S17. Legionella Pneumophillia`yı Tür Düzeyinde Algılayan

Legionella Pneumophillia’yı Tür Düzeyinde Algılayan
Biyosensör Escherichia Coli Hücrelerinin Oluşturulması
Başak Alan, Özgür Ozan Ceylan, Cansu Çelik, Berkhan Genç,
Sevecen Kaplan, Süleyman Mert Yiğitbaşı
Danışman: Prof. Dr. Feride İffet Şahin
ÖZET
Dönem III Çalışma Grubu ile yürütülmekte olan çalışmamızda, genetik
mühendisliği yöntemlerini kullanarak Legionella pneumophila’yı özgül
olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap vererek bazı
Stafilokok suşlarının salgıladığı anti-Legionella peptidini üretebilen E. coli
hücrelerinin
oluşturulması
hedeflenmiştir.
2012
yılında
itibaren
“Baskent_Meds” ismiyle çalışan takımımız International Genetically
Engineered Machine (iGEM) yarışmasına katılmayı amaçlamaktadır. Bu
kapsamda çalışma grubumuz 2013 Ekim-Kasım aylarında düzenlenecek
olan yarışmaya katılmak için kayıt yaptırmıştır. Bu yarışmada amaç,
organizasyon tarafından temin edilen “biobrick” adı verilen parçalar
kullanılarak fonksiyonel üniteler geliştirmektedir.
Anahtar kelimeler: Legionella quarum sensing, BioBrick, biyosensör,
anti-Legionella peptidi
GİRİŞ
Legionella bakterileri gram negatif patojen mikroorganizmalardır. Su
depolama tankları, havuzlar, klimalar gibi sistemler bu bakterinin
çoğalması için elverişli ortamlardır (3,10). Elliye yakın çeşidi tespit edilmiş
olup, L.pneumophilla, Legionella kökenli tüm enfeksiyonların yaklaşık
%90’ına kaynaklık etmektedir. Virulans faktörünü insanda intrasellüler
yaşam sürdürdüğü akciğer alveolar hücrelerinde göstermektedir (13).
Bakterilerin bulunduğu ortamda popülasyon yoğunluğunun düşük veya
yüksek olduğunun ayırt edilebilmesi türlere özel sinyal moleküllerinin
algılanması ile mümkün olmaktadır. Böylelikle hücre sayısındaki değişikliğe
cevap olarak gen ekspresyonu, simbiyozis, virülans, antibiyotik üretimi ve
biyofilm
oluşumunun
popülasyon
düzeyinde
kontrolü
düzenlenebilmektedir.
Bu olay “Quorum Sensing” olarak ifade
edilmektedir (6, 14, 15). Legionella pneumophila ve Vibrio cholera
türlerinin quorum sensing molekülleri α-hidrosilketon türleridir (18). L.
pneumophila’da lqsA (autoinducer synthase), lqsR (response regulator) ve
lqsS (sensor kinase) genlerinden oluşan lqs (legionalla quorum sensing)
gen kümesi quorum sensing mekanizmasından sorumludur (15-19).
Neden olduğu ölümlerin çoğu, kolay tespit edilememesi ya da belirtilerinin
Klebsiella pneumoniae belirtileri ile karıştırılmasından kaynaklanmaktadır
(13). L. pneumophila lqs algılama sisteminin bazı gen bileşenlerinin başka
bir bakteriye aktarılması ile L. pneumophila’yı tür düzeyinde özgül olarak
algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap verebilen hücreler
oluşturmak mümkündür.
GEREÇ VE YÖNTEM:
Kullanılan Besiyerleri
SOC medium
Luria Broth Agar-Ampisillin (50-100 µg/mL)
Luria Broth Agar-Kanamisin (50 µg/mL)
Luria Broth Agar- Ampisillin (50 µg/mL) + kanamisinin (50 µg/mL) (8)
DH5α ve XL1-Blue E.coli suşlarından CaCl2 çöktürme yöntemi ile
kompetan (alıcı uyumlu) hücre eldesi: Bir gece katı besiyerinde (Luria
Broth Agar; LBA) büyüyen kültürler sıvı besiyerine (LB) inoküle edilir.
Ardından 37 C’de yaklaşık 3 saat inkübasyon yapılır ve optik yoğunluk
(OD) 30 dakikada bir 600 nm’de ölçülür. OD 0,6 ya yakın veya eşit olduğu
durumda; kültürler 15 mL’lik falkon tüplerde 10dk buz üzerinde inkübe
edilir. İnkübe edilen kültürler 4 C’ de 4000 rpm de 10dk santrifüj edilir.
Süpernatant atılır ve pellet kurutulur. Pellete 2.5 mL 0,1 M CaCl 2
eklenerek pellet çözülür. Tekrar 4 C’ de 4000 rpm de 10dk santrifüj edilir.
Süpernatant atılır ve pellet 1,2 mL 0,1 M CaCl2 içeren 500 L süspansiyon
eppendorf tüplere dağıtılır. Her birine 7.5 L gliserol eklenir. Elde edilen
hücreler -40 C’ de saklanır.
Transformasyon
Transformasyon aşamasında kullandığımız vektörler pNT-1, pTS-2,
ligasyonlardan elde edilen ürünler, iGEM kitlerinden elde edilen plazmidler.
Transformasyonda kullanılacak olan plastik malzemeler soğuk olarak
kullanılır.-40 C’dan çıkartılan hücreler buz üzerinde eritilir (0 C>). 50 L
hücre kültürüne 3 L plasmid eklenir. 30dk buzda inkübe edildikten sonra
60sn 42 C’ deki su banyosunda inkübasyon yapılır. Ardından 1dk buzda
inkübasyon yapılır. 250 L SOC besiyeri eklenir. 37 C 1 saat çalkalamalı
inkübasyon yapılır. 50 L kültür LBA (amp) besiyerine yayma yöntemi ile
inoküle edilir (4).
Plasmid İzolasyonu
“Promega Pure Yield Plasmid Miniprep System” ile “QIAprep Spin Miniprep
Kit” kullanılmıştır.
Restriksiyon Endonükleaz Kesimi
Reaksiyon karışımı
Vektör (0,3-0,8 g)
Restriksiyon endonükleaz (10-12U/ L)
10X Tampon
BSA (10 mg/mL)
dH2O
→
→
→
→
RE ünite: gvektör > 20
1X
0,1 mg/mL
toplam hacim 50 L
5-16 saat, 37 C inkübasyon yapıldı.
Ardından 20 dk, 60 C / 80 C inaktivasyon yapıldı.
Jelden Bant Elüsyonu
Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System üretici protokolüne
uygun olarak kullanıldı.
Ligasyon
Reaksiyon karışımı
Plazmid (50-100 ng)
Hedef DNA
T4 DNA ligaz (3U/ L) →
→
10X Tampon
→
dH2O
1,5 U
1X
Toplam hacim 10 L
Vektör : hedef DNA oranı; 1:3, 1:2, 1:1 olarak uygulanmıştır
(ng vektör x insert bç) / vektör bç x (insert : vektör oranı) = ng hedef
DNA
Çalışmalarımızda 50 ya da 100 ng plazmid ile başlayarak hedef DNA yı 3
kat molar oranda kullanıldı. Baz uzunluklarını gözeterek kullanacağımız
hedef DNA nın miktarı hesaplandı.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Reaksiyon karışımı
L
dH2O
25,7
10X PZR Tamponu
5
5X PZR Tamponu
10
25 mM MgCl2
1
2.5 mM dNTP
4
100p mol/ L primerler
1/1
Taq polimeraz
0,3
Kalıp DNA
2
Toplam hacim
PZR Koşulları C Süre Döngü
İlk
denatürasyon
95 15dk 1
Denatürasyon 95 1dk
Bağlanma
60 45sn
Uzama
72 3dk
Son uzama
72 7dk
İnkübasyon
4
40
1
50
Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz Jel Hazırlanması; Gerekli miktarda agaroz tartılır, erlene koyulur.
Gerekli miktarda TBE eklenir. Ardından hafifçe çalkalanıp mikrodalga fırına
koyulur. Mikrodalga fırın örnek kaynamaya başlayana kadar yüksek
ayarda çalıştırılır. Aralıklarla erlen mikrodalgadan çıkarılıp çalkalanır.
Kaynama başladıktan sonra mikrodalganın ayarı düşürülür. Tamamen
eriyene kadar çalkalanarak ısıtılır. Sonra etidyum bromür eklenir ve
çalkalayarak tüm çözeltiye dağılması sağlanır. Solüsyonun biraz soğuması
beklendikten sonra yavaşça dökülür ve polimerize olması için en az 15
dakika beklenir.
Örneklerin Jele Yüklenmesi; Jel tanka yerleştirilir. Tank jelin üstünü
kapatacak kadar TBE ile doldurulur. Küçük bir parça parafilm alınır ve
yüklenecek örnek sayısı kadar yükleme tamponu (yaklaşık 1’er μl) üstüne
koyulur. 5 μl örnek yükleme tamponu ile karıştırılıp jele yüklenir. Bir
kuyucuğa da marker koyulur. 90 V da 45 dakika yürütülür (5). Moleküler
ağırlık belirleyicisi olarak 50bp’lik gene ruler DNA ladder (Fermentas)
kullanılmıştır.
UYGULAMA PLANI
BULGULAR:
1. Kasetin Yapımı
1. LqsR (1007 bç) ve LqsS (1290 bç), pNT-1
plasmidinden
dizayn
edilen
primerler
kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu ile
çoğaltıldı.
2. Transformant kolonilerden plazmid izole
edildi.
4. LqsR NsiI ve SpeI enzimi ile kesildi.
2. Bidirectional double terminator geninin
bulunduğu
plazmid
(BioBrick:
P224C)
transforme edildi.
3. Bidirectional double terminator geninin
bulundupğu plazmid XbaI enzimi ile kesildi
ve 3284 bç’lik açık plazmid elde edilir.
5. LqsR ve bidirectional double terminator
parçalarının liasyonu yapıldı.
2. Kasetin Yapımı
1. Fep A geninin bulunduğu plazmid (BioBrick:P215E) ve RBS geninin
bulunduğu plazmid (BioBrick: P12M) transforme edildi.
2. Transformant kolonilerden plazmid izole
edildi (Sırasıyla FepA ve RBS plazmidleri)
4. RBS geninin bulunduğu 2079 bç’lik
plazmid (BioBrick: P12M) Spe I ve PstI ile
kesildi.
3. A geninin bulunduğu 5397 bç’lik plazmid
Xba I ve Pst I enzimleri ile kesildi. 2208
bç’lik Fep A geni jelden izole edildi.
5. FepA geni RBS vektörüne yerleştitirildi ve
içerisinde 4285 bç’lik açık vektörün de
bulunduğu ligasyon ürünü elde edildi.
6. Ligasyon ürünü transforme edildi.
7. Transformant kolonilerden plazmid izole
edildi.
8. Transformant kolonileden elde edilen plazmid önce EcoR I ile kesilerek açıldı (4285 bç)
ve SpeI ile kesilerek 2230 bç’lik RBS+FepA parçası plazmidin geri kalan kısmından jelde
izole edilerek ayrıldı.
8. RBS+FepA parçası EcoRI ve XbaI ile kesilmiş bidirectional terminatör geninin içerisinde
bulunduğu plazmide enzim kesim bölgeleri sayesinde doğru oryantasyonda yerleştirildi.
Ligasyon ürünü transforme edildi.
3. Kasetin yapımı
1. 259 bç’lik LqsR promoter bölgesi, pNT-1 plasmidinden Biobrick enzim kesimlerine
uygun olarak dizayn edilen primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu ile
çoğaltıldı. Çoğaltılan bölge EcoRI ve SpeI enzimi ile kesildi.
259 bç
2. RBS geninin bulunduğu plazmid EcoRI ve XbaI enzimi ile kesildi. LqsR promotor
bölgeyi içeren parça RBS geninin önüne oturacak şekilde plazmide yerleştirildi.
Uluslararası
Genetik
Mühendisliğiyle
Geliştirilmiş
Makine
(International Genetically Engineered Machine–iGEM) Massachusetts
Teknoloji Enstitüsü (MIT) tarafından 2004 yılından itibaren dünyanın çeşitli
bölgelerindeki üniversite takımlarının katılımı ile düzenlenmekte olan bir
yarışmadır. Bu takımlar, sentetik biyoloji ve mühendislik yaklaşımlarını
kullanarak fonksiyonel biyolojik sistemler oluşturmaktadır. Yarışma
kapsamında, akademisyenler ve gönüllü araştırmacılar, DNA tabanlı
yeniden standart biyolojik parçalar oluşturup tüm araştırmacıların
kullanımına sunmuştur. Bu genetik parçaları kapsayan bir DNA seti ile
çalışmaya başlayan biyoteknoloji konusuna meraklı yüksek lisans, lisans
ve lise seviyelerindeki öğrencilerden oluşan takımlar günlük yaşamda
karşılaşılan problemlere çözüm olabilecek yeni genetik programlar
oluşturmaya çalışıyorlar. Bu yaklaşım oldukça karmaşık olan biyolojik veri
birikimini belirli kıstaslara göre kategorize ederek bir takım standartlar
oluşturmak ve bu standartları kullanarak hazırlanacak biyolojik parçaları
(genler ve genetik kontrol üniteleri) bir bilgi bankasında kataloglamak
üzerine oturuyor.
Yarışmanın finalinde ise takım üyeleri, araştırma projelerini içinde
akademisyenlerin, endüstri ve sosyal bilimler alanında uzman kişilerin
bulunduğu bir jüriye ve diğer takımlara sunuyor. Yarışma sonucu
üniversite takımlarına proje fikirlerinin tutarlılığı, deneylerinde ulaştıkları
sonuçlar ve projelerinin bilim dünyasına katkısı göz önünde bulundurularak
6 klasmanda Altın, Gümüş ve Bronz madalyalar veriliyor (7).
Gelecek hedefimiz; Legionella pneumophila’yı tür düzeyinde özgül
olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap vererek, bazı
Stafilokok suşların salgıladığı anti-Legionella peptidini üretebilen
Escherichia coli hücreleri oluşturmaktır. Proje kapsamında, iki adet
transforme E. coli üretilecektir (2). Bunlardan bir tanesi L. pneumophilia
LqsA gen bölgesini içeren plazmid (17) ile ikincisi ise L. pneumophilia LqsR
ve LqsS gen bölgelerini (15, 16, 19) ve Warnericin RK® peptidini (22 aa
düz peptit) (1, 9, 11, 12, 20) içeren plazmid ile transforme edilmiş
olacaktır. Bu plazmid taşıyabilirse, renk reaksiyonu oluşturacak bir gen
bölgesi de içerecektir. LqsA ile transforme E. coli, çalışmamızda ürettiğimiz
kompozit plazmitin Legionella pneumophilia’yı algıladığını göstermek
amacıyla kontrol bakteri olarak kullanılacaktır. Projeden beklentimiz,
hazırladığımız plazmitin Legionella pneumophiliayı tanıyarak, kontamine
edebileceği yüzeylerde çoğalmasını engellemesini sağlamaktır.
Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Araştırma Kurulu
tarafından onaylanmış (DA13/06) ve Başkent Üniversitesi Araştırma
Fonunca desteklenmiştir.
KAYNAKLAR
1.
2.
3.
4.
5.
Bastos MCF, Ceotto H, Coelho MLV, et al. Staphylococcal Antimicrobial
Peptides: Relevant Properties and Potential Current Biotechnological
Applications. Pharma Biotech. 2009; 10:38-61
Choi JH, Lee SY. Secretory and extracellular production of recombinant
proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotech. 2004; 64:625–
635
Declerck P. Biofilms: the environmental playground of Legionella
pneumophilaemi. Environ Microbiol. 2010; 12(3):557–566
Frederick M. Ausubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston
(Editor), David D. Moore (Editor), J. G. Seidman (Editor), John A. Smith
(Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th
Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 1-27
Frederick M. Ausubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston
(Editor), David D. Moore (Editor), J. G. Seidman (Editor), John A. Smith
(Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th
Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 2-14
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Guerrieri El, Bondi M, Sabia C, et al. Effect of Bacterial Interference on
Biofilm Development by Legionella pneumophila. Curr Microbiol. 2008;
57:532–536
http://igem.org/Main_Page
http://tip.baskent.edu.tr/egitim/mezuniyetoncesi/calismagrp/ogrsmpzsn
m14/14.S22.pdf
Huang Y, Huang ,J Chen Y. Alpha-helical cationic antimicrobial peptides:
relationships of structure and function. Protein Cell. 2010; 1(2):143–152
Loret JF, Robert S, Thomas V, et al. Comparison of disinfectants for
biofilm, protozoa and Legionella control. J Water Health. 2005; 3(4):42333
Marchand A, Verdon J, Lacombe C, et al. Anti-Legionella activity of
staphylococcal hemolytic peptides. Peptides. 2011; 32:845–851
Mohammed Al-Mahrous M, Jack WR, Sandiford SK, et al. Identification of
a haemolysin-like peptide with antibacterial activity using the draft
genomesequence of Staphylococcus epidermidis strain A487. Immunol
Med Microbiol. 2011; 62:273–282
Murray PR, Rosenthal KS, and Pfaller MS, Medical Microbiology, 6th Ed,
Mosby Elsevier, Philadelpia, PA, USA; 2009; 365-370
Sahr T, Bruggemann H, Buchrieser C, et al. Two small mcRNAs jointly
govern virulence and transmission in Legionella pneumophila. Mol
Microbiol. 2009; 72(3):741-762
Tiaden A, Spirig T, Carranza P, et al. Synergistic Contribution of the
Legionella pneumophila lqs Genes to Pathogen-Host Interactions. J
Bacteriol. 2008; 7532–7547.
Tiaden A, Spirig T, Hilbi H et al. The Legionella pneumophila response
regulator LqsR promotes host cell interactions as an elementof the
virulence regulatory network controlled by RpoS and LetA . Cell
Microbiol. 2007; 9(12):2903-2920
Tiaden A, Spirig T, Hilbi H, et al. The legionella Autoinducer Synthase
LqsA Produces an α-Hydroxyketane Signaling Molecule. J Biol Chem.
2008; 283(26):18113-18123
Tiaden A, Spirig T, Hilbi H. Bacterial gene regulation by a-hydroxyketone
signaling. Trends Microbiol. 2010; 18(7):288-97
Tiaden A, Spirig T, Sahr T et al. The autoinducer synthase LqsA and
putative sensorkinase LqsS regulate phagocyte interactions,extracellular
filaments and a genomic island of Legionella pneumophila. Environ
Microbiol. 2010; 12(5):1243 -1259
Verdon J, Falge M, Maier E, et al. Detergent-Like Activity and a-Helical
Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide. Biophy J. 2009;
97:1933–1940