCl4 kal4tsal bir hastal4kt4r17. Spontan veya çe3itli etkenler sonucu meydana
gelen kanamalar4n s4kl4C4 hastal4C4n klinik 3iddetini (fenotipini) aC4r, orta veya hafif
hemofili olarak belirler5 (Çizelge 2). Hemofilinin iki tipi vard4r. Hemofili A, yakla34k
her 5.000 erkek doCumda rastlanan FVIII eksikliCi veya bozukluCu, hemofili B ise
yakla34k her 30.000 erkek doCumda rastlanan FIX eksikliCi veya bozukluCudur17.
Hemofili olgular4n4n %85’inden Hemofili A (Klasik Hemofili) ve %12’inden Hemofili
B (Christmas Hastal4C4) sorumludur18.
Çizelge.2. Hemofilinin S4n4fland4r4lmas45
Hemofili Hastal4k
FVIII Konsantrasyonu
Derecesi
(FVIII:C)
AC4r Hemofili
< 0,01 IU/mL
(<%1)
Il4ml4 Hemofili
0,01-0,05 IU/mL
(% 1-5)
Hafif Hemofili
>0,05-0,40 IU/mL
(> % 5)
Hemofili genellikle kan p4ht4 olu3umunda bir bozukluk olmas4 nedeniyle uzam43
kanama zaman4 ile karakterize, s4k görülen kal4tsal kanama hastal4C4d4r19. Hemofili Ave
B’deki genetik bozukluk, FVIII ve FIX’un eksikliCi ve anormalliCi ile sonuçlan4r. Bu
faktörler, uygun yan4t doCrultusunda aktive edilen baz4 inaktif kofaktör ve
proteazlardan olu3mu3 intrinsik p4ht4la3ma kaskad4n4n merkezinde bir role sahip
proteinlerdir10. FVIIIa, FX’un aktivasyonu için kofaktör olarak rol oynar20. FIX, FXIa
taraf4ndan proteolitik kesilmeden sonra aktive edilerek FVIIIa, Ca+2 ve fosfolipid
kompleksi ile FX’u aktive eden bir serin proteazd4r21. Bu proteinler kan p4ht4la3ma
kaskad4nda çok önemlidir.
7
Hemofililere fenotipik olarak, protrombin zaman4 (PT) ve parsiyel tromboplastin
zaman4 (PTT) gibi tarama testleriyle tan4 konur. Uzam43 PTT, FVIII ve FIX’u içeren
çe3itli faktörlerin koagülant aktivitesinde eksikliCin bir i3aretidir. PTT’nin anormal
olduCu her durumda, spesifik faktör testleri eksik faktörün saptanmas4 için gereklidir.
Bu testler pahal4 ise de, biyokimyasal seviyelerde doCru tan4y4 saClarlar22.
Kad4nlarda ta34y4c4 durumlar4n4n belirlenmesi, p4ht4la3ma aktivitelerinin (FVIII:C
ya da FIX:C) ya da antijen (FVIII:Ag ya da FIX:Ag) seviyelerinin ve standart ku3ak
analizinin ölçümüyle çal434lm43t4r22,23. vWF antijene, FVIII aktivitesinin oran4, normal
ki3ilerle kar34la3t4r4ld4C4nda yüksek vWF antijen seviyesine sahip ta34y4c4lar da
tan4mlanabilir. Fakat, ta34y4c4 tan4s4 her zaman ba3ar4l4 deCildir. FVIII ya da FIX
aktivitesinin normal aral4C4, hata riskinin yüksek olduCu geni3 bir aral4kt4r.
Koagülasyon testleri, random X-kromozom inaktivasyonunun etkileri taraf4ndan da
etkilenmektedir. Ek olarak; inflamasyon, stres, egzersiz ve hamilelik de faktör
seviyelerini etkileyerek yanl43 tan4ya neden olabilirler24.
Hastal4C4n genotipi FVIII ve FIX genlerinde meydana gelen mutasyonlar4n
saptanmas4 ile belirlenir. Hastal4C4n olu3umu 1/3 oran4nda nadir olarak görülür.
Kazan4lm43 bozukluklarda mutasyon annenin gametlerinden birinde olu3mu3tur. Ailede
bir tek hasta birey vard4r ve anne ta34y4c4 deCildir. Ailesel geçi3li hemofilide ise hastal4k
ailede birden çok bireyde görülür ve hastan4n annesi ta34y4c4 durumdad4r17.
Hemofili hastal4C4n aC4rl4C4, p4ht4la3ma faktörlerindeki eksikliCin derecesine
baCl4d4r. AC4r hemofililer, (FVIII:C ya da FIX:C normalin <%1’i), eklemlerde, kaslarda
ve iç organlarda tekrarlayan kanamalarla karakterizedir. Dü3ük faktör düzeyleri ve
3i3en, ac4 veren eklem kanamalar4 hastal4C4n tan4s4ndaki iki temel ölçüttür. Il4ml4
hemofililerde (FVIII:C ve FIX:C normalin >%1-5’i), daha az s4kl4kta eklem kanamas4
görülür, fakat tedaviye ihtiyaç vard4r. Hafif olgularda (FVIII:C ya da FIX:C normalin
%5-40’i) spontan eklem kanamalar4 gözlenmez. Genellikle operasyon ve travmadan
sonra tan4 konulur. Semptomlar genellikle doCumdan sonra ba3lar ve ya3am boyu
devam eder, fakat plazma ya da faktör replasmantlar4yla azalt4labilir25. Fakat, FVIII ve
FIX konsantrasyonlar4 geni3 plazma havuzlar4ndan haz4rland4C4ndan beri, hepatit ve
HIV enfeksiyonu gibi hastal4k riskine sahiptirler. Bu komplikasyonlar4 önlemek
amac4yla ya rekombinant DNA teknolojisi ile FVIII ve FIX’un üretimi ya da 4s4l i3lem
uygulanm43 plazma bazl4 deri3imlerin üretimi kullan4lmaktad4r 26 .
8
FVIII ve FIX genlerinin klonlanmas4, geni3 ölçülü rekombinant faktör üretimini
mümkün k4lm43, daha güvenli tedaviler yap4lmas4n4n yolunu açm43t4r27,28. FVIII ve FIX,
prokaryot kullan4m4 ile eksprese edilmeyen [-karboksilasyon glikolizasyon gibi
kompleks post-translasyonel modifikasyonlara uCrar. Karboksilaz ve diCer genler için
ekspresyon vektörlerini içeren memeli kültür hücrelerinin kullan4m4, karboksile ve
tamamen aktif rekombinant faktör VIII ve IX’un üretimiyle sonuçlan4r. Fakat, bu
ürünler çok pahal4d4r. Ek olarak, replasmant terapi gören aC4r hemofililerin %1015’inde, terapiye kar43t4r4lan eksojen FVIII ve FIX’a kar34 inhibitör geli3ir. CRM+
(Cross Reactive Material pozitif) olan hastalarda, FVIII ve FIX dola34r ve FVIII’deki
inhibitör fenotipin tamamiyle eksik olduCu CRM- (Cross Reactive Material negatif)‘lere
göre daha az aC4r fenotiptedirler. nhibitör antikorlar CRM+’lerde CRM- hastalar4ndan
daha az ortaya ç4kt4C4ndan, CRM+’lerin replasman terapisi aldat4c4 olabilir29. Bu yüzden
hastalar4n FVIII:Ag ya da FIX:Ag seviyelerinin bilinmesi, p4ht4la3ma aktivitelerinin
bilinmesi kadar önemlidir.
Her iki tip hemofili için en son tedavi gen terapisidir30. Rekombinant faktör IX
üretimindeki ilk çal43ma, insan hepatositlerinin, fibroblastlar4n4n ya da kültürlerdeki
keratinositlerin izleyen transfeksiyonu biyolojik olarak aktif proteinin üretiminde
ba3ar4l4 olmu3tur. DiCer gruplarda, fare ve s4çan fibroblastlar4nda ilgili genin transferine
arac4l4k eden farkl4 retroviral vektörler kullan4larak bu analizler tekrarlanm43t4r. Her iki
durumda,
insan
FIX
transfekte
fibroblastlar
ya
da
keratinositlerin
izleyen
implantasyonu hayvan plazmas4nda geçici olarak tan4mlanm43t4r. Ara3t4rmac4lar, gen
terapinin hemofililer için gelecekte en etkili tedavi olduCunu dü3ünmektedirler26, 31, 32.
2.2.1. Hemofili A
Aktif faktör VIII proteininin k4smi ya da total eksikliCine neden olan, faktör VIII
genindeki mutasyonlar Hemofili A hastal4C4na yol açar. Hemofili A s4k görülen kal4tsal
koagülasyon hastal4C4d4r. Her 5.000 erkek doCumdan birini etkiler. Hastal4k; hastalar4n
yakla34k 1/3’inde yeni genetik mutasyonun bir sonucudur, bu nedenle kanama
hastal4C4n4n aile hikayesi s4kl4kla yoktur33.
Hemofili A klinik olarak çok heterojendir. Klinik tablonun aC4rl4C4 olgular4n
çoCunluCunda, FVIII koagülasyon aktivitesiyle ili3kilidir. Hastal4k FVIII p4ht4la3ma
aktivitesine baCl4 olarak aC4r, orta ve hafif olarak s4n4fland4r4l4r34. Hastalar4n yakla34k
9
%50’si aC4r hemofiliye, %10’u orta hemofiliye ve %30-40’4 da hafif hemofiliye
sahiptir. Hemofilinin 3iddeti, normal ki3ilerde 0,5-1,5 iu/ml olan plazma FVIII:C
seviyesi ile tan4mlan4r35.
Hematomlar ve hemartrozlar, hemofili A’n4n temel iki özelliklerindendir.
Hematomlar, kas içinde ya da baC dokular4ndaki hemorajilerdir. Bilinen ya da
bilinmeyen travma ile meydana gelebilir, yüzeysel ya da derin olabilirler35.
1984’den beri yakla34k 2500 hemofili A hastas4nda hemofilinin moleküler temeli
gen yap4s4 düzeyinde incelenmi3tir ve mutasyonlar sürekli güncellenen bir
veritaban4nda
tutulmaktad4r
(http://europium.mrc.rpms.ac.uk).
Hemofili
A
veritaban4nda 821 hasta giri3i vard4r. Bunlardan 43 tanesi Türk hastalar4nda saptanan
mutasyonlard4r17.
2.2.1.1. FVIII Proteininin Yap( ve Clevi
FVIII; 265 kD moleküler aC4rl4Ca sahip geni3 bir glikoproteindir. Enzimatik
aktivitesi yoktur8, fakat FIX taraf4ndan FX’un aktivasyonunda kofaktör olarak rol
oynar. FVIII, Ca+2 ve fosfolipid yüzey varl4C4nda tepkimenin maksimal h4z4n4 (Vmax)
10.000 kat artt4r4r36,37. En geni3 ve en az kararl4 koagülasyon faktörü olup, plazmada
vWF ile nonkovalent kompleks halinde dola34ma kat4l4r. vWF, FVIII’i prematüre
proteolitik y4k4mdan korur 38. Yeti3kinlerde yakla34k 12 saat yar4 ömre sahiptir.
FVIII sentezinin temel bölgesi hepatositlerdir. Ayr4ca; böbrek, lenf nodülleri,
pankreas, kas ve plasenta gibi çe3itli dokularda da sentezlenir39.
FVIII; 19 amino asitlik bir sinyal peptid ile, 2351 amino asitlik tek bir zincir öncüsü
olarak sentezlenir ve disülfit baC4 formasyonu, karbohidrat zincir yap43mas4, proteolitik
kesilmeler
ve
diCer
modifikasyonlar4
da
içeren
ko-
ve
post-translasyonel
modifikasyonlara uCrar. Amino asit dizisi, üç tekrarl4 domain yap4s4 gösterir; A, B ve C
s4ras4yla A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2 ( ekil 2). AC4r zincir A1-A2-B domainlerinden
olu3urken, hafif zincir A3-C1-C2 domainlerinden olu3ur40.
10
ekil.2. FVIII proteini40.
FVIII A domainleri, yakla34k 350 amino asit uzunluCundad4r. FV ve plazma bak4rbaCl4 protein serüloplazminin A domainleriyle ortak domain yap4s4na sahiptir41 ( ekil
3). kisi FVIII’in aC4r zincirlerinde, üçüncüsü hafif zinciri amino terminalinde bulunan
üç A domaini, yakla34k %40 amino asit s4ra benzerliCi gösterir10. Üç benzer A domaini
Ca+2’a baClan4r ve katalitik kofaktör aktivitesi için esansiyeldir42. A2 ve A3 domainleri,
25 potansiyel N-glikolizasyon bölgesinin 19’unu içeren 983 amino asitlik B domaini
taraf4ndan ayr4l4r. A1 ve A2 aras4nda ve A2-B ve B-A3 birle3me yerinde sülfatlanm43
tirozin rezidüleri içeren k4sa asidik diziler yer al4r43. FVIIIa’da A2 domaini çok h4zl4
olarak ayr4lm43t4r ve A1 ve A3 ile ara yüzeyi boyunca meydana gelen mutasyonlar,
aktif proteinin stabilitesini azaltarak hemofiliye neden olabilir44,45.
ekil.3. FVIII domain yap4s4 ve FV, Serüloplazmin, Diskoidin I ile yap4sal benzerliCi41.
11
Geni3 B domaini tek bir gen taraf4ndan kodlanm43t4r41. Bu domain 748-1648 amino
asitliktir ve
proteolitik aktivasyon s4ras4nda kesilir46. FVIII B domaini, bir çok
proteinin Asn-baCl4 karbohidrat zincirlerini içerir, fakat FV’in B domaini ile çok az bir
dizi benzerliCi gösterir47. Yakla34k tüm rezidüleri silinmi3 B domaini içeren FVIII,
i3levsel olarak normaldir ve wild-type FVIII gibi normal trombin aktivasyonuna
sahiptir48. Geni3 B domaini yüksek derecede glikozillenmi3tir, fakat deCi3ken bir
yap4ya sahiptir. FVIII aktivitesini yitirmeksizin B domaininin büyük bir k4sm4 (>700
amini asit) silinebilir49,50. A3 ile birlikte (Glu1649-Arg1689) B ile ileti3imde olan asidik bir
dizi; Try1680’nin sülfatlanmas4n4 gerektiren bir major vWF baClanma bölgesi içerir51,52.
B domaininin rolü, bugüne kadar tam olarak bilinmemektedir. Fakat, B domaini
silinmi3 FVIII kullan4larak yap4lan çal43malar ya da kimerik moleküller, B domaininin
FVIII mRNA ekspresyonundan sorumlu olduCunu göstermi3tir53.
FVIII C domainleri, yakla34k 150 amino asitten olu3mu3tur, FV ve fosfolipid baCl4
protein diskoidin I ile %20-30 benzerlik gösterir41,54. Olgun FVIII’in C terminalinde,
C1 ve C2 olarak adland4r4lan iki homolog bölge yer al4r. C1C2; FV ve lektinlerin bir
s4n4f4 ile benzerlik gösterir55. C1 domaini, ekson 20-23 taraf4ndan kodlan4r ve 20002172 amino asit rezidüsü içerir. C2 domaini, ekson 24-26 taraf4ndan kodlan4r ve 21732332 amino asit rezidüsü içerir56. C2 domaininin karboksi terminali negatif yüklü
fosfolipidler için baClanma bölgeleri içermektedir57. zole C2’de trombin ve FXa için
baClanma bölgeleri vard4r58,59. Ayr4ca C2, vWF için önemli baClanma bölgesi de
içermektedir60. C1C2, FX aktivasyonunu kolayla3t4rmak için intrinsik sistem
p4ht4la3mas4nda enzim ve substratla FVIII aras4ndaki etkile3ime yönelterek FIX ve FX
zimojenlerine de baClanabilir. Bu karboksi terminal domainler vWF, FIX ve FX
baClanmas4na, ayr4ca FVIIIa için fosfolipid baClanmas4na katk4da bulunurlar61.
FVIII proteininde iki asidik bölge bulunur. Bunlardan A1 ve A2 aras4nda uzanan
birincisi, 331-379 amino asit rezidüsünden olu3ur, 15 aspartik asit ve glutamik asit
rezidüsü içerir. kincisi ise 1649-1689 amino asit rezidüsünden olu3ur, 15 aspartik asit
ve glutamik asit rezidüsü içerir56.
12
2.2.1.2. FVIII’in Sekresyon ve Aktivasyonu
FVIII sentezi için temel bölge karaciCerdir62. SaCl4k ve hastal4k durumlar4nda
FVIII’in ekstrahepatik biyosentezinin önemli katk4s4 hala bilinmemektedir. FVIII
geniyle transfekte olmu3 memeli hücrelerinde FVIII’in ekspresyonu, biyosentezin
analizine ve bu kompleks glikoprotein sürecine izin verir63.
Sekresyonun ba3lang4ç evresi, glikolizasyonun meydana geldiCi ER lümenindeki
olgun 2332 amino asitlik polipeptidin translokasyonunu içerir. ER’in içinde, FVIII
kalretikulin, kalneksin ve IgG-baClay4c4 proteini de içeren çok say4da 3aperon proteinle
etkile3imde bulunur64. Bu 3aperon proteinlerle etkile3imden dolay4, FVIII proteininin
önemli bir oran4 ER içinde tutulur. Bu nedenle, FVIII’in Golgi aparat4na ta34nmas4
s4n4rland4r4l4r. ER’den Golgi aparat4na ta34madan sorumlu mekanizma, henüz
aç4klanmam43t4r63.
FVIII sekresyondan önce ve sonra proteolitik sürece yüksek derecede duyarl4d4r ve
dola3an FVIII’in yaln4z küçük bir fraksiyonu tek zincir 3eklindedir. Proteinin
çoCunluCu, a3-A3-C1-C2 domainlerini kapsayan C-terminal hafif zinciri (80 kD) ve
A1-a1-A2-a2-BV (BV: B domaininin deCi3ir ölçüsü) domainlerini kapsayan deCi3ir
molekül aC4rl4kl4 N-terminal aC4r zincirin (90-200 kD) heterodimeri olarak dola34r. Bu
iki zincir, divalent kalsiyum baC4ml4 biçimde non-kovalent olarak birle3ir41. Sekresyon
üzerinde sinyal peptid uzakla3t4r4l4r, tek zincir aC4r ve hafif zinciri 3ekillendirmek için
arjinin (R) 1648’den sonra kesilir ve B domaini bilinmeyen faktörler taraf4ndan deCi3ik
bölgelerde kesilir.
FVIII’in aktivasyon süreci, arjinin rezidüsünden sonra a3aC4daki kesilmeleri
gerektirir;
•
Trombin ve ayr4ca FXa’n4n R740’taki kesilmeleri, B domainini tamamen
uzakla3t4r4r.
•
Trombin ve FXa R372 ve R1689’da kesilir A1 ve A2 domainini ay4ran ilk
kesilme, k4sa a1 asidik bölgesini A2 için baClanma bölgesi olarak i3lev
göstermesine izin vermek için hizmet eder65. kinci kesilme, bir vWF baClanma
bölgesi içeren a3’ün uzakla3t4r4lmas4 ile vWF’den FVIII’in ayr4lmas4na izin
verir. Kesilmelerin sonunda, FVIII’de A1-a1, A2-a2, A3-C1-C2’yi kapsayan bir
heterodimer olu3ur. A1-a1 ve A3-C1-C2 metal baClanma arac4l4C4 ile baCl4d4rlar
ve A2 zay4f iyonik etkile3imler arac4l4C4 ile onlarla etkile3imde bulunur66.
13
FVIII’in inaktivasyonu arjinin rezidüsünden sonra a3aC4daki kesilmeleri
gerektirir;
•
Aktif protein C (APC), trombin (FII), FIX ve FXa kesilmesi R336’da, a1 asidik
domainini uzakla3t4r4r. Bu bölgenin FVIIIa’da A2 subünitesinin dü3ük ilgili
baClanmada gerekli olduCu dü3ünülmektedir67.
•
FIXa, R1719’da ve FXa’n4n R1721’de kesilmeleri, altünitesinin birle3mesinde
rol oynayan bölgenin uzakla3t4r4lmas4n4 saClayarak A3’ü bozar68.
•
APC’nin
R562+’da
kesilmesi,
A2’yi
y4kar.
Bu
kesilme
h4zl4d4r
ve
koagülasyondan sonra FVIII aktivitesinin down-regülasyonunda çok önemli
olabilir. Bu, A2 domaininde 558-565 rezidülerinin bir FIXa baClanma bölgesini
tan4mlad4C4n4 gösterir66 ( ekil 4).
FVIII, birincil olarak karaciCerde sentezlenir; fakat FVIII mRNA seviyesi
karaciCerde s4rad434 olarak dü3üktür (%0,001). Bu, FVIII’in dola3an çok dü3ük
seviyeleri ile (0,1 µg/mL) uygundur. FVIII cDNA’n4n ekspresyon seviyeleri, FIX
cDNA ve albumin cDNA’s4 ile kar34la3t4r4ld4C4nda yakla34k 7.000 kat dü3üktür.
Ekspresyon
çal43malar4,
FVIII
ekspresyonunun
birincil
olarak
s4n4rland4C4n4
göstermektedir. Sonuç olarak, mRNA ekspresyonu azalm43t4r, ER’den golgi aparat4na
birincil olarak çevrilmi3 FVIII miktar4 yetersizdir ve vWF’nin yüksek seviyeleri
gerekmektedir.
Aktif FVIII, h4zl4 olarak kofaktör i3levini kaybeden, kararl4 olmayan bir
moleküldür. Fakat bu kay4p, trombin ya da FXa taraf4ndan ilerleyen proteolizisin bir
sonucu deCildir50,69,70. FVIIIa’n4n instabilitesinin, alt ünite ayr4lmas4n4n bir sonucu
olduCu dü3ünülmektedir. Prokoagülan aktivitenin kayb4, protein fizyolojik pH’da
tutulduCunda, FVIIIa heterodimerinden dü3ük çözünürlükteki A2 altünitesinin
ayr4lmas4yla kesi3mektedir71.
14
ekil 4. FVIII’in sekresyonu, aktivasyonu ve inaktivasyonu66.
2.2.1.3. FVIII Geninin Yap( ve Clevi
lk olarak 1984’te klonlanan FVIII geni; X kromozomunun uzun kolu üzerinde,
telomere 1 Mb uzakl4kta, Xq28 bölgesinde bulunur ve X kromozomunun yakla34k
%0,1’ini te3kil eder27. FVIII geni, 186 kb uzunluCundad4r ve 26 eksona sahiptir40,72.
Ekson uzunluCu; 3106 bç uzunluCundaki ekson 14 ve 1958 bç uzunluCundaki son
ekson (ekson 26) d434nda, 69-262 bç aras4nda deCi3ir47 ( ekil 5).
ntron dizisi, FVIII geninin %95’inden sorumlu tutulmaktad4r. 25 introndan 6’s4, 14
kb’dan geni3tir. ntron 22, 32 kb’l4k uzunluCuyla FVIII geninin en geni3 intronudur56.
ki ek kopya ile ili3kili intron 22’ de, bir CpG adas4 bulunur. “FVIII-associated gen A”
(F8A) olarak adland4r4lan 1,8 kb’lik birinci kopya, çok çe3itli hücrelerde bol olarak
bulunur72. Bu kopyan4n yönü, FVIII’inki ile z4tt4r ve araya giren dizisi yoktur73.
F8A’n4n iki kopyas4 telomer ucuna doCru 400 kb uzakl4ktad4r. F8A homologlar4
aras4ndaki intrakromozomal rekombinasyon aC4r hemofiliye yol açar17. Bu homologlar,
int22h-1 (intrajenik) ve int22h-2 ile int22h-3 (ekstrajenik) olarak bilinir74. “FVIIIassociated gen B” (F8B) olarak adland4r4lan 2,5 kb’l4k ikinci kopya, ve FVIII ekson 23-
15
26’y4 da içine alarak FVIII ile ayn4 yönde kopyalan4r73. Bu gen. F8A ve F8B
kopyalar4n4n i3levleri ve potansiyel protein ürünleri henüz bilinmemektedir.
ekil 5. Faktör VIII Geni47.
FVIII geninin promoter bölgesi, gene 5’ ucunda 300 nükleotidlik bir k4s4mda
yerle3mi3tir. Bu bölgedeki bölge-doCrultulu metagenez, transkripsiyon için TATA
kutusunun esansiyel olmad4C4n4, fakat HNF1, NFkB, C/EBPa ve C/EBPb gibi karaciCer
transkripsiyon faktörlerinin, FVIII promoter bölgesi ile etkile3tiCini gösterir75. lginç
olarak hemofili A’a neden olan mutasyonlardan hiçbiri bu promotor bölgede
bulunmamaktad4r.
FVIII genini, 2351 amino asit rezidülük bir öncü protein kodlar. lk 19 amino asit,
lider peptidi olu3turur41. Bu peptid, iki yüklü rezidü yan4nda 10 hidrofobik amino asit
içerir. Olgun protein, 264.763 moleküler aC4rl4C4ndad4r ve 2332 amino asit içerir. 25
potansiyel asparagin baCl4 glikolizasyon bölgesi ve 23 sistein rezidüsü vard4r. Olgun
FVIII mRNA’s4 9 kb uzunluCundad4r56 .
2.2.1.4. Hemolili A’n(n Moleküler Geneti&i
FVIII mutasyonlar4n4n karakterizasyonu, genin büyüklüCü nedeniyle yava3t4r33.
FVIII genindeki de novo mutasyonlar, hemofili A olgular4n4n (tüm olgular4n yakla34k
%30’u) önemli bir oran4n4 olu3turmaktad4r75. FVIII geni mutasyonlar4; diCer genetik
hastal4klarda bulunan geni3 ve küçük delesyonlar, insersiyonlar, nonsense, missense ve
16
splice bölge mutasyonlar4yla sonuçlanan nokta mutasyonlar4n4 gibi birçok mutasyon
tipini içermekle beraber, genin 1. ve 22. intronlar4ndaki bölgeleri kapsayan yeni
introkromozamal inversiyonlar4n4 da kapsamaktad4r.
predominant
olarak
spesifik
restriksiyon
enzim
lk bulunan mutasyonlar
bölgelerini
etkileyen
nokta
mutasyonlar4 ve geni3 delesyonlard4r. Hastalar4n küçük bir k4sm4ndaki mutasyonlar4n
anla34lmaz kalmas4na raCmen, PCR’ye dayal4 tekniklerin uygulanmas4, hemofili A’dan
sorumlu geriye kalan bir çok mutasyon s4n4f4n4n tan4mlanmas4n4 saClam43t4r76.
2.2.1.5. Hemofili A’dan Sorumlu Mutasyonlar
2.2.1.5.1. CpG Dinükleotid Mutasyonlar(
nsan genomik DNA’s4n4n CpG dinükleotidlerinde bulunan genel bir s4cak nokta
mutasyonu, ya CG a TG deCi3imi ya da eCer CT deCi3imi antisense iplikte meydana
geliyorsa CG a CA deCi3imidir77. Bu CG dinükleotidleri, genel s4cak nokta olarak
bilinir ve mutasyonlar memeli DNA’s4nda 5’ CG rezidüsünün tek metilasyon bölgesi
olmas4 nedeniyle meydana gelir. Bu sitozinler, 5-metil sitozin üretmek için bir metil
transferaz taraf4ndan metillenir. 5-metil sitozin nonenzimatik bir tepkimede deamine
olduCunda, timin üretilir. Kaydedilmi3 CG a TG ya da CG a CA deCi3imi, FVIII
geninde tan4mlanan nokta mutasyonlar4n4n %38’inden sorumludur78.
2.2.1.5.2. Missense Mutasyonlar
Missense mutasyonlar, hemofili A’dan en fazla sorumlu olan mutasyon tipidir. Bu
mutasyonlar, amino asit deCi3imine yol açan nükleotid deCi3imleridir. Bu nükleotid
deCi3imleri, B domainini kodlayan ve missense mutasyondan yoksun ekson 14 d434nda,
FVIII geninin ba34ndan sonuna yay4lm43t4r. Missense mutasyonlar4n çoCunda antijen
seviyesi, FVIII aktivitesiyle orant4l4 olarak çok dü3üktür. Hastal4C4n aC4rl4C4
mutasyonun tipine ve yerle3imine baCl4d4r76.
Trombin kesilme bölgesindeki mutasyonlar, (372-1689 arjinin rezidüsü), FVIII:Ag
seviyesi normal CRM+ hemofili üreterek, trombin taraf4ndan FVIII’in aktivasyonunu
bloke eder. ÖrneCin; Arg372His yerdeCi3imi, tüm FVIII aktivitesi için gerekli olan bir
trombin kesilme bölgesine etki ederek normal, fakat yakla34k %3-5 eksik aktiviteli
antijen seviyesine sahip FVIII ile sonuçlan4r79.
17
Y1680F
mutasyonu,
FVIII’e
kontaminant
vWF
baClanmas4
ve
tirozin
sülfatlanmas4n4 bloke etmesinden dolay4 hafif CRM-reduced fenotiple sonuçlan4r80.
Ser2119Tyr deCi3imi, vWF taraf4ndan kararl4l4C4n4n engellenmesinin bir sonucu
olarak, hafiften orta dereceli hemofili A’ya neden olarak (%4-8 FVIII:C), vWF’ye
baClanman4n azalt4lmas4 ile sonuçlan4r81.
DiCer iki CRM+ mutasyonlar, 1566T ve M1772T, proteinde yeni bir Nglikolizasyon bölgesi yaratarak aC4r hemofili A fenotipine yol açar82
Missense mutasyonlar
FVIII geni
boyunca
yerle3mi3lerdir ve
ba3lang4ç
metiyonininden (kodon 19), terminasyon kodonuna (2332) kadar olan pozisyonlara etki
ettikleri rapor edilmi3tir. Mart 2002’ye kadar, 386 farkl4 missense mutasyon
tan4mlanm43t4r. Mutasyonlar4n, tüm amino asit pozisyonlar4n4n yakla34k 1/10’unu
etkilediCi rapor edilmi3tir75.
2.2.1.5.3. Nonsense Mutasyonlar
K4rksekiz farkl4 kodondaki 115 nonsense mutasyon bu hastal4ktaki toplam nokta
mutasyonlar4n4n yakla34k %20’sinden sorumludur56. Nonsense mutasyonlar, bir
prematüre terminasyon kodonu (PTC) ile bir amino asit kodonunun yerdeCi3imi sonucu
olu3ur. HAMSTeRS (Hemophilia A Mutation, Search, Test and Resource Site)’da
kaydedilmi3 187 hastadaki nonsense mutasyonlardan 116’s4 (%59,4) arjinin rezidüsüne
etki etmektedir. Bu hastalar4n hemen hemen tamam4n4n aC4r tip hemofili A’ya sahip
olduklar4 rapor edilmi3tir75,83.
2.2.1.5.4. GeniC Delesyonlar ve nsersiyonlar
Geni3 delesyonlar, hemofili A’daki karakterize mutasyonlar4n %5-10’undan
sorumludur. Delesyonlar genellikle FVIII aktivitesi hiç olmayan aC4r hemofili A ile
sonuçlan4r56. FVIII geninde, 200 bç’den büyük 105 geni3 delesyon tan4mlanm43t4r. Bu
hastalar4n 2’sinde tüm FVIII geni delesyona uCram43t4r (>210 kb). Hastalar4n yar4s4 bir
eksondan daha fazla delesyona, geriye kalan yar4s4 da tek ekson delesyonuna sahiptir76.
Tekrarlanan, daC4lm43 elementler LINE (L-1) ve Alu delesyonlar4n patogenezinde
önemli bir rol oynayabilir. Van de Water ve arkada3lar4 geni3 bir delesyon
mutasyonunu (20,7 kb) detayl4 olarak analiz etmi3 ve mutasyonun, intron 14’de bir L-1
yan dizisiyle benzer rekombinasyonu takiben, FVIII geninin intron 20’sine bir
18
ba3lang4ç (L-1) elementinin insersiyonuyla sonuçland4C4n4 göstermi3tir84. Mutasyon,
ekson 15 ve 20’nin delesyonuyla sonuçlan4r. Buna ek olarak, FVIII geninin ekson
25’ini içeren bir 23 kb’l4k delesyonun, e3it olmayan benzer Alu arac4l4
rekombinasyondan sonuçland4C4 gösterilmi3tir85. Wild-type dizili mutantlar4n s4ral4
dizisi, mutasyonun intron 24 ve 25’teki Alu elementleri aras4ndaki rekombinasyondan
sonuçland4C4n4 göstermektedir. Ek olarak; Sommer ve arkada3lar4, FVIII geninin Alu’ca
zengin doCas4 olduCunu rapor etmi3lerdir86. FVIII dizisi çal43ma taslaC4nda 52 Alu
tekrar4 vard4r (3,8 kb ba34na 1 tane), bu dizilerdeki rekombinasyon karakterize olmayan
FVIII delesyonlar4n4n birçoCundan sorumlu olabilir.
Bugüne kadar yaln4z 3 geni3 insersiyon mutasyonu rapor edilmi3tir. DaC4lm43,
tekrarlanan elementlerdeki tüm sonuçlar, FVIII geninin ekson 14’ünde birle3mi3tir.
Kazazian ve arkada3lar4 L-1 elementinin insersiyonunu, Sukarova ve arkada3lar4 bir
Alu tekrar4n4n insersiyonunu rapor etmi3tir 87, 88.
2.2.1.5.5. Küçük Delesyonlar ve nsersiyonlar (Frameshift Mutasyonlar)
Küçük delesyonlar ve insersiyonlar, 200 bç’den a3aC4 büyüklüklerle tan4mlan4rlar.
Yakla34k olarak 1-150 bç aras4nda deCi3en 59 insersiyon ve 143 delesyon
kaydedilmi3tir. Bunlardaki
bir tek nükleotid, predominant olarak eklenmi3 ya da
89
silinmi3tir .
FVIII komplementer DNA (cDNA)’da A rezidüsü tekrarlar4 s4kt4r ve diCer
nükleotid tekrarlar4ndan genellikle daha uzakta meydana gelir. Tan4mlanm43 59
insersiyonun en az 32’si ve 143 delesyonun en az 31’i A rezidüsü tekrarlar4n4 etkiler.
Bunlar 1191-4, 1439-41 ve 1588-90 kodonlarda (25 insersiyon ve 25 delesyon hep
beraber) çok yayg4nd4r. nsersiyon ve delesyon mutasyonlu hastalar, aC4r hemofili A’ya
sahip ise de küçük bir oran4 orta dereceli olarak rapor edilmi3tir56.
2.2.1.5.6. Splicing Hatalar(
Splicing hatas4 52 hastada rapor edilmi3tir. Bunlar4n 14’ü, intronlar4n 3’ ve 5’
uçlar4nda hemen hemen deCi3mez GT splice donör ve AG splice akseptör bölgelerini
etkiler. Bu mutasyonlar bask4n olarak aC4r hemofili A ile sonuçlan4r. Yeni bulunan
splice bölgeleri, mutasyonlar4nda bir yeni splice donör ve akseptör bölgesi bulunan 10
hastada listelenmi3tir. Bu olgulardan alt4s4, yeni bir akseptör splice bölge yaratan sessiz
19
CTG>CTT nükleotid deCi3iminin (Leu504Leu) olduCu ekson 11’de yer al4r ve ekson
11’in 3’ ucunda 34 bp’lik bir delesyonla sonuçlan4r90,91. Bu deCi3ime sahip tüm
hastalar, hafif dereceli hemofili A’ya sahiptir. Mutasyondan sonuçlanan yeni splice
bölge, bazen normal mRNA ile sonuçland4C4 için tüm FVIII transkriptlerde görülmez.
Bagnall ve arkada3lar4, kriptik splice bölgesini aktive eden ve bir yeni eksonun
transkripsiyonuyla ve aC4r hemofili A ile sonuçlanan intron 1’de derince bir A>G
deCi3imini rapor etmi3lerdir92.
FVIII geni 50 splice birle3me yeri (25 donör 25 akseptör bölge) içermesine raCmen,
splicing hatalar4na yol açan mutasyonlar nadirdir. Be3yüzyetmi3iki adet nokta
mutasyonunun yaln4z 25’i (%4) splice birle3me yeri ve konsensus dizileri olup splicing
bozukluklar4na neden olurlar56.
2.2.1.5.7. Gen nversiyonlar(
Bugüne kadar FVIII genini etkileyen iki farkl4 intrakromozomal inversiyon
tan4mlanm43t4r91,92. kisi de FVIII geninin intronlar4 dahilindeki dizilerin homolog
rekombinasyonlar4n4n bir sonucudur. AC4r hastalar4n %40’4nda intron 22 inversiyon
mutasyonu, %2-5’inde ise intron 1 inversiyon mutasyonu görülür17.
2.2.1.5.7.1. ntron 22 nversiyonu
ntron 22 (int22h)’nin 9,5 kb’l4k bölgesinin iki kopyas4, yakla34k 500 kb ile FVIII
genine telomerik ve 5’ doCrultusunda uzan4r. Bunlar; int22h-2 ve int22h-3 dizileri
olarak adland4r4l4rlar93. ntron 22 inversiyonu mayoz s4ras4nda, int22h-1 ve int22h-2
(proksimal) ya da int22h-3 (distal) aras4nda homolog rekombinasyon doCrultusunda
gerçekle3ir91 ( ekil 6).
nt22h-3 ile rekombinasyon daha s4k görülür91,94. Gen
tamam4yla mutasyon sonucu inaktif olarak her zaman aC4r hemofili A ile sonuçlan4r.
Dünyadaki tüm aC4r hemofili A’l4 olgular4n %45’inden bu mutasyon sorumludur94.
2.2.1.5.7.2. ntron 1 nversiyonu
ntron 1’in (int1h) 1,0 kb’l4k bölgesinin bir kopyas4, yakla34k 140 kb ile FVIII
genine telomerik ve 5’ doCrultusunda uzan4r. Bu ekstrajenik bölge, int1h-2 olarak
adland4r4l4r. nt1h’4n ekstrajenik kopyalar4 ve FVIII (int1h-1) aras4ndaki homolog
20
rekombinasyon, aC4r hemofili A ile sonuçlan4r. Mutasyon aC4r hemofili A olgular4n4n
%5’inden sorumludur92.
ekil 6. FVIII geninde ntron 22 nversiyonu91.
2.2.1.5.8. Gen Polimorfizmleri
FVIII geninin intron 22’deki XbaI ve MspI RFLP’leri, int22h-1 dizisi dahilinde
meydana gelir. Ekstrajenik homologlar int22h-2/3’deki benzer pozisyonlarda XbaI ve
MspI
için
polimorfiktir95,96.
Baz4
polimorfizmlerin
allel
s4kl4klar4,
çe3itli
populasyonlarda çal434lm43 ve farkl4l4klar gözlenmi3tir97 ( ekil 7). BclI ve HindIII
RFLP’leri
için
(+)
alleller,
siyah
Amerikal4larda
diCer
etnik
gruplarla
kar34la3t4r4ld4C4nda çok farkl4 s4kl4ktad4r. Beyazlar ve Çinliler; BclI, HindIII ve XbaI’da
benzer allel s4kl4klar4na sahip olmalar4na raCmen, BglI lokusunda farkl4l4k gösterirler.
BglI RFLP bir transisyonun sonucudur97. Siyah Amerikal4larda BclI ve HindIII için
allel s4kl4C4 diCer etnik gruplara göre terstir.
21
97
ekil.7. FVIII gen polimorfizmleri .
2.3.1. Hemofili B
FIX eksikliCi ya da Christmas Hastal4C4 olarak da adland4r4lan Hemofili B; K
vitamini baC4ml4 kan prokoagülant proteini FIX’un eksikliCinin neden olduCu X’e
baC4ml4 resesif bir p4ht4la3ma hastal4C4d4r. Hemofili B, yakla34k olarak 30.000 erkek
doCumda bir görülür ve klinik olarak aktif FIX için aktif bölgede katalitik kofaktör
olarak görev yapan FVIII eksikliCinin neden olduCu s4k görülen hemofili A’dan
farkl4d4r98.
Olu3turulan
hemofili
B
veritaban4na
(http://www.umds.ac.uk/molgen/
haemBdatabase.htm) bugüne kadar 2511 hasta giri3i yap4lm43t4r ve bunlar4n 44 tanesi
Türk hastalard4r17.
2.3.1.1. Faktör IX Proteini
Faktör IX, K vitamini baC4ml4 serin proteaz ailesinin bir üyesidir ve
nonenzimatik kofaktörü FVIII ile birlikte yine bir serin proteaz zimojeni olan FX’u
aktive eden bir kompleksi 3ekillendirirler. FIX proteini yakla34k 20-24 saat yar4 ömre
sahiptir8,99.
nsan FIX ilk olarak; 18 amino asitlik bir propeptid ve bir hidrofobik amino asit
sinyal peptidi içeren yakla34k 454 amino asitlik bir öncü protein olarak karaciCerde
sentezlenir100. Daha sonra kana sal4nan olgun gamma karboksile zimojene dönü3mek
için; gamma-karboksilasyon, beta-hidroksilasyon ve sinyal peptidin ve propeptidin
uzakla3t4r4lmas4, karbohidrat eklenmesi, sülfatlanma ve fosforilasyon gibi çe3itli posttranslasyonel düzenlenmelere uCrar99. K vitamini baC4ml4 gamma-karboksilasyon,
22
gamma glutamil karboksilaz enziminin, karaciCerde öncü proteinin propeptid
bölgesindeki spesifik bölgelere baCland4C4 bir süreçtir. Glutamik asit rezidülerinin
gamma-karboksilasyon süreci, olgun proteinde Gla rezidülerini 3ekillendirir. Bu Gla
rezidüleri, lipid membrana aktif FIX baClanmas4 için gerekli olan yüksek ilgili Ca+2
baClanma bölgeleridir. Böylelikle, aktif FIX tam prokoagülant aktivitesi gösterebilir.
Tüm K vitamini baC4ml4 prokoagülanlar ve antikoagülanlar N-terminaldeki glutamik
asit rezidüleri karboksile olmad4C4nda biyolojik olarak inaktiftir99.
Yap4sal olarak FIX proteini; a) bir sinyal peptid, olgun proteininin gamma
karboksilasyonu için gerekli olan bir prepropeptid bölge (yakla34k rezidü -46 ve -1), b)
6 kalsiyum molekülünün 4 tanesine baClanan 12 gamma-karboksi-glutamik (gla)
rezidüsüne sahip bir Gla domaini (rezidü 1-40), c) bir k4sa aromatik amino asit, yüksek
ilgili kalsiyum baClanma bölgesi içeren bir ilk epidermal büyüme faktörü (EGF1;
rezidü 41-84), d) bilinmeyen i3levli ikinci bir epidermal büyüme faktörü (EGF2; rezidü
85-127), e) FVIII ve FIX taraf4ndan proteolizis s4ras4nda uzakla3t4r4lan bir aktivasyon
peptidi (rezidü 146-180) ve f) FX’u aktive eden bir katalitik domain’den (rezidü 181415) olu3ur101 ( ekil 8).
ekil 8. FIX proteini101.
2.3.1.2. Faktör IX Aktivasyonu
FIXa’ya. FIX’un aktivasyonu, Arg 145 - Ala 146 ve Arg 180 - Val 181’de 415
amino asitlik FIX’daki iki baC4n kesilmesiyle gerçekle3ir. Bu tepkime için katalizörler;
vasküler yaralanma bölgesinde meydana gelen FVIIa - doku faktörü - Ca+2 ve FXI Ca+2 kompleksidir. Bu iki baCdaki kesilme; 35 amino asitlik 10 kDa ve 45 kDa’l4k bir
aktivasyon peptidi, Cys 132 ve Cys 289 aras4ndaki disülfit baC4yla etkile3imde bulunan
bir hafif zincir (1-145 amino asit) ve bir aC4r zincir (181-415 amino asit)’den olu3an
380 amino asitlik aktif FIX (FIXa) meydana getirir98 ( ekil 9). FIX, yakla34k %17
karbonhidrat içeriCi ile 57 kDa molekül aC4rl4C4na sahiptir98. FIX’un aktivasyon
23
peptidinde; Tyr 155’de tirozin sülfatlanmas4, Ser 158’de serin fosforilasyonu; Thr 159,
Thr 169 ve Thr 172’de O-glikolizasyon ve Asn 157 ile Asn 167’de N-glikolizasyon
içeren çok say4da posttranslasyonel düzenlenmeler vard4r101.
FIXa, FX aC4r zinciri dahilindeki Arg 52 - Ile 53 baC4n4n kesilmesi ile FX’un
direkt aktivasyonu doCrultusunda p4ht4 olu3umunu geli3tirir. Sonra FXa, protrombini
trombine aktive eder. FIX, fosfolipid yüzey; FX aktivasyon kompleksinin toplanmas4n4
mümkün k4larken, konformasyonel bir deCi3imi gerçekle3tirmek için ihtiyaç duyulan
kalsiyum iyonlar4yla etkile3imde bulunur.
Yap4sal veriler, hemofili B’ye neden olan mutasyonlar4n, FIX’un konkav
yüzeyindeki yüzey bölge rezidülerinde meydana geldiCini göstermektedir102.
ekil 9. Olgun FIX Proteini98.
2.3.1.3. FIX Geni Yap( ve Clevi
FIX geni; 34 kb uzunluCundad4r ve Xq27.1’de, FVIII geni ve fragil X lokusuna
sentromerik olarak yerle3mi3tir. FIX geni, k4smi olarak FVII, FX ve Protein C gibi K
vitamini baC4ml4 protein ailesinin üyeleri ile yüksek derecede benzerlik gösteren,
boyutu 25-1935 nükleotid aras4nda deCi3en 8 ekson içerir10. FIX mRNA’s4, yakla34k 3
kb uzunluCundad4r ve 205 bazl4k 5’UTR, 1386 bazl4k preprofaktör IX ve 1392 bazl4k
3’UTR’den olu3mu3tur103 ( ekil 10).
24
FIX geni baz4 tekrar dizilerine sahiptir. Be3 Alu tekrar4n4n 4’ü, intron içindeki
gende, biri ise 3’ yan dizide bulunur. Kpn tekrarlar4, intron 4 ve 5’ yan bölgede bulunur.
Bir Line-1 elementi 5’ yan bölgede, diCeri ise intron 4’te bulunur. FVIII’den farkl4
olarak, CCAAT gibi tan4mlanm43 5’ regülator dizisi yoktur, fakat RNA polimeraza
baClanma için TATA kutusu muhtemelen transkripsiyon için ba3lama bölgesinden 27’de ba3layan bir TGTA dizisidir. 3’ “untranslate” bölge, bir poli A kuyruCu ekleme
bölgesi içerir 104.
ekil 10. FIX geni ve FIX mRNA’s4103.
2.3.1.4. FIX Eksikli&iyle Sonuçlanan Mutasyonlar
Hemofili B, klinik aC4rl4kta ve moleküler düzeyde oldukça heterojendir. Nokta
mutasyonlar4, k4smi olarak missense mutasyonlar, FIX genini etkileyen en s4k görülen
deCi3imlerdir. Promotor bölgedeki missense mutasyonlar, birçok spesifik gen
düzenleyici protein için tan4ma dizisini bozar. Bu durum, hemofili B Leiden olarak
adland4r4lan spesifik bir hemofili fenotipiyle sonuçlan4r. Hemofili B Leiden’de,
pubertede androjen seviyesi yükseldiCinde fenotipi hafif seyreder105.
Baz4 missense nükleotid deCi3imleri, evrimsel olarak korunmu3 verici splice ve
al4c4 splice konsensus dizilerinde meydana gelir. Bunlardan baz4lar4, FIX primer RNA
transkriptinin olu3umunu etkileyen gizli splice kav3aklar olu3turur. Bir çok missense
deCi3imleri, FIX genini kodlayan bölgesindeki amino asit rezidülerinde meydana gelir
ve bu mutasyonlar4n birçoCu, genellikle korunmu3 amino asitleri etkiler. Koagülasyon
FIX’un bozulmu3 translasyonuna neden olan nokta mutasyonlar4, kararl4 olamayan
25
k4rp4lm43 protein üreten nokta mutasyonlar4 ve terminal olarak sapm43 FIX molekülüyle
sonuçlanan frameshift mutasyonlar’d4r (küçük delesyonlar ve insersiyonlar). BaC4ms4z
mutasyonlar4n
yakla34k
%10’undan sorumlu geni3 delesyonlar da (>2 kb)
tan4mlanm43t4r106.
FIX genindeki tek nükleotid deCi3imlerinin büyük çoCunluCu transisyonlard4r.
Transisyonlar4 azalan s4rada transversiyonlar, küçük delesyonlar/insersiyonlar ve geni3
delesyonlar izler. FIX genini kodlayan bölgesindeki CpG dinükleotidleri, nokta
mutasyonlar4n4n s4cak noktalar4d4r107.
Yineleyen mutasyonlar baC4ms4z olarak CpG bölgelerinde gözlenmi3tir. Bunlar
CpG’de; Gly60 Ser(C a T), Ile397 Thr (Ta C), Thr296 Met (C a T)‘dir108.
2.3.1.5. Gen Polimorfizmleri
FIX geninde ve genin d434nda baz4 polimorfik bölgeler tan4mlanm43t4r. Gen
dahilinde bulunan RFLP bölgeleri, XmnI (intron 3), TaqI (intron 4), MspI (intron 4) ve
MnlI’d4r (ekson 6)
109
. Yan dizilerde bulunanlar ise MseI, BamHI (5’UTR) ve HhaI
(3’UTR)’d4r110,111. Bugüne kadar MnlI, tan4mlanan tek eksonik polimorfizmdir. MnlI
polimorfizmi pozisyon 148’de treonin/alanin amino asit deCi3imine neden olur111.
RFLP’lerin yan4nda, FIX geninde ba3ka iki polimorfik bölge daha vard4r. Her ikisi de,
uzun tandem benzer tekrarlardan yoksun pürin-pirimidin tekrarlar4n4 deCi3tirir.
Bunlardan biri ilk intronda yerle3mi3tir ve ba3lang4çta 50 bp’lik delesyon/insersiyonu
ile tan4mlanan HinfI / DdeI polimorfizmi olarak tan4mlanm43 ise de daha sonra
biallelikten çok multiallelik olarak bulunmu3tur112.
Faktör IX gen polimorfizmleri etnik varyasyon gösterir. ÖrneCin; BamHI
RFLP’nin allel s4kl4C4 siyah Amerikan popülasyonunda yüksek iken, beyazlarda,
Çinlilerde ve Japonlarda bu bölge polimorfik deCildir. Ekson 6’daki MnlI RFLP,
beyazlarda ve siyah Amerikal4larda s4kt4r ancak, Çinlilerde nadir görülür112( ekil 11).
26
ekil.11. FIX gen polimorfizmleri112.
27
3. GEREÇ VE YÖNTEMLER
3.1. Gereçler ve Kimyasal Maddeler
3.1.1. Gereçler
UV Spektrofotometro
(Shimadzu UV- 120-02)
Santrifüj
(Eppendorf 5403)
Manyetik Kar43t4r4c4
(Heidoph MR 2002)
Buz Makinesi
(Scotsman AF-10)
Hassas Terazi
(Mettler AJ 100)
Etüv
(Nüve N 400)
Vorteks
(Nüve NM 110)
Mikro Santrifüj
(Beckman Microfuge E)
Analog pH metre
(Beckman Century SS-1)
Otomatik Pipet
(Gilson P-2, P-10, P-20, P-100, P-200,
P-1000)
Elektroforez Güç KaynaC4
(Bio-Rad Power PAC 300, Pharmacia
Electroforesis Power Supply EPS
500/400)
Elektroforez Tank4
(Bio-Rad Mini Protean II Cell, Bio-Rad
Sub-CellGT)
Thermal Cycler
(Perkin Elmer GeneAmp PCR System
9600)
Thermal Cycler
(Eppendorf Gradient PCR System)
3.1.2. Kimyasal Maddeler
Amonyum Klorür
Amonyum Bikarbonat
NaCl
EDTA-Na2
SDS
Proteinaz K
28
Doymu3 fenol çözeltisi
Kloroform
Etanol
Primerler
dNTP’ ler
Taq DNA Polimeraz
HindIII
AlwNI
TaqI
XmnI
100 bç DNA Ladder
Phi x 174 DNA /HinfI
3.2. Örnek Seçimi ve Eldesi
Kan örnekleri Ç.Ü. Biyokimya Anabilim Dal4 ve Pediyatrik Hematoloji
Anabilim Dal4 i3birliCi ile gerçekle3mi3tir. Örnek büyüklüCünü Pediyatrik Hematoloji
Anabilim Dal4’na ba3vuran hemofili A veya B öntan4s4 konmu3 hastalar olu3turmu3tur.
Bireylerden al4nan 3 mL kan örnekleri soCuk zincir kurallar4na uyularak Biyokimya
Anabilim Dal4m4za getirilmi3tir.
Moleküler analizlerde kullan4lacak olan DNA’lar Na-EDTA’l4 tüpteki tam kan
lökositlerinden izole edilmi3tir. zole edilen DNA’lar çal434lmak üzere -20ºC’ de
saklamaya b4rak4lm43t4r.
3.3. Moleküler Analiz Yöntemleri
3.3.1. DNA zolasyon Yöntemi
Prensip: EDTA’l4 tüplere al4nan kan4n, plazmas4 uzakla3t4r4ld4ktan sonra, 3ekilli
elemanlar4 y4kan4r. Eritrositler hemoliz edilerek saf lökosit elde edilir. Proteinaz K ve
SDS ile muamele edilen lökositlerin hücre zar4 parçalanarak proteinler hidroliz edilir.
Bir gece inkübasyonun ard4ndan bu homojen kar434m fenol ile ekstre edilerek sulu fazda
bulunan DNA alkol ile çöktürülür113.
29
Ay(raçlar
1. Parçalay4c4 (Lizis) Tampon
Amonyum Klorür
131,0 mM
Amonyum Bikarbonat
0,9 mM
2. 4 M NaCl
3. 0,5 M EDTA-Na2 (pH 7,5)
4. Tampon A
% 10’luk (g/mL) Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)
Proteinaz K (10 mg/mL)
5. Doymu3 Fenol Çözeltisi (önceden haz4rlanacak)
250 g kristalize fenol 50 mL saf suda çözünür. E3it hacimde 0,5 M Tris-HCl
tamponu (pH 8,0) ilave edilerek manyetik kar43t4r4c4da 15 dk kar43t4r4l4r.
Çözelti iki faza ayr4ld4C4nda üst faz aspire edilir. Üzerine e3it hacimde 0,1 M
Tris-HCl tamponu eklenerek ayn4 i3lem tekrarlan4r. Bu i3leme fenol faz4n4n
pH’si 8,0 olana kadar devam edilir. Son deri3imi %0,1 olacak 3ekilde 8hidroksikinolin ilave edilir.
6. Kloroform
7. %70’lik etanol
8. Saf soCuk etanol
Yöntem
500 SL EDTA’l4 tam kan 1,5 mL’lik ependorf tüpüne konur.
Üzerine 1 mL parçalay4c4 tampon eklenerek 3 dk buzda bekletilir. 13.000
devirde 2 dk santrifüj edilerek süpernatan at4l4r. Bu i3lem 3 kez tekrarlan4r.
Pellet üzerine 500 SL Tampon A eklenir. Hafifçe kar43t4r4l4p 37 °C’de bir
gece veya 55 °C’de 2 saat bekletilir.
Süre sonunda tüpe 250 SL fenol, 250 SL kloroform eklenerek kar43t4r4l4r ve
1 dk 13.000 devirde santrifüj edilerek alttaki fenol-kloroform kar434m4 at4l4r.
Bu i3lem 3 kez tekrarlan4r.
Ayn4 i3lem 3 kez sadece kloroform ile tekrarlan4r.
30
Süpernatan ba3ka bir ependorf tüpüne aktar4larak üzerine 1 mL saf etil alkol
eklenir. Tüp yava3ça alt üst edilerek DNA’n4n ipliksi görünümü izlenir. Tüp
13.000 devirde 2 dk santrifüj edilir.
Süpernatan at4l4r, dipte DNA pellet halinde görülür. DNA üzerine 1 mL
%70’lik etil alkol eklenip kar43t4r4l4r ve 13.000 devirde 2 dk santrifüj edilir.
Süpernatan at4l4r, tüp ters çevrilerek alkol kurutulur.
Pelletin büyüklüCüne göre saf su eklenir ve DNA’n4n çözülmesi için 1 saat
37 °C’de bekletilir.
Çözünen DNA’n4n konsantrasyonu hesaplanarak amplifikasyona haz4r hale
getirilir.
DNA deri3imi (Sg/mL) = OD260 x suland4rma faktörü (50) x 50
3.3.2. FVIII Polimorfizmlerinin RFLP ile Belirlenmesi
zole edilen genomik DNA’lar4n ilgili bölgeleri amplifiye edilmi3, daha sonra
amplifiye ürünler RFLP yöntemiyle HindIII ve AlwNI restriksiyon enzimleri
kullan4larak kesilmi3 ve genotip tayini yap4lm43t4r.
FVIII genindeki HindIII restriksiyon bölgesini amplifiye etmek için a3aC4daki
primer dizileri kullan4lm43t4r114.
Forward 5’: AAG GTC CTC GAG GGC GAC CAT CTA CAT GCT
GGGATG AGC.
Reverse 5’: AAG GTC GGA TCC GTC CAG AAG CCA TTC CCA GGG
GAG TCT.
FVIII genindeki AlwNI restriksiyon bölgesini amplifiye etmek için a3aC4daki
primer dizileri kullan4lm43t4r114.
Forward 5’: TAA TGT ACC CAA GTT TTA GG.
Reverse 5’: TAT AGA ACA GCC TAA TAT AGC AAG ACA CTG.
31
Amplifikasyon
KoCullar(:
PCR
50
µL’lik
reaksiyon
hacminde
gerçekle3tirilmi3tir. Reaksiyon kar434m4, PCR tamponu (67 mM Tris-HCl tamponu pH
8,8, 16,6 mM amonyum sülfat, 6,7 mM magnezyum klorür, 0,17 mg/mL BSA, 10 mM
Z-merkaptoetanol), 1 mM dNTP, 0,2 µM primer ve 2,5 U Taq DNA Polimeraz enzimi
içermektedir114.
PCR Program(;
PCR; 92 °C ‘de 7 dk denatürasyon ile ba3lad4ktan sonra bunu 30 döngü 92 °C
‘de 1 dk denatürasyon ve 60 °C ‘de 4 dk uzama ile devam eder. 60 °C ‘de 7 dk son
uzama ile sonlan4r114.
PCR i3leminden sonra 5 µL PCR ürünü ve 5 µL yükleme boyas4 (%15 Ficoll,
%10 Gliserol, Bromfenol Mavisi, 1x TBE Tampon) ile %2’lik agaroz jele uygulama
yap4larak, örnekler 150 volt ak4mda 30 dk yürütülmü3tür. Agaroz jel etidyum bromid
ile boyanarak (0,5 µL olacak 3ekilde saf Etidyum Bromid çözeltisi son hacim saf su ile
suland4r4l4r) UV translüminatörde incelenmi3 ve amplifikasyon kontrolü yap4lm43t4r.
Restrüksiyon enzimi ile kesim, son hacim 20 µL olacak 3ekilde, 10 µL PCR ürünü 15 U
HindIII ve AlwNI ile kendi tamponlar4 içinde gerçekle3tirilmi3tir.
HindIII (Haemophilus influenzae Rd kaynakl4) restriksiyon enzimiyle kesim 37
eC’de gerçekle3ir. Bu enzimin kesim bölgesi a3aC4daki gibidir;
5’......AfAGCTT......3’
3’......TTCGAgA......5’
AlwNI (Comamonas acidovorans lti 19-021 kaynakl4) restriksiyon enzimiyle
esim 37 eC’de gerçekle3ir. Bu enzimin kesim bölgesi a3aC4daki gibidir;
5’......CAGNNNfCTG......3’
3’......GTCgNNNGAC......5’
nkübasyon sonras4nda HindIII ile kesilmi3 örnekler %1,8’lik agaroz jelde,
AlwNI ile kesilmi3 örnekler %12’lik poliakrilamid jelde yürütülerek genotipik
özellikleri belirlenmi3tir. Jel haz4rland4ktan sonra örneklerden 5’er µL al4narak, 7 µL
yükleme boyas4yla kar43t4r4lm43 ve jele uygulanm43t4r. 150 voltta 45 dk yürüyen
örnekler, etidyum bromidle boyanarak UV translüminatörde incelenmi3tir.
32
Amplifikasyon kontrolünde ve restriksiyon enzimi ile kesim sonras4nda
örneklerin bç uzunluklar4n4 saptamak amac4yla belirteç olarak 100 bç’lik DNA Ladder
ve Phi x 174 DNA /HinfI kullan4lm43t4r.
3.3.3. FIX Polimorfizmlerinin RFLP ile Belirlenmesi
zole edilen genomik DNA’lar4n ilgili bölgeleri amplifiye edilmi3, daha sonra
amplifiye ürünler RFLP yöntemiyle DdeI, XmnI ve TaqI retrüksiyom enzimleri
kullan4larak kesilmi3 ve genotiplendirilmesi yap4lm43t4r.
FIX genindeki DdeI restriksiyon bölgesini amplifiye etmek için a3aC4daki
primer dizileri kullan4lm43t4r115.
Forward 5’: 5’GGGACCACTGTGGTATAATGTGG 3’
Reverse 5’: 5’ CTGGAGGATAGATGTCTCTATCTG 3’
FIX genindeki TaqI restriksiyon bölgesini amplifiye etmek için a3aC4daki primer
dizileri kullan4lm43t4r115.
Forward 5’: 5’CTGGAGTATGACTGGCCAATTATCC 3’
Reverse 5’: 5’ GGTACACAAGGATTCTAAGGTTG 3’
FIX genindeki XmnI restriksiyon bölgesini amplifiye etmek için a3aC4daki
primer dizileri kullan4lm43t4r115.
Forward 5’: 5’AATGAGAGACTGCTGATTGACTT 3’
Reverse 5’: 5’GAAACAGCCAGATAAAGCCTCCA 3’
Amplifikasyon KoCullar(: PCR 100 SL’lik reaksiyon hacminde gerçekle3ir.
Tepkime kar434m4, PCR tamponu (50 mM potasyum klorür, 1,5 mM magnezyum
klorür, %0,01 jelatin, 10 mM Tris-HCl pH 8,5), 100 SM dNTP, 50 ng genomik DNA,
DdeI primerinden 0,5 SM, TaqI primerinden 0,1 SM, XmnI primerinden 0,5 SM ve 1
U Taq Polimeraz içermektedir115.
PCR Program(;
PCR; 30 döngü 94 °C’ de 30 sn inkübasyon, 55 °C’ de 30 sn yap43ma ve 72 °C’
de 30 sn uzama 3eklinde gerçekle3tirilir115.
PCR i3leminden sonra 5 µL PCR ürünü ve 5 µL yükleme boyas4 (%15
Ficoll, %10 Gliserol, Bromfenol Mavisi, 1x TBE Tampon) ile %2’lik agaroz jele
33
uygulama yap4larak, örnekler 150 volt ak4mda 30 dk yürütülmü3tür. Agaroz jel etidyum
bromid ile boyanarak (0,5 µL olacak 3ekilde saf Etidyum Bromid çözeltisi son hacim
saf su ile suland4r4l4r) UV translüminatörde incelenmi3 ve amplifikasyon kontrolü
yap4lm43t4r. Restriksiyon enzimi ile kesim 10 SL PCR ürünü 1 U restriksiyon
endonükleazla muamele edilerek gerçekle3tirilmi3tir
XmnI (Pseudomonas diminuta Auk 5-324 kaynakl4 )restriksiyon enzimiyle
kesim 37 eC’de gerçekle3ir. Bu enzimin kesim bölgesi a3aC4daki gibidir;
5’......GAANNfNNTTC......3’
3’......CTTNNgNNAAG......5’
TaqI (Thermus aquaticus YT1 kaynakl4) restriksiyon enzimiyle kesim 65 eC’de
gerçekle3ir. Bu enzimin kesim bölgesi a3aC4daki gibidir;
5’......TfCGA......3’
3’......AgGCT......5’
DdeI restriksiyon bölgesi 50 bç’lik bir insersiyon/delesyon polimorfizmi
olduCundan PAGE’de direkt olarak gözlenir.
nkübasyon sonras4nda XmnI ve TaqI ile kesilmi3 örnekler ve DdeI restriksiyon
bölgesini içeren amplifiye örnek %6’l4k poliakrilamid jelde yürütülerek genotipik
özellikleri belirlenmi3tir. Jel haz4rland4ktan sonra örneklerden 5’er µL al4narak, 7 µL
yükleme boyas4yla kar43t4r4lm43 ve jele uygulanm43t4r. 150 voltta 45 dk yürüyen
örnekler, etidyum bromidle boyanarak UV translüminatörde incelenmi3tir.
Amplifikasyon kontrolünde ve restriksiyon enzimi ile kesim sonras4nda
örneklerin bç uzunluklar4n4 saptamak amac4yla belirteç olarak Phi x 174 DNA/HinfI
kullan4lm43t4r.
34
4. BULGULAR
Çal43ma grubu, 6 ayl4k bir süreç içinde Ç.Ü. T4p Fakültesi Çocuk Hematoloji
Bilim Dal4’4nda hemofili A ve B ön tan4s4 konmu3 1–22 ya3 grubundaki erkek
bireylerden olu3maktad4r. Çal43ma grubumuz 30 hemofili A ve 7 hemofili B hastas4
olmak üzere 37 olgudan olu3maktad4r. Kanlar4 al4nan hemofili hastalar4n4n genomik
DNA’lar4nda hemofili A ve B’den sorumlu FVIII ve FIX gen bölge mutasyonlar4 RFLP
tekniCi kullan4larak saptanmaya çal434lm43t4r. Böylelikle Çukurova Bölgesi ön hemofili
mutasyon haritas4 ç4kar4lmak istenmi3tir
Hemofili A mutasyonlar4n4n saptanmas4 için, iki intrajenik restriksiyon enzimi;
HindIII (intron 19) ve AlwNI (intron 7) kullan4lm43t4r. DNA’lar4n PCR ile
amplifikasyonundan sonra, uygun intrajenik belirteçlerle hastalar4n genotipleri agaroz
ve PAGE’te gözlenen restriksiyon kesim bölgelerine göre tan4mlanm43t4r. DeCi3ken
restriksiyon
bölgesinin
varl4C4
(+)
genotiple,
yokluCu
ise
(-)
genotiple
tan4mlanmaktad4r. HindIII amplifikasyon ürünü, her hastada bulunan ve PCR
ko3ullar4n4n internal kontrolü gibi rol oynayan 504 bç’lik bir parça içermektedir.
Çizelge 3’te amplifiye ürünlerin büyüklükleri ve restriksiyon enzim parçalar4 her bir
çal43ma için gösterilmi3tir.
Çizelge 3. FVIII restriksiyon bölgelerinin PCR ile amplifiye edilmi3 ve restriksiyon enzimi ile kesilmi3
parçalar4.
RFLP
YerleCimi
HindIII
ntron 19
PCR Ürünü
(bç)
738
AlwNI
ntron 7
260
35
Restriksiyon Enzimi ile
KesilmiC Parçalar
(-) genotip
(+) genotip
504 + 234
504 + 157 + 77
260
232
ntron 19’da yerle3mi3 HindIII kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak
amplifiye edilen bölge 738 bç uzunluCundad4r ( ekil 12). HindIII ile kesimden sonra
elde edilen (-) genotipte; 504 ve 234 bç’lik iki parça gözlenirken, (+) genotipte; 234
bç’lik parçan4n iki küçük parçaya ayr4lmas4ndan dolay4 504, 157 ve 77 bç’ lik üç parça
gözlenmektedir.
ntron 7’de yerle3mi3 AlwNI kesim bölgesini tan4yan primerler
kullan4larak amplifiye edilen bölge 260 bç uzunluCundad4r ( ekil 13). AlwNI ile
kesimden sonra elde edilen (-) genotipte; yine 260 bç’lik bir parça gözlenirken, (+)
genotipte; 232 bç’lik bir parça gözlenmektedir. HindIII enzimiyle kesimden sonra
olgular4n genotiplerin %1,8’lik agaroz jel elektroforez görüntüsü ve AlwNI enzimi ile
kesimden sonra olgular4n genotiplerinin %12’lik poliakrilamid jel elektroforez
görüntüsü ekil 14 ve 15’ de gösterilmi3tir.
738 bç
ekil 12. ntron 19’da yerle3mi3 HindIII kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak amplifiye edilen
738 bç’lik bölgenin %2’lik agaroz jel görüntüsü.
36
260 bç
ekil 13. ntron 7’de yerle3mi3 AlwNI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak amplifiye edilen
260 bç’lik bölgenin %12’lik PAGE görüntüsü.
1
2
3
4
5
504 bç
234 bç
157 bç
77 bç
ekil 14. FVIII geninin intron 19 amplifiye bölgesinin HindIII enzimi ile kesilerek genotiplendirilmesi.
1-Belirteç, 2 (-) genotip, 3 (+ ) genotip, 4 (-) genotip , 5 (-) genotip.
Örnekler %1,8’ lik agaroz jelde yürütülmü3tür.
Belirteç olarak 100 bç’ lik DNA Ladder kullan4lm43t4r.
37
1
2
3
4
5
6
7
260 bç
ekil 15. FVIII geninin intron 7 amplifiye bölgesinin AlwNI enzimi ile kesilerek genotiplendirilmesi.
1-Belirteç, 2 (-) genotip, 3 (-) genotip, 4 (-) genotip, 5 (-) genotip, 6 (-) genotip, 7 (-) genotip.
Örnekler %12’ lik agaroz jelde yürütülmü3tür.
Belirteç olarak Phi x 174 DNA /Hinf I kullan4lm43t4r.
Çal43mam4zda PCR ürünlerinin HindIII ile yap4lan restriksiyon enzim kesim
analizi sonucunda 13 (+) genotipli olguya rastlanm43t4r. AlwNI ile yap4lan restriksiyon
enzim analizi sonucunda ise (+) genotipli olguya rastlanmam43t4r. Çizelge 4’te
polimorfizm saptanan hastalar4n % FVIII aktivitesi gösterilmi3tir.
Hemofili B polimorfizmlerinin analizi amac4yla üç intrajenik restriksiyon
enzimi, TaqI (intron 4), XmnI (intron 3) ve DdeI (intron 1) seçilmi3tir. DNA’lar4n PCR
ile amplifikasyonundan sonra, uygun intrajenik belirteçlerle hastalar4n genotipleri
PAGE’te gözlenen restriksiyon kesim bölgelerine göre tan4mlanm43t4r. DdeI d434nda
diCer iki polimorfizm, bir restriksiyon enzim bölgesinin varl4C4 ya da yokluCu için
analiz edilmi3tir. DdeI delesyon/insersiyon polimorfizmi, 50 bç’lik insersiyon
varl4C4nda (+), yokluCunda ise (-) genotip göstermektedir.Bu polimorfizm PAGE’de
direkt olarak gözlenir. Çizelge 5’te amplifiye ürünlerin büyüklükleri ve restriksiyon
enzim fragmentleri her bir RFLP için gösterilmi3tir.
38
Çizelge 4. Polimorfizm saptanan hastalar4n % FVIII aktivitesi.
Hasta Ad(
YaC(
FVIII Aktivitesi
Polimorfizm
(%)
H.T.
6
1
HindIII
M.A.
13
11,7
HindIII
E.T.
9
1,7
HindIII
A.Ç.
16
0,3
HindIII
U. .
10
0,3
HindIII
R.Ç.
11
2,1
HindIII
M.C.K.
8
0,6
HindIII
E.Y.
15
1
HindIII
S.Y.
14
1
HindIII
A.Y.
8
1
HindIII
H.B.K.
5
0,8
HindIII
M.D.
10
1
HindIII
C.A.
15
1
HindIII
Çizelge 5. FIX restriksiyon bölgelerinin PCR ile amplifiye edilmi3 ve restriksiyon enzimi ile kesilmi3
parçalar4.
RFLP
YerleCimi
RestriksiyonEndonükleaz
ile KesilmiC Parça
(bç)
ntron 1
PCR ile
Amplifiye Parça
(bç)
319 veya 369
DdeI
XmnI
ntron 3
222
154 + 68
TaqI
ntron 4
163
124 + 39
39
ntron 4’da yerle3mi3 TaqI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak
amplifiye edilen bölge 163 bç uzunluCundad4r ( ekil 16). TaqI ile kesimden sonra elde
edilen (-) genotipte, yine 163 bç’lik parça gözlenmekte iken, (+) genotipte bu parçan4n
124 ve 39 bç’lik iki parçaya ayr4ld4C4 gözlenmektedir. ntron 3’de yerle3mi3 XmnI
kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak amplifiye edilen bölge 222 bç
uzunluCundad4r ( ekil 17). XmnI ile kesiminden sonra elde edilen (-) genotipte; yine
222 bç’lik parça gözlenirken, (+) genotipte bu parçan4n 154 ve 68 bç’lik iki parçaya
ayr4ld4C4 gözlenmektedir. ntron 1’da yerle3mi3 DdeI restriksiyon bölgesini tan4yan
primerler kullan4larak amplifiye edilen ürün direkt olarak jelde yürütüldüCünde, 50
bç’lik insersiyon varl4C4nda yani (+) genotipte 369 bç’lik bir parça gözlenirken, 50
bç’lik insersiyon yokluCunda yani (-) genotipte; 319 bç’lik bir parça gözlenmektedir.
TaqI ve XmnI enzimleriyle kesimden sonra bireylerin genotiplerinin ve DdeI insersiyon
polimorfizmi genotiplerinin %6’l4k PAGE görüntüsü ekil 18, 19 ve 20’ da verilmi3tir.
163 bç
ekil 16. ntron 4’da yerle3mi3 TaqI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak amplifiye edilen 163
bç’lik bölgenin %2’lik agaroz jel görüntüsü.
40
222 bç
ekil 17. ntron 3’de yerle3mi3 XmnI kesim bölgesini tan4yan primerler kullan4larak amplifiye edilen 222
bç’lik bölgenin %2’lik agaroz jel görüntüsü.
1
2
3
4
5
6
7
8
163 bç
124 bç
39 bç
ekil 18. FIX geninin intron 4 amplifiye bölgesinin TaqI enzimi ile kesilerek genotiplendirilmesi.
1-Belirteç, 2 (-) genotip, 3 (-) genotip, 4 (-) genotip, 5 (-) genotip, 6 (-) genotip, 7 (+) genotip, 8 (-)
genotip
Örnekler %6’ lik agaroz jelde yürütülmü3tür.
Belirteç olarak Phi x 174 DNA /Hinf I kullan4lm43t4r.
41
1
2
3
4
5
6
7
222 bç
154 bç
68 bç
ekil 19. FIX geninin intron 3 amplifiye bölgesinin XmnI enzimi ile kesilerek genotiplendirilmesi.
1-Belirteç , 2 (-) genotip, 3 (-) genotip ,4 (-) genotip, 5 (-) genotip , 6 (-) genotip, 7 (+) genotip
Örnekler %6’ lik agaroz jelde yürütülmü3tür.
Belirteç olarak Phi x 174 DNA /Hinf I kullan4lm43t4r.
1
2
3
4
5
6
369 bç
319 bç
ekil 20.FIX geni intron 1’de yerle3mi3 50 bç’lik DdeI polimorfizminin genotiplendirilmesi.
1-Belirteç , 2 (+) genotip , 3 (-) genotip, 4 (+) genotip, 5 (-) genotip, 6 (-) genotip
Örnekler %6’ lik agaroz jelde yürütülmü3tür.
Belirteç olarak Phi x 174 DNA /Hinf I kullan4lm43t4r.
42
Çal43mam4zda PCR ürünlerinin TaqI ve XmnI ile yap4lan restriksiyon enzim
analizi sonucunda bir olgu her iki polimorfizm yönünden de (+) genotipli olarak
bulunmu3tur. PCR ürünlerinin DdeI ile yap4lan mutasyon analizi sonucunda ise iki
hemofili B hastas4nda bu polimorfizme rastlanm43t4r. Çizelge 6’da polimorfizm
saptanan hastalar4n % FIX aktiviteleri gösterilmi3tir.
Çizelge 6. Polimorfizm saptanan hastalar4n % FIX aktivitesi.
Hasta Ad(
YaC(
FIX Aktivitesi
Polimorfizm
(%)
M.E. A.
22
0,6
TaqI, XmnI
Y.Ü.
17
0,5
DdeI
M.K.
14
0
DdeI
43
5. TARTI-MA
Hemofili kanama bulgular4yla en s4k hastanelere ba3vurulan, tedavi maliyetinin
yüksekliCi nedeniyle ciddi sorun yaratan ve toplumda s4k olarak görülen doCumsal bir
hastal4kt4r. Dünyan4n her kö3esinde, her 4rk ve millette rastlanabilen hemofilinin aC4r
formu her 10.000 erkek doCumda 1 ki3ide görülmektedir. Yurdumuzda 4.000 civar4nda
hemofili hastas4 olmas4 gerekirken izlenen hasta say4s4 bu rakam4n yar4s4 kadard4r.
ABD’de 10.000, Hindistan’da 50.000 hemofili hastas4 vard4r. Türkiye’de her y4l 100
yeni hemofili hastas4 doCmaktad4r.
Hemofili ki3iye, aileye ve topluma maliyeti en yüksek hastal4klardan biridir.
ABD rakamlar4na göre bir hemofili hastas4n4n topluma maliyeti y4lda 65.000 $ olarak
hesaplanmaktad4r. Dünya ölçeCine bakt4C4m4zda tüm dünyada 350.000 hemofili A,
70.000 civar4nda hemofili B hastas4 bulunduCu san4lmaktad4r. ÇoCunu geli3memi3 ve
geli3mekte olan ülkelerin olu3turduCu, aralar4nda tedavi ve izlem kalitesi açis4ndan
büyük uçurumlar olan hastalar4n %80’i tedavi imkanlar4ndan faydalanamamakta ve
sonuçta, çe3itli komplikasyonlara maruz kalmakta ya da kanamalarla hayat4n4
kaybetmektedir19.
Bu sebeplerden dolay4 akraba evliliklerinin oldukça s4k olduCu ülkemizde
hemofili hastalar4n4n doCumunun engellenmesi amac4yla ailelere ilgili genetik
dan43manl4k hizmetinin verilerek prenatal tan4 yöntemlerinin uygulanmas4 oldukça
önem ta34maktad4r. Hemofili hastas4 çocuCu olan ailenin gerekli genetik çal43malar4
yap4lm43 ve ilgili gendeki mutasyonlar saptanm43sa bir sonraki çocuCun hemofili
hastas4 olup olmad4C4 prenatal tan4 yöntemleriyle saptanabilmektedir. Ailesinde
hemofili öyküsü olan ancak mutasyon saptamas4 yap4lmam43 ailelere ise prenatal tan4
yöntemleri uygulanamamaktad4r. Ta34y4c4 tespiti ve doCum öncesi tan4n4n yap4lmas4
için, içinde bulunduCumuz toplumun genetik yap4s4n4n tespitinde popülasyonumuza
özgü mutasyonlar4n moleküler yöntemlerle h4zl4 bir 3ekilde saptanmas4 gerekmektedir.
Ta34y4c4 belirlemesi ve doCum öncesi tan4 amaçl4 hemofili genetik analizi
genellikle, FVIII ve FIX genlerinin içinde ya da uç k4s4mlar4nda bulunan DNA dizi
polimorfizmlerinin kullan4lmas4na dayanmaktad4r. Son y4llarda ise ailelerin erken
bilinçlendirilmesine ve moleküler genetik yöntemlerindeki geli3melere baCl4 olarak
hemofili ta34y4c4lar4n4n belirlenmesi ve doCum öncesi tan4 doCrudan hastal4Ca yol açan
44
mutasyonun saptanmas4na dayand4r4lmaktad4r. Hastal4Ca yol açan mutasyonun
saptanabildiCi durumda ta34y4c4 ve doCum öncesi tan4 kesinlik kazan4r17.
Polimorfik bölgelerin analizi, Türk popülasyonunun genetik yap4s4 gibi deCerli
bilgileri saClamakta ve diCer popülasyonlarla kar34la3t4rma olanaC4 vermektedir. Türk
popülasyonunun farkl4 genetik yap4s4na ilk belirteç FVIII polimorfizmleridir104. FVIII
genindeki RFLP’ler DNA “linkage” analizi ile prenatal tan4 ve ta34y4c4lar4n belirlenmesi
için oldukça uygun bir yöntemdir114. FVIII geninde baz4 intrajenik ve ekstrajenik
polimorfik belirteçler tan4mlanm43t4r115. Fakat tüm belirteçler, gen s4kl4klar4ndaki etnik
varyasyonlar ya da baz4 belirteçler aras4ndaki “linkage disequilibrium” nedeniyle tüm
popülasyonlarda “linkage” analizi için kullan43l4 deCildir. ki intrajenik RFLP (HindIII
ve AlwNI) ve ekstrajenik VNTR (St14), Türk popülasyonunda hemofili A’n4n prenatal
tan4s4 ve ta34y4c4lar4n belirlenmesinde kullan43l4 belirteçler olarak saptanm43t4r116. H4zl4
PCR analizi bu belirteçler için mümkündür117.
FVIII HindIII polimorfizmi ilk olarak Ahrens ve arkada3lar4 taraf4ndan rapor
edilmi3tir118. Bu çal43mada beyaz 4rk popülasyonundaki genotipik daC4l4m4 Southern
Blotting ile çal434lm43 ve beklenen heterozigot s4kl4C4 0,42 olarak bulunmu3tur. Yap4lan
diCer bir çal43mada, Bernardi ve arkada3lar4 fakl4 bir beyaz 4rk popülasyonunda
beklenen heterozigot s4kl4C4n4 0,33 olarak rapor etmi3lerdir119. Türk popülasyonunda
ise, ECilmez ve arkada3lar4n4n yapt4C4 çal43mada beklenen heterozigot s4kl4C4n4 0,47
olarak saptam43lard4r120. Bu deCer bat4 Avrupa toplumlar4nda tespit edilen oranlardan
daha yüksektir. Ayr4ca bu deCer, HindIII polimorfizminin Türkiye’de hemofili A için
çok kullan43l4 bir belirteç olabileceCini ve Türkiye’de hemofili A vakalar4nda prenatal
tan4 ve ta34y4c4 belirlenmesinde önemli bir te3his arac4 olabileceCini göstermektedir120.
Polimorfik
bölgenin
analizi,
“linkage”
analizinde
intrajenik
HindIII
dimorfizminin diagnostik deCerinin Türk popülasyonunda maksimal deCere yak4n
olduCunu göstermektedir. Bu nedenle, çal434lan ailelerde eCer kad4nlar bilgi verici ise
ilk belirteç olarak kullan4lmal4d4r. AlwNI intrajenik polimorfizmi, diCer bölgelerle
dengededir fakat, popülasyonumuzdaki dü3ük heterozigot s4kl4C4 bu belirtecin
kullan4l43l4C4n4 k4s4tlamaktad4r. Kad4nlar bilgi verici deCilse, doCruluCu saClamak için
HindIII polimorfizmiyle birlikte ikinci belirteç olarak kullan4lmaktad4r104.
Yap4lan bir çal43mada, Türk popülasyonunun HindIII RFLP ya da BclI RFLP
bölgesinde Anglo-Amerikal4lar kadar polimorfik olduCu gösterilmi3 ise de intron 7
45
AlwNI bölgesinde heterozigotluCunun beyaz 4rktan önemli ölçüde dü3ük olduCu
bulunmu3tur117. Türkiye’de hemofili A aileleriyle yap4lan ba3ka bir çal43mada; HindIII,
AlwNI ve ekstrajenik VNTR belirteci St14’ün birlikte kullan4m4n4n kad4nlar4n
%86’s4n4n DNA “linkage” analizi için uygun olduCu rapor edilmi3tir115. DNA “linkage”
analizinde ek bilgi verici intrajenik belirteçlerin kullan4m4, tan4da doCruluCu
artt4rmaktad4r.
Türk popülasyonunda yap4lan bir diCer çal43mada; HindIII için gözlenen
heterozigot s4kl4C4 %41, AlwNI için gözlenen heterozigot s4kl4C4 %11 olarak
bulunmu3tur104.
Avrupa ve Güney Amerika popülasyonlar4 HindIII polimorfizmi için dü3ük
heterozigot s4kl4C4na (%30–42), AlwNI polimorfizmi için ise yüksek deCerlere sahipken,
Türk popülasyonu HindIII için yüksek, AlwNI için dü3ük deCerlere sahiptir104.
Hemofili A hastas4 erkeklerle yapt4C4m4z çal43mam4zda, ta34y4c4 kad4nlarla
herhangi bir çal43ma yapmamam4za kar34n ikisininde ayn4 oranlar4 yans4tacaC4ndan yola
ç4karak HindIII polimorfizminin görülme s4kl4C4 %43 olarak saptanm43t4r. Yine
hemofili A hastas4 erkeklerle yapt4C4m4z çal43mada AlwNI polimorfizmi ta34yan olguya
rastlanmam43t4r. HindIII polimorfizmi saptanan olgular4n 4 tanesinin FVIII aktivesi
%1’in alt4nda olduCundan aC4r tip hemofiliye, 8 tanesinin FVIII aktivesi %1–5 aras4nda
olduCundan orta tip hemofiliye ve 1 tanesinin FVIII aktivitesi %5–49 aras4nda
olduCundan hafif tip hemofiliye sahip olduCu görülmü3tür. Polimorfizm saptanan
hastalar4n 1/3’de aC4r tip hemofili görülmesi, bölgemizde s4k rastlanan hemofili
hastal4C4n4n prenatal tan4s4n4n son derece önemli olduCunu göstermektedir. Bir olguda
diCerlerinden farkl4 olarak hafif tip hemofili görülmesini yanl43 ya da faktör verilmesi
sonras4 yap4lan ölçüm olarak yorumlayabiliriz.
Hemofili B’ de ta34y4c4lar4n belirlenmesi ve doCum öncesi tan4 hemofili A’ya
benzerlik gösterir. Türkiye’deki hemofili B hastalar4n4n 1000 civar4nda olduCu
dü3ünülmektedir. Bu hastal4C4n doCas4 nedeniyle yüzlerce mutasyon veritaban4nda
depolanm43t4r17. Hemofili B’de bozuk allel ta34yan riskli aileleri belirlemede en ideal
yöntem mutasyonlar4n tan4mlanmas4d4r. Fakat, FIX geninin büyük ve karma34k
olmas4ndan ve mutasyonlar4n heterojen doCas4ndan dolay4 doCrudan mutasyon analizi
hemofili B’li her aile için mümkün deCildir. Risk ta34yan ailelerde hemofili B’nin
46
ta34y4c4 belirlenmesinde yeni yakla34mlar aras4nda RFLP “linkage” analizi en fazla
kullan4lan yöntemdir121.
Prenatal tan4y4 ve/veya ta34y4c4lar4n belirlenmesini saClamak amac4yla, FIX
geniyle baClant4l4 s4kl4C4 farkl4 etnik gruplar aras4nda deCi3iklik gösteren baz4 RFLP
bölgeleri tan4mlanm43t4r. Polimorfik belirteçler aras4ndaki kuvvetli baC, baz4
belirteçlerin kullan4m4n4 k4s4tlar. Ekstrajenik ve intrajenik FIX RFLP’ leri yayg4n
hemofili B ailelerinde ta34y4c4 belirlenmesi ve prenatal tan4 için kullan4lmaktad4r122.
FIX mutasyonlar4 hemen hemen her hastada saptanabilmektedir17. FIX gen
polimorfizmlerinin analizi, gen mutasyonlar4n4n tan4mlanmas4 kolayl4kla mümkün
olmayan hemofili B’nin prenatal tan4s4 ve ta34y4c4lar4n belirlenmesi için en iyi yakla34m
olarak dü3ünülmektedir122.
Tüm FIX gen dizisinin yay4nlanmas4; TaqI, XmnI ve DdeI RFLP bölgelerini
içeren bölgelerin amplifikasyonu için PCR kullan4lmas4na imkan saClam43t4r. Uygun
restrüksiyon endonükleazlar ile PCR ürünlerinin takip eden kesimi ve PAGE ile
kesilmi3 ürünlerin h4zl4 analizi, RFLP bölgesinin varl4C4 ya da yokluCunun
belirlenmesine izin vermektedir115.
ÇaClayan ve arkada3lar4n4n hemofili B hastalar4yla yapt4C4 bir çal43mada; FIX
geninde 9 nokta mutasyonu ve bir geni3 delesyon 10 Türk hemofili B hastas4nda
tan4mlanm43t4r123. Onay ve arkada3lar4n4n yapt4C4 bir diCer çal43mada; hastalar4n
haplotipleri alt4 polimorfik belirtecin PCR analizi ile (BamHI, DdeI, XmnI, TaqI, MnlI
ve HhaI) çal434lm43t4r. Analiz, 25 missense ve 8 nonsense mutasyon içeren 33 nokta
mutasyonu ve bir geni3 delesyonu ortaya ç4karm43t4r. Tüm 33 deCi3im, PCR ve dizi
reaksiyonlar4n4n tekrar4 ile ve restrüksiyon enzim kesimi ile doCrulanm43t4r124. FIX
genindeki bu mutasyonlar4n tan4mlanmas4 hemofili B’nin moleküler patolojisini daha
iyi anlamaya yard4m saClam43t4r ve aile üyelerinin prenatal tan4s4 ve doCru ta34y4c4
tespiti için çok deCerlidir.
FIX gen dahilindeki ve yan bölgelerindeki üç polimorfik bölgenin analizi Türk
popülasyonuna en çok uygulanabilen “linkage” analiz stratejisi olarak görülmektedir.
DdeI “linkage analizi”nde kullan4lacak ilk belirteç olarak belirlenmi3tir. TaqI ikinci
belirteç olarak kullan4labilir fakat, XmnI ile güçlü “linkage disequlibruim” olduCundan
“linkage” analizi için kullan43l4 deCildir104.
47
FIX geninin klonlanmas4 ve intrajenik FIX DNA polimorfizmlerinin
tan4mlanmas4, hemofili B’li ailelerde prenatal tan4y4 ve ta34y4c4lar4n belirlenmesini
geli3tirmi3tir. Polimorfizmler için heterozigotluk oranlar4 çe3itli etnik gruplarda farkl4
olduCundan, Ghandil ve arkada3lar4n4n ran popülasyonunda yapt4C4 bir çal43mada, ilk
olarak iki s4k görülen intrajenik polimorfik bölgenin (TaqI ve XmnI) heterozigotluk
oranlar4n4 çal43m43lard4r. Sonuç olarak; TaqI ve XmnI için gözlenen heterozigotluk
oranlar4n4 %38 ve %37 olarak bulmu3lard4r. ki polimorfizmi de kullanarak gözlenen
heterozigotluk oran4 ise %46’d4r125. Bu iki bölgede Avrupa popülasyonu, diCer çal434lan
Asya popülasyonlar4ndan daha yüksek heterozigotluk oranlar4na sahiptir. Beyaz 4rkta
yüksek TaqI ve XmnI heterozigotluk oranlar4na (%45 ve %41) sahiptir126.
Türk popülasyonunda ta34y4c4 belirlenmesi ve prenatal tan4 için yap4lan bir diCer
çal43mada; DdeI, TaqI ve XmnI için gözlenen heterozigotluk oranlar4, %41, %32 ve
%26 olarak bulunmu3tur104.
Hemofili B hastas4 erkeklerle yapt4C4m4z çal43mam4zda, ta34y4c4 kad4nlarla
herhangi bir çal43ma yapmamam4za kar34n ikisinin de ayn4 oranlar4 yans4tacaC4ndan
yola ç4karak TaqI, XmnI ve DdeI polimorfizmlerinin görülme s4kl4klar4 s4ras4yla, %14,
%14 ve %28 olarak saptanm43t4r. TaqI polimorfizmi ve XmnI polimorfizmi saptanan
hemofili hastas4n4n FIX aktivitesi %1’in alt4nda olduCundan aC4r tip hemofiliye, DdeI
polimorfizmi saptanan 2 hastan4n FIX aktivitesi yine %1’in alt4nda olduCundan aC4r tip
hemofiliye sahip olduklar4 görülmü3tür. Polimorfizm saptanan hastalar4n tamam4nda
aC4r tip hemofili görülmesi, bölgemizde s4k rastlanan hemofili hastal4C4n4n prenatal
tan4s4n4n son derece önemli olduCunu göstermektedir.
Sonuç olarak; Hemofili A ve B’ nin moleküler tan4s4nda, daha fazla say4da
ekstrajenik ve intrajenik belirteç kullan4m4yla ve gerekli görüldüCü durumlarda DNA
dizi analizi yönteminin kullan4lmas4yla mutasyon belirleme ba3ar4s4n4n artt4r4labileceCi
görü3üne var4lm43t4r.
48
6. SONUÇLAR
1. Çal43ma 30 hemofili A ve 7 hemofili B hastas4 olmak üzere toplam 37 erkek
olgu ile gerçekle3tirilmi3tir. Bireylerin genetik analizlerinde; hemofili A için HindIII ve
AlwNI polimorfizm genotipleri, hemofili B için ise TaqI, XmnI ve DdeI polimorfizm
genotipleri incelenmi3tir.
2. Hemofili A hastalar4yla yapt4C4m4z analiz çal43malar4 sonucunda; 13 hastada
HindIII
polimorfizmi
saptan4rken,
AlwNI
polimorfizmine
hiçbir
hastada
rastlanmam43t4r. Türk populasyonunda yüksek görülme s4kl4C4na sahip olan HindIII
polimorfizmi, çal43t4C4m4z hasta grubunda da yüksek görülme s4kl4C4na sahip olup bu
oran %43 olarak belirlenmi3tir. HindIII polimorfizmi saptanan olgular4n FVIII
aktivitesi genellikle %1-5 aras4nda olup orta tip hemofiliye sahip olduklar4 görülmü3tür.
Hemofili B hastalar4yla yapt4C4m4z analiz çal43malar4 sonucunda; 1 hastada TaqI ve
XmnI polimorfizmi saptan4rken, 2 hastada DdeI polimorfizmi saptanm43t4r. Çal43ma
grubumuzda TaqI, XmnI ve DdeI polimorfizmleri için görülme s4kl4klar4 s4ras4yla %14,
%14 ve %28 olarak belirlenmi3tir. TaqI ve XmnI polimorfizmleri saptanan olgunun FIX
aktivitesi % 1’in alt4nda olduCundan aC4r tip hemofiliye, DdeI polimorfizmi saptanan
olgular4n FIX aktivite seviyesi yine %1’in alt4nda olduCundan aC4r tip hemofiliye sahip
olduklar4 görülmü3tür.
3. Yap4lan analizlerle Çukurova bölgesi ön hemofili mutasyon haritas4
ç4kar4lmak istenmi3 olup, analizler sonucunda tüm hastalarda genotip belirlemesi
bütçenin s4n4rl4 olmas4ndan dolay4 az say4da intrajenik belirteç kullan4lmas4 nedeniyle
mümkün olamam43t4r. leride yap4lacak çal43malarla Çukurova bölgesinde hemofili
mutasyon belirleme ba3ar4s4n4n daha fazla say4da ekstrajenik ve intrajenik belirteç
kullan4m4yla arrt4r4labileceCi, ayr4ca ekstrajenik ve intrajenik belirteçlerden yan4t
al4namamas4 durumunda DNA dizi analizi yönteminin kullan4larak FVIII ve FIX
genlerindeki diCer mutasyonlar4n da belirlenebileceCi görü3üne var4lm43t4r.
49
7. KAYNAKLAR
1.
Dhalback B. Blood coagulation. Lancet, 2000; 355: 1627-1632.
2.
Davie E W, Ratnoff O D. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science, 1964; 145:
1310-1312.
3.
Dündar S, KarakuC S. Koagülasyon sistemi. T J Hematol Onc, 2004;14(3): 172-178.
4.
Poller L, Ludlam CA. Recent Advances in Blood Coagulation. 7th Ed., Edinburg: Churchill
Livingstone; 1996.
5.
Bolton-Maggs P H B, Pasi K J. Hemophilia A and B. Lancet, 2003; 361: 1801-1809.
6.
Lakich D, Kazazian HH Jr, Antonarakis SE, Gitschier J. Inversions disrupting the FVIII gene
are a common cause of severe hemophilia A. Nat Genet, 1993; 5: 236-41.
7.
Bagnall RD, Waseem N, Green PM, Giannelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the
FVIII gen is a frequent cause of severe hemophilia A. Blood, 2002; 99: 168-74.
8.
Johannes Oldenburg MD, Rainer Schwaab M D. Molecular biology of blood coagulation. Semin
Thromb Hemost, 2001; 27: 313-324.
9.
Fruie B, Fruie BC. The moleculer basis of blood coagulation. Cell, 1988; 53: 505-518.
10. Macfarlane RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism and its function as a
biological amplifier. Nature, 1969; 202: 495-498.
11. Hoffman M, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR. Factors IXa and Xa play distinct roles in
tissue factor dependent initiation of coagulation. Blood, 1995; 86: 1794-1801.
12. Israels LG, Israels ED. Mechanisms in Hematology. 2nd Ed., England: Core Health Science
Inc; 1996.
13. Broze GJ. Tissue factor pathway inhibitor and the revised theory of coagulation. Ann Rev Med,
1995; 46: 103-112.
14. Roberts HR, Lozier JN. New perspectives on the coagulation cascade. Hosp Pract, 1992; 27: 97112.
15. Fruie B, Fruie BC. Molecular and cellular biology of blood coagulation. N Engl J Med, 1992; 326:
800-806.
50
16. Cawthern KM, CornelisV, Lock JB, DiLorenzo ME, Branda RF, Mann KG. Blood
coagulation in hemophilia A and hemophilia C. Blood, 1998; 12: 4581-4592.
17. Ça&layan SH. Hemofili moleküler genetiCi. Temel Moleküler Hematoloji Kursu. stanbul,
2004: 95-98.
18. Williams WJ, Beutler E, Erslev AJ, Lichtman M. Classification of Disorders of Hemostasis.
Hematology, New York: Mc Graw-Hill Publishing, 1991; 1338-1339.
19. Kavakl( K. Hemofili Rehberi. Ege Hemofili Derne2i Yay4nlar4, No: 6, zmir, 2001.
20. Jackson CM, Nemerson Y. Blood coagulation. Ann Rev Biochem, 1980; 49: 765-811.
21. Antonarakis SE. The molecular genetics of Hemophilia A and B in man. FVIII and FIX
Deficiency. Adv Hum Genet, 1988; 17: 27-59.
22. Kuter DJ, Rosenberg RD. Hemorrhagic Disorders III. Disorders of Hemostasis. In: Beck WS.
Eds. Hematology, 5th Ed., Massachusetts: The MIT Press, 1991: 577-598.
23. Akhmeteli NA, Aledort LN, Alexaniants S. Methods for the detection of hemophilia carriers. Bull
WHO, 1977; 55: 675-702.
24. Sadler JE. Recombinant DNA methods in hemophilia A: Carrier detection and prenatal diagnosis.
Semin Thromb Hemost, 1990; 16(4): 341-347.
25. Lillicrap DP, White BN, Holden JJA, Giles AR. Carrier detection in the hemophilias. Am J
Hematol, 1987; 26: 285-296.
26. Lillicrap DP. Molecular biotechnology and its impact on hemophilia: Carrier testing, prenatal
diagnosis and the potential role of gene therapy. In: Westphal RG and Smith DM. Arlington VA
Eds. Hemophilia and von Willebrand Disease: New Developments, Am Assoc Blood Banks, 1989;
107-142.
27. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, Wion KL, Chen EY, Eaton DH, Vehar GA, Capon DJ,
Lawn RM. Characterization of the human factor VIII gene. Nature, 1984; 312: 326-330.
28. Jeye M, de la Salle H, Schamber F, Balland A, Kohli V, Findeli A, Tolstoshev P, Lecocq JP.
Isolation of a human antihemophilic factor cDNA clone using a unique 52- base synthetic
oligonucleotide probe deduced from the amino acid sequence of bovine factor IX. Nucleic Acids
Res , 1983; 11: 2325-2335.
29. Graham JB. Genetics of Hemostasis. In: Bloom Al and Thomas DP. Eds. Hemostasis and
Thrombosis, 2nd Ed., Edinburgh: Churchill-Livingstone, 1987; 494-508.
51
30. Thompson MW, Mcinnes RR, Willard HF. Genetics in Medecine. 5th Ed., USA: WB Saunders
Company; 1991.
31. Brinkhous KM. Gene transfer in the hemophilias: Retrospect and prospect. Thromb Res, 1992; 67:
329-338.
32. Gerrard AJ, Hudson DL, Brownlee GG, Fiona MW. Towards gene therapy for hemophilia B
using primary human keratinocytes. Nat Genet, 1993; 3: 180-183.
33. Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med, 1994; 330: 38-47.
34. Eyster ME, Lewis JH, Shapiro SS, Gill F, Kajani M, Prager D. The Pennsylvania hemophilia
program. Am J Hematol, 1978; 9: 277-286.
35. Timur AA. Molecular Pathology and Management of Hemophilia A in Turkish Families. Doktora
Tezi, BoCaziçi Üniversitesi, stanbul, 1999.
36. Van Diejen G, Tans G, Rosing J, Hemker HC. The role of phospholipid and factor VIIIa in the
activation of bovine factor X. J Biol Chem, 1981; 256: 3433-3442.
37. Mann KG, Nesheim ME, Church WR, Haley P, Krishnaswamy. Surface-dependent reactions of
the Vitamin K- dependent enzyme complexes. Blood, 1990; 76: 1-16.
38. Handin RI, Wagner DD. Molecular and cellular biology of von Willebrand factor. Prog Hemost
Thromb, 1989; 9: 233-259.
39. Wion KL, Kelly D, Summerfield JA, Tuddenham EGD, Lawn RM. Distribution of FVIII
mRNA and antigen in human liver and other tissues. Nature, 1985; 317: 726- 729.
40. Vehar GA, Keyt B, Eaton D, Rodriguez H, O’Brien DP, Rotblat F, Oppermann H,
Keck R, Wood WI, Harkins RN, Tuddenham EGD, Lawn RM, Capon DJ.
Structure of human factor VIII. Nature, 1984; 321:337-342.
41. Vehar GA, Keyt B, Eaton D, Rodriguez H, O’Brien DP, Rotblat F, Oppermann H, Keck
R, Wood WI, Harkins RN, Tuddenham EG, Lawn RM, Capon DJ. Structure of human
factor VIII. Nature, 1984; 312 :337-342.
42. Lollar P, Fay PJ, Fass DN. Factor VIII and factor VIIIa. Methods Enzymol, 1993; 222: 128-143.
43. Pittman DD. Wang JH, Kaufman RJ. Identification and functional importance of tyrosine-sulfate
residues within recombinant factor VIII. Biochemistry, 1992; 31: 3315-3323.
44. Fay PJ, Haidaris PJ, Smudzin TM. Reconstruction of factor VIIIa from the isolated A1/A3-C1C2 dimer and A2 subunit. J Biol Chem, 1991; 266: 8957-8962.
52
45. Pipe SW, Saenko EL, Eickhorst AN, Kemball-Cook G, Kaufman RJ. Hemophilia A mutations
associated with 1-stage/2-stage activity discrepancy disrupt protein-protein interactions within the
triplicated A domains of thrombin-activated factor VIIIa. Blood, 2001; 97: 685-691.
46. Kaufman RJ, Wasley LC, Dorner AJ. Synthesis, processing and secretion of recombinant human
factor VIII expressed in mammalian cells. J Biol Chem, 1988; 263: 6352.
47. Thompson AR. Structure and function of the factor VIII gene and protein. Semin Thromb Hemost,
2003; 29(1): 11-22.
48. Krishnan S, Kolbe HVJ, Lepage P, Faure T, Sauerwald R, de la Salle H, Muller C, Bihoreau
N, Paolantonacci P, Roitsch C, Meulien P, Pavirani A. Thrombin cleavage analysis of a novel
antihaemophilic factor variant , factor VIII-II. Eur J Biol, 1991; 195: 637-644.
49. Pittman DD, Alderman ED, Tomkinson KN. Biochemical, immunological and in vivo
functional characterization of B-domain-deleted factor VIII. Blood, 1993; 81: 2925-2935.
50. Eaton D, Rodriguez H, Vehar GA. Proteolytic processing of human factor VIII: correlation of
specific cleavages by thrombin , factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation
of factor VIII coagulant activity. Biochemistry, 1986; 25: 505-512.
51. Foster PA, Fulcher CA, Houghten RA, Zimmerman TS. An immunogenic region within
residues Val1670-Glu1684 of the factor VIII ligth chain induces antibadies which inhibit binding of
factor VIII to von Willebrand factor. J Biol Chem, 1988; 263: 5230-5234.
52. Leyte A, van Schijndel HB, Niehrs C. Sulfation of Tyr1680 of human blod coagulation factor
VIII is essantial for the interaction of factor VIII with von Willebrand factor. J Biol Chem, 1991;
266: 740-746.
53. Pittman DD, Marquette KA, Kaufman RJ. Role of the B domain for factor VIII expression and
function. Blood, 1994; 84: 4214-4225.
54. Kane WH, Davie EW. Cloning of a cDNA coding for human factor V, a blood coagulation factor
homologous to FVIII and ceruloplasmin. Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83: 6800-6804.
55. Kane WH, Davie EW. Blood coagulation factor V and factor VIII, structural and functional
similarities and their relationship to hemorrhagic and thrombotic disorders. Blood, 1988; 71: 539555.
56. Kazazian HH Jr, Tuddenham EGD, Antonarakis SE. Haemophilia A: Deficiency of
Coagulation Factor VIII. In: Hedner U, Davie EW. Eds. The Metabolic and Molecular Basis of
7nherited Diseases. 6 th Ed., USA: Mc Graw Hill, 1989; 4367-4392.
57. Spiegel PC, Jacquemin M, Saint-Remy J-MR, Stoddard BL, Pratt KP. Structure of factor VIII
C2 domain-immunoglobulin G4K Fab komlex: identification of an inhibitory antibady epitope on
the surface of factor VIII. Blood, 2001; 98: 13-19.
53
58. Nogami K, Shima M, Hosokawa K, Nagata M, Koide T, Saenko EL, Tanaka I, Shibata M,
Yoshioka A. The factor VIII C2 domain contains the thrombin binding site responsible thrombincatalyzed cleavage at Arg 1689. J Biol Chem, 2000; 275: 25774-25780.
59. Nogami K, Shima M, Hosokawa K,Suzuki T, Koide T, Saenko EL, Scandella D, Shibata M,
Kamishe S, Tanaka I, Yoshioka A. Role of the factor C2 domain in factor VIII binding to factor
Xa. J Biol Chem, 1999; 274: 31000-31007.
60. Saenko EL, Scandella D. The acidic region of the factor VIII light chain and the C2 domain
together form the high affinity binding site for von Willebrand factor. J Biol Chem, 1997; 272:
18007-18014.
61. Liu M-L, Thompson AR. Factor VIII’s C1 domain enhances C2 binding of factors IX/Ixa, X/Xa
and von Willebrand factor. Blood, 2000; 96: 489a (Abst.).
62. Wion KL, Kelly D, Summerfield JA, Tuddenham EGD, Lawn RM. Distribution of factor VIII
mRNA and antigen in human liver and other tissues. Nature, 1985; 317: 726-729.
63. Bhopale GM, Nanda RK. Blood coagulation factor VIII: An overview. J Biosci, 2003; 28(6): 783789.
64. Marquette KA, Pittman DD, Kaufman RJ. A 110 amino acid region within the A1-domain of
coagulation factor VIII inhibits secretion from mammalian cells. J Biol Chem, 1995; 270: 1029710303.
65. Fay PJ, Haidaris PJ, Huggins CF. Role of the COOH-terminal acidic region of A1 subunit in A2
subunit retention in human factor VIIIa. J Biol Chem, 1993; 268: 17861-17866.
66. Fay PJ, Beattie T, Huggins CF, Regan LM. Factor VIIIa A2 subunit residues 558-565 represent a
factor IXa interactive site. J Bio Chem, 1994; 269: 20522-20527.
67. Fulcher CA, Gardiner JE, Griffin JH, Zimmerman TS. Proteolytic inactivation of human
factor VIII procoagulant protein by activated human protein C and its analogy with factor V.
Blood, 1984;63:486-489.
68. Donath MJSH, Lenting PJ, van Mourik JA, Mertens K. The role of the cleavage of the light
chain at positions Arg1689 or Arg1721 in subunit interaction and activation of human blood
coagulation factor VIII. J Bio Chem, 1995; 270: 3648-3655.
69. Hultin MB, Jesty J. The activation and inactivation of human factor VIII by thrombin: effect
of inhibitors of thrombin. Blood, 1981;54:476-482.
70. Fay PJ. Subunit structure of thrombin-activated human Factor VIIIa. Biochim Biophys Acta,
1988;952:181-190.
54
71. Lollar P, Parker CG. pH-dependent Denaturation of thrombin-activated porcine factor VIII. J
Biol Chem, 1990;265:1688-1692.
72. Levinson B, Kenwrick S, Lakich D, Hammonds G Jr, Gitschier J. A transcribed gene in an
intron of the human factor VIII gene. Genomics, 1990; 7: 1-11.
73. Naylor JA, Buck D, Green P, Williamson H, Bentley D, Giannelli F. Investigation of the
human factor VIII intron 22 repeated region (int22h) and the associated inversion junctions.
Hum Mol Genet, 1995; 4: 1217.
74. Figueiredo MS, Brownlee GG. Cis-Acting elements and transcription factors involved in the
promoter activity of the human factor VIII gene. J Biol Chem, 1995; 270: 11828.
75. Goodeve AC, Peake IR. The molecular basis of hemophilia A: genotype-fenotype relationships
and inhibitor development. Semin Thromb Hemost, 2003; 29(1): 23-30.
76. Youssoufian H, Kazazian HH Jr, Phillips DG, Aronis S, Tsiftis G, Brown VA, Antonarakis
SE. Recurrent mutations in hemophilia A give evidence for CpG mutations hotspots. Nature,
1986; 324: 380.
77. Tuddenham EGD, Cooper DN, Gitschier J, Higuchi M, Hoyer L, Yoshioka A, Peake I,
Schwaab R, Olek K, Kazazian H, Lavergne J-M, Gianelli F, Antonarakis S. Hemophilia A:
Database of Nucleotide substitutions, deletions, insertions and rearragements of the factor VIII
gene. Nucleic Acids Res, 1991; 19: 4821.
78. Shima M, Ware J, Yoshioka A, Fukui H, Fulcher CA. An arginine to cysteine amino acid
substitution at a critical thrombin cleavage site in a dysfunctional factor VIII molecule. Blood,
1989; 74: 1612-1617.
79. Higuchi M, Wong C, Kochhan L, Olek K, Aronis S, Kasper CK, Kazazian HH,
Antonarakis SE. Characterization of mutations in the factor VIII gene by direct sequencing of
amplified genomic DNA. Genomics, 1990; 6: 65.
80. Jaquemin M, Lavend’homme R, Benhida A, et al. A novel cause of mild/moderate hemophilia
A: mutations scattered in the factor VIII C1 domain reduce factor VIII binding to von Willebrand
factor. Blood, 2000; 96: 958-965.
81. Aly AM, Higuchi M, Kasper CK, Kazazian HH Jr, Antonarakis SE, Hoyer LW.
Hemophilia A due to mutations that create new N-glycosylation sites. Proc Natl Acad Sci USA,
1992; 89: 4933.
82. Frischmeyer PA, Dietz HC. Nonsense-mediated mRNA decay in health and disease. Hum Mol
Genet, 1999; 8: 1893-1900.
83. Van de Water N, Williams R, Ockelford P, Browett P. A 20,7 kb deletion within the factor VIII
gene associated with LINE-1 element insertion. Thromb Haemost, 1998; 79: 938-942.
55
84. Vidal F, Farssac E, Tusell J, Puig L, Gallardo D. First molecular characterization of an unequal
homologous Alu-mediated recombination event responsible for hemophilia. Thromb Haemost,
2002; 88: 12-16.
85. Sommer SS, Scaringe WA, Hill KA. Is Alu-mediated recombination an important cause of
hemophilia?. Thromb Haemost, 2002; 88: 3-4.
86. Kazazian HH, Wong C, Youssoufian H, Scott AF, Phillips DG, Antonarakis SE. Haemophilia
A resulting from de novo insertion of L-1 sequences represents a novel mechanism for mutation in
man. Nature, 1998; 332: 164-166.
87. Sukarova E, Dimovski AJ, Tchacarova P, Petkov GH, Efremov GD. An Alu insert as the cause
of a severe form of hemophilia A. Acta Haematol, 2001; 106: 126-129.
88. Cooper DN, Krawczak M, Antonarakis SE. The Nature and Mechanisms of Human Gene
Mutation. In: Vogelstein B, Kinzler KW, Eds. The Genetic Basis of Human Cancer, New York:
McGraw Hill; 1998.
89. Tavassoli K, Eigel A, Wilke K, Pollmann H, Horst J. Molecular diagnostics of 15 hemophilia A
patients: characterization of eight novel mutations in the factor VIII gene, two of which result in
exon skipping. Hum Mutat, 1998; 12: 301-303.
90. Bagnall RD, Waseem NH, Green PM, Calvin B, Lee C, Giannelli F. Creation of a novel donor
splice site in intron 1 of the factor VIII gene leads to activation of a 191 bp cryptic exon in two
hemophilia A patients. Br J Haematol, 1999; 107: 766-771.
91. Lakich D, Kazazian HH Jr, Antonarakis SE, Gitschier J. Inversions disrupting the factor VIII
gene are a common cause of severe Hemophilia A. Nat Genet, 1993; 5: 236-241.
92. Bagnall RD, Waseem NH, Green PM, Gianelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the
factor VIII gene is a frequent cause of severe hamophilia A. Blood, 2002; 99: 168-174.
93. Naylor J, Brinke A, Hassock S, Green PM, Gianelli F. Characteristic mRNA abnormality found
in half the patients with severe haemophilia A is due to large DNA inversions. Hum Mol Genet,
1993; 2: 1773-1778.
94. Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M, Horst J, De Moerloose P, Sommer S, Ketterling HH,
Negrier C, Vinciguerra C. Factor VIII gene inversions in severe hemophilia A: results of an
international consortium study. Blood, 1995; 86: 2206-2212.
95. Chan V, Tang TM, Chan TP, Tang M, Wan CW, Chan FY, Chu YC, Chan TK. Multiple XbaI
polymorphisms for carrier detection and prenatal diagnosis of haemophilia A. Br J Haematol, 1989;
73:497-500.
96. Bowen DJ, De Brasi CD, Larripa IB, Collins PW. A new polymorphism in the human FVIII
gene : implications for linkage analysis in haemophilia A and for the evolution of int22h sequences.
56
Br J Haematol, 2000; 111; 544-8.
97. Bowen DJ. An effective route for the isolation of human genetic loci exemplified using the Bgl.I
restriction fragment length polymorphism of the factor FVIII gene. Thromb Haemost, 2000; 83:
512-13.
98. Pollak ES, High KA. Haemophilia B: Deficiency of Coagulation Factor IX. In: Hedner U, Davie
EW. Eds. The Metabolic and Molecular Basis of 7nherited Disease. 6 th Ed., USA: Mc Graw Hill,
1989; 4393-4413.
99. McKenna R. FIX. Eri3im: http:// eMedicine - Factor IX .htm Eri3im Tarihi: 19.04.2005
100. Yoshitake S, Schach BF, Foster DC, Davie EW, Kurachi K. Nucleotide sequence of the gene
for human factor IX (antihemophilic factor B). Biochemistry, 1985; 24: 3736.
101. Purrello M, Alhadeff B, Eposito D, Szabo P, Rocchi M, Truett M, Masiarz F, et al. The human
genes for hemophilia A and hemophilia B flank the X chromosome fragile X site at Xq27,3. EMBO
J, 1985; 4: 725.
102. Thompson AR. Structure, function and molecular defects of FIX. Blood, 1986; 67(3): 565-572.
103. Anson DS, Choo KH, Rees DJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA, Brownlee GG. The
gene structure of human anti-haemophilic factor IX. EMBO J, 1984; 3: 1053-60.
104. Gökmen Y. Molecular Diagnosis of Two Heritable Bleeding Disorders: Hemophilia A and
Hemophilia B. Doktora Tezi, BoCaziçi Üniversitesi, stanbul, 1993.
105. Kurachi K, Kurachi S. Regulatory mechanisms of the factor IX gene. Thromb Haemost, 1994;
73(3): 333-339.
106. Gianelli F, Green PM, Sommer SS, Poon MC, Ludwig M, Schwaab R, Reitsma PH,
Goossens M, Yoshioka A, Figueiredo MS, Brownlee GG. Hemophilia B: Database of point
mutations and short additions and deletions. 8th Ed. Nucleic Acids Res, 1998; 26: 265-268.
107. Knobloch O, Zoll B, Zerres K, Brackmann HH, Olek K, Ludwig M. Recurrent mutations in
the factor IX gene: Founder effect or repeat de novo events. Hum Genet, 1993; 92: 40-48.
108. Morgan GE, Figueiredo MS, Winship PR, Baker R, Bolton-Maggs PHB, Brownlee GG.
The high frequency of the -6G® A factor IX promoter mutation is the result of both a founder
effect and recurrent mutation at a CpG dinucleotide. Br J Hematol, 1995; 672-674.
57
109. Graham JB, Kunkel GR, Tennyson GS, Lord ST, Fowlkes DM. The Malmo polymorphism
of factor IX: Establishing the genotypes by rapid analysis of DNA. Blood, 1989; 73(8): 21042107.
110. Winship PR, Rees DJG, Alkan M. Detection of polymorphisms at CpG dinucleotides and
diagnosis of hemophilia B carriers. Lancet, 1989; 631-634.
111. Weinmann AF, Alexander PR, Thompson AR. A polymorphic MseI site to the factor IX gene
varies among ethnic groups. Hum Mol Genet, 1993; 2(4): 486.
112. Bowen DJ. Haemophilia A and B: molecular inshigts. Mol Pathol, 2002; 55: 1-18.
113. Dündar E. Koroner Arter Hastal4C4nda Genetik Risk Faktörleri ve MDA’n4n Yeri. Master Tezi,
Çukurova Üniversitesi, stanbul, 2003.
114. Ça&layan H, Gökmen Y, Altay Ç, Aktu&lu G, Gürgey A, Soysal T, Apak M, Beksaç S,
Ayd(nl( K, K(rdar B. Carrier determination and prenatal dignosis of hemophilia A by DNA
analysis in Turkish families. Tur J Med Sci, 1995; 25: 177-182.
115. Bowen DJ, Thomas P, Webb CE, Pignell P, Peake IR, Bloom AL. Facile and rapid analysis
of three DNA polymorphisms within the human factor IX gene using the polymerase chain
reaction. Br J Hematol, 1991; 77: 559-560.
116. Ça&layan SH, Gökmen Y, K(rdar B. Polymorphisms associated with the FVIII and FIX genes
in the Turkish population. Haemophilia, 1995; 1: 184-189.
117. Graham JB, Kunkel GR, Fowlkes DM, Lord ST. The utility of a HindIII polymorphism of
FVIII examined by rapid DNA analysis. Br J Hematol, 1990; 76: 1-5.
118. Ahrens P, Kruse TA, Schwartz M, Rasmussen PB, Din N. A new HindIII restriction
fragment length polymorphism in the hemophilia A locus. Hum Genet, 1987; 76: 127-128.
58
119. Bernardi F, Legnani C, Volinia S, Patracchini P, Rodorigo G, DeRosa V, Marchetti G. A
HindIII RFLP and a gene lesion in the coagulation factor VIII gene. Hum Genet, 1988; 78: 359362.
120. E&ilmez N, Gökmen Y, Bahçecio&lu H, K(rdar B. Human factor VIII HindIII RFLP:
Genotypic distribution in the Turkish population. Do2a-Tr J Med Sci., 1992; 16: 105-112.
121. Zahedmehr A, Delmaghani S, Sharifian R, Lak M, Zeinali S. The frequencies of three factor
IX-linked restriction fragment length polymorphisms in ranian patients with hemophilia B.
IJMS, 2004; 29(1): 26-30.
122. Chowdhury MR, Kabra M, Menon PS. Factor IX gene polymorphisms in Indian population.
Am J Hematol., 2001; 68: 246-248.
123. Ça&layan SH, Gökmen Y, Aktu&lu G, Gürgey A, Sommer SS. Mutations associated with
hemophilia B in Turkish patients. Hum Mutat, 1997; 10: 76-79.
124. Onay UV, Kavakl( K, K(l(nç Y, Gürgey A, Aktu&lu G, Kemahl( S, Özbek U, Ça&layan SH.
Molecular pathology of haemophilia B in Turkish patients: identification of a large deletion and
33 independent point mutations. Br J Haematol, 2003; 120: 656-659.
125. Ghandil P, Farhud DD, Zeinali S, Ghadiri A. Diagnosis of hemophilia B carriers, using TaqI
and XmnI polymorphisms of the factor IX gene in ranian individuals. Iran J Public Health,
2003; 32(3): 1-6.
126. Ghandil P, Ghadiri A, Farhud DD, Zeinali S. Allele frequencies of two polymorphisms
associated with the factor IX gene in Iranian population. Thromb Res, 2004; 113: 289-293.
59
ÖZGEÇM 1978 y4l4nda Pazarc4k’ta dünyaya gelen Duygu DÜZGÜNCE; ilk, orta ve lise
öCrenimini Gaziantep’te tamamlad4ktan sonra, 1997 y4l4nda Ç.Ü. Fen Edebiyat
Fakültesi Biyoloji Bölümü’nü kazanm43 ve buradan 2001 y4l4nda mezun olmu3tur. Ayn4
y4l Ç. Ü. SaCl4k Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Anabilim Dal4’nda Yüksek Lisans
eCitimine ba3lam43t4r. Halen Biyokimya Anabilim Dal4’nda yüksek lisans eCitimine
devam etmektedir.
60