gıda biyoteknolojisi-4

6.3.2016
• GENETİK MÜHENDİSLİĞİ TEKNİKLERİ
GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-4
1
Restriksiyon enzimleri
2
• RE hücre içine yabancı bir DNA girişine karşı bir savunma
mekanizması (virüslere karşı) oluştururlar
• Prokaryotik hücreler DNA’yı kimyasal olarak değiştirebilen bir
veya daha fazla enzim içerirler.
• Hücrede önemli rol oynamalarının yanında restriksiyon
enzimleri in vitro DNA çalışmaları için de zorunludur.
• Bu enzimlerin önemli bir sınıfı kısaca restriksiyon enzimleri
olarak bilinen restriksiyon endonükleazlardır.
• Bunların keşfi genetik mühendisliği alanının doğuşuna imkan
vermiştir.
• Bu sistemler prokaryotlar arasında geniş yayılımlar
göstermesine karşın ökaryotlarda çok nadir olarak bulunurlar.
• 1970’lerde DNA klonlamasının gerçekleşmesi RE’inin bulunuşu
ile olmuştur.
• Restriksiyon enzimleri (RE) özel DNA dizilerini tanıyarak DNA’yı
keserler.
3
4
•
Hücre içine yabancı DNA girişine karşı savunma mekanizması iki bileşenden oluşur:
Restriksiyon -modifikasyon sistemi
•
1 Restriksiyon endonükleazlar: Kısa ve simetrik bir DNA sekansını tanırlar ve sekansın
içinden herbir ipliği spesifik bir noktadan keserler.
Dolayısıyla DNA kısa fragmentlere parçalanır.
•
2) Modifikasyon: Hücresel DNA’da aynı tanıma sekansları içindeki bir C veya A bazına metil
grubu ilave eden metilazdır.
Bu modifikasyon konak hücre DNA’sının dirençli olmasını sağlayarak endonükleazlarla
parçalanmasını önlerler.
•
•
•
•
•
•
5
Modifikasyon genleri, DNA üzerinde restriksiyon genleri ile yakın bölgede
bulunmaktadır. Bu nedenle bunlara restriksiyon modifikasyon genleri (R/M)
denilmektedir.
RE tanıdığı nükleotit dizilimlerini tanıyan metilaz enzimleri de vardır.
Metilazlar ortak tanıma dizilimlerini bir veya birkaç noktada metilasyona
uğratmaktadır (A veya C’e metil grubu eklerler).
Bu durumda, DNA metile olarak, metilaz enzimi için substrat olmaktan çıkar ve
korunmuş olur.
6
1
6.3.2016
3 tip RE vardır : Tip l, Tip ll, Tip lll
• Tip I ve Tip lll RE hem restriksiyon hem de metilasyon aktivitesine
sahiptirler. Her ikisi de DNA’yı tanıma bölgelerinin dışında bir yerden
keserler.
• ATP enerjisine ihtiyaçları vardır (tanıma bölgesinden kesim bölgesine
hareket etmek için).
• Tip l ve tip lll klonlamada kullanılmaz
• Moleküler biyolojide Tip II RE bu enzimler kullanılır. Tam
hedef nükleotitten kesim yaptıkları için klonlama ve
moleküler biyoloji araştırmaları için önemlidir.
Tip II RE sadece restriksiyon (kesme) aktivitesine sahiptirler. Modifikasyon
başka bir enzim tarafından gerçekleştirilir
• Enzimi tanıma bölgesinden keserler. Bunun için ATP enerjisine ihtiyaçları
yoktur.
• Mg+2 iyonlarına ihtiyaç duyarlar
7
Tip II RE
8
RE kesim sonucunda DNA’da oluşturdukları uçların motiflerine göre iki alt
gruba ayrılırlar
• Mg+2 iyonları varlığında çift iplikli DNA üzerindeki palindromik dizileri
tanıyan ve bu diziler içindeki özel bir bölgeden kesen homodimerik
enzimlerdir.
• Yapışkan uç oluşturacak şekilde kesim yapanlar: Kesim yapılan
bölgelerde tek iplikli çıkıntılı yapı oluşmaktadır. Bunlara yapışkan uçlar
denir. Çünkü, bunlar tek iplikli kuyruklarının baz eşleşmesi ile aynı çıkıntı
uca sahip herhangi bir uca bağlanabilir.
• Tanıma bölgeleri palindromiktir ve 4-8 nükleotit uzunluktadır
Palindromik: Eğer zincirlerden biri
soldan biri sağdan okunursa aynı
diziye sahiptir ( veya ikisi de 5’-3’
veya 3’-5’ yönünde okunursa
aynıdır)
Daha sonra bu eşleşen zincirler
ligasyonla birbirlerine bağlanabilir.
Bu nedenle klonlama
çalışmalarında bu enzimler
kullanılmaktadır.
Homodimerik: Birbirine benzer iki
polipeptit alt ünitesinden
oluşmuşlardır.
9
Küt uçlu kesim yapanlar: İki zinciri de aynı
noktadan kesenler. Bunların ligasyon
etkinlikleri düşüktür.
• Klonlamada tercih edilmezler
10
• Kesim sonunda her zaman 5’ uçları fosfat
gruplarını korur.
11
12
2
6.3.2016
Bazı RE ve tanıma dizileri
• 6 bp’lik tanıma sekansı rastgele DNA dizisinde ortalama her
4096 (46) bp’de bir oluşacaktır. Bu nedenle büyük bir DNA
molekülü bu tip bir enzimle ortalama 4 kb’lık spesifik
fragmentlere kesilebilir.
• Günümüzde 600’den özel dizi tanıyan, yaklaşık 6000 RE
bilinmektedir.
• Genetik mühendisliği bakımından büyük öneme sahip
olduklarından yeni enzimler de araştırılmaktadır.
• HindIII ilk bulunan RE (1970)
• Ticari olarak yaygın bir şekilde bulunmaktadırlar.
13
14
DNA’nın restriksiyon analizi ve
elektroforezi
RE’lerinin isimlendirilmesi
•Pek çok RE farklı noktalardan kesim yaptığından ticari olarak karışıklığı önlemek için
enzimlerin isimlenririlmesi yapılmıştır.
İlk harf Bakteri cinsinin baş harfi
2. ve 3. harfler Türün adı
4. harf suşun adı:
5. rakam enzimin izole ediliş (bulunuş)sırası
Kısaltma
Anlam
Açıklama
E
Escherichia
cins
co
coli
tür
R
RY13
suş
I
İlk tespit edilmiş
O bakteride
tespit edilme sırası
•
DNA’nın kesimi sonrasında oluşturulan fragmentler jel
elektroforezi ile birbirinden ayrıştırılabilir ve analiz
edilebilir.
•
DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün
elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır.
•
Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde
kullanılan maddenin konsantrasyonuna ve uygulanan
akıma bağlı olarak değişmektedir.
•
Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde
molekülleri birbirinden ayırmak için kullanılır.
Destekleyici madde poliakrilamid veya agaroz olabilir
•
15
16
Agaroz jel elektroforezi
•
Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentlerinin (5-500 baz çifti)
ayırımında kullanılır.
•
Bu jellerin ayırım güçü çok yüksek olduğundan boyutları birbirine yakın DNA
fragmentlerinin analizleri için daha uygundur.
•
Poliakrilamid jelleri hazırlamak zor ve uzun süre alır.
•
Uygulanacak DNA’nın yüksek konsantrasyonda olması gerektiğinden agaroz jel
elektroforezi kullanılır.
17
•
DNA’nın analizinde tüm laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan en basit
yöntemlerden bir agaroz jel elektroforezidir.
•
Yöntemin avantajı basit ve hızlı olması, ayrıca DNA fragmentlerinin birbirinden
ayrılmasını sağlamasıdır.
•
UV ışık altında floresan etki gösteren etidium bromür boyasının kullanımı ile çok
düşük konsantrasyonlarda (1-10 ng) DNA fragmentinin yerini belirlemek
mümkündür
18
3
6.3.2016
• Agaroz kırmızı bir alg türü olan agar agar dan elde edilen doğrusal bir
polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde
karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur.
DNA örneği RE ile kesilir
• Agaroz konsantrasyonu % 0.5-1.5 arasında değiştirilerek jelin por çapı
ayarlanabilir.
agaroz jelindeki kuyucuklara yerleştirilir.
Tampon çözeltisi eklenir.
• Küçük DNA fragmentleri için yüksek , büyük DNA fragmentleri için düşük
agaroz kons. kullanılarak DNA’nın jelde uygun şekilde yürümesi sağlanabilir.
RE ile kesilen DNA fragmentlerinin kontrolü boyutları
bilinen standart DNA fragmentleri (marker)
kullanılarak agaroz jel elektroforezi ile yapılır.
Markerlar baştaki ve sondaki kuyucuğa yüklenir
19
• Elektrik akımı uygulanır
•
20
• DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi
etidiyum bromürün DNA’ya bağlanarak
300 nm’de UV ışığı absorblaması
sonucu floresan etki göstermesi ile olur.
nükleik asitler jel boyunca hareket
ederler.
• Nükleik asitler negatif yüklü olduğu için
katottan anota doğru hareket eder.
• Floresan etki DNA konsantrasyonuna
bağlı olarak kuvvetli veya zayıf olabilir.
• Küçük moleküller büyük moleküllerden
daha hızlı hareket ederler.
• Böylece agaroz jel elektroforezinde DNA
fragmentleri boyutlarına göre ayrılırlar.
Etidium bromür mutajendir. Çalışırken mutlaka eldivenle çalışılmalı.
Çalışılan bölge sadece bu analiz için ayrılmalı. Analiz sonrası Etbr’ün
inaktivasyonu yapılmalı (Na hipoklorit ile)
21
• Analiz sonunda görüntülenen bantlar marker ile
karşılaştırılarak büyüklükleri belirlenir.
• Restriksiyon analizleri iki veya daha fazla DNA’nın
karşılaştırılması için kullanılır. Her organizmanın genomu farklı
olduğu için RE kesme sonucunda hepsinde farklı bantlar
oluşacaktır.
• Klonlama deneylerinde kullanılmak üzere spesifik fragmentleri
izole etmek için agaroz jeller kullanılabilir. Fragmentler jelden
kesilip çıkarılır .
22
Nükleik asit hibridizasyonu ve
Southern Blot
• Nükleik asit hibridizasyon (melezleme) yöntemleri; tek iplikli nükleik asit
moleküllerinin tamamlayıcı dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden
eşleşerek çift iplikli melez moleküller oluşturmasıdır.
• Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotit dizileri içeren tüm tek
iplikli nükleik asit molekülleri (DNA/DNA, RNA/DNA) arasında
gerçekleşebilir.
• Bu yöntem hem DNA hem RNA üzerindeki belirli nükleotit dizilerinin
tanımlanmasında kullanılır.
• Bunun için araştırılan nükleik asit dizisini tamamlayıcı olan tek iplikli (dizisi
bilinen) nükleik asit dizilerine ihtiyaç vardır. Bunlara prob denir
23
24
4
6.3.2016
• Prob: tanımlanmak istenen nükleik asit
bölgesini tamamlayıcı olan ve belirleyici olarak
kullanılan tek iplikli nükleik asit parçalarıdır.
Problar 100-1000 nükleotitlerden
oluşur.
Hibridizasyonla oluşan çift zincirli
molekülü görünür hale
getirilmesi için probları radyoaktif
veya radyoaktif olmayan bir
belirleyici ile işaretlenmesi
gerekir.
• Hibridizasyon farklı genetik materyallerden
benzer dizileri veya özel bir genin bulunduğu
yeri bulmak için oldukça faydalı olabilir.
• DNA, RE ile kesildikten sonra jel elektroforezi
ile ayrılarak DNA zincirlerini hibritleştirmek
için Southern blot tekniği kullanılır.
25
Southern blot
• Southern blot bir genomdaki spesifik genlerin
belirlenmesinde kullanılır.
• RE ile kesilen DNA fragmentlerinin agaroz jel
elektroforezinde ayrılması ve ayrılan
fragmentlerin membran filtreye aktarıldıktan
sonra DNA problarıyla eşleştirilmesine dayanır.
27
26
• 1- büyük molekül ağırlıklı DNA RE ile
fragmentlere ayrılır
• 2- Agaroz jelde boyutlarına göre ayrılır.
• 3- Jel üzerinde DNA’nın denatürasyonunu için
NaOH uygulanır
• 4. Ayrılan zincirler nitoselüloz membrana
aktarılır. Zincirler membrana fikse
edildiklerinden kendi kendileriyle yeniden
eşleşmeleri önlenir
• 5- Membrana aktarılan DNA fragmentleri
işaretlenmiş Hibridizasyon probları ile
muamele edilir
• 6- Hibridizasyondan sonra memran yıkanırak
eşleşmeyen DNA fragmentleri uzaklaştırılır.
Hibridizasyon membrana bağlanmış olan
işaret molekülünü araştırarak belirlenir
• Röntgen filmi ile görüntülenir
28
• Membrana DNA emdirilmiş ve prob olarak RNA veya DNA’nın
kullanıldığı hibridizasyon prosedürü Southern blottur
• Eğer membrana RNA emdirilmiş ve prob olarak RNA veya DNA
kullanılıyorsa buna Northern blot denir
29
• Blotlama teknikleriyle bir genomda spesifik bir
genin olup olmadığı ve bu genden kaç tane
olduğu belirlenebilir.
30
5
6.3.2016
DNA dizi analizi
• Her iki yöntemde de dizisi yapılacak olan DNA bölgesinin
fragmentlerine ihtiyaç vardır.
DNA molekülündeki bazların diziliminin belirlenmesinde
genel olarak iki yöntem vardır
• Günümüzde Dizi analizlerinin çoğu Sanger yöntemi ile yapılmaktadır.
Bu yöntem temel olarak PCR’a benzer
1) Maxam Gilbert Yöntemi (kimyasal yöntem)
2) Sanger yöntemi (Enzimatik zincir sonlandırma yöntemi)
Dizisi belirlenecek bölgeye ait primerlere ihtiyaç vardır
DNA dizi analizi ile:
• Proteinleri kodlayan gen bölgeleri belirlenebilir
• DNA tarafından kodlanan diğer RNA’ların dizileri
belirlenebilir (rRNA, tRNA)
• Bir organizmanın genomu belirlenebilir.
dNTP ‘ler (dATP, dGTP, dTTP,dCTP)
Zincir uzaması DNA polimeraz enzimi ile gerçekleştirilir.
Ayrıca dNTP’lerin dideoksi analoglarına ihtiyaç vardır
31
• Dideoksi nükleotitler (ddNTP) deoksinükleotitlerin 3’-OH
grubunun O atomunun uzaklaştırılması ile oluşturulmuş
nükleotitlerdir.
32
• ddNTP’lerin her biri farklı renklerde floresan
boyalarla işaretlenir
A –yeşil
G-siyah
C-mavi
T-kırmızı
ddNTP’ler 3’ grubunda O olmadığı için fosfodiester bağı yapamazlar. Yani bu
gruba yeni bir nükleotit eklenemez. Sentez durur. Bunlar zincir sonlandırma
amacı ile kullanılır. BU SANGER YÖNTEMİNİN TEMELİNİ OLUŞTURUR.
33
34
Analiz tüpüne
 dNTP’ler
 ddNTP’ler
 primerler
 ve DNA polimeraz eklenir
•
•
•
• Sentezleme sırasında bütün zincirler aynı nükleotit dizisi ile
başlayacak ve sentez durduğu zaman bütün zincirlerin
sonunda bir ddNTP olacaktır. Ve bu oluşan farklı uzunluktaki
dizilerin her birinden milyonlarca olacaktır.
dNTP’lerden daha az miktarlarda ddNTP
kullanılır (ddNTP/dNTP=1/300)
Reaksiyon devam ederken uygun dNTP
ve ddNTP’ler rastgele zincire eklenir.
dNTP’lerin sayısı fazla olduğu için
eklenme oranları daha fazla olacaktır
zincire ddNTP’ler geldiği zaman
reaksiyon duracaktır.
Bu şekilde milyarlarca farklı uzunlukta
DNA kopyası oluşur
• Daha sonra her sentezlenen dizinin boyutları belirlenerek
dizideki bazların yeri belirlenebilir.
35
36
6
6.3.2016
• Oluşan fragmanların boyutlarını belirlemek için reaksiyon sonrası elde
edilen ürün poliakrilamid jel içeren kapiler kolona yüklenir. Poliakrilamit
Agaroz jelden daha iyi rezolüsyona sahiptir ve 1 baz faklı dizileri ayırabilir.
Örn 400 baz ve 401 baza sahip olan diziler ayrı bant verir.
• Elektroforezde elektrik akımı uygulanarak yük farklarına göre moleküller
ayrılır. Daha kısa zincirli moleküller daha hızlı ilerlerler ve boyutlarına göre
ayrılırlar.
• Kolon çıkışında herbir ddNTP’ın oluşturduğu florosan laser dedektörde
belirlenir ve kaydedici tarafından kaydedilir ve elektrofogramlar
oluşturulur.
37
38
7