Enzim Kinetiği - OMÜ

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ
MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ LABORATUVARI II
DENEY: ENZİM KİNETİĞİ
DENEYİN AMACI
Katalaz enzimi katalizörlüğünde gerçekleşen hidrojen peroksitin parçalanma reaksiyonuna ait
Michaelis–Menten sabitlerinin ve kinetik parametrelerin hesaplanması
TEORİ
ENDÜSTRİYEL ENZİMLER VE ENZİM KİNETİĞİ
Hücrelerde oldukça önemli metabolik görevleri olan enzimler, biyokimyasal
reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir. Enzimler çeşitli amaçlarla
kullanılmak üzere gündelik ve ekonomik hayata girmiştir. Endüstrinin hemen her alanında
kullanılan
enzimler
genellikle
mikroorganizmalardan
elde
edilmektedir.
Çünkü
mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre
katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha
stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır. Enzim
teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik
değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili
alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır.
Enzimlerin mikrobiyolojik yolla üretilmesinde genellikle derin kültür tekniği ve
aerobik karıştırmalı tank tipi biyoreaktörler kullanılır. Mikroorganizmalar yardımı ile enzim
üretimi birçok faktör tarafından etkilenir. Besi ortamının kompleks kimyasal bileşimi gibi
faktörler yanında pH ve oksijen temini gibi dış faktörler de enzim üretim verimi için
önemlidir. Mikroorganizma seçimi bir başka önemli konudur. Seçilen mikroorganizma kısa
sürede yüksek verimle enzim üretebilmeli, toksik madde ve antibiyotik üretmemeli, ucuz besi
ortamında rahatlıkla çoğalabilmeli, gerek enzim üretimi sırasında gerekse izolasyon ve
saflaştırma işlemleri sırasında problem oluşturacak yan ürünler üretmemelidir. Bazı
1
endüstriyel enzimler ve kullanım alanları Tablo 1 de verilmiştir. (Dr.Halil Tosun,
Biyoteknolojide Enzimler).
Tablo 1 Yaygın kullanım alanı olan bazı endüstriyel enzimler
Enzim
Kullanım alanı
Mikroorganizma
α-amilaz
Maltoz ve dekstrinin parçalanması, leke çıkarıcı, unun
Bacillus subtilis
kalitesinin arttırılması, glikoz şurubu üretimi
Aspergillus oryzae; B.licheneformis
Katalaz
İçeceklerin bozulmasının önlenmesi
A.niger
Glikoz izomeraz
GlikozFruktoz dönüşümü
Aspergillus spp.;Streptomycetes spp.
Glikoz oksidaz
Biyosensör
A.niger
Laktaz
Laktoz → Glukoz+Galaktoz
Kluyveromyces laktis
Proteaz
Deterjan katkı maddesi, deri endüstrisi
B.subtilis
Lipaz
Deterjan endüstrisi, yağların parçalanması
A.oryzae
Enzimlerin katalizör olarak kullanılması oldukça yaygındır. Bununla birlikte enzimin
ticari olarak kullanımının yaygınlaşmasında en önemli engel enzimin çalıştığı oldukça
spesifik koşullarının sağlanmasının zorluğudur. Enzimden en uygun koşullarda
yararlanmak ve ürün seçiciliğini arttırmak için enzimin çalışma koşullarının optimize
edilmesi zorunludur. Seçicilik sıcaklık, pH ve ortamda bulunan diğer maddelerin
miktarlarından oldukça etkilenir.
Bu problemin önüne geçmek için diğer bir yol mikroorganizmaları içerisinde
eşzamanlı olarak birçok reaksiyonun aynı anda gerçekleştiği birer mikrofabrika gibi
kullanmaktadır. Bu şekilde kullanım daha ekonomik olsa da reaktantların hücre içerisine,
ürünlerin de hücre dışına kütle transferinde sınırlamalar prosesi yavaşlatmaktadır. Ayrıca
hücre içerisinde bulunan diğer enzimler farklı dönüşüm reaksiyonları ile reaktantları farklı
ürünlere çevirebilir ve istenilen ürün miktarında azalma gözlenebilir. Fakat uygun şartların
sağlanması ile bu yöntem enzimin izole edilip kullanılmasından daha ekonomiktir.
Ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae) mikroorganizmalar arasında en iyi
bilinen maya türüdür. Son yıllarda bu mayanın basitliği ve çeşitli amaçlarla kullanılması
nedeniyle bu tür üzerinde biyoteknolojik araştırmalar artmıştır. S.cerevisiae yaygın şekilde
fermentasyon ve fırıncılıkta kullanılmaktadır. Arkeolojik kazılarda, S.cerevisiae nin
kullanımının MÖ 4000 yılına kadar uzandığı bulunmuştur. Maya üzerine çalışmalar var olan
kullanım alanlarında verimin arttırılmasının yanında biyolojik proseslerin anlaşılması ve
2
uygulama alanlarının geliştirilmesi açılarından da önemlidir. S.cerevisiae tüm gen haritası
çıkarılmış ilk canlıdır.
Bu deneyin kapsamında S.cerevisiae bir mikrofabrika olarak kullanılacak ve içerdiği
katalaz enziminin H2O2 parçalama kabiliyetinin H2 O2 konsantrasyonu değişimi incelenecektir.
Hidrojen peroksit canlılardaki hidroliz ve dehidroliz reaksiyonlarında küçük miktarlarda
ortaya çıkan toksik bir maddedir. Genel olarak tüm peroksitler yaşayan organizmalara zarar
verir. Bu nedenle canlılarda bu maddeye karşı savunma da kullanılan katalaz enzimi
bulunmaktadır. Katalaz enzimi hidrojen peroksitin parçalanmasında oldukça etkili bir
ezimdir. Bir molekül katalaz, saniyeler içinde 40 milyon hidrojen peroksit (H2 O2)
molekülünü su ve oksijen şeklinde parçalayabilir.
Enzimler bir katalizör olduğundan enzimatik reaksiyonlara ait kinetik parametrelerin
belirlenmesi pilot ve büyük ölçekli biyoreaktörlerin ya da tesislerin kurulması ve en uygun
şartlarda işletilmesi açısından önemlidir. Enzim kinetiği yaygın şekilde Michaelis–Menten
kinetik eşitliğine bağlı olarak hesaplanır. Michaelis–Menten kinetiği, enzim kinetiğinin en
basit ve en iyi modellerinden biridir. Alman biyokimyacı Leonor Michaelis ve Kanadalı
hekim Maud Menten'e atfen adlandırılmıştır. Basit bir enzimatik reaksiyon aşağıdaki gibi
yürümektedir.
E+SE.S→ E+P
Bu enzimatik reaksiyon modeli için enzim reaksiyon hızını betimleyen Michaelis–Menten
kinetik denklemi Eşitlik 1 deki gibidir. Bu denlemde reaksiyon hızı (V), bir substrat ([S])
konsantrasyonu cinsinden ifade edilir:
=
[ ]
(1)
[ ]
Burada, Vmax sistemden elde edilebilecek en yüksek reaksiyon hızıdır, enzimi doyurucu substrat
konsantrasyonunda bu hıza ulaşılır. Michaelis sabiti Km, reaksiyon hızının Vmax'ın yarısı olduğu
substrat konsantrasyonudur. Genelde tek substratlı biyokimyasal reaksiyonların Michaelis–Menten
kinetiğine uyduğu varsayılır.
Vmax ve Km sabitlerinin belirlenmesi için tipik yöntem, farklı substrat konsantrasyonlarında ([S]) bir
seri enzim ölçümü yapılması ve reaksiyon ilk hızının (v0) ölçülmesidir. Burada 'ilk' teriminden kasıt,
reaksiyon hızının başlangıçtan sonraki nispeten kısa bir süre içinde ölçülmesidir, bu süre zarfında
enzim-substrat kompleksinin oluşmuş olduğu ama substrat konsantrasyonun yaklaşık sabit olduğu ve
dolayısıyla denge veya kararlı hal yaklaşımının geçerli olduğu varsayılır. Reaksiyon hızını
konsantrasyona göre grafiğe geçirilince ve Michaelis-Menten denklemi ile doğrusal olmayan
regresyon yapılarak Km ve Vmax parametreleri elde edilebilir. Bununla birlikte parametrelerin
3
bulunmasında daha kesin bir yöntem lineerleştirilmiş Michaelis-Menten denklemini kullanmaktır.
Farklı lineerleştirme yöntemleri olsa da en yaygın kullanılan yöntem Eşitlik 2 de verilen Lineweaver–
Burk eşitliğidir.
=
+
∗
(2)
[ ]
DENEYDE KULLANILAN MALZEMELER
Deney düzeneği Şekil 1 deki gibi kurulacaktır. Malzemeler;

250 mL erlen

250 mL mezür

İki delikli tıpa

Şırınga

Serum hortumu

Kronometre

Magnetik karıştırıcı ve magnetik balık
Deneyde kullanılacak sarf maddeler ise aşağıdaki gibidir.

Marketlerde satılan yaş ya da kuru maya

H2O2
DİKKAT!!! H2O2 aşındırıcı, kuvvetli oksitleyici bir kimyasal olup
kesinlikle eldivensiz kullanılmamalıdır.
4
Şekil 1 Deney düzeneği
DENEYİN YAPILIŞI
Bu deneyde maya içerisinde bulunan katalaz enziminin kinetiği üzerinde çalışılacaktır. Katalaz
hidrojen peroksiti parçalayarak su ve oksijen oluşumunu sağlar.
2
⎯⎯⎯⎯ 2
+
En az beş farklı konsantrasyonda hazırlanan H2 O2 çözeltileri enzim için substrate
(besin) olarak kullanılacaktır. Deneylerde seyreltilmiş konsantrasyonlar kullanılacaktır.
Seyreltilk konsantrasyonlarda yapılan deneylerde reaksiyon çok hızlı gerçekleşmeyeceğinden
verileri toplamak daha kolay olacaktır. Ayrıca ekzotermik reaksiyonlarda düşük
konsantrasyonlarda deney yapıldığında reaksiyon ortamının sıcaklığı önemli ölçüde
değişmeyecek ve neredeyse izotermal şartlarda deney yapılmış olacaktır. Enzim kaynağı
olarak ticari olarak satılan hamur mayası kullanılacaktır. Katalaz enzimi için yaş maya
(50g/L) ya da kuru maya (12g/L) kullanılarak sulu süspansiyon hazırlanır. Erlene belirli
hacimde süspansiyon alınır. Deney düzeneği şekildeki gibi kurulur. Eklenen H2O2
konsantrasyonlarına bağlı olarak aşağıdaki Tablo 2 deki gibi tablolar hazırlanır. Oluşan gaz
hacmi kaydedilir ve ideal gaz yasası kullanılarak deney koşullarında gazın molü hesaplanır.
5
Tablo 2 Veri tabloları için örnekler.
Süre (sn)
Çıkan O2 hacmi
Çıkan O2 Konsantrasyonu
10
20
.
.
.
[S]; H2O2 kons.
[V] ; Hız
%0.5
%1.0
%1.5
%2.0
%2.5
Deney sonuçları için Tablo 2 de verilen tablolara benzer tabloların deney raporunda verilmesi
gerekmektedir. Ayrıca her hesap için bir örnek hesaplama gösterilmelidir.
6
Veriler kullanılarak Km ve Vmax değerlerinin bulunması için Şekil 2 deki sıralama izlenmelidir.
a.
b.
c.
Şekil 2 Deney verileri kullanılarak (a) O2 konsantrasyonunun zamana bağlı değişimi; (b) İlk
hızların konsantrasyonla değişimi ve Km-Vmax hesabı (c) Lineweaver–Burk grafiği ile Vmax
ve Km değerlerinin hesaplanması.
Çalışma Soruları
1. Basit bir enzimatik reaksiyon aşağıdaki gibi yürümektedir.
E+SE.S→ E+P
Bu reaksiyon için Michaelis–Menten eşitliğini türetiniz.
2. A maddesi bir enzimatik katalitiz reaksiyonu ile bozulmaktadır. Reaksiyon hız denklemi
Michaelis–Menten eşitliğine bağlı olarak aşağıdaki gibi gösterilebilir.
−
=
7
[
]
[
]
Reaksiyon bir kesikli reaktörde gerçekleştiğine göre bu reaksiyon için gerçekleşen dönüşüm (x) ve
bu dönüşüme ulaşmak için gerekeli süre (t) arasındaki eşitliği türetiniz.
Kaynaklar
1. Dr.Halil Tosun, Biyoteknolojide Enzimler
2. H.Scott Fogler; Temel Kimyasal Tepkime Mühendisliği; Çeviri, Prof.Dr. Satılmış Basan;
Bölüm 7: Enzimatik Tepkimelerin Temelleri
3. http://www.ou.edu/OpenEducation/ou-resources/biochemical-methods/lab-11/michaelismenten-derivation.pdf
8