C - Kanunum.com

C.20 DAPHNIA MAGNA ÜREME TESTİ
1.YÖNTEM
Bu üreme toksisitesi test yöntemi, OECD TG 211 (1998) yönteminin bir benzeridir.
1.1 Giriş
Testin ana amacı, kimyasalların Daphnia magna üremesinin verimliliği üzerindeki
etkisini değerlendirmektir.
1.2 Tanımlar ve birimler
Ebeveyn hayvanlar: testin başlangıcında bulunan ve üreme verimliliği çalışmasının
amacı olan dişi Daphnia’ dır.
Yavrular (döl): test sürecinde ebeveyn hayvanlar tarafından üretilen genç Daphnia lar.
Olumsuz Etki Gözlemlenen En Düşük Konsantrasyon (LOEC): üreme ve ebeveyn
hayvanların ölümleri (p<0,05’ de) üzerinde kontrol grupları ile karşılaştırıldığında
belirtilen maruz kalma periyodu içinde istatistiksel olarak önemli bir etkisi olduğu
gözlenen test edilen en düşük madde derişimdir. Fakat LOEC’ den yüksek tüm test
derişimleri LOEC’ te gözlenen zararlı etkilere eşit veya daha fazla olmalıdır. Bu iki koşul
sağlanmadığında, LOEC’ in (ve dolayısıyla NOEC) nasıl seçildiği ile ilgili tam bir
açıklama verilmelidir.
Olumsuz Etki Gözlemlenmeyen Konsantrasyon (NOEC): kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında belirtilen maruz kalma süresi içinde, istatistiksel olarak belirgin bir
etkinin (p<0,05) var olmadığı LOEC’ in hemen altındaki test derişimidir.
1240
ECx: Daphnia magna’ nın belirtilen maruz kalma süresi içerisinde üremesinde yüzde x
azalmaya sebep olan su içinde çözünmüş test maddesi derişimidir.
İçsel (kendine özgü) artış oranı: üreme verimini ve yaşlanmaya özgü ölümü
(20)(21)(22) birleştiren popülasyon büyümesinin bir ölçütüdür.
Gözlem sınırı:gözlemlenebilen fakat miktarı belirlenemeyen en düşük derişimdir.
Tayin sınırı: miktar olarak ölçülebilen en düşük derişimdir.
Ölüm oranı: bir hayvan hareketsizken ölü olarak kaydedilir, örneğin yüzemezken, veya
test kabının hafifce çalkalanmasından sonra 15 saniye içinde ilave bir hareket
gözlenmediği durumlarda (Farklı bir tanım kullanılıyorsa, referansı ile birlikte rapor
edilmelidir).
1.3 Test yönteminin ilkesi
Testin başlangıcında 24 saatten daha az yaşlı olan genç dişi Daphnia (ebeveyn hayvanlar)
suya eklenerek belirtilen derişim aralığında test maddesine maruz bırakılır. Test süresi 21
gündür. Test sonunda ebeveyn hayvan başına yaşayan üretilmiş yavruların toplam sayısı
değerlendirilir. Bu yetişkinler vasıtasıyla üretilen ve test esnasında ölen gençlerin
hesaplamalardan çıkarılması anlamına gelir. Ebeveyn hayvanların üreme verimi diğer
şekillerde ifade edilir (örneğin yavrunun gözlendiği ilk günden itibaren günde ebeveyn
hayvan başına üretilen yaşayan yavru sayısı olarak) fakat ek olarak bunlar test sonunda
yaşayan ebeveyn başına üretilen geçlerin toplam sayısı olarak rapor edilmelidir. Test
maddesine maruz kalan hayvanların üreme verimi olumsuz etkinin gözlemlendiği en
düşük konsantrasyon (LOEC) ve bundan dolayı olumsuz etkinin gözlemlenmediği
konsantrasyonu (NOEC) belirlemek için kontrol veya kontrollerle karşılaştırılmalıdır.
Ayrıca ve mümkün oldukça üreme veriminde % x azalmaya sebep olan derişimin
hesaplanması için veriler regresyon modeli kullanılarak analiz edilir. (örneğin EC 50, EC20
veya EC10).
1241
Ebeveyn hayvanların hayatta kalması ve birinci kuluçka üretim zamanı da rapor
edilmelidir. Maddelerin büyüme (örneğin uzunluk) gibi parametreler üzerindeki diğer
etkileri ve olası kendine özgü artış oranı da incelenebilir.
1.4 Test maddesi ile ilgili bilgi
Daphnia magna ile yürütülen Akut Toksisite testinin sonuçları (bakınız Yöntem C.2,
Bölüm I) mevcut olmalıdır. Bu sonuçlar üreme testlerinde uygun test derişimi
aralıklarının seçimi için faydalı olabilir. Test maddesinin suda çözünürlüğü ve buhar
basıncı bilinmeli ve test çözeltisi içindeki test maddesinin miktar tayini için geri kazanım
verimliliği ve tayin sınırı ile rapor edilmiş anlamlı bir analitik yönteminin mevcut olması
gerekir.
Yapısal formül, maddenin saflığı, ışıktaki kararlılığı, test koşulları altında kararlılığı, pKa,
Pow ve kolay biyolojik bozunabilirlik için yapılmış test (Bakınız yöntem C.4) sonuçları
gibi test maddesi hakkında bilgiler test koşullarının oluşturulmasında faydalı olabilir.
1.5 Testin geçerliliği
Testin geçerli olabilmesi için kontrol ve kontrollerde aşağıdaki yapılabilirlilik ölçütlerinin
sağlanması gerekir:
-
ebeveyn hayvanların ölümü (mortalitesi) (dişi Daphnia) test sonunda % 20’yi geçemez;
-
hayatta kalan ebeveyn hayvan başına üretilmiş hayatta olan yavruların ortalama sayısı
test sonunda ≥60 dır.
1.6 Test yönteminin tanımlanması
1.6.1 Düzenek
Test maddesi ile temas halinde olacak test kapları ve diğer cihazlar tamamen cam veya
kimyasal olarak reaksiyona girmeyen malzemeden yapılmış olmalıdır. Test kapları
normal olarak cam beherler olacaktır.
Ek olarak, aşağıdaki gereçlerin bazıları veya tamamı gereklidir;
1242
-
oksijen metre (düşük hacimli örneklerde çözünmüş oksijen miktarını ölçmek için
mikroelektrot ile ve diğer uygun donanıma sahip);
-
sıcaklık kontrolu için yeterli cihazlar;
-
pH metre;
-
su sertliğinin belirlenmesi için donanım;
-
suyun toplam organik karbon (TOC) miktarının belirlenmesi için donanım veya kimyasal
oksijen ihtiyacının (COD) belirlenmesi için donanım;
-
ışıklandırma yönetiminin kontrolu ve ışık şiddetinin ölçümü için yeterli cihazlar;
1.6.2 Test Organizması
Testte kullanılacak tür Daphnia magna Straus’ dur. Geçerlilik ölçütleri sağlayan diğer
Daphnia türlerinin kullanımı da uygundur (Daphnia türleri için geçerlilik ölçütleri
kontrollerdeki üreme verimi ile ilgilidir). Eğer diğer Daphnia türleri kullanılıyorsa bunlar
açıkça tanımlanmalı ve kullanımın haklı gerekçeleri açıkça belirtilmelidir.
Tercihen, klon genetik kopyası (genotyping) ile tanımlanmalıdır. Araştırma (1) Klon
A’nın (Fransada IRCHA kaynaklı) (3) üreme performansını yöntemde açıklanan koşullar
altında kültürlendiğinde hayatta kalan her ebeveyn başına ≥60 yavru kalite ölçütünü
sürekli olarak sağladığını göstermektedir. Fakat, Daphnia kültürlerinin testin geçerlilik
ölçütlerini sağladığı gösterilen diğer klonlarda kabul edilebilirdir.
Test başlangıcında, hayvanlar 24 saatten daha az yaşlı olmalı ve ilk yavru soyundan
olmamalıdır. Sağlıklı stoklardan türetilmiş olmalıdır (örneğin yüksek ölüm oranı,
erkeklerin baskınlığı ve ephippia, ilk yavrunun üretilmesinde gecikme, renksiz hayvanlar,
vs. gibi stres işaretleri göstermeyen). Stok hayvanları test kullanılacak koşullara benzer
kültür koşullarında korunmalıdır (ışık, sıcaklık, ortam, birim hacim başına besleme ve
hayvan). Eğer testte kullanılacak Daphnia kültür ortamı rutin olarak kullanılan Daphnia
kültüründen farklı ise, normal olarak 3 haftalık bir test öncesi alıştırma periyodu dahil
etmek ebeveyn hayvanların strese girmesini engellemek için iyi bir alıştırma olacaktır.
1243
1.6.3 Test Ortamı
Tamamıyla tanımlanmış bir ortamın testte kullanılması gerekmektedir. Karakterize
etmenin zor olduğu katkıların (örneğin deniz yosunu, toprak ekstraktı vs.) kullanımını
engelleyebilir, ve böylece laboratuarlar arası standardlaştırma imkanlarını da artırabilir.
Elendt M4 (4) ve M7 ortamı (Bakınız Ek l) bu amaç için uygun bulunmuştur. Bununla
birlikte, diğer ortamlar (örneğin (5)(6)) Daphnia kültürlerin testinin geçerlilik ölçütlerini
yerine getirme performansını sağlayanlar da uygundur.
Tanımlanmamış katkılar içeren ortam kullanılırsa, bu katkılar açıkça belirlenmeli ve
bileşim hakkındaki test raporunda gerekli bilgiler, özellikle karbon içeriğini dikkate
alarak sağlanmalıdır. Organik katkının stok’unun Toplam Organik Karbon (TOC)
ve/veya Kimyasal Oksijen İhtiyacı (COD) belirlenmesi gereklidir ve sonuç olarak test
ortamı içindeki TOC/COD’ a yapılan katkının hesabı yapılır. Ortam (örneğin deniz
yosunu (Algae) eklemeden öce) içindeki TOC düzeyleri 2 mg/l altında olması
zorunluluğu vardır.
Metal içeren test maddelerini test ederken, test ortamının test maddesinin toksisitesini
artırabilecek özelliklerinin (örneğin sertlik, şelatlaşma kapasitesi) farkına varmak
önemlidir. Bu sebeple tamamen tanımlanmış ortam arzu edilir. Fakat, şu anda, uygun
uzun vadeli Daphnia magna kültürü olarak bilinen ortamlar sadece Elendt M4 ve M7 dir.
Her iki ortamda şelatlaştırıcı ajan EDTA içerir. EDTA içermeyen M4 ve M7
ortamlarında üreme testi gerçekleştirildiğinde, çalışma (2) kadmiyumun “görünür
toksisitesinin” genel olarak daha az olduğunu göstermektedir. Bu yüzden M4 ve M7
metal içeren test maddeleri için zorunlu değildir, ve bilinen şelatlaştırıcı ajanlar içeren
diğer ortamların kullanımından da kaçınmak gerekir. Metal içeren maddeler için EDTA
içermeyen, yosun ekstraktı (8) eklenmiş ASTM tarafından belirtilen yeniden
oluşturulmuş sert tatlı su (7) gibi alternatif ortamların kullanılması tavsiye edilebilir.
ASTM tarafından belirtilen yeniden oluşturulmuş sert tatlı suyun bu bileşimi ve yosun
ekstraktı, eklenen yosun ekstraktı içindeki organik karbon içeriği yüzünden hala yumuşak
1244
şelatlaştırma etkisi göstermesine rağmen, uzun vadeli kültür ve Daphnia magna testi (2)
için uygundur.
Testin başlangıcında ve test esnasında, çözünmüş oksijen derişimi 3 mg/l’nin üzerinde
olmalıdır. pH 6-9 aralığında olmalı ve normal olarak herhangi bir testte 1,5 birimden
fazla değişmemelidir. 140 mg/l üzerindeki sertlik (CaCO3 olarak) zorunludur. Bu seviye
ve üzerindeki testler geçerlilik ölçütleriyle (9)(10) uyum içinde üreme performansı
gösterir.
1.6.4 Test çözeltileri
Çoğunlukla stok çözeltilerin seyreltilmesiyle seçilen derişimlerdeki çözeltiler hazırlanır.
Stok çözeltiler tercihen test maddesi ortamı içerisinde çözülerek hazırlanır.
Organik çözücülerin ve dağıtıcıların kullanımı uygun derişimde stok çözelti hazırlamak
için bazı durumlarda gerekli olabilir, fakat bu tip maddelerin kullanımından kaçınmak
için her türlü caba gösterilmelidir. Uygun çözcülere örnek olarak aseton, etanol,
dimetilformamid ve trietilenglikol gösterilebilir. Uygun dağıtıcılara örnek olarak
Cremophor RH4, metilselüloz %0,01 ve HCO-40 gösterilebilir. Hiçbir durumda, çözelti
içindeki test maddesi test ortamı içerisindeki çözünürlük sınırını aşmamalıdır.
Çözücüler Su içinde doğru olarak dozlanabilen stok çözeltilerinin hazırlanmasında
kullanılır. En son test ortamı içerisindeki gerekli çözücü derişiminde (örneğin ≤0,1 ml/l),
yukarıda listelenen çözücüler toksik olmayacak ve maddenin suda çözünürlüğünü
artırmayacaktır.
Dağıtıcılar doğru dozlama ve dağılıma yardımcı olabilirler. En son test ortamı
içerisindeki gerekli çözücü derişiminde (örneğin ≤0,1 ml/l), yukarıda listelenen
dağıtıcılar toksik olmayacak ve maddenin suda çözünürlüğünü artırmayacaktır.
1.7 Testin dizaynı
İşlemler test kaplarına dağıtılmalı ve test kabının takip eden tüm işlemleri rastlantısal
olacak şekilde yapılmalıdır. Bunu yaparken ortaya çıkan başarısızlıklar derişim etkisi
olarak yorumlanabilen yanılgıyla sonuçlanabilir. Özellikle, deneysel birimler işlem veya
1245
derişim sırasına göre yürütülüyorsa, o zaman bazen işlemci yorgunluğu veya diğer hatalar
gibi zamanla ilgili etkiler, yüksek derişimlerde daha büyük etkilere neden olabilir.
Ayrıca, eğer test sonuçları testin ilk ve çevresel koşullarından etkilenme eğilimindeyse,
mesela
laboratuvardaki
pozisyonu
gibi,
testin
durdurulması
göz
önünde
bulundurulmalıdır.
1.8 İşlem
1.8.1 Maruz kalma koşulları
1.8.1.1 Süre
Test süresi 21 gündür.
1.8.1.2 Yükleme
Ebeveyn hayvanlar her test kabında bir tane olacak şekilde, her test kabı içinde 50-100 ml
ortam ile tek tek korunmalıdır.
Kimyasal analiz için kullanılan tekrarların toplanmasına izin verilebilir olsa da, test
maddesi derişimini belirlemek için kullanılan analitik işlemin gerekliliklerini karşılamak,
için bazen daha büyük hacimler gerekebilir. 100 ml’den daha büyük hacimler
kullanılıyorsa, Daphnia’ ya verilen yiyecek payı, yeterli besinin varlığından emin olmak
ve kalite ölçütlerine uygunluk için artırılması gerekebilir. Akış yollu testler için, teknik
sebeplerden dolayı alternatif dizaynlar dikkate alınabilir (örneğin daha geniş hacimdeki
10 hayvanlık dört grup), fakat test dizaynındaki en küçük değişiklik rapor edilmelidir.
1.8.1.3 Hayvan sayıları
Yarı statik testler için, her test derişiminde ve kontrol serilerinde en az 10 hayvan bireysel
olarak bulunmalıdır.
1246
Akış yollu testler için, her test derişiminde 10’lu gruplar halinde dörde bölünmüş 40
hayvanın uygun olduğu gösterilmektedir (1). Daha düşük sayılardaki bir test organizması
için derişim başına eşit sayıda hayvan (örneğin her biri için 4 tekrar ile beş daphnid) ile
iki veya daha fazla tekrarlar halinde en az 20 hayvan kullanılması zorunludur. Testlerde
hayvanların gruplar halinde tutulmasına dikkat edilmelidir, eğer ebeveyn hayvanlar
ölürse, test sonunda ebeveyn hayvan başına üretilen yaşayan yavru toplam sayısı olarak
üreme veriminin ifade edilmesi mümkün olmayacaktır. Böyle durumlarda üreme verimi,
“test başında varolan ebeveyn sayısı başına üretilmiş yaşayan yavruların toplam sayısı”
olarak ifade edilebilir.
1.8.1.4 Besleme
Yarı statik testler için besleme tercihen günlük olarak yapılmalı, değilse haftada en az üç
kere (örneğin ortam değişikliklerine uygun olarak) yapılmalıdır. Bu durumdan sapmalar
(örneğin akış yollu testlerde) rapor edilmelidir.
Test esnasında ebeveyn hayvanların diyeti, tercihen aşağıdakilerden biri veya birkaçının
yaşayan deniz yosunu hücreleri olmalıdır: Chlorella sp, Selenastrum capricornutum
(şimdi Pseudokirchneriella subcapitat (11)) ve Scenedesmus subspicatus. İhtiyacı
karşılayacak diyet her ebeveyn hayvana sağlanan organik karbon (C) miktarı esasına göre
olmalıdır. Bir araştırma Daphnia magna için 0,1 ve 0,2 mg C/Daphnia/gün arasındaki
günlük yiyecek istihkakının test ölçütlerini sağlamak için gerekli olan yavru sayısına
ulaşmak için yeterli olduğunu göstermektedir. Test periyodu boyunca yiyecek miktarları
hem istikrarlı bir oranda sağlanabilir hem de daha sonra arzu edildiğinde başlangıçta veya
test esnasında ebeveyn hayvanların büyümesi dikkate alındığında artırılacak şekilde daha
düşük oranlarda da sağlanabilir. Bu durumda, günlük verilen yiyecek istihkakı, gerekli
olan 0,1 – 0,2 mg C/Daphnia/gün aralığında kalmaya devam etmelidir.
Gerekli olan günlük yem seviyesinde (örneğin karbon içeriği ölçümünün zaman alıcı
olmasından dolayı kolaylık sağlamak için) besleme yapmak için deniz yosunu hücresi
sayısı veya ışık ölçümü gibi ikame ölçümler kullanılacaksa, her laboratuar denizyosunu
kültüründeki karbon miktarının ikame ölçümü ile ilgili kendi sayısal bağıntıları gösteren
1247
çizelgesini (nomograph) hazırlamalıdır (Bakınız EK-II nomograf (sayısal bağıntıları
gösteren çizelge) hazırlanması için). Nomograflar en az yıllık olarak ve deniz yosunu
kültür koşulları değiştikçe kontrol edilmelidir. Işık absorbansının karbon miktarı için
hücre sayısına göre daha iyi bir vasi ölçüm olduğu bulunmuştur (13).
Test kaplarına transfer edilen deniz yosunu kültür ortamı hacmini en az indirmek için
Daphnia derişik deniz yosunu süspansiyonu ile beslenmelidir. Deniz yosunu derişimine,
santrifüjü takiben saf su içinde, iyonu giderilmiş su içinde veya Daphnia kültür
ortamında yeniden yapılan süspansiyon ile ulaşılır.
1.8.1.5 Işık
15-20 µE.m-2.s-1 değerini geçmeyen ışık şiddetinde 16 saatlik ışık.
1.8.1.6 Sıcaklık
Test ortamının sıcaklığı 18-22 °C aralığında olmalıdır. Fakat mümkünse hiçbir testte
sıcaklık belirtilen sınırlarda 2 °C’ tan daha fazla değişmez (örneğin 18-20, 19-21 veya 2022 °C). Sıcaklığın izlenmesi amacıyla, ek test kaplarının kullanılması uygun olabilir.
1.8.1.7 Havalandırma
Test esnasında test kapları havalandırılmamalıdır.
1.8.2 Test derişimi
Normal olarak, 3,2’yi geçmeyen ayırma faktörü ile geometrik seriler halinde düzenlenmiş
en az beş test derişimi olmalıdır ve her test derişimi için uygun sayıda tekrarlar
kullanılmalıdır (Bakınız bölüm 1.8.1.3). Eğer beş derşimden daha az derişim kullanılırsa
haklı gerekçeler belirtilmelidir. Maddeler test ortamında çözünürlük sınırlarının üzerinde
test edilmemelidir.
1248
Derişim aralığını ayarlarken aşağıdakiler akıldan çıkarılmamalıdır.
i.
Eğer amaç LOEC/NOEC’i elde etmek ise, en düşük test konsantrasyonu yeterince düşük
olmalıdır, şöyleki, o konsantrasyondaki doğurganlık kontrolden belirgin olarak daha
azdır. Eğer bu böyle değil ise test azaltılmış en düşük konsantrasyonla tekrarlanmalıdır.
ii.
Eğer amaç LOEC/NOEC’i elde etmek ise, en yüksek test konsantrasyonu yeterince
yüksek olmalıdır, şöyleki, o konsantrasyondaki doğurganlık kontrolden belirgin olarak
daha azdır. Eğer bu böyle değil ise test artırılmış en yüksek konsantrasyonla
tekrarlanmalıdır.
iii.
Üreme üzerindeki etkiler için ECx değeri hesaplanırken, uygun güvenirlik seviyesi ile
ECx değerlerini tanımlamak için yeterli derişimlerin kullanılması tavsiye edilir. Üreme
üzerindeki etkiler için EC50 değeri hesaplanırken, en yüksek test derişiminin EC50
değerinden büyük olması tavsiye edilir. Aksi takdirde, EC50’ yi hesaplamak mümkün
olmasına rağmen, EC50 için güvenirlik aralığı çok geniş olacaktır ve uygun modelin
yeterliliğinin tatmin edici şekilde değerlendirilmesi mümkün olamayacaktır.
iv.
Test derişim aralığı, tercihen yetişkinlerin hayatta kalması üzerinde belirgin bir etkisi
olan herhangi bir derişimi içermemelidir. Çünkü bu test derişiminin doğasını üreme
testinden, daha kompleks istatistiksel analizler gerektiren birleştirilmiş üreme ve ölüm
oranı testine dönüştürecektir.
Test maddesinin toksisitesi ile ilgili daha önceki bilgiler (örneğin akut testinden ve/veya
aralık bulma çalışmalarından) uygun test derişimlerinin seçilmesinde yardımcı olabilir.
Test çözeltilerinin hazırlanmasında yardımcı olarak bir çözücü veya dağıtıcı (dipersant)
kullanıldığında (Bakınız bölüm 1.6.4), test kabındaki son derişim 0,1 ml/l’ den daha fazla
olmamalı ve tüm test kaplarında aynı olmalıdır.
1.8.3 Kontroller
Bir test ortamı kontrol serisi ve hatta, eğer anlamlı ise, çözücü ve dağıtıcı içeren bir
kontrol serisi, test serisine ek olarak yürütülebilir. Bu yapıldığında çözücü ve dağıtıcı
1249
derişimi test maddesini içeren test kaplarınınkiyle aynı olmalıdır. Uygun sayıda denek
kullanılarak tekrar yapılmalıdır. (Bakınız bölüm 1.8.1.3).
Genel olarak, iyi yürüyen bir sistemde, kontrol(ler) içindeki ebeveyn hayvan başına
üretilen yaşayan yavru ortalama sayısı civarındaki değişme katsayısı ≤%25 olmalı ve
bireysel olarak ele alınan hayvanların kullanıldığı test dizaynı için bu rapor edilmelidir.
1.8.4 Test ortamının yenilenmesi
Test ortamının yenilenme sıklığı, test maddesinin kararlılığına bağlıdır, fakat yenileme
haftada en az üç kere yapılmalıdır. Eğer, ilk kararlılık testlerinden (Bakınız bölüm 1.4)
maksimum yenileme periyodu boyunca (örneğin 3gün) test maddesi derişimi kararlı
değilse (örneğin tanımlanan %80 – 120 aralığının dışında kalması veya ölçülen ilk
derişimin %80’ nin altına düşmesi) daha sık ortam yenilemesi veya akış yollu test
kullanılması düşünülmelidir.
Yarı statik testlerde ortam yenilendiği zaman, test kaplarının ikinci bir serisi hazırlanır ve
ebeveyn hayvanlar uygun çaptaki cam bir pipet yardımıyla bunlara transfer edilir.
Daphnia ile transfer edilen ortam hacmi minimuma indirilmelidir.
1.8.5 Gözlemler
Test sırasında yapılan gözlemlerin sonuçları veri kağıtlarına kaydedilmelidir (Bakınız
EK-III EK-III ve IV’ teki örnekler). Eğer başka ölçümler gerekliyse (Bakınız 1.3 ve
1.8.8) ek gözlemlere ihtiyaç duyulabilir.
1.8.6 Yavrular
Her ebeveyn hayvandan üretilen yavrular, yetişkinler için verilen besinleri tüketmelerini
engellemek için tercihen ilk yavruların görülmesinden itibaren ayrılmalı ve günlük olarak
sayılmalıdır. Bu yöntemin amacı ile ilgili olarak sadece yaşayan yavruların sayılmasına
gerek vardır, fakat başarısızlıkla sonuçlanmış yumurtaların veya ölü yavruların varlığında
bunlarda kaydedilmelidir.
1250
1.8.7 Ölüm oranı
Ebeveyn hayvanlara ait olan ölüm oranı yavruların sayıldığı zamanla aynı zamanda
tercihen günlük olarak kaydedilmelidir.
1.8.8 Diğer değişkenler
Bu yöntem prensip olarak üreme üzerindeki etkileri değerlendirmek için dizayn edilmiş
olsa da, miktarları istatistiksel analize imkan verecek biçimde yeterince belirlenmiş diğer
etkiler için de kullanılabilir. Büyüme ölçümleri şiddetle arzu edilir, çünkü yanlız üreme
ölçümünden daha kullanışlı olabilen öldürücü yan etkiler hakkında da bilgi sağlayan bir
ölçümdür; test sonunda ebeveyn hayvanların uzunluklarının ölçümü (örneğin anal
omurgayı hariç tutarak vücut uzunluğu) zorunludur. ölçülebilen ve hesaplanabilen diğer
parametreler, ilk yavrunun üretimi için geçen zamanı (ve müteakip yavrular), hayvan
başına düşen yavruların sayısı ve boyutu, iptal edilen yavruların sayısı, erkeklerin veya
ephippia varlığı ve içsel nüfus artış hızı.
1.8.9 Analitik tayinlerin ve ölçümlerin sıklığı
Oksijen derişimi, sıcaklık, sertlik ve pH değerleri, taze ve eski ortamda, kontrol veya
kontroller içinde ve en yüksek test derişimi içinde, en az haftada bir ölçülmelidir.
Test süresince, düzenli aralıklarla test maddesinin derişimi tayin edilmelidir.
Yarı statik testlerde, test maddesi derişimi, tanımlanmış derişimin (örneğin %80 – 120
aralığı içinde – Bakınız 1.4 ve 1.8.4 ) ± % 20’ si içinde kalması beklenir. Taze olarak
hazırlandığında ve testin ilk haftası içinde (örneğin taze olarak hazırlandığında ve
yenileme esnasında aynı çözeltiden alınan örnekler analiz yapılmalıdır) üzerinde bir
vesile ile yenileme işleminin gerçekleştiği bir zamanda en yüksek ve en düşük test
derişimlerinin analiz edilmesi zorunludur. Daha sonra bu tayinler en az haftalık
aralıklarla tekrar edilmelidir.
Tanımlanan derişimin ±%20’ si içinde kalması beklenmeyen test maddesi derişimlerinin
testleri için, taze olarak hazırlandığında ve yenileme zamanlarında bütün test
1251
derişimlerinin analizi gereklidir. Her ne kadar bu testler için, test maddesinin ölçülen ilk
derişimi tanımlanmış derişimin ±%20’ si içinde bulunmadığında fakat ilk derişimin
tekrarlanabilir ve kararlı olduğunu göstermek için yeterli delil sağlanabildiğinde,
kimyasal tayinler 2 ve 3 hafta içinde en yüksek ve en düşük test derişim tayinlerine
indirgenebilir. Tüm durumlarda, test maddesi derişim tayininin yenileme öncesinde,
sadece her test derişiminde bir tekrar kabında gerçekleştirilmesine gerek vardır.
Eğer bir akış yollu test kullanılıyorsa, yarı statik testler için açıklanan benzer örnekleme
yönetiminin kullanımı uygundur (fakat eski çözeltilerin ölçümü bu durumda kabul
edilemez). Fakat test derişimlerinin kararlı olarak kaldığında emin olmak için, ilk hafta
içinde örnekleme zamanı sayıların artırılması tavsiye edilebilir. Bu tiplerdeki testler
içinde, seyrelticinin ve test maddesinin akış hızı günlük olarak kontrol edilmelidir.
Test boyunca, test edilen madde derişiminin tanımlanan veya ölçülen ilk derişimin %±20’
si içinde tatmin edici derecede korunduğunu gösteren deliller varsa, o zaman sonuçlar
tanımlanan ve ölçülen ilk değerler üzerine dayandırılabilir. Eğer tanımlanan ve ölçülen
ilk derişimden sapma %±20’ den daha büyükse, sonuçlar zaman ağırlıklı ortalama
şeklinde ifade edilmelidir (Bakınız EK-V).
2. VERİLER VE RAPORLAMA
2.1 Sonuçların işlenmesi
Bu testin amacı, test maddesinin yaşayan ebeveyn hayvan başına üretilen toplam canlı
yavru sayısı üzerindeki etkisini belirlemektir. Ebeveyn hayvan başına toplam yavru sayısı
her test kabı (tekrar) için hesaplanmalıdır. Eğer herhangi bir test kabında test esnasında
ebeveyn hayvan ölürse veya erkeğe dönüşürse, o zaman bu tekrar analiz dışında tutulur.
Daha sonra analizde azaltılmış sayıdaki tekrarlar esas alınır.
Kimyasalların üreme verimi üzerindeki etkileri için LOEC ve dolayısıyla NOEC’ in
hesaplanmasında her derişim için ve toplanmış artık standard sapma için tekrarlara karşı
ortalama üreme veriminin hesaplanması gereklidir, bu varyans analizi (ANOVA)
1252
kullanılarak yapılabilir. Daha sonra her derişim için ortalama uygun çoklu karşılaştırma
metodu kullanılarak kontrol ortalaması ile karşılaştırılmalıdır. Dunnett veya Williams
testleri kullanışlı olabilir (14)(15)(16)(17). Varyans’ın homojenliğinin ANOVA
varsayımının geçerli olup olmadığı kontrol etmek gereklidir. Bunun biçimsel değer testi
yerine grafiksel olarak yapılması zorunludur (18); uygun bir alternatifte Barlett testini
uygulamaktır. eğer varsayım geçerli değilse, o zaman ANOVA veya ağırlıklandırılmış
ANOVA
gerçekleştirmeden
önce
verileri
homojenleştirilmiş
varyans
haline
dönüştürmesine önem verilmelidir. Algılanabilir etkinin boyutu ANOVA (örneğin en az
belirgin fark) kullanarak hesaplanabilir ve rapor edilebilir.
Üreme veriminde % 50 azalmaya sebep olacak olan derişimin hesaplanması için (örneğin
EC50), lojistik eğri gibi uygun bir eğri en küçük kareler yöntemi gibi istatistiksel metotlar
kullanılarak verilere uydurulmalıdır. Eğri parametrelerle ifade edilen bir hale getirilebilir,
bu sayede EC50 ve onun standart hatası doğrudan hesaplanabilir. Bu EC50 ile ilgili güven
sınırlarının hesaplanmasını büyük oranda kolaylaştırır. Farklı güvenlik seviyelerinin
tercih edilmesi için iyi sebepler bulunmadıkça, iki taraflı % 95 güven sınırları
kullanılmalıdır. Uydurma işlemi, tercihen uyum eksikliği belirtisi değerlendirmesi için bir
anlam sağlar. Bu grafiksel olarak yapılabilir veya karelerin kalıntı toplamlarının ‘uyum
eksikliği’ ve ‘saf hata bileşenleri’ halinde bölünmesiyle ve uyum eksikliği için bir
belirginlik testinin gerçekleştirilmesi ile yapılabilir. Çünkü, üretilen gençlerde yüksek
doğurganlık sağlayan işlemler, daha düşük doğurganlık sağlayan işlemlerden, daha büyük
varyans’a sahip olma eğilimindedirler. Farklı işlem gruplarında gözlenen değerlerin
ağırlıklandırılmasında, farklı varyansları yansıtmak için dikkat gösterilmelidir (Geriye
kalan bilgi için bakınız kaynak 18).
Son halka testinden elde edilen verilerin analizinde (2), diğer uygun modeller
kullanılabilir durumdayken aşağıdaki model kullanılarak lojistik eğri oluşturulmuştur.
1253
Y: Test sonunda canlı ebeveyn hayvan başına gençlerin toplam sayısı (her kap için
hesaplanmış)
x: madde derişimi
c: x = 0 olduğunda gençlerin tahmini sayısı
x0: popülasyondaki EC50
b: eğim parametresi
Bu model farklı durumlar için yeterli görülmektedir, fakat bu modelin uygun olmayacağı
testlerde olacaktır. Yukarıda önerilen modelin geçerliliği için kontrol yapılmalıdır. Bazı
durumlarda, düşük derişimlerde geliştirilmiş etki yaratan hormesis modelinin
kullanılması uygun olabilir (19).
Diğer etki derişimleri,EC50 hesaplamasında kullanılan modelin farklı parametreler
halinde ifade edilerek kullanılması tercih edilmesine rağmen örneğin EC10 veya EC20
değerleri de hesaplanabilir.
2.2 Test raporu
Test raporu aşağıdakileri içermelidir.
2.2.1 Test maddesi:
- Fiziksel doğası ve ilgili fizikokimyasal özellikler;
- saflığı da içeren kimyasal tanımlama verileri;
2.2.2. Test türleri :
- klon (genetik olarak yazılı olsa da) , tedarikçi veya kaynak (biliniyorsa) ve
1254
kültür koşulları kullanılır.Daphnia magna’dan farklı bir tür kullanılırsa, bu
raporlanmalı ve gerekçelendirilmelidir.
2.2.3 Test koşulları:
-
kullanılan işlem (örneğin; yarı statik veya akış yollu, hacim, litre başına yüklenen
Daphnia sayısı);
-
ışığa maruz kalma zamanı ve ışık şiddeti;
-
test dizaynı (örneğin; tekrar sayıları, tekrar başına ebeveyn sayısı);
-
kullanılan kültür ortamının detayları;
-
eğer kullanılıyorsa, eklenen organik madde ve kompozisyonu, kaynağı, hazırlama
yöntemi, stokların TOC/COD değerleri, test ortamında sonuçlanan TOC/COD’ un
hesaplaması;
-
miktarı (mg C/Daphnia/gün şeklinde), besleme planını (örneğin; yiyecek tiplerini, deniz
yosununun spesifik ismini ve eğer biliniyorsa, ırk ve kültür koşulları), içeren, besleme ile
ilgili ayrıntılı bilgi;
-
stok
çözeltilerini
hazırlamada
kullanılan
yöntem
ve
yenileme
sıklığı
(eğer
kullanılıyorlarsa, çözücü ve dağıtıcı ve derişimleri verilmelidir).
2.2.4 Sonuçlar:
-
test maddesinin kararlığı ile ilgili herhangi bir ön çalışmanın sonuçları;
-
tanımlanan test derişimi ve test kapları içindeki test maddesinin derişimini belirlemek
için yapılan tüm analizlerin sonuçları (Bakınız EK-IV içindeki örnek veri kağıtları);
yöntemin geri kazanım etkinliği ve tayin sınırı da rapor edilmelidir.
-
test kapları içerisindeki su kalitesi (örneğin pH, sıcaklık ve çözünmüş oksijen derişimi
TOC ve/veya COD ve gerekli olduğunda sertlik) (EK-III’ teki örnek veri kağıdına
bakınız);
-
her ebeveyn hayvan tarafından yaşatılan canlı yavruların tam kaydı (EK-III, EK-III’ teki
örnek veri kağıdına bakınız);
-
ebeveyn hayvanlara ait ölü sayıları ve ölümün gerçekleştiği gün (EK-III, EK-III’ teki
örnek veri kağıdına bakınız);
1255
-
kontrol doğurganlığı için varyasyon katsayısı (test sonundaki canlı ebeveyn hayvan
başına toplam canlı yavru sayısı esasına göre);
-
test sonundaki ebeveyn hayvan başına toplam canlı yavru ağırlığına (gram) karşı gelen
test maddesi derişiminin grafiği;
-
üreme için en düşük etki gözlenen derişim (LOEC) uygulanan istatistiksel prosedürlerin
açıklaması ile birlikte ve hangi boyuttaki etkilerin algılanabileceğinin belirtileri ve üreme
için etki gözlenmeyen derişim (NOEC); uygun olduğunda, ebeveyn hayvanların ölüm
oranları için LOEC/NOEC de rapor edilmelidir.
-
uygun olduğunda, üreme ve güven aralıkları için ECx ve hesaplaması için kullanılan bir
uydurulmuş model grafiği, doz-tepki eğrisinin eğimi ve onu standart hatası;
-
gözlenen diğer biyolojik etkiler veya ölçümler: diğer herhangi bir biyolojik etki
gözlendiğinde ve ölçüldüğünde (örneğin ebeveyn hayvanların büyümesi) haklı
gerekçeleri de içerecek şekilde rapor edin;
-
test yönteminden herhangi bir sapmanın açıklaması.
3. KAYNAKLAR
1)
OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot
Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
2)
OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment
No.6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
3)
Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and Calow P. (1991). A
comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia
magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257 -265.
4)
Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to
antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
5)
EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving
Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I.
Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
6)
Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard
medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. ,47, 775-782.
1256
7)
ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes,
Macroinvertebrat es and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and
Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
8)
Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley M.C. and Calow P. (1989).
The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests;
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on
Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144148.
9)
Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity
test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1-8.
10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water
quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185 -196.
11) Korshikov (1990 ). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36,
209.
12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile
production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058.
13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total
organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol.,
128, 459-466.
14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several
treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20,
482-491.
16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose
levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control.
Biometrics, 28, 510-531.
18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley,
N.Y.
19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is
stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer
Associates Inc. Publishers.
1257
21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in
Population Biology, New York, p 532.
22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. (1986). Estimating
uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67,
1156-1166.
1258
EK-I
Tamamen tanımlanmış elendt m7 ve m4 ortamlarının hazırlanması
Elendt M7 ve M4 ortamlarına alıştırma
Bazı laboratuarlar Daphnia’ nın M4 (1) ve M7 ortamına doğrudan transferinin zorluğu
konusunda tecrübelidirler. Fakat, dereceli alıştırma ile bazı başarılar elde edilir, örneğin
sahip olunan ortamı %30’ luk Elendt ortamına hareket ettirerek, daha sonra % 60 Elendt
ve daha sonra %100 Elendt ortamına hareket ettirerek. Alıştırma periyodunun bir ay
boyunca devam ettirilmesi gerekebilir.
Hazırlama
Eser elementler
İlk önce her eser elementin uygun saflıkta su içinde kendi stok çözeltileri (I) hazırlanır,
örneğin iyonu giderilmiş, damıtılmış ve ters ozmoz yapılmış su ile. Bu stok
çözeltilerinden (I) bütün eser elementleri içeren ikinci bir stok çözeltiler hazırlanır (II)
(birleştirilmiş çözelti), örnek olarak:
1259
Stok çözeltiler I
(tek madde)
H3BO3
MnCl2
H2O
LiCl
RbCl
SrCl2
H2O
NaBr
Na2MoO4
2H2O
CuCl2
H2O
ZnCl2
CoCl2
H2O
KI
Na2SeO3
NH4VO3
Na2EDTA
H2O
FeSO4
H2O
* 4
* 6
*
* 2
* 6
* 2
* 7
Suya eklenen
miktar
mg/l
Derişim (M4
ortamına bağlı
olarak)
Birleşik stok çözelti II’ yi
hazırlamak için aşağıdaki
miktarları stok çözelti I’den
suya ekleyin
kat
ml/l
57 190
20 000
M4
1.0
M7
0.25
7 210
20 000
1.0
0.25
6 120
1 420
20 000
20 000
1.0
1.0
0.25
0.25
3 040
20 000
1.0
0.25
320
20 000
1.0
0.25
1 260
20 000
1.0
0.25
335
20 000
1.0
0.25
260
20 000
1.0
0.25
200
20 000
1.0
0.25
65
43.8
11.5
20 000
20 000
20 000
1.0
1.0
1.0
0.25
0.25
0.25
5 000
2 000
-
-
1 991
2 000
-
-
Ya Na2EDTA ya da FeSO4 çözeltileri teker teker hazırlanır, beraber dökülür ve hemen otoklavlama
yapılır. Bu aşağıdakini verir
21
FeEDTA
çözeltisi
1000-kat
20.0
5.0
M4 ve M7 ortamı
M4 ve M7 ortamı stok çözelti II kullanarak hazırlanır, makro-besinler ve vitaminler
aşağıdaki gibidir:
1260
Suya
eklenen
miktar
mg/l
Stok çözelti II
birleştirilmiş eser
elementler
Derişim (M4
ortamına bağlı
olarak)
Ortamı hazırlamak için eklenen
stok çözelti miktarı
ml/l
kat
M4
M7
20
50
50
Makro-besin stok çözeltisi
(tek madde)
CaCl2 * 2 H2O
293 800
1 000
1.0
1.0
MgSO4 * 7 H2O
246 600
2 000
0.5
0.5
KCl
58 000
10 000
0.1
0.1
NaHCO3
64 800
1 000
1.0
1.0
Na2SiO3 * 9 H2O
50 000
5 000
0.2
0.2
NaNO3
2 740
10 000
0.1
0.1
KH2PO4
1 430
10 000
0.1
0.1
K2HPO4
1 840
10 000
0.1
0.1
_
10 000
0.1
0.1
Birleştirilmiş Vitamin
stok’u
Birleştirilmiş Vitamin çözeltisi, aşağıda gösterildiği gibi 3 vitamin 1 litre suya eklenerek hazırlanır:
Tiamin hidroklorür
750
Siyanokobalamin (B12)
Biotin
10 000
_
_
10
10 000
_
_
7.5
10 000
_
_
1261
Birleştirilmiş vitamin stok çözeltisi küçük miktarlar halinde donmuş olarak depolanır.
Vitaminler kullanmadan önce ortama kısa eklenir.
NOT 1. Tam bir ortam hazırlarken tuzların çökmesinden kaçınmak için, stok
çözeltisinden 500-800 ml iyonu giderilmiş su içine küçük miktarlar ekle ve 1litreye
tamamla.
NOT 2. M4 ortamının ilk yayını Elendt, B.P. (1990) de bulunabilir. Selenium deficiency
in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus.
Protoplasma, 154, 25-33. içerisinde bulunabilir.
1262
EK-II
Toplam organik karbon analizi ve deniz yosunu besinlerindeki toc içeriği için bir
nomograf üretimi
Deniz yosunu besinlerindeki karbon içeriğinin normal olarak doğrudan ölçülemeyeceği
fark edilmiştir, fakat korelasyondan (örneğin nomograf) deniz yosunu hücresi sayısı veya
ışık absorbansı gibi vasi ölçümlerle gerçekleştirilebilir.
TOC UV metodu ve persülfat yöntemi yerine yüksek sıcaklık yükseltgenmesi ile
ölçülebilir. (Bakınız: The Instrumental Det ermination of Total Organic Carbon, Total
Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn,
London WC1V 6HB).
Nomograf üretimi için, deniz yosunu büyüme ortamından santrifüjleme ve takiben
damıtılmış su içindeki yeniden süspansiyonlaşma ile ayırılır. Vasi parametreyi ve her
örnekteki TOC derişimini üçlü tekrar halinde ölçün. Damıtılmış su kör örnekleri ve deniz
yosunu TOC derişimlerinden çıkarılmış TOC derişimleri analiz edilmelidir.
Gerekli olan karbon derişimleri boyunca nomograf doğrusal olmalıdır. Örnekler aşağıda
verilmiştir.
N.B. Bunlar dönüştürmeler için kullanılmamalıdır; her laboratuarın kendi nomografını
hazırlaması gereklidir.
1263
1264
1265
EK-III
Ortam yenilemesinde veri kayıt formu örneği, fiziksel/kimyasal izleme verileri, besleme,
daphnıa üremesi ve yetişkin ölüm oranı
* deney için hangi kabın kullanıldığını belirtir
‡ herhangi bir yetişkin hayvanın ölüm oranını ‘M’ olarak ilgili kutucuğa kaydet
† İptal edilen yavruları ‘AB’ olarak ilgili kutulara kaydet
Deney
Verilerin
No:
Başlangıcı:
Gün
0 1 2
3
4
Ortam
yenileme
(tik)
Klon:
Ortam:
5
8
6 7
9
BesinTipi:
10 11
12
Test
Tanımlanmış
Maddesi:
Derişimler:
13 14 15 16 17 18 19 20 21
yeni
eski
yeni
eski
yeni
eski
PH*
O2 mg/l*
Sıcaklık
(°C)*
Sağlanan
yiyecek
(tik)
Canlı
yavru
sayısı †
Kap 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Toplam
Toplam
Toplam
yetişkin
ölüm oranı
‡
1266
EK-IV
Kimyasal analiz sonuçlarının kaydı için örnek veri kağıdı
(A) Ölçülen derişimler
Tanımlanmış
Derişimler
1. Hafta Örneği
2. Hafta Örneği
3. Hafta Örneği
Taze
Taze
Taze
Eski
Eski
Eski
(B) Tanımlanan derişimin yüzdesi olarak ölçülen derişimler
Tanımlanmış
Derişimler
1. Hafta Örneği
2. Hafta Örneği
3. Hafta Örneği
Taze
Taze
Taze
Eski
Eski
Eski
1267
EK-V
Bir zaman-ağırlıklandırılmış ortalamanın hesaplanması
Zaman-ağırlıklandırılmış ortalama
Verilen test maddesi derişimi ortam yenilemeleri arısındaki periyot boyunca azalabilir,
ebeveyn Daphnia tarafından maruz kalınan derişim aralığındaki hangi derişimin temsili
olarak seçileceğine karar vermek için gereklidir. Seçim istatistiksel olanlar kadar
biyolojik sebepler de esas alınarak yapılmalıdır. Örneğin, eğer üreme maruz kalınan pik
derişiminden daha çok etkilendiği düşünülüyorsa, o zaman maksimum derişim
kullanılmalıdır. Fakat, toksik maddenin birikmiş veya daha uzun süreli etkileri daha
önemli olarak dikkate alınmalıdır,
o zaman ortalama derişim daha anlamlıdır. Bu
durumda, kullanmak için uygun bir ortalama zaman-ağırlıklandırılmış ortalama
derişimdir, çünkü bu süre boyunca derişimdeki anlık değişimleri dikkate alır.
Günler
Şekil 1: Zaman-ağırlıklandırılmış ortalama örneği
1268
Şekil 1, Gün 1, 2 ve 4’ te ortam yenilemeleri ile 7 gün süren bir testi örnek olarak
(basitleştiriliş) gösterir.

İnce zig zag çizgisi zaman içindeki herhangi bir noktadaki derişimi gösterir.
Derişimdeki düşmeden bir üssel bozunma işleminin geleceğine hükmedilir.

6 adet
çizilen nokta yenilenme periyodunun başında ve sonunda ölçülmüş
gözlenen derişimleri gösterir.

Kalın düz çizgi zaman-ağırlıklandırılmış ortalamanın yerini belirtir.
Zaman-ağırlıklandırılmış ortalama hesaplanır. Bu yüzden zaman-ağırlıklandırılmış
ortalama altında kalan alan ile derişim eğrisi altında kalan birbirine eşittir. Yukarıdaki
örnek için hesaplama Tablo1’ de gösterilmiştir.
Tablo 1: Zaman-ağırlıklandırılmış ortalamanın hesaplanması
Yenileme
No
1
2
3
Günler
2
2
3
Derişim 0
10.000
11.000
10.000
Derişim1
4.493
6.037
4.066
Ln(Derişim
0)
2.303
2.398
2.303
Toplam Gün : 7
Ln(Derişim 1)
Alan
1.503
13.767
1.798
16.544
1.403
19781
Toplam Alan 50.091
TW Ortalaması 7.156
Günler yenileme periyodu içindeki gün sayısıdır.
Derişim 0 her yenileme periyodu başlangıcında ölçülen derişimdir.
Derişim 1 her yenileme periyodu sonundaki ölçülen derişimdir.
Ln(Derişim 0) Derişim 0’ın doğal logaritmasıdır.
Ln(Derişi 1) Derişim 1’in doğal logaritmasıdır.
Alan her yenileme periyodu için üssel eğrinin altında kalan alandır. Şu şekilde hesaplanır:
Zaman-ağırlıklandırılmış ortalama (TW Ortalaması) Toplam gün tarafından ayrılmış
Toplam alandır.
1269
Tabiiki, Daphnia üreme testi için tablo 21 günü kapsayacak şekilde genişletilmelidir.
Her yenilenme periyodunun başında ve sonunda gözlemler yapıldığında gerçekte üssel
olan bozunma işlemini doğrulamak mümkün değildir. Farklı eğriler, farklı alan
hesaplamaları ile sonuçlanacaktır. Fakat, üssel bozunma işlemi makul olan diğer
bilgilerin yokluğunda kullanmak için belki de en iyi eğridir.
Fakat, yenileme periyodu sonunda herhangi bir maddeyi bulmak için yapılan kimyasal
analiz başarısız olursa dikkatli çalışma gereklidir. Maddenin çözelti içinde nasıl hızlı bir
şekilde gözden kaybolduğunu hesaplamak mümkün olmadıkça, eğri altındaki gerçekçi
alanı elde etmek imkansızdır ve dolayısıyla makul zaman-ağırlıklandırılmış ortalama elde
etmek de imkansızdır.
1270