Tanısal moleküler biyolojik yöntemlerin temel prensipleri ve klinik

TANISAL MOLEKÜLER
BİYOLOJİK YÖNTEMLERİN
TEMEL PRENSİPLERİ VE KLİNİK
ÖNEMİ
Dr.Hüsnü PULLUKÇU
• Plazmit analizi
• Polimeraz zincir reaksiyonu
• DNA dizi analizi • Ligaz zincir reaksiyonu
• Ribotipleme
• MTD
• HBV DNA hibridizasyon
• HPV DNA ve tiplendirme
MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLER
•
•
•
•
•
•
HIZLI
DUYARLI
TANI KOYDURUCU
PAHALI
LABORATUVAR DONANIMI
DENEYİMLİ PERSONEL
TEMEL BASAMAKLAR
I.
HİBRİDİZASYON TEKNİĞİ
II.
AMPLİFİKASYON TEKNİĞİ
HİBRİDİZASYON
• Klinik örnekte bulunan etkenin genomik yapısının
ayrıştırılarak kendisine uygun nükleik asit probu ile
bağlanması
NÜKLEİK ASİT PROBLARI
• Aranan etkenin genomik yapılarına özgül ve duyarlı
• DNA yada RNA hedeflerle hibridizasyon
• Yüksek spesifiklikle hedef nükleik asite
komplementer bağlanma
• 20-1000’lerce baz çift uzunluğu
• Oligonükleotitler 50 baz çiftten kısa
hedef moleküllere daha hızlı bağlanma
HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİ
Katı fazlı hibridizasyon
Dot blot
Southern blot
Northern blot
II. Sıvı fazlı hibridizasyon
III. İn-situ hibridizasyon
I.
İNSİTU HİBRİDİZASYON-1
İNSİTU HİBRİDİZASYON-2
İNSİTU HİBRİDİZASYON-3
AMPLİFİKASYON TEKNİKLERİ
 Prob amplifikasyonu
QB replikaz
Ligaz zincir reaksiyonu
 Sinyal amplifikasyonu
branched-DNA (Dallanmış problar)
Diğer (enzim, radyoizotop, florokrom boya arttırımı)
 Hedef nükleik asitin çoğaltılması
PZR (polimeraz zincir reaksiyonu)
TMA (transkripsiyon aracılı çoğaltma)
SDA (İplikçik uzaklaştırarak çoğaltma)
PROB ÇOĞALTILMASI
• Testin temel basamağı ortama eklenen
probların çoğaltılması
• QB replikaz
• LZR (Ligaz zincir reaksiyonu)
QB REPLİKAZ
LİGAZ ZİNCİR REAKSİYONU
SİNYALLERİN ÇOĞALTILMASI
• Hedef nükleik asite bağlanmış olan enzim,
florokrom boya, radyoizotop gibi işaretlerin
çoğaltılması
• Fazla sayıda enzim, fazla sayıda prob
• İkinci sıra enzim ve prob
• Dallanmış DNA (branched DNA)
• HBV-DNA hibridizasyon
DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-1
DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-2
DALLANMIŞ PROB (b-DNA)-3
HBV DNA HİBRİDİZASYON TESTİ-1
HBV DNA HİBRİDİZASYON TESTİ-2
HEDEF NÜKLEİK ASİTLERİN
ÇOĞALTILMASI
• Örnekte az sayıda bulunan mikroorganizmalara ait
nükleik asitlerin saptanması
• Kantitatif olarak uygulamak mümkün
• PZR ( Polimeraz zincir reaksiyonu)
• MTD ( M.tuberculosis Direkt Test)
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
TMA (Transkripsiyon Aracılı amplifikasyon)
SORUNLAR
• Nükleik asit kontaminasyonu
• İnhibitör maddeler
• Standardizasyon yok
• Yüksek maliyet
• Yanlış tetkik istemleri